JPS6322193A - Ｌ−リンゴ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規好熱性７マラーゼ、その製造法および該酵
素を生産する能力を有する微生物ならびに該酵素を利用
するＬＩＪンゴ数の製造法に関する。

Ｌ−リンゴ酸は輸液の成分として利用され、また清涼飲
料水の酸味料としての用途も広がシつつある重要な物質
である。現在Ｌ−リンゴ酸の製造法としてはマルイン酸
よシ化学的に得られるＤＬ−リンゴ酸の光学分割法、微
生物出来のフマラーゼを利用する方法、微生物の直接発
酵による方法などがあるが、微生物由来のフマラーゼを
利用する方法が実用的である。微生物由来の７マラーゼ
を利用した例としては、北原等による乳酸菌ラクトバチ
ルス・プレビスを７マール酸カルシウムに作用させＬ−
リンゴ酸カルシウムとして析出させる方法（特公昭３７
−４ｃＪＩ／’）、酵母を用いフマール酸から酵素的Ｋ
　Ｌ　−ＩＪンゴ酸を製造する方法（Ｗ開開！コーｔＪ
ｏｚｒｙ）およびブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
スを用いフマール酸から酵素的にＬ−リンゴ酸を製造す
る方法（ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・アプライド
・ミクロバイオロジー、第３巻、ｌぶり頁、ｌり７を年
）などが知られている。特公昭３７−≠ｊ／ｌ記載の方
法は、石膏の副生および増殖不良などの欠点があシ、後
二者は酵素反応を常温で行うので実用上難点がある。

発酵操作、酵素反応などを高０！余件で行なえることは
、雑菌汚染防止、酵素反応の迅速性、冷却エネルギーの
節約などの点から極めて有利である。

本発明者らは、熱安定なフマラーゼを得る目的で槙々の
好熱性細菌についてフマラーゼ活性を調べた結果、サー
マス属およびバチルスＭＫ属する高度好熱性細菌が好熱
性の７マラーゼ活性を有することを見出し本発明を完成
するに到った。

従って本発明は、新規好熱性フマラーゼ、その製造法お
よび該酵素を生産する能力を有する微生物ならびに該ひ
素を利用するＩ、　　＋Ｊンゴ酸の製造法に関し、以下
にその詳細を説明する。

本発明に係る高度好熱性フマラーゼは、該酵素を生産す
る能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に
該＃素を蓄積せしめ、該培養物から該酵素を採取するこ
とによって製造することができる。

本発明で使用する微生物は高度好熱性７マラーゼを生産
する能力を有するものならいかなる菌株を用いてもよい
が、具体的にはサーマス属またはバチルス属に属する菌
株、例えばサーマ）ＴＣＣＪ／！、ｊｌ）、サーマス・
ラフチフス・ＡＴＣＣＪ／！！７’）、サーマス・ルー
ベンス・ムＴＣＣ！／！！≦）、サーマス・アクアティ
クスＡＴＣＣλｊ　／　０４’、サーマス・アクアティ
クスムＴＣＣ２！１０！、サーマス・サーモフィルス（
Ｔｈｅｒｍｕａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ムＴＣＣ
２７ｔＪ４／−１！ｌ！／号、ＩＪＲＲＬ　　Ｂ−／２
０２≠）、バチルＢ−／２０λり、バチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ａ　Ｔ　
ＣＣＡ　Ｏｊ　／　、バチルス・リケニホルミスｈＴｃ
ｃｔ／！ＡＯ，バチルスφステアロサーモフィラス（Ｅ
ａｃｉｌｌｕｓｓｔｓａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）ムＴＣＣ／２０／Ａ、バチルス−コアギユランス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕ−１ａｎｓ）ＡＴＣＣ７０
ｊＯなどがあげられる。

上記微生物の菌学的性質については下記文献にそれぞれ
記載がある。

サーマ、；ｔ、　−７クアテイク、ｘ、　　　Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　　　　。

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌ
ｏｇｙ　ｊｇ　Ｉｒ版２１３頁サすマス１サーモフィル
ス　特開昭！／−１１３９１１号公報 バチルス・リケニホルミス　　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃ
ｔｅ−ｒｉＯ１０ｇｙ第ｒ版、！３４を頁 バチルスψフミルス　　同上、！３３〜！Ｊ≠頁しくチ
ル２・ズブチリス　同上、ＪＪＩ　Ｐ−ＪＪＪ頁ノシリ
シス・ステアロサーモフィクス　　同上、！３Ｙ〜！４
ＬＯ頁バチルス・コアギュラシス　　同上、！弘Ｏ−よ
≠１頁尚、本発明者らが分離したサーマス・アクアブ・
エスピーＡ４１０２の菌学的性質および同定の根拠につ
いて以下に示す。

上述の菌学的性質をもとにして、パージ−〇マニュアル
・オブ・デターミナテイプ・バクテリオロジー第ｒ版お
よびジャーナル・オプ・バクテリオロラー２２巻−ｒタ
ーλり７頁（／りｔり）、インターナショナル・ジャー
ナル・オプ・システマテイツク・バクテリオロジーλ≠
巻１０２−　／’／コ頁（ｌり７４Ａ）、同２ｊ巻３７
７−ｊＪ弘頁（／り７ｊ）、アグリカルチエラル・バイ
オロジカルケミストリーＪｊ巻コ３ｊ７−２Ｊｔｔ頁を
参考にして、公知の菌株とその異同を検討した。

上記の３菌株は、ダラム陰性、無胞子、非運動性、好気
性の桿菌ないし糸状桿菌で、生育至適温度ｔｏ″Ｃ以上
の偏性好熱菌であるところから、サーマスＢ４に属する
ものと考えられる。

／１６ｉｏ弘菌は、同定実験に際し対照菌として使用し
た丈−マス・アクアティクスの標準味についての実験結
果あるいは、前記報文中の記載とほぼ完全に一致するの
で、サーマス・アクアティクスと同定した。／１６ｉｏ
ｒ菌株は、（１）コロニーがクリーム色であること　（
２）ガラクトース、２クトーズ、グリセロールからの酸
生成が異なること　（３）グルタミン酸の要求性がない
点からサーマス・アクアティクスと区別でき、新種と見
なし、サーマス・ラフテラス・ノブ・エスピーと命名し
た。７に１０２菌は、（１）コｏニーが赤橙色であるこ
と　（２）生育至適温度が低いこと（３）至適ｐＨが低
いこと　（４）グリセロール、マニトールからの酸生成
が異なる点からサーマス・アクアティクスと区別でき、
新種と見なし、サーマス・ルーベンス・ノブ・ニスヒー
ト命名した。

これらの菌株の培養について述べる。これらの菌株の培
養においては通常の好熱性細菌の培養法が一般に用いら
れる。

炭素源トＬ、てはシュークロース、マンノース、澱粉、
糖蜜、グリセリン、マニトール等の糖質および糖アルコ
ールが単独または組合せて用いられる。また菌の資化性
によっては炭化水素、アルコール類、有機酸等も用いう
る。盆素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等の無機金索
源、あるいはポリペプトン、ベグトン、イーストエキス
、コーン・ステープ・リカー、アミノ酸等の有機ｇ素像
を単独または組合せて用いる仁とができる。

また７マ一ル酸等有機酸やＭｎ４）、ＣＯ代Ｍｇ＋％Ｍ
Ｏ拝を含む各日塩の添加によシ菌の生育や酵素の生産が
促進される。培゛養法としては液体培養法が適している
。培養温度はｔｏ−ｔｒｏ℃でｐＨは中性付近で培養を
行なうことが望ましい。

培養終了後、培養液よシ好熱性フマラーゼを採取するに
は一般の酵素採取法を用いることができ、本酵素は菌体
内酵素であるため、例えば次のような方法で単離するこ
とができる。

まず得られた菌体をｚｏｉ７を程度の濃度でタイノーミ
ル（シンミルエンタープライス）ＦＣかけ無細胞抽出液
を得る。これを≠θ〜７０％の硫酸アンモニウムで２１
時間塩析する。緩衝液は０．７　Ｍ　）　ＩＪス・塩酸
液を使用する。

次に、ＤＥＡＥ・セファデックスＧ−２ｔ（生化学工業
社製）カラムに吸着させ０−０．ＡＭ食塩水で濃度勾配
に溶出させ活性区分を集める。

次にこの両分を硫酸アンモニウム７ｏチ飽和にし、生じ
た沈澱を集めてｐＨ約ム！のリン酸緩衝液で透析する。

さらにＤＥＡＥ・セルロース（生化学工業社製）、ＤＥ
ＡＥ・セファデックスＧ−７７（生化学工業社製）、最
後にハイドロキシ・アパタト（゛生化学工業社製）に吸
着・溶出させて本ｒ！ｌ素を得る。

本屏素の活性の測定は次のように行う。

０、　／　Ｍフマール酸ナトリウムと本酵素、菌体また
は菌体処理物とを（ＤＣｗ換ｇ１０ｉｙｌ　）接触させ
、ｐ　Ｈ７，０、温度４ＡＯ〜７０”Ｃで３゜分間反応
を行う。反応液をＩ、Ｊンゴ酸としてｔ−ｔｏγ程度に
なるように稀釈する。

稀釈液１１１ｔｔ−採取し、これに濃硫散ｊａ（を加え
て十分に攪拌後、λ７−ナフタレンジオール（／　！ｉ
／ｌ　００１１−１ｌｋ硫酸）　０．　／　ｘｉを加え
て沸とう水中に２０分間浸漬する。

これを冷却後３りＯｎｍでの吸収値よ＃）′Ｌ−リンゴ
酸量を算出し、この値から酵素活性を算出する。その他
高速液体クロマトグラフィー法、マリツクエンザイム法
、過マンガン酸カリウムによる７マール酸の定量法等が
使用可能である。

いずれの場合も酵素活性は国際単位（ｕｎｉｔ／ｙ−ｍ
ｉ→で表示する。

次に得られた酵素の性質について述べる。サーマス属、
バチルスＭ’によシ生産される酵素は若干性質に差があ
るので、別々に記載する。

サーマス属菌（サーマス・アクアティク７Ｊ６１０’１
より得た＃索を代表として示す） （１）作用および基質特異性 フマール酸およびＬ−リンゴ酸にのみ作用し、Ｌ−リン
ゴ酸からフマール酸および水を生成する反応およびその
逆反応を触媒する。　　　　］（２）至適ｐＨ Ｏ，ＪＭリンｆｌｌ緩衝液（ｐＨＪ−ｒ）、ｏ、、２Ｍ
トリス・塩酸緩衝液（ｐａｒ−Ｐ）中での活性をぶＯ℃
７０分間処理にて測定した。結果は第１図に示す通シで
あって、ＰＨ７，２付近に至適ｐｌ（がある。一般に動
物起源、および常温菌産生の７マラーゼはアルカリ側に
至適ｐＨがあるが、好熱性７マラーゼは一般的に中性か
あるいは若干酸性側に至適ｐＨを有している。

（３）安定ｐＨ範囲 ０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ−ｔｒ　−、ｒ、　ｏ　
）、ｏ、２Ｍトリス−塩ｅｇｉａ液（ｐ　Ｉ（ｒ、　ｏ
　−ｙ、　ｏ　）　中、ｔｏ℃、７７時間処理し、７Ｍ
７マール酸ナトリウム（′ｐＨ７２）を添加しＡｏ’ｃ
、３０分反応して活性を測定した。結果は第１図に示す
通シである。ｐＨｊｒ、　０でバッファーにょシ活性に
約２倍の差が生じたが図のようにｐＨ！ｊ−７７４では
相対的に安定と思われる。

：４）作用適温の範囲 ！０−ｒＪ’ｃの範囲でＰＨ７，２で１０分間反応した
。結果は第３図の通シであシ、７０Ｃ付近に至適温度が
ある。

（５）Ｋ度安定性 本酵素を０−　／　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ１１７．２
）中ｊ　Ｏ−ｒ　□’ＣＫＪ　Ｏ−７２０分間処浬した
後／Ｍフマール酸ナトリウムを加えてｔｏ℃、ＩＯ分間
反応して活性を測定した。結果は第ダ図に示す通シであ
る。ぶＯ′Ｃまでは１００チ安定である。

（６）阻害、活性化および安定化 本酵素はある種の、１価の金属イオンにて若干の活性化
を示す。その順序はＣＯ″）　Ｚｎ＋）Ｍｇ＋であＪ、
Ｃｕ＋は若干の阻害作用を示す。〇−７エナンスロリン
、α、α１−ジピリジルなどの金属キレート試薬によ）
阻害を受ける。

（７）分子量 内部標準蛋白としてチトクローム−Ｃ，オバルプミン、
ｒ−グロブリンを使用してセファデックスＧ−２００に
よるゲル濾過を行った結果、分子量は約Ｉｔ万であった
。

（８）、アミノ酸組成： リ　　　　ジ　　　　ン　　：　　　　　６．００アル
ギニン　：　　５．８０ ヒスチジン　：　　１．５６ アスパラギン酸　：　　　７．８０ ア　　ラ　　ニ　　ン　　：　　　　１２．４０スレオ
ニン　：　　５．０６ セ　　　　リ　　　　ン　　：　　　　　４．８０グル
タミン酸　：　　１２．２０ ブ　　ロ　　　リ　　　ン　　　＋　　　　　　６．６
０グ　　リ　　シ　　ン　　：　　　　１０，１０バ　
　　　リ　　　　ン　　：　　　　　６．７０メチオニ
ン　二　〇 イソロイシン　：　　　３．６０ ロ　　イ　′　シ　　ン　　：　　　　１０．６０チ　
　ロ　　シ　　ン　　：　　　　　２．５０フェニルア
゛ラニン：　　　４．２０ トリプトフアン　：　微量のため測定できない シ　　ス　　チ　　ン　　二　　　〇 （９〕　　蛋白変性温度（Ｔｍ値）＝　９０℃／＜チル
スＲＷｉ＜バチルス・リケニホルミスＴ−！／ｌよシ得
た酵素を代表として示す）（１）作用および基質特異性
　　　　　　　　　　（フマール酸およびＬ−リンゴｒ
ＲＩＣのみ作用し、Ｌ−リンゴ酸から７マール酸および
水を生成する反応およびその逆反応を触媒する。

（２）至適ｐｇ 本酵素を０＃Ｍ酢酸緩衝液（ｐａｊ−ムよ）、ｏ、　２
Ｍ！ｊＶｍｍ衝液（ｐＨ＆ｊ　〜ｒ、Ｊ−）、０．２１
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ　ｎ　ｒ、　ｒ〜／　ｏ、　
ｏ　）中での活性をｊθ℃３０分間処理にて測定した。

結果は第５図に示す通シであって、ｐＨ７０付近に至適
ｐＨを有する。

（３）安定ｐＨ範囲 上記の緩衝液中ｊＯ℃でｐＨ範囲よ０〜ｉｏ、。

にて７２時間°処理後、ｔｏ℃、ｐＨ７，０で活性を測
定した。結果は第を図に示す通υで、安定ｐＨ範囲はｐ
　Ｈ７，０−７：　ｒで安定である。

（４）作用適温の範囲 ＜ｚｏ−１ｒｏ℃の範囲でｐ　１１　ｚＯで７０分間反
応した。結果は第７図に示す通シであ汎！Ｏ〜ｔ０℃に
至適温度がある。

５）温度安定性 酵素液を４Ａｏ　〜ｔｏ℃にｐ　Ｈ７，０で３０〜／、
２０分間処理した後／Ｍフマール酸ナトリウムを添加し
てＺＯ℃、ｉｏ分間反応して活性を測定した。Ｍｒ図に
示すよりにＪＯ’Ｃまではｉｏ。

多安定である。

、６）゛阻害、活性化および安定化 本酵素はｃｏ＋）、Ｚｎ＋、Ｍｇ什、ＭＯＪ＋等の１価
の金属イオンにて若干の活性化を示す。基質であるフマ
ール酸塩の存在で安定化作用が認められている。Ｃ−お
よび０−７エナンスロリン、α、α１−ジピリジルなど
の金属キレート試薬は若干の阻害作用を示す。

（力分子量。

内部標準蛋白としてチトクローム０１オノくルブミン、
γ−グロブリンを使用してセファデック２Ｇ−，２００
によるゲル濾過を行った結果、分子量は約／ｒ万であっ
た。

本酵素、本酵素を含有する菌体または該菌体の処理物を
フマー／ｌ／酸に作用させることによつてＬ−リンゴ酸
を製造することができる。反応は通常４ｔｏ−、ｒｏ℃
、ｐＨｔ、ｏ−ｒ、ｏテ行う。

反応に際してのフマール酸濃度は０．λ〜／、７モル程
度が造画である。また酵素濃度はｔ−ｒ。

ｕｎｉｔｓ　／ｍ程度が適当である。

反応に際してフマール酸は通常塩として用いる。用いら
れる塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウ
ム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などがあげられる。従来
のフマラーゼを用いる場合は、溶解”度の関係から１価
の金属塩の使用に限られていたが、本発明の耐熱性フマ
ラーゼの使用により２価の金属塩の使用も可能になり、
Ｌ−リンゴ酸への転換率が著しく向上した。

反応に際してＦｉ酵素、菌体、菌体処理物を固定化して
用いるとよシ興用的にＬ−リンゴ酸を製造することがで
きる。これらの固定化は酵素、菌体等の固定化に用いら
れる一般的方法によシ行うことができる。たとえば、酵
素液はフマラーゼを吸着しうる一般的な陰イオン交換樹
脂と接触させればよく、菌体の固定化には、エチルセル
ロース、酢酸・酪酸セルロース等によるマイクロカプセ
ル化、アクリルアミド系単量体によるゲル包括、ポリビ
ニールアルコールによる包括、コラーゲンによる膜状包
括等が用いられる。また単に菌体を充填混合剤と混合し
、架橋剤等で処理する方法、たとえばゼラチン・ゲルタ
ールアルデヒド法、キトサン・ゲルタールアルデヒド法
、カラゲ一二ン・ゲルタールアルデヒド法、アルブミン
・ジアルデヒドデンプン法などが利用できる。

反応液からのＸ、９ンゴ酸の採取は反応液を常法によシ
イオン交換樹脂、活性炭処理を行った後、濃縮、晶析す
るととによシ得ることができる。

実施例Ａ ポリペプトンｏ、ｒｌ／／ｄ１１イーストｘ　キス０．
４１ｇ７ｃｕ、塩化ナトリウム０．−ｇ７ｔｕの組成を
有しｐＨ７，０ＶＣ調整した培地ＪＯ１ｄを含む３００
−容量フラスコにサーマス・アクアティクス屑ｌＯμ菌
、サーマス・ラフテラス・ノブ・エスピー／１６Ｉ　Ｏ
ｒ菌、　’ｔｊ−マス・ルーベンス・ノブ・エスピー＊
ｉｏλ菌、サーｉス・アクアティクスＡＴＣＣコｓｉｏ
≠、ＡＴＣＣ２７１０Ｊ、ナーマス・サーモフィルスＡ
ＴＣＣコアＪＪグを接種し、ｔｏ−ｔｏ℃にてｌｔ時間
振とう培養する。次にこの培養物全量を同組成の培地Ｊ
　００ｎｔヲ含ムコｌ容量バツフル付フラスコに植菌し
同温度で４λ時間振どう培養する。この培養液をさらに
同組成の培地３ノを含むｊＩ！容量ジャーファーメンタ
−に植菌して３０〜１０℃、通気量０．ｒｖ、７６ｍ１
．攪拌Ｊ　００　ｒ、ｐ、ｍ、Ｉｔｃｃλ弘時間培養し
た結果第２表に示す量の菌体が得られた。得られた菌体
を７０．０００　Ｇにて遠心分離を行ない、２度洗浄を
繰シ返した後、凍結乾燥した。この乾燥菌体を１モルの
７マール酸ナトリウムと接触させ１０〜１０℃、３０分
反応し生成するＬ−リンゴ酸より７マラーゼ活性を測定
したところ第２表に示す如き結果であった。

第２表 実施例よ 実施例１と同・様の培地に７マール酸を（、コＶ”　添
加り、テｆ−マス＠ルーベンス・ノブ・エスピー１６１
０２菌をぶ０℃で１≠時間培養した。

フマラーゼ活性を測定したところり０（：１ｕｎｉｔ／
７７　、　ｃｅｌｌの菌体が得られた。この菌体を凍結
乾燥し、この凍結乾燥菌体を用いて固定化微生物を作成
した。分散媒としての水ｔ００ｘｔに分散剤としてエマ
ルゲンータｒｒ（化工アトラス社製）をＺλ１１セロゲ
ン−１’Ｒ（第一工業製薬社製）をＪｉ溶解し、強攪拌
下ｊ−７０℃に冷却しておく。一方凍結乾燥菌体／Ｊ−
１をＯ，タチ生理食塩水３０１１と菌体凝桑剤である／
％キトサン水／よ４Ｆｃ均一に懸濁しておく。酢酸・酪
酸セルロース３ｒ／−一〇（イーストマン・ケミカルイ
ンターナショナルＬｔｄ製）ｉｔｓと分散剤としてアル
ラセル−１３（化工アトラス社！Ａ）！！／をＩＪ！ｉ
の酢酸インブチルに溶かしたものを十分に攪拌し、均一
なＷ１０エマルジョンとする＝この菌体懸濁液と酢酸・
酪酸セルロースによるＷ　／　０エマルジヨンを先の冷
却授拌中の分散媒にロートを用いて滴下し、滴下後ｎ−
ヘキサン／２００ｎｔを徐々に定量ポンプで添加する。

その結果、酢酸・酪酸セルロース内に菌体が包括恣れた
、強固で均一な粒径の固定化微生物が液中に析出する。

これを戸布等で戸取し、十分に洗浄して反応に使用する
。

得られた固定化微生物を用いて７Ｍ−フマール酸ナトリ
ウムからＬ−リンゴ酸への転換を２０℃、流速Ｓ　Ｖ　
＝０．　ｊにて連続カラム運転によって行ったところ、
７５％以上の転換率でＬ−リンゴ酸の生産が／ケ月以上
可能であった。

さらに常温では使用しがたいフマール酸マグネシウムも
一モルの濃度で４０℃では可溶であシ、これを用いたと
ころｒｚａ）以上の転換率で安定したＬ−リンゴ酸マグ
ネシウムが得られた。これどよシ常温で使用し難いマグ
ネシウム塩を用いたことによシ反応率がｉ。

チ以上上昇し未反応フマール酸の回収工程も縮少されａ
製工程も簡略された。

実施例３゜ サーマス・ア２アティクスＡｌＯ４を菌を実施例／の培
地にフマール酸アンモニウム。、λｌ／ｄｌ添加した培
地中、７０℃で３を時間培養したところ２００　ｕｎｉ
ｔ／！１−ｃｅｌｌの７マラーゼ活性を有する菌体Ｊ！
ｉ／ｌが得られた。

°菌体を十分洗浄してから凍結乾燥し、この凍結乾燥菌
体を１０１／／ｌの濃度で超音波処理し粗Ｔｎ素液を調
製した。

この粗醪素液を防イオン交換樹脂である吸着担体に接触
させ固定化酵素を作成した。

まずデュオライドーム７（米国ダイヤモンドジャムロッ
クケミカル社製）をレジン水にて十分に洗浄してから０
．　／　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ五ので緩衝化する。

これに上記で調製した粗溝素液を活性値として１００−
２００　ｕｎｉｔ廓樹脂の割で、Ｊｊ〜７！℃゛で負荷
し、／ｊ時間吸着固定化させる。蛋白吸着量はりＯチ以
上であった。

その後酪素の安定化剤としてｏ、／％フマール酸ナトリ
ウム、架橋剤として０．コチグルタールアルデヒドを０
．　／チリン酸緩衝液に溶かしたものを３０分間反応さ
せ、十分洗浄して固定化酵素とした。この固定化酵素を
ｊＯ１Ｌｔ谷量のコーンタイプ流動層に３０耐充填して
／Ｍフマール酸ナトリウムからＬ−リンゴ酸への転換を
連続カラム運転によって行ったところ、日ｖ　＝　０．
＃　。

７０℃で約コＯ日間の間、転換率ｔｏ％でＬ　−リンゴ
酸の連続生産が可能であった。反応液は完全清澄液であ
シ、ひ素の洩れもなく、また高温操作の為、雑菌汚染も
なく非常に効率よいＬ−リンゴ酸の生産が可能であった
。

実施例″　　　　　　　　　　　　　５７０．菌す−マ
ス・ラフテラス・ノブ・エスピーを実Δ 施例３と同様の培地で７０℃でλ≠時間培養したところ
Ｊ　ＯＱ　ｕｎｉｔ／！１−ｃｅｌｌの７マラーゼ活性
の菌体が得られた。

得られた菌体をコ′ラーゲン・フィブリル液と十分に混
合してテフロンシート上にキャスティングして固定化微
生物とした。この固定化微生物をチップ状に細断してカ
ラムに充填して／Ｍフマール酸マグネシグムをＳ　Ｖ　
＝　Ｏ，よで通液したところ２０％以上の転換率でＩＯ
日間以上安定したＬ−リンゴ酸の生成が確認された。

高速液体クロマトグラフィー５ｈｏｄｅｘ工ｏｎｐａｋ
Ｃ−１１／（昭和電工社製）で反応液を分析したところ
、Ｌ−リンゴ酸と７マール酸のみが検出され、他の不純
物は皆無であった。

実施例よ １／−２濃Ｒのブイヨン培地にて活性化スラントトシた
バチルス・リケニホルミスＴ−！／／菌、バチルス・フ
ミルスＴ−に３０″ｔ！１１バチルス・ズブチリス人Ｔ
ＣＣ１Ｏｊ／＞よびバチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ
／／！ｔＯをｙｔ！’）ペプトンμｒｇ７ｔｔ、イース
ト・エキスｏ、　ｐ　ｇ７ｃｕ、食塩０．．２ｆｌ／ｄ
ｉの組成を有し、ｐＨ７ＯにＨ整した培地ＪＯＩＬＩを
含′むＪＯＯＭＩ容量フラスコに接槌しＮ３表に示す温
度でコ≠時間培養する。

次にこの培養物全量をグルコースＪｌ／ｄｌ、ペプトン
／：ｌ／ｄｌ、イース）　ｘ、　キス０．２　ｊ　ｌ１
ｄｌ。

リン酸−カリウム０．／ｌ／ｄｌ、リン酸二カリウムｏ
、ｔｇ７ｃｕ、硫酸マグネ’／’）ム０．／ｇ／ｄｉ１
硫酸鉄０．００２１　／　ｃｕ、硫酸マンガフ０．００
００１１７ｃｕ、硫酸亜鉛ｏ、ｏｏ／Ｉ／ｄｉｓβ−７
２＝ｙ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ　ｚ　＃／＃Ｏｆｆｉｇヲ有Ｌ
ｐ　Ｈ７ＪＫＲ整した培地ＪＯＯＩＬＩを含むコｌ容量
バッフル付フラスコに植替えて第３表に示す温度でコ弘
時間培養した結果第Ｊ弐に示す量の菌体が得られた。得
られた菌体を／　０．０００　Ｇにて遠心分離を行ない
２度洗浄した後、凍結乾燥した。

この乾ＩＡ菌体を１０１１／ｌの濃度で１モルの７マー
ル酸ナトリウムと接融させＳＯ〜７０″Ｃ１３０分反応
し生成するＬ−リンゴ酸よシフマラーゼ活性を測定した
。結果を第３表に示す。

第　３　表 実施例ム バチルス・フミルスＴ−！１３０菌をグルコースＪｌ／
ｄ１％硫酸ナトリｆ）ム０．２ｊｉ／ｄｔ、　リン酸−
カリウム０．／ｆ／／ｄｌ、リン酸二カリウム０．３シ
ａ１塩化アンモニウムｏ、！ｉ／ｄ１％ｉ酸マグネシウ
ム０．０／ｉ／ｄ１１硝酸７７モニクムｏ、　ｔ　Ｉ／
ａ、塩化カルシウム０．０００　／　Ｊｌ　／　ｄｊ　
、　Ｎ１ｔａｃｈｅ’５ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　
／　ｘｉ　／　ｌの組成を有しＩ）　Ｅ　７．λに調整
したＪＯＯＫＩの培地を含む２ノ容量バツフル付フラス
コにＪＯｍの容量の前培養液（培地は上記と同じ）を植
苗しμ！℃で３コ時間培養した。

フマラーゼ活性を測定したところ、２ｊｊｕｎｉｔ／７
７　、　ｃｅｌｌの菌体が得られた。

この凍結乾燥菌体を！０１／Ｉ！（０９度で超音波処理
した。かくして得られた粗酵素液を隘イオン交換樹脂で
ある吸着担体に接触させ固定化酵素を作成した。

まずデュオライ）　−Ａ７をレジン水にて十分に洗浄し
テカら０−　／　Ｍ　’）　：／［緩％ｉ（ｐ　ＨＬｏ
　）で緩衝化する。次に、上記で調整した粗酵素を活性
値として／　００〜２００　ｕｎｉｔ／ＩＬｔ−樹脂の
割で、ぶ３〜７ｊ”Ｃで負荷し／ぶ時間吸着固定化させ
る。蛋白吸着量はりｏ％以上であった。

その後、酵素の安定化剤として０．　／％７マール酸ナ
トリウム、架橋剤としてＯ０λチグルタールアルデヒド
を０．　／チリン酸緩衝液に溶かしたものを３０分間反
応させ、十分洗浄して固定化酵素とした。

この固定化ひ素を１０１１１容量のジャケット付カラム
に充填し６０℃流速８　Ｖ　＝　０．　／で／Ｍフマー
ル酸ナトリウムを流したところ約７０％の転換率でＬ　
　ＩＪンゴ酸が１０日間にわたって連続生産可能であっ
た。

高温操作の為、雑菌汚染もなく、非常に安定したＬ−リ
ンゴ酸の生産がなされた。

実施例２ 実施例コと同様の合成培地でバチルス・リケニホルミス
Ｔ−に／／＠ｆｔＪＯ℃で、ｐｒ時間培養したところ、
約２−０１／ｌの菌体が得られ奪。この菌体の７マラー
ゼ活性は２　Ｊ’　Ｏｕｎｉｔ／Ｊ−ｃｅｌｌであった
。

次に得られた菌体を十分洗浄して凍結乾燥菌体としてか
ら、コラーゲン・フィブリル液と混合して、テフロン・
シート状にキャスティングすることによシ、コラーゲン
包括菌体を作成した。

このコラーゲン包括菌体をチップ状に細断してカラムに
充填し流速ＢＴ＝０．Ｏｒ、３０℃で／Ｍフマール酸マ
グネシウムを通液したところ１３％程度の転換率で７日
間安定したＬ−リンゴ酸の生成が確認された。

副生成物を高速液体クロマトグラフィーにて確認したと
ころフマール酸とＬ−リンゴ酸以外の他の有機酸類は検
出されなかった。

実施例Ｌ サーマス・ルーベンス・ノブ・エスピー／１６ｉｏコ菌
を実施例１と同様に培養する。得られた菌体（ｒｏｌｌ
／ｌ）を超音波破砕する。

この破砕液をＤＥＡＲ・セファデックスＧ−２Ｊ−を充
填したカラムに通塔し、０−０．４Ｍ食塩水で濃度勾配
溶出させ、フマラーゼ活性区分を集めた。これを硫安７
０％飽和とし、生じた沈殿をリン酸緩衝液（ｐＨムよ）
で透析する。

この透析液をＤＥＡＥ・セルロースヲ用いｐｌ（２よに
てカラムクロマトグラフィーを行い、ついで溶出液をハ
イドロキシ・アパタイトでカラムクロマトを行い、凍結
乾燥を行って、フマラーゼ粉末を得る。得られたフマラ
ーゼの蛋白当シの比活性はセルフリー抽出液の約！θ倍
であった。

ここで得られたフマラーゼを蛋白換算的よ♂ｇ／ｌの濃
度で／Ｍフマール敲ナナトリウムｔｏ℃、ｐＨ７，２で
２０時間接触させたところ約ｒＯ％、の転換率でＬ−リ
ンゴ酸が得られる。

実施例２ バチルス・プミルスＴ−！ＪＯ菌を実施例１と同様にし
て４Ｌｔ”ｃ、コ≠時間培養する。得られる菌体を実施
例ｒと同様に処理してフマラーゼ粉末を得る。得られた
フマラーゼの蛋白尚シの、比活性はセルフリー抽出液の
約６０倍であった。

ここで得られたフマラーゼを蛋白換％　／　０１９／ｌ
の濃度で／Ｍフマール酸ナトリウムと≠ｊ℃、ｐＨ７よ
で２０時間接触させたところ約７ｊチの転換率でＬ−リ
ンゴ酸が得られる。

実施例／　０゜ サーマス・アクアティクス屋ＩＯ≠菌を実施例／の培地
にフマール酸アンモニウム２２／ｌ添加した培地中、７
０℃で３Ｊ時間培養したところコｏ　ｏ　ｕｎｉｔ／ｐ
む７ｃｅｌｌ−のフマラーゼ活性゛を有する菌体が得ら
れた。

菌体分離後、菌体を十分洗浄して凍結乾燥品とした。本
゛品をｒＯｆ／ｌの濃度で超音波処理し粗醪素液を調製
した。これを陰イオン交換樹脂である吸着担体に接触さ
せ固定化酵素を作成した。まずデュオライ）Ａ−７（米
国、ダイヤモンドジャムロックケミカル社製）をレジン
水で十分に洗浄してから０．　／　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ａＡ、Ｏ）で緩衝化する。これに上記で調製した粗薄素
液を７マラーゼ活性値として１ｏｏ−２００ｕｎｉｔ／
ｍｌ樹脂の割合でぶ！〜７ｊ℃で負荷し、／を時間吸着
固定化させる。蛋白吸着量はりＱチ以上であった。その
後フマラーゼの安定化剤として／ｆ／ｌのフマール酸ナ
トリウム、架橋剤として２２／ｌのゲルタールアルデヒ
ドを０．　／チリン酸緩衝液に溶かしたものを３０分間
反応させ十分洗浄して標品を得た。

この固定化酵素を！Ｏｔｄ容量のコーン型流動層ＫＪ０
−充填し、１モルフマール酸マグネシウムを連続的に通
液したところｓ　ｖ　＝　ｏ、　ｔｉ、７．０℃でｒ！
チ以上の転換率で安定してＬ−リンゴ酸マグネシウムが
得られた。反応液は完全清澄液であシ酵累の洩れもなく
、また高温操作の為、雑菌汚染もなく効率よいＬ　＋　
ＩＪンゴ酸の生産が可能であった。

実施例／　／。

実施例λで得られたサーマス・ルーうダ、ノブエスピー
の凍結！！ｉ、燥物に１モルフマール酸アンモニウムを
ｔｏ℃、５時間作用させたところ本凍結乾燥物にはアス
パルターゼ活性がほとんどなく、ｒ−’−リンゴ酸アン
モニウムがｒ４ｔａｌの転換率で得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第弘図は、サー・マス属菌によシ生産される本
酵素の至適ｐＨ，安定ｐＨ範凹、作用適温の範囲および
温度安定性をそれぞれ示す。 第１図〜第を図は、バチルス属菌によシ生産される本酵
素の至適ｐＨ１安定ＰＨ範凹、作用適温の範囲および温
度安定性をそれぞれ示す。 Ｘ＋　　１　７ ｐＨ 第２図 第３ｎ Ｓｏ　　　　００　　　　’Ｉｏ　　　　８０ジ紡（”
Ｃ） 第＋　図 ぢＯＧｏ　　　　７０　　　８０ ５五坦じＣ） 吊　蜂 ｐＨ 元　６日 ｅト１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　サーマス属に属し、フマラーゼ生産能を有する微生物
   の菌体およびその処理物をフマール酸に作用させること
   により反応物中にＬ−リンゴ酸を生成させ、該反応物か
   らＬ−リンゴ酸を採取することを特徴とするＬ−リンゴ
   酸の製造法。