JPS63216481A - カルボキシペプチダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はカルボキシペプチダーゼおよびその製造法に関
し、詳しくは７５〜８０℃に最適作用温度を示し、耐熱
性にすぐれたカルボキシペプチダーゼおよびその製造法
に関する。

〔従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕カルボ
キシペプチダーゼは微生物界、動物界。

植物界から多数分離され、それぞれの構造、性質等が詳
細に調べられている。カルボキシペプチダーゼは、その
触媒活性の発現の違いによって、セリンカルボキシペプ
チダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システィン
カルボキシペプチダーゼに分類されている。

しかし、これまでに報告されているカルボキシペプチダ
ーゼは常温生物から得られたものであり、好熱性細菌を
はじめとした好熱性生物からはまだ精製されていない、
また、細菌から分離されたメタロカルボキシペプチダー
ゼの報告は少ない。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、耐熱性にすぐれたカルボキシペプ
チダーゼを生産する好熱性細菌を探索すべく研究を重ね
た結果、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する高度好
熱性細菌が目的とする酵素を生産することを見出し、本
発明を完成した。

すなわち本発明は、ペプチドのＣ末端からアミノ酸を順
次遊離する作用を有し、７５〜８０℃に最適作用温度を
示し、かつ高い熱安定性を有するカルボキシペプチダー
ゼ並びにサーマス属に属し、該カルボキシペプチダーゼ
を生産する能力のある高度好熱性細菌を培養して該カル
ボキシペプチダーゼを製造する方法を提供するものであ
る。

本発明のカルボキシペプチダーゼは、サーマス属に属し
、該酵素生産能を有する高度好熱性細菌を栄養培地に培
養し、培養物中に該酵素を生成せしめ、これを採取する
ことよって製造することができる。

目的とするカルボキシペプチダーゼを生産する能力のあ
る微生物としては、たとえばサーマス・アクアティカス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｄ）　Ｙ　Ｔ　−１（ＡＴＣＣ２５
１０４）があり、本面のばかその自然的もしくは人工的
変異株なども該酵素生産能を有する限り本発明に使用す
ることができる。

栄養培地は、上記微生物が十分に生育し、目的とする酵
素を生産しうるものであればよく、たとえばポリペプト
ン、酵母エキス、ホエイ蛋白質等に硫酸カルシウムなど
の無機塩類等を加えたものが好適に用いられる。

培養は通常、通気攪拌培養法により行うことが好ましく
、必要に応じて消泡剤を添加する。一般に、培養は中性
付近のｐＨに調整し、４０〜８０℃の温度で１２時間〜
１０日間程度行い、カルボキシペプチダーゼを十分に生
成せしめる。この酵素は主として菌体中に蓄積される。

培養物からのカルボキシペプチダーゼの採取は適宜既知
の手法を組合せて行えばよく、その１例を示すと、培養
終了後、培養物から遠心分離などによって菌体を集め、
必要により凍結保存する。

菌体を破砕処理したのち遠心分離して得た上清液を適当
な緩衝液で透析して菌体抽出粗酵素液を得る。

次いで、粗酵素液を硫安塩析、カラムクロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、電気泳動などの酵素精製に用いられる通
常の操作を適宜組合せることによって精製されたカルボ
キシペプチダーゼを得ることができる。

次に、本発明の酵素の性質を以下に示す。なお、酵素活
性の測定は以下の方法で行った。

１）一般の合成ペプチドに対する活性の測定一般の合成
ペプチドに対する酵素活性の測定は、Ｍａｔｈｅｓｏｎ
””マＣａｎ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、、　
　４２＋　　９５＋　　１９６４）　　の方法に準じて
行い、酵素作用によって生じたアミノ酸などをニンヒド
リンと反応させて比色定置した。実際に、緩衝液に溶解
した１ｍＭの各種ペプチド溶液０．１＋ｊ！を酵素反応
温度とした後に、酵素溶液０．１　■ｉをそれぞれ加え
て一定時間反応させた後、０．１Ｍ酢酸溶液０．１ｍ＋
＃を加えて反応を停止させた０反応停止溶液に蒸留水０
．７■ｌを加えて１　ｔａｌとした後に、０．２Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐ）Ｉ　５．０）　０．５　ｔｓｌとニン
ヒドリン試薬１．２ｍＪを加え攪拌混合後、沸騰水浴中
で７．５分間加熱を行った。その後、速かに氷水中で十
分に冷却した後に、６０％エタノール２．５ｍｘで希釈
し、室温で５７０ｎｍにおける吸光値を分光光度計で測
定した。また、分析内容によっては。

酵素反応時の基質溶液、酵素溶液、蒸留水または緩衝液
の割合を変えて行った。酵素活性の単位は、ニンヒドリ
ン陽性物質をロイシン量に換算し、１８Ｍのロイシンに
相当するニンヒドリン陽性物質を生成する酵素量を１単
位（Ｕ）とした。

２）プロリン残基を含むペプチドに対する活性の測定 プロリン残基を含むペプチドに対する酵素活性の測定は
、’１ａｒｏｎとＭｌｙｎｅｒ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｓｍｕｎ、、　３２．６５８．１９６８
）の方法に準じて行液に溶解した１ｍＭの各種ペプチド
溶液０．１ｍｌを酵素反応温度とした後に、酵素溶液０
．１ｍｌをそれぞれ加えて反応を行った。反応条件は通
常ｐＨ８，５で７０℃、３０分間で行った。反応停止は
Ｏ，ｌ　Ｍ酢酸溶液０．１ｅ＋βを加えて行い、さらに
蒸留水を０．１ｔｍ１加え全体で１　ｍｌｌとした。

その後、氷酢酸２．５ｍｌとニンヒドリン試薬２．５ｍ
ｌを加えて攪拌混合してから沸騰水浴中で３０分間加熱
を行った。加熱終了後は氷水中で十分に冷却してから室
温に戻して４８０ｎｍにおける吸光値を分光光度計で測
定した。酵素活性の単位は、通常ｐＨ８，５，７，５℃
において酵素溶液ＩＩＩＩｊ！が１分間に生成するプロ
リン量を算出し、ｌｐＭのプロリンを生成する酵素量を
１単位（Ｕ）とした。

以上の２種類の方法を用いて測定し、酵素の比活性は酵
素溶液中の蛋白質ＩＩＩＩｇ当りの活性単位で表わした
。

るゲル濾過法で求めた。精製酵素および標準蛋白質の溶
出位置と分子量の関係を第１図に示した。

この結果、本酵素の分子量は６２，０００と推定された
。

２）アミノ酸組成 本酵素のトリプトファンを除いたアミノ酸分析の結果と
分子量６２．０００とした場合の計算上の残基数を第１
表に示した。構成するアミノ酸組成はＧｌｕ（ｎ）、　
Ｇｌｙ、　Ｓｅｔ、　Ａｌａの含量が比較的多くＣｙｓ
は含まなかった。

第１表 Ａｓｘ　　　　　　　　　　　６．２ Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　４．６ Ｓｅｒ　　　　　　　　　　１２．９ Ｇｌｘ　　　　　　　　　　１３．６ Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　５．４ Ｇｌｙ　　　　　　　　　　１２．６ Ａｌａ　　　　　　　　　　１１．７ Ｈａｌｆ　　Ｃｙｓ　　　　　　　Ｏ，０Ｖａｌ　　　
　　　　　　　　５．８ 第１表（続き） アミノ酸　　　　　　　含有量（モル％）Ｍｅｔ　　　
　　　　　　　　　　　Ｏ，７１ｉｅ　　　　　　　　
　　　　　　３．２Ｌ　ｅ　ｕ　　　　　　　　　　　
　　　８．７Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　１，
２Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　２．９１、　ｙ
　ｓ　　　　　　　　　　　　　　３．４Ｈｉｓ　　　
　　　　２．６ Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　４．５Ｔ　ｒ　ｐ
　　　　　　　　　　　　　　ｎ、ｄ。

合計　　　　　　１００．０ ３）最適作用ｐＨ 本酵素の最適作用ｐＨはｐｔｌ　５．　Ｏから１０．０
の範囲で、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを基質として７０℃
、３０分間の反応条件で測定した。緩衝液は室温で各ｐ
Ｈに調製した０、０５Ｍクエン酸塩緩衝液（ＰＨ５〜６
）。

０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６〜Ｂ）、０．０５Ｍ
Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ！緩衝液（ｐＨ８〜９）および０．
０５Ｍ　　Ｈｚ　Ｂ　Ｏ４’　Ｋ　ＣＩ　　Ｎ　ａ　Ｏ
Ｈ緩衝液（ｐＨ９〜１０）を使用した。結果は第２図に
示した。最適作用ｐＨよ８．０から９．０の範囲であっ
た。　ＰＨ９，５よりアルカリ性側、ｐＨ７より酸性側
では相対的活性は低下した。

４）最適作用温度 精製酵素の最適作用温度は３０℃から９５℃の温度で、
Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを基質としてｐＨ８，５０，０
５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＩＩｌ街液を用いて３０分間
の反応で測定した。結果は第３図に示した。本酵素は７
５℃から８０℃に最適作用温度を示し、８５℃では相対
的活性で約９５％、９５℃でも約８５％と非常に高温度
でも活性を有した。低い反応温度での活性は、６０℃で
は約７５％、５０℃では約５５％、３０℃では約２０％
であった。

５）熱安定性 酵素活性の熱安定性は菌体抽出粗酵素液と精製酵素で測
定した。酵素の加熱処理は、ｐＨ７，２０，０５Ｍ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液を用いて８０℃から９５℃の範
囲で２０時間行い、加熱後に残存する活性はｐＨ８，５
でＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを基質として７０℃、３０分
間の反応で測定し、それぞれの未加熱の酵素活性を基準
として相対的活性値を示した。

加熱時の蛋白質濃度は精製酵素は１０μｇ／Ｉ１１で行
い、菌体抽出粗酵素液は未加熱時に精製酵素と同じ活性
を有する濃度で行った。得られた結果を第４図に示した
。精製酵素は８０℃、２０時間の加熱で約７５％、９０
℃、２０時間の加熱でも約４０％の活性が残存した。ま
た、菌体抽出粗酵素液は精製酵素より更に高い熱安定性
を示し、８０℃、２０時間の加熱で約８５％、９０℃、
２０時間の加熱で約６５％の活性が残存した。

６）金属イオンの影響 本酵素の活性におよぼす各種金属イオンの影響を測定し
た結果を第２表に示した。各種金属イオンをそれぞれ酵
素溶液に１ｍＭとなるように加え、２５℃で３０分間放
置した後に金属イオン混在下でＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
を基質としてｐＨａ、　５で７０℃。

３０分間の反応を行った０本酵素はＣａ　”、　Ｃｏ　
”。

Ｍｇ１に対しては安定であったが、Ｚ　ｎ　２　＋によ
って殆ど活性を失った。また、Ｃｕ”、Ｆｅ”°。

Ｓｕ”°、Ｍｎ”によっである程度影響を受けた。

第２表 金属イオン（１ｍＭ）　　　　　相対活性（％）Ｃｏｎ
ｔｒｏｌ　　　　　　　１００．０ＣａＣ１ｚ　　　　
　　　　　　　９７．９ＧｏＣＩ、　　　　　　　　　
　１０６．３ＣｕＳｏａ　　　　　　　　　　　７６．
３ＭｇＣ１ｇ　　　　　　　　　　１０３．０ＦｅＳｏ
、　　　　　　　　　　　７４．５ＳｉＯ２ｇ　　　　
　　　　　　　６５．ｌＺｎＣ１ｇ　　　　　　　　　
　　１７．２ＭｎＣ１，８３，５ ７）試薬の影響 本酵素の活性におよぼす各種試薬の影響を測定した結果
を第３表に示した。酵素溶液とそれぞれの濃度の各種試
薬を混合し、２５℃で３０分間放置した後に、試薬混在
下でＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを基質としてｐＨａ、　５
で７０℃、３０分間の反応を行った。

本酵素の活性は１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　　１−１０
フエナントロリンのような金属キレート剤によって強く
阻害された。また、ＳＨ試薬であるＰ　ＣＭＨにもかな
り阻害を受けたｅ　　１　ｍ　Ｍ　Ｎ−エチルマレイミ
ド、１ｍＭ　モノヨード酢酸、１ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、０．１ｍＭシスティン、１０μＭアマスタチ
ン、１０μＭベスタチンに対して殆ど影響を受けなかっ
た。ＳＤＳに対しては０．０５％、グアニジン塩酸には
０．５Ｍでかなり強く阻害を受けた。

第３表 Ｃｏｎｔｒｏｌ　　　　　　　　−１００，０ＥＤＴＡ
”　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０
　　ｍＭ　　　　　　　　２７．８１．１Ｏ−Ｐｈｅｎ
ａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ　　　１．ＯｍＭ　　　　１４．
３ＰＣＭＢ”　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．０　−Ｍ　　　　　　　　６３．０Ｎ−ｆ！ｔ
ｈｙ１ｍａｌｅｉｓｉｄｅ　　　　１．Ｏｄ　　　　９
４．６Ｍｏｎｏｉｏｄｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　　　
１．ＯｍＭ　　　　９６．７第３表（続き） 試　　薬　　　　　　　　濃度　　　相対活性（％） ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ　　　　　１．Ｏ
ｍＭ　　　　９５．８Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　　　　　　　
　　Ｏ，１ｍＭ　　　　９１．９Ａｍａｓｔａｔｉｎ　
　　　　　　　　０．０１ｍＭ　　　１００．０Ｂｅｓ
ｔａｔｉｎ　　　　　　　　　Ｏ，０１ｄ　　　　９９
．７ＳＤＳ　”　　　　　　　　　　　０．０５χ　　
　４７．３ＰＣＭＢ；ｐ−クロルメルクリ安息香酸。

ＳＤＳ　；ドデシル硫酸ナトリウム ８）−値およびＶｍａｘ。

本酵素のｉ値およびＶｍａｘ、はＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒを基質として酵素反応温度を変えて求めた。各種濃度
酵素反応を行った後に、遊離したチロシンを日立アミノ
酸自動分析計８３５型で同定、定量した。

９０℃でそれぞれ０．０５６．０．０５７．０．０５８
゜０．０６８ｍＭであった。一方、Ｖｍａｘ、はそれぞ
れ０．４　Ｂ、　１．６４．５．４１．９．５２μＭ／
ｌｌ１ｉｎであった。反応温度によって一値は殆ど変化
しなかったが、Ｖｍａｘ、ばかなり異っており９０℃で
最も高い値を示した。

９）基質特異性 本酵素の各種基質に対する特異性を測定しＣｂｚ−Ｐｈ
ｅ−Ｔｙｒを基準とした相対的活性値を第４表に示した
。酵素反応はｐＨ８，５で７０℃３０分間行った。本酵
素はＣ末端にＰｒｏを含むＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを除
いたペプチドに対して広い（低い）特異性を示し、Ｃ末
端から２残基目にＰｒｏを持つペプチドに対しても弱い
ながら活性を示した。疎水性アミノもＣ末端から２残蟇
目のアミノ酸の種類によって活性は太き（異った。Ｃ末
端がＰｈｅで２残基目にＧｌｕを持つペプチドとＧＩｙ
を持つペプチドの活性を比較するとＧｕｙの方が高い活
性を示した。また、Ｃ末端にＴｙｒを持ち２残基目がＧ
ｌｕとＰｈｅのペプチドを比較するとＰｈｅＯ方が高い
活性を示した。

このような結果はＣｂｚ−Ｇｌｙ−ＬｅｕとＣｂｚ−（
ｙｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｃｂｚ−Ｑｌｙ−（ｒｌｙと
Ｃｂｚ−Ｑｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｑｌｙの比較でも得
られた。

第４表 ペプチド　　　　　　　　　相対活性 Ｃｂｚ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　７．５Ｃ
ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ　　　　　　　　　　３．７Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　　　　　　　　　　８３．２Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　　１８．９Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　８４．０Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　９１．０Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　　Ｏ，０Ｃｂｚ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　５７．４Ｃｂｚ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ　　　　　　　　　１００．０Ｃｂｚ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ　　　　　　　　　　３０．０Ｃｂｚ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　　　　　　　　２２．３Ｃ
ｂｚ−Ｇｌ　−Ｐｒｏ−Ｌａｕ−Ｇｌ　　　　　１２３
．９１０）ペプチドに対する加水分解作用 本酵素のＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、　
Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ、　
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇに対する加水分解作用を
測定した。酸素反応はｐＨ８，５０，１Ｍ　　ギ酸−ア
ンモニア緩衝液を用いて７０℃で行い、酵素／基質（Ｗ
／Ｗ）は各々１：３０，１：４０，１ニア０で行った。

Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙに対する作用
は最初にＧｌｙが遊離した後、Ｌｅｕは比較的ゆっくり
遊離した。そして、Ｃ末端がＰｒｏになったＣｂｚ−Ｑ
ｌｙ−Ｐｒｏに対しては作用せず、先の基質特異性の分
析結果と同じであった。Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐに対してはＣ４゜ 末端からＴｒｐ＋　Ｌｅｕと速かに遊離し、Ｌｅｕの遊
離速度はＰｒｏが同じ条件で位置する（Ｃ末端から２残
基目）先のペプチドとは異った結果を示した。

次に、Ｃ末端がＰｒｏになったＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ
−Ｐｒｏに対しても弱いながら活性を示し、このＰｒｏ
が遊離するとＭｅｔ、　Ｔｈｒと殆ど同時に遊離した。

Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇに対してはＣ末端のＡｒ
ｇから順次加水分解しく＜ｌｕ、　Ｇｉｎに対しても作
用した。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例 ポリペプトン０．４％、酵母エキス０．２％。

Ｃａ５Ｏａ・２ＨｚＯＯ，１５ｇ／’ｊ！を地下水で溶
解し、ＮａＯＨでｐＨ７，２に調整後、１２０℃で６０
分間滅菌を行ったものを栽培とした。この培地にサーマ
ス・アクアティカス　ＹＴ−１（ＡＴＣＣ２５１０４）
を接種し、７５℃で２４時間振盪培養を行った。

次いで、３１容ジャーファーメンタ−に上記と同じ組成
の培地１１を入れて滅菌したのち前培養液を２％の割合
で接種し、２５０ｒｐｍ、　１．　ＯＶＶＭ。

０．５ｋｇ／−にて７５℃で２４時間第２次前培養を行
った。

本培養は、ポリペプトン０．８％、酵母エキス０．４％
、ＣａＳＯ４”２ＨｚＯＯ，１５ｇ／ｘ。

ホエイ蛋白質０．４％を地下水で溶解し、前培地と同様
にｐＨ調整、滅菌した培地を用い、第２次培養液を４％
接種し、６５℃で定常期になるまで培養を行った。なお
、第２次前培養２本培養では必要に応じて消泡剤（Ａｄ
ｅｃａｎｏｌ　ＬＧ１２６）を添加した。

培養後菌体は遠心分離で常法にもとづいて集菌した。

次いで、菌体を０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（
ｐ）１７．２）に懸１（１０％■ハ）した後に、強力超
音波振盪器（ブラソフ・ン社、モデル２００１００Ｖ　
　２０ＫＨｚ）を用いて最大出力で１０分間超音波処理
を行い、菌体を破砕した。この時の試料の温度は１０℃
以下で行った。その後、菌体の破片を遠心分離（３５，
ＯＯＯｘｇ２０分間）で除去し、得られた上清液を同上
緩衝液で十分に透析して菌体抽出粗酵素液とした。

次いで、以下の方法により酵素を精製した。

ｌ）硫酸アルモニウムによる塩析 菌体抽出粗酵素液５０＋＊ｌに硫酸アンモニウム２８．
０５ｇを加えて８０％飽和となるようにし、３０分間放
置した後、遠心分離（１０，ＯＯＯＸｇ３０分間）を行
う、得られた沈澱物は０．０５Ｍ５Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ
　１１衝液（ｐＨ７，２）で溶解し、同緩衝液で十分に
透析した後に、硫酸アンモニウム沈澱酵素画分とする。

２）ＤＥＡＥセファセルクロマトグラフィー８０％硫酸
アンモニウム沈澱酵素画分７０１１を予め０．０５Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化したＤ
ＥＡＥセファセルカラム（２，４Ｘ２４Ｇ）に吸着させ
る。カラムを同緩衝液で洗浄してから、ＯＭ　〜０．５
　Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｊりの直線的濃度匂配とな
る条件で同緩衝液１０１００Ｏを用いて溶出する。溶出
速度は４０ｔｓｌｌ／時間で行い、溶出液はｌ百分１０
ｍｆｆ１づつ分取する。

分画した各両分蛋白ｆｔ量（２８０ｍの吸光値）および
カルボベンゾキシ（Ｃｂｚ）−Ｐｈｅ−Ｔｙｒに対する
加水分解活性を測定し、カルボキシベブチグーゼ活性を
含む溶出画分患２４〜５４を集め、０．０５ＭＴｒｉｓ
　−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，２）で透析を行った後に、
ＤＥＡＥセファセルクロマトグラフィー酵素画分とする
。

３）フェニルセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィ フェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（１，２Ｘ２０
（Ｊ）を予めＩＭＮａＣＪを含んだ０．０５Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！ｌｉｌ衝液（ｐＨ７，２）で平衡化を行っ
た。先の酵素溶液３００ｍ／は同緩衝液でＩＭ　ＮａＣ
１とした後にカラムに吸着させた。その後、ＩＭ〜０．
０５Ｍ　ＮａＣ１の直線的濃度匂配となる条件で０．０
５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１＠衝液（ｐＨ７，２）　　７０
０　　ｍ＃、　　０．０５Ｍ〜ＯＭ　　Ｎａ　Ｃ１の条
件で同緩衝液２００　ｍｌ、ＮａＣ１を含まない同緩衝
液１００　ｍｌ、　　０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（ｐＨ９，０）　　１００　ｔａｌ、蒸留水１００
ｍ１゜更にエタノール１００ｍ１で順次溶出を行う、溶
出速度は２０ｓ＋４！／時間で行い、溶出液は１百分５
■ｌづつ分取する０分画した各両分の蛋白質量（２８０
Ｍの吸光値）およびＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒに対する加
水分解活性を測定し、カルボキシベブチグーゼ活性を含
む溶出画分１１ｋＬ３８〜１６０を集め、０．０５Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＩＩｌ衝液（ｐＨ７，２）で透析を繰
り返した後にフェニルセファロースＣＬ−４Ｂクロマト
グラフィ酵素画分とする。

４）セファデックスＧ−２００ゲルクロマトグラフイ先
の酵素溶液６１０懺ｌはコロジオンバックで濃縮した後
に、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｇ衝液（ｐＨ７，２
）で平衡化し、最終的に３　ａｌｌまで濃縮を行う、濃
縮試料は、予め同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ
−２００カラム（２Ｘ７０ｃｍ）にのせ、同緩衝液で溶
出を行う、溶出速度は５ａ＋ｊ！／時間で行い、溶出液
は１両分２．５＋ｍｉづつ分取する０分画した各両分の
蛋白質量（２８０ｍ＋の吸光値）およびＣｂｚ−Ｐｈｅ
−Ｔｙｒに対する加水分解活性を測定し、カルボキシベ
ブチグーゼ活性を含む溶出画分−４８〜７４を集め、セ
ファデックスＧ−２００クロマトグラフィ酵素画分とす
る。

５）ＤＥＡＥセファセルによる再りロマトグラフィ先の
ゲル濾過による精製で得た酵素溶液６５ｎｊ！を、予め
０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！緩衝液（ｐｎ　７．２
　）で平衡化したＤＥＡＥセファセルカラム（１，７Ｘ
　２０ｃｍ）に吸着させる。同緩衝液で洗浄してから、
ＯＭｔａｇ／時間で行い、溶出液は１画分５　ｔａｌｌ
づつ分取ヅする。溶出した各百分の蛋白質！（２８Ｑ＋
ｍの吸光値）およびＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒに対する加
水分解活性を測定する。酵素の活性は１回目のＤＥ／ｌ
セファセルによる精製工程でも認められたように今回も
活性の主ピークの前部分で活性が肩のように広がって分
画されたため、カルボキシペプチダーゼ活性を含む溶出
画分を２画分に分けて集め、最初に活性が肩の溶出した
両分魚３３〜４８をＤＥＡＥセファセル再クロマりグラ
フィ酵素画分■とする。それぞれの酵素画分は０．０５
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！緩衝液（ｐＨ７，２）で透析を
行う。ここで得られた比活性は酵素画分Ｉは３２５．５
Ｕ／■、酵素画分■は７１２．２Ｕ／■であった・ ６）ディスク電気泳動ゲル抽出 先のＤＥＡＥセファセル再クロマトグラフィで精泳動は
７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてｐＨ８，０で
行ν４、濃縮した酵素画分Ｉ、■はカラム１本当り蛋白
質量で２２０μｇづつのせ、１本当り３ｍＡの定電流で
約２時間電気泳動を行う。泳動後、酵素画分１．ｎの１
本は染色し、他のゲルは２鶴毎にスライスして各々の両
分を１　ｖｇｌｔの０．０５ＭＴｒｉｓ　−ＨＣ１２１
％衝液（ｐｉ（７，２）に浸し、破砕して酵素を抽出す
る。酵素画分Ｉ、■の染色したゲルの吸光値５５０鰭の
デンシトメーターによるパターンと、分画した各画分の
Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒに対する加水分解活性を測定し
た結果、ＤＥＡＥセファセル再クロマトグラフィで得た
酵素画分１．ＩＩをディスク電気泳動ゲル抽出で精製し
たカルボキシペプチダーゼ活性のパターンは同じであっ
た。ディスク電気泳動上のカルボキシペプチダーゼ活性
は、相対的移動度約０．３５の位置に主な活性ピークを
示し、それより移動度の低い部分全体にも弱い活性が認
められた。以後は、先のＤＥＡＥセファセル再クロマト
グラフィによる精製工程で高い比活性の有した酵素画分
■でディスク電気泳動による相対的移動度０．３５の主
活性ピークの部分を精製することとし、このカルボキシ
ペプチダーゼ活性画分を集めてディスク電気泳動酵素画
分とした。

７）ディスク電気泳動による再ゲル抽出酵素溶液■のデ
ィスク電気泳動による主な活性画分溶液をコロジオンバ
ックで濃縮し、先と同じ方法で再度ディスク電気泳動で
ゲル抽出を行い、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒに対する加水
分解活性を含む両分を集めて０．０：Ｍ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，２）で透析を行った後に、精製
酵素溶液とする。

以上の精製工程における結果を第５表に要約する。

精製酵素はＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを基質として菌体抽
出粗酵素液と比較すると、比活性で４１２．５倍に精製
され、活性の収率は２１．６％であった。

〔発明の効果〕

本発明のカルボキシペプチダーゼは最適作用温度が７５
〜８０℃であり、高温下での熱安定性も優れている。こ
のように高い耐熱性とペプチドのＣ末端からアミノ酸を
順次遊離する真のカルボキシダーゼ作用を有するので、
本酵素は酵素の構造や機能の研究９分析用試薬１食品工
業への応用など幅広い利用が期待される。

また、本酵素は好熱性細菌を用いて効率よく製造するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素および標準蛋白質の溶出位置と分
子量の関係を示すグラフであり、図中のＡはキモトリプ
シン（分子量２５．０００）、Ｂはオボアルブミン（分
子量４３．０００）　、　Ｃは牛血清アルブミン（分子
量６７．０００）　、　　Ｄはアルドラーゼ（分子１１
６０．０００）　、　　Ｅは本発明の酵素を示す、第２
図はｐｉと酵素の残存活性の関係を示すグラフであり、
ｐＨ５〜６はクエン酸ナトリウム、ｐＨ６〜８はリン酸
ナトリウム、ｐＨ８〜９はトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９〜ｌ
Ｏはホウ酸ナトリウムの各緩衝液（０，０５Ｍ）を用い
た。第３図は温度と酵素の相対活性の関係を示すグラフ
、第４図は温度と酵素の残存活性を示すグラフ、第５図
は本発明の酵素のｌｖ値とＶｍａχ、を示すグラフであ
り、３０℃（黒丸）、５０℃（四角）。 ７０℃（白丸）または９０℃（三角）でｐＨ８，５にて
３０分間インキエベートしたときの結果を示している。 残存活性（％） 第４図 温度（°Ｃ） ｌ／Ｓ　　ｍＭ　Ｘ　１０−”

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペプチドのＣ末端からアミノ酸を順次遊離する作
   用を有し、７５〜８０℃に最適作用温度を示し、かつ高
   い熱安定性を有するカルボキシペプチダーゼ。
2. （２）サーマス属に属し、ペプチドのＣ末端からアミノ
   酸を順次遊離する作用を有し、７５〜８０℃に最適作用
   温度を示し、かつ高い熱安定性を有するカルボキシペプ
   チダーゼを生産する能力のある高度好熱性細菌を栄養培
   地に培養し、培養物中に該カルボキシペプチダーゼを生
   成せしめ、これを採取することを特徴とするカルボキシ
   ペプチダーゼの製造法。
3. （３）サーマス属に属するカルボキシペプチダーゼ生産
   能を有する高度好熱性細菌が、サーマス・アクアティカ
   ス　ＹＴ−１（ＡＴＣＣ　２５１０４）である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。