JPH0343096A - 基質又は酵素の定量方法 - Google Patents
基質又は酵素の定量方法Info
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- JPH0343096A JPH0343096A JP15768390A JP15768390A JPH0343096A JP H0343096 A JPH0343096 A JP H0343096A JP 15768390 A JP15768390 A JP 15768390A JP 15768390 A JP15768390 A JP 15768390A JP H0343096 A JPH0343096 A JP H0343096A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、基質又は酵素の改良された定量方法に関する
。
。
近年、酵素法による生体成分の分析法が広く普及し、生
体中の酵素あるいは非酵素成分の測定系に、種々の共役
反応を利用する場合が非常に多くなった。中でも脱水素
酵素群は、検出が容易なＮＡＤ又はＮＡＤＰが関与する
ため適用範囲が広べ、クレアチンキナーゼ測定系におけ
るグルコース−６−リン酸脱水素酵素、トリグリセライ
ド測定系におけるグリセロール脱水素酵素などがそのよ
い例である。現在、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの検出は、
一般にホルマザン発色系の共役によって行われているが
、この方法では色素が水に難溶性であり、又、反応条件
により発色度が異なるので正確な分子吸光係数を適用し
にくい。さらに測定器具に色素が吸着するなどの欠点が
ある。
体中の酵素あるいは非酵素成分の測定系に、種々の共役
反応を利用する場合が非常に多くなった。中でも脱水素
酵素群は、検出が容易なＮＡＤ又はＮＡＤＰが関与する
ため適用範囲が広べ、クレアチンキナーゼ測定系におけ
るグルコース−６−リン酸脱水素酵素、トリグリセライ
ド測定系におけるグリセロール脱水素酵素などがそのよ
い例である。現在、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの検出は、
一般にホルマザン発色系の共役によって行われているが
、この方法では色素が水に難溶性であり、又、反応条件
により発色度が異なるので正確な分子吸光係数を適用し
にくい。さらに測定器具に色素が吸着するなどの欠点が
ある。
最近、これらの諸問題を解決する新しい発色系の利用が
報告されている。例えば、脱水素酵素−基質−ＮＡＤの
反応系にＦｅ’“、電子伝達剤及びＦｅｔ４″に特異的
に反応するキレート剤を添加した緩衝液中で次の反応を
行わせ、結果として生成した着色化合物を比色定量する
ことによる、トリグリセライドの測定方法が発表されて
いる（特開昭５４−８０１９２号公報）。
報告されている。例えば、脱水素酵素−基質−ＮＡＤの
反応系にＦｅ’“、電子伝達剤及びＦｅｔ４″に特異的
に反応するキレート剤を添加した緩衝液中で次の反応を
行わせ、結果として生成した着色化合物を比色定量する
ことによる、トリグリセライドの測定方法が発表されて
いる（特開昭５４−８０１９２号公報）。
脱水素酵素
ＮＡＤ十基質 ＮＡＤＨ十生成物電子伝達剤
ＮＡＤ Ｈ＋ ２ Ｆｅ ’ ”−一−−→ＮへＤ＋２
Ｆｅ”Ｆｅ宜０＋ｎ（キレート剤）−一→錯化合物（着
色）この方法は、生成する着色物が水溶性であり、感度
もかなり高い。しかしながら、試薬ブランク植の経時変
化が著しいので、比色時には検体ごとに試薬ブランク値
による分光光度計のゼロ調整をしなければならず、測定
する試料件数が限られ、多検体処理には不適当であった
。
Ｆｅ”Ｆｅ宜０＋ｎ（キレート剤）−一→錯化合物（着
色）この方法は、生成する着色物が水溶性であり、感度
もかなり高い。しかしながら、試薬ブランク植の経時変
化が著しいので、比色時には検体ごとに試薬ブランク値
による分光光度計のゼロ調整をしなければならず、測定
する試料件数が限られ、多検体処理には不適当であった
。
本発明者は、この試薬ブランク値の経時変化を抑制し、
比色時の煩雑な操作を除くことにより多検体処理を可能
にするため、種々研究を行った結果、試薬ブランク値の
上昇は試薬中に含まれる種々の成分によるＦ、ｅ３４″
の非特異的還元に帰因し、とくに酵素蛋白やその夾雑物
量に依存して増大する傾向があることを見出し、更に、
それに効果的な隠ぺい剤、すなわちｐ ｅ ２ ＋と錯
化合物（キレート）を形成するキレート剤を使用するこ
とにより試薬ブランク値の経時変、化の抑制が可能であ
ることを見出した。本発明はかかる知見に基づくもので
ある。従って、本発明方法は、広く一般に脱水素酵素及
びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系Ｃ：１１応用するこ
とが可能であり、ホルマザン法にかわる比色法として、
ＮＡＤＨ又はＮへＤＰＨの検出に適用することができる
。
比色時の煩雑な操作を除くことにより多検体処理を可能
にするため、種々研究を行った結果、試薬ブランク値の
上昇は試薬中に含まれる種々の成分によるＦ、ｅ３４″
の非特異的還元に帰因し、とくに酵素蛋白やその夾雑物
量に依存して増大する傾向があることを見出し、更に、
それに効果的な隠ぺい剤、すなわちｐ ｅ ２ ＋と錯
化合物（キレート）を形成するキレート剤を使用するこ
とにより試薬ブランク値の経時変、化の抑制が可能であ
ることを見出した。本発明はかかる知見に基づくもので
ある。従って、本発明方法は、広く一般に脱水素酵素及
びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系Ｃ：１１応用するこ
とが可能であり、ホルマザン法にかわる比色法として、
ＮＡＤＨ又はＮへＤＰＨの検出に適用することができる
。
本発明は、脱水素酵素と酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）又は酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）とを含む酵素
反応系により生成する還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡ Ｄ Ｐ Ｈ）の量
に対応して、電子伝達剤の存在下で第二鉄イオン（Ｆｅ
″′″）から還元生成する第一鉄イオン（Ｆｅ”）の量
を、Ｆｅ”に特異的に反応するキレート剤の作用により
生成する着色化合物として比色定量する方法であって、 エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をキレート剤とし
て含有するｐＨ５，０〜８．６の緩衝液を、一定時間反
応後に添加することを特徴とする、基質又は酵素の定量
方法に関する。
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）又は酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）とを含む酵素
反応系により生成する還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡ Ｄ Ｐ Ｈ）の量
に対応して、電子伝達剤の存在下で第二鉄イオン（Ｆｅ
″′″）から還元生成する第一鉄イオン（Ｆｅ”）の量
を、Ｆｅ”に特異的に反応するキレート剤の作用により
生成する着色化合物として比色定量する方法であって、 エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をキレート剤とし
て含有するｐＨ５，０〜８．６の緩衝液を、一定時間反
応後に添加することを特徴とする、基質又は酵素の定量
方法に関する。
即ち、簡単に言えば、本発明方法は、電子伝達剤の存在
下に、脱水素酵素反応により生成したＮへＤｒ（又はＮ
ＡＤＰＨ量に対応してＦｅ”から還元生成するＦｅ”を
錯化合物として比色するにあたり、余剰のＦ Ｃ３＋と
測定波長に吸収スペクトルを示さないキレート化合物を
生成するキレート剤を添加して反応を停止させるととも
に試薬ブランク値の経時変化を抑制することを特徴とす
る基質又は酵素の改良された定量方法である。
下に、脱水素酵素反応により生成したＮへＤｒ（又はＮ
ＡＤＰＨ量に対応してＦｅ”から還元生成するＦｅ”を
錯化合物として比色するにあたり、余剰のＦ Ｃ３＋と
測定波長に吸収スペクトルを示さないキレート化合物を
生成するキレート剤を添加して反応を停止させるととも
に試薬ブランク値の経時変化を抑制することを特徴とす
る基質又は酵素の改良された定量方法である。
本発明方法におけるキレート剤、即ち、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）の効果は、Ｆｅ”と安定な錯化合
物（キレート）を形成し、Ｆｅ”が還元されるのを抑制
する作用で説明することができる。従って、反応時にキ
レート剤を共存させると、反応に由来するＦｅｈの還元
を阻害する一可能性がある。そこで、実際に本発明方法
を実施する際には、基質の定量の場合には反応が終結し
た時点でキレート剤を加え、酵素の定量の場合には、規
定時間反応させた直後にキレート剤を（必要により酵素
反応停止剤と共に）加える。キレート剤が同時に酵素反
応を停止する作用を有する場合もある。
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）の効果は、Ｆｅ”と安定な錯化合
物（キレート）を形成し、Ｆｅ”が還元されるのを抑制
する作用で説明することができる。従って、反応時にキ
レート剤を共存させると、反応に由来するＦｅｈの還元
を阻害する一可能性がある。そこで、実際に本発明方法
を実施する際には、基質の定量の場合には反応が終結し
た時点でキレート剤を加え、酵素の定量の場合には、規
定時間反応させた直後にキレート剤を（必要により酵素
反応停止剤と共に）加える。キレート剤が同時に酵素反
応を停止する作用を有する場合もある。
本発明で使用するキレート剤はエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）である。
（ＥＤＴＡ）である。
キレート剤は、その濃度とｐＨにより、効果がかなり左
右されるため、使用する際には条件設定が重要となる。
右されるため、使用する際には条件設定が重要となる。
次に、本発明のキレート剤であるエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ） 、及びこれと同様の効果を有する以下
のキレート剤等について、各種の条件を具体的に示す。
酸（ＥＤＴＡ） 、及びこれと同様の効果を有する以下
のキレート剤等について、各種の条件を具体的に示す。
ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−
ＯＨ） ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ジアミノプロ
パノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ） ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ） トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ） ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）リン酸塩 表１及び表２は、後述の参考例１の乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ）測定試薬を用いて試験を実施した結果を示すもの
である。表１には、ｐＨが試薬ブランク値の経時変化に
及ぼす影響を示した。この結果から、ｐＨの選択によっ
ては、かえって逆効果となってしまうことがわかる。表
２には、キレート剤の濃度が試薬ブランク値の経時変化
と呈色に及ぼす影響を示した。この結果から、キレート
剤が高濃度になるに従って経時的に試薬ブランク値は減
少するが、反応による呈色をも減少させる傾向にあるこ
とがわかる。従ってＬＤＨを測定する場合のキレート剤
としては、１〜８ｍＭ−ＥＤＴＡ−ＯＨ（ｐＨ８，６）
や１〜８ｍＭ−ＤＰＴＡ−ＯＨ（ｐＨ８，６） 、４〜
８ｍＭ−ＣｙＤＴＡ （ｐＨ８，６）が有効と考えられ
る。
ＯＨ） ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ジアミノプロ
パノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ） ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ） トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ） ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）リン酸塩 表１及び表２は、後述の参考例１の乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ）測定試薬を用いて試験を実施した結果を示すもの
である。表１には、ｐＨが試薬ブランク値の経時変化に
及ぼす影響を示した。この結果から、ｐＨの選択によっ
ては、かえって逆効果となってしまうことがわかる。表
２には、キレート剤の濃度が試薬ブランク値の経時変化
と呈色に及ぼす影響を示した。この結果から、キレート
剤が高濃度になるに従って経時的に試薬ブランク値は減
少するが、反応による呈色をも減少させる傾向にあるこ
とがわかる。従ってＬＤＨを測定する場合のキレート剤
としては、１〜８ｍＭ−ＥＤＴＡ−ＯＨ（ｐＨ８，６）
や１〜８ｍＭ−ＤＰＴＡ−ＯＨ（ｐＨ８，６） 、４〜
８ｍＭ−ＣｙＤＴＡ （ｐＨ８，６）が有効と考えられ
る。
表３及び表４は、同様に、後述の参考例３のトリグリセ
ライド測定に用いるキレート剤を検討した結果を示すも
のである。これらの表から、１〜８ｍＭ（特に１〜４
ｍＭ） −ＥＤＴＡ （ｐＨ８，６）、１〜８ｍＭ−Ｄ
ＴＰＡ−ＯＨ（ｐＨ８，６） 、４〜８ｍＭ−Ｃｙ Ｄ
ＴＡ （ｐＨ１０，０）及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）が使用可能なものと判断することができる。
ライド測定に用いるキレート剤を検討した結果を示すも
のである。これらの表から、１〜８ｍＭ（特に１〜４
ｍＭ） −ＥＤＴＡ （ｐＨ８，６）、１〜８ｍＭ−Ｄ
ＴＰＡ−ＯＨ（ｐＨ８，６） 、４〜８ｍＭ−Ｃｙ Ｄ
ＴＡ （ｐＨ１０，０）及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）が使用可能なものと判断することができる。
後述の参考例２に記載の方法に従ってクレアチンキナー
ゼ（ＣＫ）を測定する場合には、ここで生じる色素が中
性以上のＰＨで不安定であるため、キレート剤を弱酸性
の条件で用いることが望ましい。
ゼ（ＣＫ）を測定する場合には、ここで生じる色素が中
性以上のＰＨで不安定であるため、キレート剤を弱酸性
の条件で用いることが望ましい。
又、表５に示す様に、使用する緩衝液の種類によって効
果の異なるものもある。濃度を変化させた場合の実験結
果を表６に示した。この結果から、０．５〜２ｍＭのＥ
ＤＴＡＳＥＤＴＡ−ＯＨＳＤＴＰＡ及びＣｙＤＴＡが有
効であることがわかる。
果の異なるものもある。濃度を変化させた場合の実験結
果を表６に示した。この結果から、０．５〜２ｍＭのＥ
ＤＴＡＳＥＤＴＡ−ＯＨＳＤＴＰＡ及びＣｙＤＴＡが有
効であることがわかる。
本発明方法に用いられるＦｅ”＋は、硫酸第二鉄アンモ
ニウム、塩化第二鉄などであり、Ｆｅ”に特異的に反応
するキレート剤としては、例えば、バソフエナンスロリ
ンスルホン酸ナトリウム、２−ピリジルアルドキシム、
３−（２−ピリジル）−５，６−ビス（４−スルホニル
） −１，２，４−トリアジンスルホン酸ナトリウム、
オルトフェナンスロリンが適当である。また、電子伝達
剤としては、たとえばフェナジンメトサルフェー） （
ＰＭＳ）、メルトラブル−、メトキシフェナジンメ！・
サルフェート（Ｍ−ＰＭＳ） 、ディアフォラーゼが適
している。緩衝液としては、トリエタノールアミン緩衝
液の他、反応に関わる酵素等の反応至適条件を満足する
ような成分と９Ｈを選択することができる。
ニウム、塩化第二鉄などであり、Ｆｅ”に特異的に反応
するキレート剤としては、例えば、バソフエナンスロリ
ンスルホン酸ナトリウム、２−ピリジルアルドキシム、
３−（２−ピリジル）−５，６−ビス（４−スルホニル
） −１，２，４−トリアジンスルホン酸ナトリウム、
オルトフェナンスロリンが適当である。また、電子伝達
剤としては、たとえばフェナジンメトサルフェー） （
ＰＭＳ）、メルトラブル−、メトキシフェナジンメ！・
サルフェート（Ｍ−ＰＭＳ） 、ディアフォラーゼが適
している。緩衝液としては、トリエタノールアミン緩衝
液の他、反応に関わる酵素等の反応至適条件を満足する
ような成分と９Ｈを選択することができる。
表１
（１） ０度は全て４ｍＭとした。
（２）キレート剤を５０ｍ１Ｊシュウ酸含有０．１Ｍコ
ハク酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解。
ハク酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解。
（３）キレート剤を５０ｍＭシュウ酸含有０．１Ｍ ト
リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８，６）に溶解。
リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８，６）に溶解。
（４）キレート剤を５０ｍＭシュウ酸含有０．１Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ１０，ｏ）に溶解。
緩衝液（ｐＨ１０，ｏ）に溶解。
表２
（１）キレート剤添加直後に測定した吸光度に対する、
６０分後に測定した吸光度の百分率で示した。
６０分後に測定した吸光度の百分率で示した。
表３
（１）濃度は、全て４ｍＭとした。
（２）キレート剤を０．１Ｍコハク酸緩衝液に溶解（ｐ
Ｈ６，０）（３）キレート剤をＯ，１Ｍ）リエタノール
アミン緩衝液に溶解（ｐＨ８，６） （４）キレート剤をＯ，１Ｍ炭酸緩衝液に溶解（ｐＨ１
Ｏ，Ｏ）表４ 表５ キレート剤の溶解緩衝液 ０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ５，０）０．１Ｍコハク
酸緩衝液（ｐＨ６，０）０、１Ｍ３．３−ジメチルグル
タル酸緩衝液（ｐＨ５，０）０、１Ｍ３．３−ジメチル
グルタル酸緩衝液（ｐＨ６，０）濃度は全てＩｍＭ 表６ （１）０．１Ｍ ３．３ 一ジメチルグルタル酸（ｐＨ６，０） に溶解 〔以下余白〕 〔実施例〕 次に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、これ
は本発明を限定するものではない。
Ｈ６，０）（３）キレート剤をＯ，１Ｍ）リエタノール
アミン緩衝液に溶解（ｐＨ８，６） （４）キレート剤をＯ，１Ｍ炭酸緩衝液に溶解（ｐＨ１
Ｏ，Ｏ）表４ 表５ キレート剤の溶解緩衝液 ０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ５，０）０．１Ｍコハク
酸緩衝液（ｐＨ６，０）０、１Ｍ３．３−ジメチルグル
タル酸緩衝液（ｐＨ５，０）０、１Ｍ３．３−ジメチル
グルタル酸緩衝液（ｐＨ６，０）濃度は全てＩｍＭ 表６ （１）０．１Ｍ ３．３ 一ジメチルグルタル酸（ｐＨ６，０） に溶解 〔以下余白〕 〔実施例〕 次に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、これ
は本発明を限定するものではない。
施：血 の酸脱 ＬＤＨ活の
定
ｌ）試薬
溶液Ａ ： １１．６ｍＭオルトフェナンスロリンと４
００ｍＭ乳酸リチウムとを含む２００ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ８，０）。
００ｍＭ乳酸リチウムとを含む２００ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ８，０）。
溶液Ｂ ：２０ｍＭ−ＮＡＤと、３Ｕ／ｄデイアフオラ
ーゼと、１２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニウムとを含む５
０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７，２）。
ーゼと、１２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニウムとを含む５
０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７，２）。
溶液Ｃ（キレート剤）：５０ｍＭシュウ酸と、４ｍＭ−
ＥＤＴＡとを含む０．１Ｍ ）リエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ８，６）。
ＥＤＴＡとを含む０．１Ｍ ）リエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ８，６）。
２）操作方法
血清３０μｌと溶液Ｂ０．５ｒＩＬｌとを試験管にとり
、溶液へ〇、５−を加えて３７”Ｃで正確に１０分間反
応させた後、ただちに溶液Ｃ２７１Ｌｌを添加して室温
に戻す。別に、血清を加えずに、同様に操作したものを
試薬ブランクとして、５１０ｎｍの吸光度を測定する。
、溶液へ〇、５−を加えて３７”Ｃで正確に１０分間反
応させた後、ただちに溶液Ｃ２７１Ｌｌを添加して室温
に戻す。別に、血清を加えずに、同様に操作したものを
試薬ブランクとして、５１０ｎｍの吸光度を測定する。
次に、血清試料と同一方法で処理した既知ＬＤＨ活性の
溶液によって示される吸光度と測定吸光度との比較によ
って、血清試料のＬ Ｄ Ｈ活性を算出する。
溶液によって示される吸光度と測定吸光度との比較によ
って、血清試料のＬ Ｄ Ｈ活性を算出する。
１：血 の乳酸脱 ＬＤＨ活 の団完
ｌ）試薬
溶液Ａ ： １１．６ｍＭオルトフェナンスロリンと４
００ｍＭ乳酸リチウムとを含む２００ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ８，０）。
００ｍＭ乳酸リチウムとを含む２００ｍＭトリエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ８，０）。
溶液Ｂ ：２０ｍＭ−ＮＡＤと、３Ｕ／−ディアフォラ
ーゼと、１２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニウムとを含む５
０ｍＭ ）リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７，２）。
ーゼと、１２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニウムとを含む５
０ｍＭ ）リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７，２）。
溶液Ｃ（キレート剤）：５０ｍＭシュウ酸と、４［ＩＩ
Ｍ −ＥＤＴＡ−ＯＨとを含む０．１Ｍ）リエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ８，６）。
Ｍ −ＥＤＴＡ−ＯＨとを含む０．１Ｍ）リエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ８，６）。
２）操作方法
血清３０μｌと溶液Ｂ０．５Ｔｌｄ！とを試験管にとり
、溶液Ａ０．５−を加えて３７℃で正確に１０分間反応
させた後、ただちに溶液Ｃ２ｎ１１を添加して室温に戻
す。別に、血清を加えずに、同様に操作したものを試薬
ブランクとして、５１０ｎｍの吸光度を測定する。次に
、血清試料と同一方法で処理した既知ＬＤＨ活性の溶液
によって示される吸光度と測定吸光度との比較によって
、血清試料のＬＤＨ活性を算出する。第１図に示すとお
り、上記の諸条件下で、直線的な吸光度の応答が約１２
００ウロブレスキー（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ）単位のＬ
ＤＨ活性のレベルまで認められた。
、溶液Ａ０．５−を加えて３７℃で正確に１０分間反応
させた後、ただちに溶液Ｃ２ｎ１１を添加して室温に戻
す。別に、血清を加えずに、同様に操作したものを試薬
ブランクとして、５１０ｎｍの吸光度を測定する。次に
、血清試料と同一方法で処理した既知ＬＤＨ活性の溶液
によって示される吸光度と測定吸光度との比較によって
、血清試料のＬＤＨ活性を算出する。第１図に示すとお
り、上記の諸条件下で、直線的な吸光度の応答が約１２
００ウロブレスキー（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ）単位のＬ
ＤＨ活性のレベルまで認められた。
ｌ）試薬
溶液へ： ６ｍ）Ｊ ３−（２−ピリジル）−５，６−
ビス（４−スルホニル）−１，２，４−トリアジンスル
ホン酸ナトリウムと、４０ｍＭクレアチンリン酸をを含
む２００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７
，６）。
ビス（４−スルホニル）−１，２，４−トリアジンスル
ホン酸ナトリウムと、４０ｍＭクレアチンリン酸をを含
む２００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７
，６）。
溶液Ｂ：２ｍＭＮＡＤＰと、４０ｕＭ−ＰＭＳと、４ｍ
Ｍ了デノシンー２−リン酸と、６ｍＭ硫酸第二鉄アンモ
ニウムと、−１２ｍＭ塩化マグネシウムと、８０ｍＭグ
ルコースと、０．１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンと、０
．８Ｕ／−グルコース６リン酸脱水素酵素と、１．３Ｕ
／ｍｌへキソキナーゼとを含む５０ｍＭ ）リエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７，２）。
Ｍ了デノシンー２−リン酸と、６ｍＭ硫酸第二鉄アンモ
ニウムと、−１２ｍＭ塩化マグネシウムと、８０ｍＭグ
ルコースと、０．１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンと、０
．８Ｕ／−グルコース６リン酸脱水素酵素と、１．３Ｕ
／ｍｌへキソキナーゼとを含む５０ｍＭ ）リエタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ７，２）。
溶液Ｃ（キレート剤）： １ｍＭ−ＤＴＰＡを含む０．
１Ｍ ３．３−ジメチルグルタル酸緩衝液−（ｐＨ６
，０２”）。
１Ｍ ３．３−ジメチルグルタル酸緩衝液−（ｐＨ６
，０２”）。
２）操作方法
血清ｌＯμｌと溶液Ａ０．２５ｍ１とを試験管にとり、
溶液８０．２５ｍ１を加えて３７℃で正確に１０分間反
応させた後、ただちに溶液Ｃ４ｒＩｄ！を添加し、室温
に戻す。別に、血清を加えずに同様に操作したものを試
薬ブランクとして、５６４ｎｍの吸光度を測定する。
溶液８０．２５ｍ１を加えて３７℃で正確に１０分間反
応させた後、ただちに溶液Ｃ４ｒＩｄ！を添加し、室温
に戻す。別に、血清を加えずに同様に操作したものを試
薬ブランクとして、５６４ｎｍの吸光度を測定する。
次に、血清試料と同一方法で処理した既知ＣＫ活性溶液
によって示される吸光度と測定吸光度との比較によって
血清試料のＣＫ活性を算出する。第２図に示すとおり、
上記の諸−条件下で直線的な吸光度の応答が２００１．
Ｕ、／ｊ７のレベルまで認められた。
によって示される吸光度と測定吸光度との比較によって
血清試料のＣＫ活性を算出する。第２図に示すとおり、
上記の諸−条件下で直線的な吸光度の応答が２００１．
Ｕ、／ｊ７のレベルまで認められた。
例３：血 のトリグセライドの 定
ｌ）試薬
溶液Ａ：５．８ｍＭバソフェナンスロリンスルホン酸ナ
トリウムと、２００ｍＭ塩化カリウムとを含む２００ｍ
Ｍ’トリエタメトリアミン緩衝液（ｐＨ８，０）。
トリウムと、２００ｍＭ塩化カリウムとを含む２００ｍ
Ｍ’トリエタメトリアミン緩衝液（ｐＨ８，０）。
溶液Ｂ ： ４０ｍＭ−ＮＡＤと、４０μＭメトキシＰ
ＭＳと、２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニウムと、０．１ｗ
／Ｖ％ウシ血清アルブミンと、４０００／−リポプロテ
ィンリパーゼと、３２Ｕ／−グリセロール脱水素酵素と
を含む５０ｍＭ ）リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７
，２）。
ＭＳと、２５ｍＭ硫酸第二鉄アンモニウムと、０．１ｗ
／Ｖ％ウシ血清アルブミンと、４０００／−リポプロテ
ィンリパーゼと、３２Ｕ／−グリセロール脱水素酵素と
を含む５０ｍＭ ）リエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７
，２）。
溶液Ｃ： ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液。
２）操作方法
血清１０μｌと、溶液へ〇、 ２５ｍ１とを試験管にと
り、溶液Ｂ Ｏ，２５ｔｄを加えて、３７℃で２０分間
インキュベートした後、ただちに溶液Ｃ４−を添加して
室温に戻す。別に、血清を加えずに同様に操作したもの
を試薬ブランクとして５３５ｎｍの吸光度を測定する。
り、溶液Ｂ Ｏ，２５ｔｄを加えて、３７℃で２０分間
インキュベートした後、ただちに溶液Ｃ４−を添加して
室温に戻す。別に、血清を加えずに同様に操作したもの
を試薬ブランクとして５３５ｎｍの吸光度を測定する。
次に、血清試料のトリグリセライド含量を血清試料と同
一方法で処理した既知トリグリセライド含量の溶液によ
って示される吸光度と測定吸光度との比較によって算出
する。第３図に示すとおり、上記の諸条件下で直線的な
吸光度の応答がほぼ１０００ｍｇ／ｄｌのトリグリセラ
イドのレベルまで認められた。
一方法で処理した既知トリグリセライド含量の溶液によ
って示される吸光度と測定吸光度との比較によって算出
する。第３図に示すとおり、上記の諸条件下で直線的な
吸光度の応答がほぼ１０００ｍｇ／ｄｌのトリグリセラ
イドのレベルまで認められた。
以上述べたことから、本発明方法は広く一般に脱水素酵
素及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系への応用が充分
可能であ、す、比色時の煩雑な操作を必要とせず、−信
頼度の高い測定を多検体にわたり可能とする。又、本発
咀方法は高い感度を期待できるため、反応時間の短縮や
試料の微量化も可能であることが明らかである。
素及びＮＡＤ又はＮＡＤＰを含む測定系への応用が充分
可能であ、す、比色時の煩雑な操作を必要とせず、−信
頼度の高い測定を多検体にわたり可能とする。又、本発
咀方法は高い感度を期待できるため、反応時間の短縮や
試料の微量化も可能であることが明らかである。
第１図は血清中のＬＤＨ活性の測定におけるウロプレウ
スキー単位と吸光度との関係を示すグラフであり、第２
図はクアレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性測定における測
定可能領域を示すグラフであり、そして第３図はトリグ
リセライドの測定における測定可能領域を示すグラフで
ある。
スキー単位と吸光度との関係を示すグラフであり、第２
図はクアレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性測定における測
定可能領域を示すグラフであり、そして第３図はトリグ
リセライドの測定における測定可能領域を示すグラフで
ある。
Claims (1)
- （１）脱水素酵素と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ）又は酸化型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）とを含む酵素反応
系により生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の量に対応して
、電子伝達剤の存在下で第二鉄イオン（Ｆｅ＾３＾＋）
から還元生成する第一鉄イオン（Ｆｅ＾２＾＋）の量を
、Ｆｅ＾２＾＋に特異的に反応するキレート剤の作用に
より生成する着色化合物として比色定量する方法であっ
て、 エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をキレート剤とし
て含有するｐＨ５．０〜８．６の緩衝液を、一定時間反
応後に添加することを特徴とする、基質又は酵素の定量
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15768390A JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | 基質又は酵素の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15768390A JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | 基質又は酵素の定量方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15396181A Division JPS5856698A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 基質又は酵素の改良された定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0343096A true JPH0343096A (ja) | 1991-02-25 |
| JPH0442000B2 JPH0442000B2 (ja) | 1992-07-10 |
Family
ID=15655108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15768390A Granted JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | 基質又は酵素の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0343096A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0681611A4 (en) * | 1993-01-28 | 1998-07-29 | Boehringer Mannheim Corp | COMPOSITIONS USED IN ANAEROBIC DETERMINATION OF ANALYZES. |
| EP1466987A4 (en) * | 2001-12-28 | 2006-04-19 | Arkray Inc | COLORIMETRY METHOD AND REAGENT FOR USE THEREIN |
| US7550273B2 (en) | 2001-12-28 | 2009-06-23 | Arkray, Inc. | Colorimetric method and reagent used for the same |
-
1990
- 1990-06-18 JP JP15768390A patent/JPH0343096A/ja active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0681611A4 (en) * | 1993-01-28 | 1998-07-29 | Boehringer Mannheim Corp | COMPOSITIONS USED IN ANAEROBIC DETERMINATION OF ANALYZES. |
| EP1466987A4 (en) * | 2001-12-28 | 2006-04-19 | Arkray Inc | COLORIMETRY METHOD AND REAGENT FOR USE THEREIN |
| US7550273B2 (en) | 2001-12-28 | 2009-06-23 | Arkray, Inc. | Colorimetric method and reagent used for the same |
| US8574896B2 (en) | 2001-12-28 | 2013-11-05 | Arkray, Inc. | Colorimetric method and reagent used for the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0442000B2 (ja) | 1992-07-10 |
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