JPS63240792A - 発酵法によるメナキノン−４の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は生体の血液凝固やカルシウムの調節に関与する
重要な生理活性物質であるメナキノンー４の新規な工業
的製法を提供する。

従来の技術 微生物を用いるメナキノン−４の製造方法としては、フ
ラボバクテリウム・エスピーを用いるビタミンに２４（
メナキノン−４）の生産が知られている〔ビタミン５８
　　（７）、　２７８（１９８４＞　、特開昭６１−２
１６６９６　）。

また、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
ミクロバクテリウム属、タルトバクテリウム属、オーレ
オバクテリウム属またはダラム陽性のフラボバクテリウ
ム属に属するメナキノン−４生産菌（特開昭６ｌ−１７
３７９２）、コリネバクテリウム属に属するメナキノン
−４生産菌のカロチノイド色素生成変異株（特開昭６ｌ
−２６５０９７）などを用いるメナキノン−４の製造法
が知られている。

発明が解決しようとする問題点 生体の血液凝固やカルシウムの調節に関与するメナキノ
ン−４を、工業的に安価に製造する方法の開発が求めら
れている。

問題点を解決するための手段 本発明者はメナキノン−４を工業的に安価に製造する方
法について研究を行った結果、メナキノン−４生産能を
有する微生物が炭素源としてラクトースを含む培地で、
より優れたメナキノン−４生産性を示すことを見い出し
本発明を完成した。

以下に本発明について詳細に説明する。

本発明はメナキノン−４生産能を有する微生物を、炭素
源としてラクトースを含む培地に培養し、培養物中にメ
ナキノン−４を生成蓄積させ、該培養物よりメナキノン
−４を採取することを特徴とする発酵法によるメナキノ
ン−４の製造法を提供する。

本発明に使用する微生物としては、メナキノン−４生産
能を有する菌株であればいずれも用いることができる。

具体的には、コリ不バクテリム属、ブレビバクテリウム
属、ミクロバクテリウム属、タルトバクテリウム属、オ
ーレオバクテリウム属、フラボバクテリウム属などに属
するメナキノン−４生産菌があげられる。好適な微生物
の一例として、コリネバクテリウム・リケファシエンス
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｌ１ｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）　　ＡＴＣＣ１４９２９があげられる。

本発明に用いる培地としては炭素源としてラクトースを
含有し、さらに窒素源、無機物その他栄養物を適当に含
有する培地ならば合成培地、天然培地のいずれでも使用
できる。

具体的には炭素源としてラクトースを５〜２００ｇ／Ｉ
！、好ましくは２０〜１８０　ｇ　／β含有する培地を
用いる。また、グルコース、シュークロース、マルトー
ス、グリセリン、ソルビット、マンニット、糖蜜、を機
酸、脂肪酸などをラクトースと組み合わせて用いること
もできる。窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、
酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、コーンス
チープリカー、大豆粕、無機および有機アンモニウム塩
などを単独あるいは組み合わせて用いることができる。

無機物としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、鉄塩、マンガン塩、ナトリウム塩、カリウム塩など
の無機塩類などを用いる。その他の微看元素として各種
のビタミン例えばチアミン、ニコチン酸、ビオチン、パ
ントテン酸などを用いる。

また、メナキノン−４生合成前駆物質およびその関連物
質を培地に添加することにより、ノナキ生成−４生成債
が増加する場合がある。

培養は、振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条件下で
行う。

培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃が適
当である。培養中、培養液のｐＨは５〜９、好ましくは
７前後に保持するのがよい。

ｐＨ調整剤としてはアンモニア水、水Ｍｌ−）リウム、
水酸化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウム
、尿素などを用いる。

培養期間は通常３〜７日間である。メナキノン−４は培
養液中および菌体中の両方に蓄積するが、大部分は菌体
中に蓄積する。

培養物からメナキノン−４の単離は、メタノール、エタ
ノール、アセトン、クロロホルムなどの単独あるいは混
合溶媒を用いて、メナキノン−４含有抽出物を得、これ
を有機溶媒による分配抽出、シリカゲル、セファデック
スなどによるカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロ
マトグラフィーなどを組み合わせて精製することにより
行うことができる。

試料中のメナキノン−４の定量はＳｈｉｍｐａｃｋ　０
０Ｓ（島原製作所社製）　、Ｚｏｒｂａｘ　ＯＤＳ、　
ｌ１ｎｉｓｉｌ　ＮＱＣ−１８くいずれも、ガスクロ工
業社製）などを用いる逆相分配型の高速液体クロマトグ
ラフィーを利用する。

以下に本発明の実施例をあげて本発明を具体的に示す。

実施例１ ペプトン１　ｇ／ｄｆｌ、肉エキスＩｇ／Ｊ、ＮａＣＡ
’０．３ｇ、／ｊ！の組成よりなる種培地（ｐＨ７，２
）３０　Ｑｍｌを２β容三角フラスコに入れて殺菌した
。

これにコリネバクテリウム・リケファシェンスＡＴＣＣ
１４９２９を接種し、２８℃で２４時間振盪培養した。

該培養液３０　Ｑｍｌをイーストエキス２ｇ／ｄｉ、リ
ン酸−カリウム０．１ｇ／ｄ１、リン酸二カリウム０．
０５ｇ／ｄ１、硫酸マグネシウム・７水塩０．１ｇ／ａ
　　硫酸アンモニウム０．２５ｇ／ｄｌｌ、炭酸カルシ
ウム０．５ｇ／ｄ１、硫酸第一鉄０．１ｍｇ／Ｊからな
る基本培地（ｐＨ７，２）に第１表に示す種々の炭素源
を３０ｇ／Ａずつ添加した生産培地３βを含む５β容ジ
ャーファーメンタ−に接種し、４００ｒｐｍの回転数、
１分間当り３１の通気、温度２８℃の培養条件下で５日
間培養し回転数、１分間当り３２の通気、温度２８℃の
培養条件下で５日間培養した。このときのメナキノン−
４生成Ｊは第１表に示すとおりであった。

炭素源としてラクトースを用いた培地で、メナキノン−
４の生成量は１８．７ｍｇ／βであり、他の炭素源に比
し、約３倍以上と時異的に生成量が向上した。

第　　　１　　　表 （ｍｇ／β） グルコース　　　　３．６ グ　リ　　セ　　リ　　ン　　　　　　　　　　　　２
．６マンニント　　　　１．９ ソルビット　　　　２．４ ラ　　り　　ト　　−　ス　　　　　　　　　　　ｌ　
８バシユークロース　　　　　　５．９ マルトース　　　　５．８ 澱　　　　　　　粉　　　　　　　　４．０ついで、上
記のようにして得られた培養液２１菌体を得た。これに
４５　Ｑｍｌのメタノールを加えて５５℃で３回抽出し
た。その抽出液を濃縮して、得られた油状物に３０　Ｑ
ｍｌのヘキサンを加えて不溶物を濾過した。ｐ液に８ｇ
のシリカゲルを加えて撹拌し、目的物をシリカゲルに吸
着させた。

非吸着物を洗い出した後、酢酸エチル５Ｑｍｌを用いて
目的物を溶出した。溶出液を減圧濃縮し、油状物］、３
０ｍｇを得た。

次にこの油状物をＱｍｌのアセトンに溶かし、このアセ
トン溶液を７リ力ゲル薄層６０Ｆ２Ｓ、　　（メルク社
製）８枚にスポットし、トルエン；酢酸エチル−９：１
の展開溶媒を用いて展開した。Ｒｆｊ！０．８の紫外部
吸収を示す部分を削りとり、アセトンで抽出、濃縮後、
再びアセトン４ｍｌに溶解した。

これをあらかじめパラフィンを浸漬したシリカゲル６０
　Ｆ２５４（メルク社製）８枚にスポットし、アセトン
：水−９５：５の展開溶媒で展開し、メナキノン−４の
標準品と一致するＲｆ値０．６２の部分を削りとり、ア
セトン抽出、ａｗｌを行い１８ｍｇのメナキノン−４を
得た。これは逆相薄層クロマトグラフィー、高速液体ク
ロマトグラフィーなど１こよりメナキノン−４であるこ
とを確Ｓ忍した。

実施例２ 第２表に示した濃度になるようにラクトースを添加した
生産培地を用いて、実施例１と同様にしてコリネバクテ
リウム・リケファシエンスＡＴＣＣ１４９２９の培養を
行った。メナキノン−４の生成量は、第２表に示したと
おりである。

第　　　２　　　表 発明の効果 本発明方法によれば、メナキノン−４の発酵生産を著し
く向上させることができるので、メナキノン−４を大量
に安価に供給することができる。

手続補正層（自発） 昭和６２年９月　１２日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. メナキノン−４生産能を有する微生物を、炭素源として
   ラクトースを含む培地に培養し、培養物中にメナキノン
   −４を生成蓄積させ、該培養物よりメナキノン−４を採
   取することを特徴とする発酵法によるメナキノン−４の
   製造法。