JPS6324888A

JPS6324888A - 組換え型ｄｎａ分子

Info

Publication number: JPS6324888A
Application number: JP62165127A
Authority: JP
Inventors: ダニエル・エスピオン; アルセーヌ・ブリュニイ; クリスチン・デバウック
Original assignee: SmithKline RIT
Current assignee: SmithKline RIT
Priority date: 1986-06-30
Filing date: 1987-06-29
Publication date: 1988-02-02
Also published as: ZA874677B; PT85220A; AU7492087A; EP0252060A1; DK335987A; DK335987D0; PT85220B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、ＤＮＡ配列１組換え型ＤＮＡ分子およびニュ
ーカッスル病ウィルス融合タンパク質ま、たは均等なポ
リペプチドの産生法、得られた産生物ならびにそれを含
有する調製物、ざらに詳しくは診断またはワクチン目的
用の調製物に関する。

発明の背瞼しばしば「家禽ペスト」とも称されるニューカッスル病
は、家禽を襲う最も償犬な病気の１つである。原因とな
る病原体はパラミクソウィルス。

すなわち、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）である
。ウィルス感染は、しばしば、林早および死昏こつなが
る信篤な神経系の併発症を伴う呼吸症状を引き起こし、
家禽飼育事業）こ重大な経済的問題をもたらす。この疾
患昏こ対して用いられるワクチンの大部分は、緩和なま
たは弱毒化された生ウィルスから調製されるが、そのよ
う１こして調製されたワクチンは、まだ、若干呼吸器疾
患を誘発し、時には二次感染；こよって悪化させうるの
で、それらは全く安全というわけではない。したがって
。

それらの使用は、理想的な１ｍの感染の調節を構成しな
い。したがって、本発明の目的は、遺１云子工学手法ｌ
こより、感染の間抗体の中和の誘発に関与する実質的な
量の該ウィルスタンパク質を産生ずることによって安全
かつ有効ｆ；ワクチンを調製すること；こある。

そのようなワクチンの映浦は、該ウィルスの膜に存在す
る２種の糖タンパク質、すなわち、ＨＮおよびＦ（レイ
、アールら、ジャーナル・オブ・イン７エクシヤス・デ
ィシーズ（Ｒａｙ　、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、）、１５２．１２１９〜１２３０
（１９８５））である。両方共ウィルス外膜上にスパイ
ク様突起を形成し、共にウィルス細胞膜相互作用を媒介
する。すなわち、ＨＮはウィルス吸着に関与し、一方、
Ｆはウィルスおよび細胞ＩＩ５！の融合を媒介する。融
合タンパク質Ｆは、ウィルスの感染力の本質であり（ナ
ガイ、ワイら、パイロロジー（Ｎａｇａｉ、　Ｙ、　ａ
ｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、　７２　。

４９４〜５０８　（１９７６））、その中和は、パラミ
クソウィルス１こよる感染の有効すん疫的予防コこ必要
である（メルフ。ディー・シーら、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メデイシン（Ｍｅｒｚ、Ｄ、Ｃ，
ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　）、　１５１
　。

２７５〜２８８（１９８０））。

Ｆタンパク質が不活性前駆体（Ｆｏ）として最初に合成
され、ついで、宿主タンパク質分解酵素シこよって特殊
な方法で開裂して２踵のジスルフィド結合ポリペプチド
（Ｆ工およびＦ２）が生じることが十分鋪かめられてい
る（ナガイ、ワイら（Ｎａｇａｉ。

Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、）＋　　前記文献、ナガイ、ワイら
、パイロロジー（Ｎａｇａｉ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　７７　。

１２５〜１３４（１９７７））。この細胞内開裂（モリ
ソン、ティーら、ジャーナル・オブ・バイｏｏジー（Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、）。

５３．８５１〜８５７（１９８５））は、Ｆ０ポリペプ
チド上に新たなアミノ末端を生じ、Ｆの生物学的活性の
本質であることが示されている（ナガイ、ワイら（Ｎａ
ｇａｉ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、）　、前記文献）。

ＦＩＮ−末端６ｒｉ域のアミノ酸配列は非常に疎水性で
あり、いくつかのパラミクソウィルスの間で制度に保存
されている（チョピン、ピー・ダブリューら、ジャーナ
ル・オブ・イン７エクシヤス・デーイジーズ（Ｃｈｏｐ
ｐｉｎ　、　Ｐ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｎ
ｆ、　Ｄｉｓ、）１４３．３５２〜３６３（１９８１）
）。この新しいアミン末端は、膜融合反応において標的
細胞１＠と相互作用しうるということをこれらの発見は
示唆している。この可能性は、Ｆ工のアミノ末端Ｇこｍ
似した配列を有する合成オリゴペプチドが。

特に、いくつかのパラミクソウィルスによる膜融合を抑
制するという研究によって確認された（リチャードソン
、シー・ディーら、パイロロン−（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ、　Ｃ，Ｄ、　ｅｔ　ａｔ、　；　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
　）＋　１３１　。

５１８〜５３２（１９８３）およびチョピン、ピー・ダ
ブリューらＣＣｈｏｐｐｉｎ、　Ｐ、　Ｗ、　ｅｔ　ａ
ｔ、　）。

前記文献）。

ＨＮおよびＦは２両方共抗体の中和を誘発する（し・ロ
ンら、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｌ’ｅ″Ｌｏ
ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、５７　、
１１９８〜１２０２（１９８６，））。しかし、Ｆはワ
クチン５こ必須であると考えられた（メルフ。ディー・
シーら（Ｍｅｒｚ、　Ｄ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、）　、前
記文献およびチョピン、ピー・ダブリューら（Ｃｈｏｐ
ｐ　ｉｎ、　Ｐ、　Ｗ。

ｅｔ　ａｌ、）、前記文献）。事実、ＩＮに対する抗体
と異り、Ｆに対する抗体は、感染細胞から放出される感
染ウィルスにより起こる外からの融合および膜融合によ
る感染の細胞間拡大をもたらす内からの融合の両方の踵
閑の融合を抑制することによって感染の拡大を完全に阻
止する（メルフ。ディー・シーら（Ｍｅｒｚ、　Ｄ、Ｃ
，ｅｔ　ａｔ、）、前記文献およびチョピン、ピー・ダ
ブリューら（Ｃｈｏｐｐｉｎ。

Ｐ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、）、前記文献）。結果として、有
効なワクチンは、Ｆ糖タンパク質に対する抗体を誘発す
るはずであり、純粋なＦ塘タンパク質は、そのようなワ
クチンの理想的な免疫原であると考えられた（チョピン
、ピー・ダブリューら（Ｃｈｏｐｐｉｎ　。

Ｐ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、）、　前記文献）。

融合タンパク質は、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ
）ばかりでなく曲のパラミクソウィルス（例えば、ＳＶ
５、センダイウィルス）およびヒト呼吸シンシチウムウ
イルス（ＨＲＳ　Ｖ　）　ｉ、：も見出されており、こ
の発見以前に、該ＳＶ５．センダイＳよびＨＲ３Ｖウィ
ルス融合タ融合タンパク−ドするＤＮＡ配列が決定され
ている（パターソン、アール・ジーら、プロシーディン
ゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイ
エンシーズ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、　　８１．６７０６〜６７１０　（
１９８４）、ブランベルグ、ビー・エムら、ジャーナル
・オフ・ジェネラル・パイロロジー（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ
。

Ｂ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）
　、　６６　、３１７〜３３１（１９８５）、エランゴ
、エヌら、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｅｌａ
ｎｇｏ、　Ｎ、　ｅｔａｌ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、
　Ｒｅｓ、）、　１３　、１５５９〜１５７４（１９８
５）およびコリンズ、ピー・エルら、プロシーディンゲ
ス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエ
ンシーズ・ニー・ニス・ニー（Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｐ、
　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８１．７６８３〜７６８７　（１９
８４））。

その配列が知られているパラミクソウィルス融合タンパ
ク質は、共シこ、かなり疎水性の全体特性を有して３つ
、３種の待機的な疎水項域、すなわち、シグナル配列、
Ｆｌのアミン末端およびアンカー鎖酸を示すということ
も知られている。

本発明ＬＪ、前に、核ＮＤＶ−Ｆタンパク質が５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル上電気泳動により検出されてい
る（ナガイ、ワイら（Ｎａｇａｉ、　Ｙ、　ｅｔａｌ、
）、前記文献）。にもかかわらず、該Ｆタンパク貫構造
は知られておらず、実質的な量を得ることができなかっ
た。少なくともＦ遺伝子の一部を存するクローンを含む
ＮＤＶ遺云子配列からなるライブラリーが作成されてい
るが、この遣１云子は発現されなかった（チャンパース
、ピーエッチら。

ジャーナル・オフ・ジェネラル・パイロロジー（Ｃｈａ
ｍｂｅｒｓ　Ｐｈ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖ
ｉｒｏｌ、）、６７゜４７５〜４．８６　（１９８６）
　）。

発明の要約本発明は、一つの態様に８いて、ニューカラスｔし病ウ
イＩレス融合タンパク質のＤＮＡコーディング配列また
はそのフラグメントもしくは誘導体からなり、該フラグ
メントまたは誘導体がニューカッスル病ウィルス融合タ
ンパク質に対する免疫応答を誘発しうるポリペプチドを
コードすることを特徴とする組換え型ＤＮＡ分子に関す
る。

もう１つの態様において、本発明は１発現調節配列に機
能的：こ結合した該融合タンパク質コーディング配列を
有する発現ベクターである該組換え型ＤＮＡｅ子Ｓよび
それで形質転換した微生物または細胞に関する。

さらにもう１つの轢様において、本発明は、組換え型Ｄ
ＮＡ方法によって調製したＮＤＶ融合タンパク質Ｓよび
ＮＤＶに対する家禽の免疫応答を誘発する該タンパク質
からな、Ｓことを特徴とするワクチン昼こ関する。

第１図α、ｂ、Ｃｓよびｄ）は、ニューカッスル病ウィ
ルス融合タンパク質ｃＤＮＡの一徹鎖ヌクレオチド配列
およびＦｏタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。推定
単一配列および模アンカーｍ域は破線を下に引いている
。矢印は、活性化開裂部位を示す。Ｆ２およびＦ□の間
の推定結合ペプチドは。

二重線で示す。先に決定したＦ□のアミン末端の疎水性
配列には下線を引いである。潜在的なグリコジル化部位
は箱で囲っである。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、各
ラインの最後に番号を付しである。

第２図は、ＮＤＶ感染細胞から抽出し、かつ。

クローン１．５（レーン１）、■、５０　　（レーン２
）。

■、１４（レーン３　）、　［１１，３１（レーン５）
、ｔｌｌ、３６（レーン６）、１．５および１．５０　
　（レーン７）からの３２ｐ−標識プラスミドＤ　Ｎ　
Ａ　Ｉｃでハイブリッド形成した全ポリ（Ａ）＋−ｍ　
ＲＮ　Ａの７ザンプロツトである。ＢＨＫ−２１細胞か
ら抽出した１８５ｓよび２８ＳｒＲＮＡの位置を、それ
にまた全ウィルスポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡ　（１８Ｓ　
、　２２　ＳＳよび３５３ｍＲＮＡ）も同様に印しであ
る。得られた結果は、Ｌ、ＨＮ、ＦおよびＮＰ遺１云子
（それぞれクローン［５，Ｔ、、５０．１．１４および
■。

３０）Ｉこ対応する４ｎに明ｌｉｔこ同定できる。しか
し、Ｍ８よびＰ　＋（ｌ　云子シこ対応するｍ　ＲＮ　
Ａは十分に分離されず、クローン■、３１および■、３
６の同定は不明瞭でめった。

第３図は、部分的制限エンドヌクレアーゼ開裂マツプお
よびクローン０．１４（ＮＤＶのＦ）＋ｃ対して用いた
配列決定方法を示している。ヌクレオチドは、ｃＤＮＡ
の最初から番号を付しである。

矢印は、配列の方向および特定の制限フラグメントの配
列決定の範凹を示している。該コーディング頭載＋（、
は破線を下に付し、Ｆ２およびＦｌ　と称するこの領域
の部分を示している。

４４図は、ＮＤＶ：　ｐＹＤＥｌからのＦ−ｃＤＮＡ挿
入物を含有する酵母プラスミドベクターの構造を記載し
ている。クローン０．１４からのＢａｍＨＩ−Ｆｓｐエ
フラグメントをＣｕ−ＭＴプロモーターおよびＣＹＣ１
ターミネータ−を含有するシャトルベクターｐｃＤ１９
２のｐｖｕＵ部位中部位中口−ンした。該挿入物の正確
な配向のみを示す。関連した制限部位に印をつける。／
／／、／／：　Ｉ）　Ｂ　Ｒ３２２配列、　−□　：　
２　ｕ　ｍ配列、−−−−−：　Ｆ配列。

第５図は、酵母中のＦタンパク質の発現を示したウェス
タンプロットである。ウィルスタンパク質の検出は、Ｎ
ＤＶに対するポリクローナル抗体（希釈：　１／１００
０）を用いることにより行われた。レーン１．ニューカ
ッスル病ウィルス；レーン２．誘発したＢＲＩＯ／ｐｃ
Ｄ１９２からの細胞抽出物；レーン３、誘発したＢＲＩ
Ｏ／ｐＹＤＥ１からの細胞抽出物。ＮＤＶのネイティブ
Ｆエボリペプチドが２それ藝こまだ発現Ｆタンパク質お
よび分子量（ＭＷ）も同様（こ示されている。ＢＲ１０
／ｐＹＤＥ１（Ｆ遺伝子を含有する）の誘発後約５０ｋ
ｄの２つのバンドが存在し、一方、酵母ＢＲＩ　Ｏ／ｐ
ｃＤ１９２　（異種遺伝子不含）を誘発した場合、バン
ドが観察されないということが判明しうる。

発明の詳説クローンしたライブラリーは、ＮＤＶ感染１８胞ポリ（
Ａ）＋−ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを挿入するこ
とにより公知のｐＢＲ３２２プラスミド中に作成されて
いる。ハイブリッド形成実験４こよるウィルスクローン
の同定後、該融合塘タンパク質の全コーディング領域を
含む１つのｃＤＮＡの配列を決定した。この方法昼こよ
り、コードされたポリペプチドは５２６アミノ酸長であ
り、４つの潜在的グリコジル化部位（Ｆ２上に１つおよ
びＦ１上昏こ３つ）を含有していることが判明した。

ニューカッスル病ウィルス融合タンパク質ｃＤＮＡの一
改鎖ヌクレオチド、さらにまだネイティブＦタンパク質
（Ｆｏ）の推定アミノ酸配列も同様シこ第１図に示す。

該融合タンパク質に対する推定アミノ酸配列から、いく
つかの疎東性残基を含有する領域であるシグナル配列が
該タンパク質のアミノ末端に位置していることがわかる
。それは、担い内部原形質網状組織を越えて該タンパク
質の輸送に関与すると考えられ１通常、７オン・ハイネ
の規則（フォノ・ハイネ、ジー（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ
、　Ｇ　）　、　　前記文献）に従って予測した場合、
残基１８（２つのセリン残基の２番目）の次であると考
えられる特定の部位（小さな非荷電側鎖を有するアミノ
酸の次）の開裂＄こより該成熟タンパク質中に移動する
（７オン・ハイ不、ジー、ヨーロピアン・ジャーナル・
オフ・バイオケミストリー（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　
Ｇ　。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１３３．１７〜２１
　（１９８３））。この開裂は、明らかに活性ではない
前駆体融合タンパク質Ｆ。を生じる。

前記のように、　　Ｆ□はタンパク質分解的に開裂して
ジスルフィド結合により相互に結合している２つのアポ
タンパク質Ｆ１およびＦ２を生じる。

Ｆｌのアミノ末端は、エドマン分解）こよって直接決定
されている（チョピン、ビー・ダブり二一ら（Ｃｈｏｐ
ｐｉｎ　、　Ｐ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、）、前記文献）
。すなわち、それは、第１図（２）、ｙ、ｃＨよびｄ）
の完全なＦ配列上昏こ認められうる疎水性領域である（
Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　・−、すなわち残基
１０４Ｓよび次の残基）。この配列は、１つの位置以外
（残基１１１、Ｇｌｙの代りシこ５ｅｒ）　、記載した
配列と実質的に向−である。

この疎水性領域の直前の、いくつかの塩基性残基（Ａｒ
ｇ　−Ａｒｇ　−Ｇｌｎ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ、すなわ
ち残基９９〜１０３）が同定されている。Ｆ２およびＦ
工の間のこの結合ペプチドは、該開裂と平行するＦ。

の等重点の酸性シフトから他の場合嘉こ推定されている
よう怪こ、該融合タンパク質の活性化の間に除去されう
る（コハマ、ティーら、パイロロジー（Ｋｏｈａｍａ、
　Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１１
１．３６４〜３７６（１９８１））。

ＮＤＶのＦタンパク質配列のカルボキシ末端において、
非萌電領域（残基４８０〜５１２）は該タンパク質全体
中最強の疎水特性を有し１強く荷電した領域；こよりど
ちらの側とも接している。これらの特性は、転位中止配
列として作用する、すなわち、膜を通じて該鎖の転移（
核シグナル配列により開始）を中止させるｉ＋１域の特
性を示している（デービス、エヌ・ジーら、セル（Ｄａ
ｖｉｓ、　Ｎ。

Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ）、４１　、６０７〜６１
４　（１９８５））。そのうえ、この頭載は、おそらく
二重１漠中に固定されている。それは、ウィルス組立て
の前または間核内、漠タンパク質Ｍと相互作用する１４
アミノ酸（残基５１３〜５２６）の相対的極性領域であ
る細胞質末端を伴う（ピープルズ、エム・イーら、ジャ
ーナル・オフ・パイロロン−（Ｐｅｅｐｌｅｓ、Ｍ、　
Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、　５１　
、８１〜９０（１９８４））。

第１図（ａ、ｂ、ｃおよびｄ）のＦの完全なアミノ酸配
列から、該シグナル配列、Ｆ１のアミン末端および該ア
ンカー領域が、特に、疎水性傾城であるということが判
明しうる。全体として、Ｆの配列は相対釣場こ疎水性で
ある。

該ＮＤＶ融合融合タンパクズリコジル化は、アスパラギ
ン残基への炭化水素側鎖のＮ−結合を阻ざする抗生物質
であるツニカマイシン（モ１１ソン。

ティー・ジーら、ジャーナル・オフ・パイロロン−（Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｔ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｔ、　、Ｊ、
　Ｖｉｒｏｌ、）、３６　。

１７１〜１８０（１９８０）；し・ロンら（Ｌ￥・Ｌｏ
ｎｇ　ｅｔ　ａｔ、）、前記文献）の序在下に完全ＩＣ
阻止されることが判明している。該配列を視察すること
により、４つの潜在的グリコジル化部位（Ａｓｎ−Ｘ　
−ＳｅｔまたはＡｓｎ　−Ｘ−Ｔｈｒ　）　、すなわち
、Ｆ２上；こ１つ（残基７２〜７４）ＳよびＦＩＪ：Ｉ
こ３つ（残基１８９〜１９１，３５４〜３５６および４
３５〜４３７）が存在することがわかる。Ｆ２アポタン
パク質がグリコジル化されるということ（シエイド、ニ
ーら、パイロロジー（５ｃｈｅｉｄ、　Ａ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　８０．５４〜６
６　（１９７７）〕。Ｆ２の糖鎖についての２１００ダ
ルトンの平均分子量（ハンター、イーら、ジャーナル・
オフ・パイロＯ）　−（Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｅ、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）、４６，９２０〜９３６　（１９８２）
）は、ポリアクリルアミドゲルからの以前に推定した階
と良く一致した結果であるこの残基についての±１０５
００のＭｒを予測させるということ（シエイド、ニーら
（５ｃｈｅｉｄ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）前記文献）が
知られている。ＦＩＩこ関しては、３つのグリコジル化
部面金てが用いられる場合、このアポタンパク質の分子
量は±５２０００．すなわち。

ゲル上で観察した分子！（５５０００）より少し低い分
子量と考えられる（モリソン、ティー・ジーら（Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ、Ｔ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、）、前記文献）
。

したがって、Ｆの全ての潜在的グリコジル化邪位が引用
されると考えられる。

ニューカッスル病ウィルス融合タンパク質を発現させる
ため、いくつかのウィルスの＃、（例えば。

Ｉｔａｌｉｅｎ、　Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、　Ｕｌｓｔｅ
ｒおよびＱｕｅｅｎｓｌａｎｄ株）が利用できる。いく
つかの宿主／ベクター系も利用できる。例えば、ウィル
スまたは細菌プロモーターの４［１’に非対応遺伝子を
発現しうるイー・コリ細菌および発現プラスミド（ハリ
ス、ティー・ジエイ・アール、ジエ不ティック・エンジ
ニアリング（Ｈａｒｒｉｓ、　Ｔ、　Ｊ、　Ｒ１，Ｇｅ
ｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、　４　；アール
・ウィリアムソン編。

アカデミ、ツク・プレス、ロンドン（Ｒ，Ｗｉ　ｌｌｉ
ａｍｓｏｎｅｄ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　
Ｌｏｎｄｏｎ　）、１２７〜１８５（１９８３））、酵
母プロモーターの調節下に非対応遺伝子を発現しうる発
現プラスミドでもあるＦｌニス・セレビシアエおよびニ
ス・ボンベ（Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ａｎｄ　
Ｓ、　ｐｏｍｂｅ　）ならびにシャトル・ベクター（ベ
ッグス、ジエイ・ディー、ジエ不テイック・エンジニア
リング（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ。

Ｄ、、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、ｉｎｇ）、
２　　；アール・ウィリアムソン偏、アカデミツク・プ
レス、ロンド７　（Ｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　ｅｄ、
　Ａｃａｄｅｒｒ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏ、ｎ）、１７５〜２０３（１９８１））、ウ
ィルスレプリコンに由来する浦乳矧細１泡およびベクタ
ー系（リグビー、ピー・ダブリュー・ジエイ、ジエ不テ
イツク・エンジニアリング（Ｒｉｇｂｙ　。

Ｐ、Ｗ；Ｊ、、Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ）、　３　　；アール・ウィリアムソン編、アカデ
ミツク・プレス、ロンドン（Ｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ
、　ｅｄ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　　Ｌｏｎ
ｄｏｎ　　）、　８３〜　１４１（１９８２）；カンホ
、エム・ニス、ディー・ニス・ニー・クローニング・ア
・プラクティカル・アプローチ（Ｃａｍｐｏ、　Ｍ、　
Ｓ、　、　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　ｐｒａ
ｃｔ　１ｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ）　、２　　；ディー
・エム・グローノく一編。

アイ・アール・−エル・プレス、オックスフォード。

ワシントン・ディー・シー（Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　
、　ｅｄ。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，）、２１３〜２３８（１９８５））
、ライｌレスレプリコン・こ由来する昆虫細１泡および
系（フレンチ、アールら、サイエンス（Ｆｒｅｎｃｈ、
　Ｒ，ｅｔ　ａｔ、。

５ｃｉｅｎｃｅ）　、　２３１．１２９４〜１２９７（
１９８６）；スミス、ジー・イーら、プロシーディンゲ
ス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエ
ンシーズ・オフ・ニー・ニス・ニー（Ｓｍｉｔｈ、　Ｇ
、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、　８２．８４０４〜８４０８（１９８５））
、ポックスウィルス科シこ由来する生組換え型ウィルス
の構成体（例えば、ワクシニア）であって、単独でワク
チンとして用いることができるもの（マケット、エムラ
、ティー・エヌ・ニー・クローニング・ア・プラクティ
カル・アプローチ、２、ディー・エム・グローバー編、
アイ・アール・エル・プレス、オックスフォード、ワシ
ントン・ディー・シー（Ｍａｃｋｅｔｔ、　Ｍ、　ｅｔ
　ａｔ、、　ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　ａｐｐｒｏａｃｈ、　２．
　Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｄ。

ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，）。

２１３〜２３８（１９８５））。

前記の有機体のうち、イー・コリ、ニス・セレビシアエ
（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびワクシニアは、
ＮＤＶ・Ｆタンパク質を発現することが籾量している。

好ましい具体例として、ニス・セレビシアエが用いられ
る。

ワクチン投与については、得られたポリペプチド調製物
の懸濁液は、好ましくは、ワクチン処方の分野でよく知
られているような完全７０インドアジユバントまたは水
酸化アルミニウムのような務肉内または皮下投与のため
の適当なアジュバントを補足した等張水溶液中でＩＭａ
され、該組成物は１例えば、ワクチンの１００〜１００
０有効用置を含有するグラスバイアルに分注される。該
バイアル（ま凍結乾燥し、ついで密栓する。

投与前、該ワクチンは、パイロゼン不含蒸密水の添加に
より即座に復元する。

実施例つぎに実施例を挙げて本発明をざらに詳しく説明する。

実施例ｌＮＤＶ融合タンパク質のヌクレオチド配列Ａ５　　物質
および方法ウィルス：ニューカッスル病ウィルス、　　Ｉｔａｌｉ
ｅｎ株は、ジ・インターナショナル・レファレンス・ラ
ボラトリ−・ウェイブリッジ、ユナイテッド・キングダ
ムから入手した。それは、９〜１１日目のひな胚にて成
長し、典型的なウィルス源として用いられた。該ウィル
スは、し・ロンら（Ｌ？Ｌｏｎｇ　ｅｔ　ａｔ、）（前
記文献）の記載と同様にして精製した。

ＮＤＶ感染細胞からのポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡの抽出：
ＢＨＫ−２１細・胞を５〜１’０ＰＦＵ（プラーク形成
ユニット）／細胞の多眼間で感染させた。

３０分の吸着期間後、該細胞をイーグル最少必須培地（
ＭＥＭ）中３７℃をごてインキュベートした。

感染後２．３０時間でアクチノマイシンＤを２μｙ／ｍ
ｅの最終濃度で加え、４時間後該細胞をＴ　Ｎ　Ｅ　？
、１衝液（０，０１Ｍ　トリス、ｐＨ８，３、０，１５
−Ｍ　Ｎａ１ｌ、０、ＯＯＩＭＥＤＴＡ）で２回洗浄し
、プロテイナーゼＫ　４００　ｔｔ！／ｍｅを含有する
ＴＨＥ−ＳＤＳ緩衝液（０，ＯＩＭ）リス、　　ｐＨ８
，３，０，１５Ｍ　Ｎａｃｌ。

０．００１ＭＥＤＴＡ、０．５％５ＤＳ）中に溶解した
。１容のフェノール：クロロホル、ム：イソアミルアル
コール（２５：２４：１）を加えた後、該ＤＮＡをミキ
サー中で粉砕し、該混合物をフェノール：クロロホルム
：イソアミルアルコール（１容）で２回抽出した。エタ
ノール沈殻後、該核酸をペレットにし、溶゛雌復衝液（
０，１Ｍ！−リス、ｐＨ７，５，０，００１ＭＥＤＴＡ
、０．５％５ＤＳ）中に溶解し、該混合物をＬｉＣｌ中
２Ｍにし、４℃で１２時間インキュベートした。遠心分
離後、該ペレットをハイブリッド形成緩衝液（０，１Ｍ
　トＩＪス、ｐＨ７，５，０，３５Ｍ　ＮａＣｌ、Ｏ，
ＯＯＩＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）２ｍｔ’中に溶解
し、１．５ｒｎｌオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム１
こ通した。溶蝶緩衝液でポリ（Ａ）含有ＲＮＡを溶離し
た。

使用する前に、ウサギ網状赤面法溶解物（パルハム、エ
ッチ・アール・ピーラ、ヨーロピ７７・ジャーナル・オ
フ・バイオケミストリー（Ｐａｌｈａｍ。

Ｈ，Ｒ，Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）、　６７　、２４７〜２５６（１９７６
））およびアフリカッメガエル卵母細胞（ガードン、ジ
エイ・ビーら、ネイチャー（Ｇｕｒｄｏｎ、　Ｊ、　Ｂ
、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ）　。

２３３．１７７〜１８２（１９７１））に６いてタンパ
ク質合成の刺ｆ！ｌｌ＋こついて該ポＩＪ　（Ａ）　−
ｍＲＮＡを試験し、該合成ウィルスタンパク質をし・ロ
ンら（ＬＩｉ”Ｌｏｎｇ　ｅｔ　ａｔ、）　（前記文献
）の記載と同様コこして特異的抗−ＮＤＶ抗体を用い免
疫沈降により検出した。

ｃＤＮＡの合成およびクローニング：鋳型およびオリゴ
（ｄＴ）　１０−１２プライマーとしての感染細胞から
のボ’Ｊ　（Ａ）”　−ｍ　ＲＮ　Ａを用いて、逆転写
酵素により第１鎖ｃＤＮＡコピーを合成した。

ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドの熱／冷麦性後。

該−改鎖ｃＤＮＡからの３′末端ループを第２鎖合成の
ためＤＮＡポリメラーゼ）ｌこよりプライマーとして用
いた。ついで、生じた二重鎖ｃＤＮＡからのにアピンル
ープを８１ヌクレアーゼで消化し。

オリゴ（ｄＣ）残基を該ｃＤＮＡの３′末端−こ加えて
オリ：Ｉ’　（ｄ　Ｃ）末端を形成した。ついで、該Ｃ
ＤＮＡを（ｄＧ）−（ｄＣ）ｎハイブリッド形成により
オリゴ（ｄＧ）末端ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡのＰ
ｓｔ　１部位中に挿入し、該−結反応混合物を用いてイ
ー・コリ株ＭＭ２９４（ｈｓｄ　　Ｒ１７、すなわち、
ｒＫｍＫ）をテトラサイクリン耐性に形質転換した。

ウィルスクローンの検出：挿入物としてのウィルスｃＤ
ＮＡ含有クローン（１２７７からの１９９テトラサイク
リン耐性およびアンピシリン感受性コロニー）を、プロ
ーブとして３２ｐ−標識５０ＳウイルスＲＮＡ（ショ塘
ａｌｔ勾配法（１５〜３０％ｗｔ／ｗｔ）にて単離）を
用いてその場でコロニーバイブ’Ｊツド形成（グルンシ
ュタイン、エムら（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　、　Ｍ、　ｅ
ｔ　ａｔ、）、前記文献）１こより検出した。ついで、
ウィルスクローンを、プローブとして無作為に選択した
プラスミドＤＮＡ含有ｃＤＮＡＩｆ！入物を用いてその
場で他のコロニーノ１イブリッド形成実験を行うことに
よりいくつかの群に＋ｍし、ニックトランスレーション
により３２Ｐ−標識した。

該ｃ　ＤＮＡの同定：　ＮＤＶのｍＲＮＡの公知のコー
ディングアサイメント（コリンズ、ビー・エルら、ジャ
ーナル・オフ・パイロロジー（Ｃｏｆｆ１ｎｓ　。

Ｐ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　、　４
３．１０２４〜１０３１　（１９８２））を利用して、
６Ｍ尿素を含有する０、０２５Ｍクエン酸ナトリウム、
ｐＨ３，５中１．５％アガロースゲルを用いて感染細胞
からのポリ（Ａ）”−ｍ　ＲＮ　Ａの電気法ｗＪ１こよ
りｍＲＮＡの分離を行い、ニトロセルロース上でＲＮＡ
の移動を行った。ついで、該ニトロセルロースシートを
りくつかのバンドに切断し、それらのそれぞれをニック
トランスレーションにより３２Ｐ−標識した１つのｃＤ
ＮＡでハイブリッド形成した。

リッツマン、エッチら、イー・エム・ビー・オー・ジャ
ーナＪＬ／　（Ｒｉｅｚｍａｎ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　
、　Ｅｍｂ。

Ｊ、）、　　　１２．　２１６１　〜２１６８（１９８
３）＋こ記載されているようなハイブリッド形成−選択
法昼こより、ｖｃｃＤＮＡの補足的同定を行った。この
方法で選択したそれぞれのｍＲＮＡをアフリカッメガエ
ル卵母細胞（ガードン、ジエイ・ビーら（Ｇｕｒｄｏｎ
、　Ｊ、Ｂ、ｅｔ　ａｔ、）、前記文献）中で形質転換
し、得られたタンパク質を抗ＮＤＶ抗体（し・ロンら（
Ｌｉ”　Ｌｏｎｇ　ｅｔ　ａｔ、）、前記文献）を用い
て免疫沈降させた。

ＤＮＡ配列分析：マキサム・アンド・ギルバート（Ｍａ
ｘａｍ　＆　Ｇｉ　１ｂｅｒｔ　）の化学的方法オヨヒ
サンガー・ジデオキシ配列法昏こよりＤＮＡ配列を決定
した。

Ｂ、糖果（１）ウィルス特異的配列含有クローンの同定１つのク
ローン（すなわち、Ｌ遺伝子転写物である３５５ｍＲＮ
Ａとハイブリッド形成したクローン１．５）を除き、そ
れぞれのＤＮＡが、主要バンド、１８５ｍＲＮＡおよび
２２Ｓ頭域に位置する小バンドとハイブリッド形成する
ことを第２図は示している。この後者の頭載は、ＮＤＶ
遺伝子のポリシストロニクス転写物を含有することを示
しているので（コリンズ、ピー・エルら（Ｃｏ１１ｉｎ
ｓ。

Ｐ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、）、　　前記文献）、得られた結
果は４群の明確な同定を許容し、特に、クローン０．１
４は、少なくとも、該Ｆ配列の一部を含むことを示して
いる（コリンズ、ピー・エルラ（Ｃｏ１１ｉｎｓ。

Ｐ、Ｌ、、　ｅｔ　ａ）、　　）、　前記文献）。

（２）核融合１青１云子のヌクレオチド配列およびタン
パク質Ｆのアミノ酸配列組換え型ｃＤＮＡクローン（旧１４）がＦ特異的配列を
含有するクローン中最大の挿入物を有するのでＤＮＡ配
列分析のためそれを選択した。第３図に概略を示した方
法により該配列を実施した。

Ｆタンパク質コーディング領域の両方の鎖の配列の９４
％以上を決定した。ｍＲＮＡ１こ関して、クローンｎ、
１４の挿入物の全ヌクレオチド配列を第１図ｔＣ示す。

それは、ポＩＪ（Ａ）糸ｓよヒａ−Ｃ末端を除いて１７
６４塩基対を含有する。ＡＴＧ（ヌクレオチド６８〜７
０）から始まって、オーカー終止コドン（ヌクレオチ）
’１６４６〜１６４８）で終ｒする単一の長い読み取り
フレームが存在する。この終止コドンは、さら１こ４つ
のインフレームターミネータ−を伴う。

該コーディング傾城は、３つの特有の疎水性頭載を含む
５２６アミノ酸のタンパク質（Ｍｒ５６４６４、いずれ
の炭水化物組成物も含まない）をコードする。Ｆ２は、
おそらく、残基１９から残基９８へ伸長しくＭｒ８３０
４．いずれの炭水化物組成物も含まない）、Ｆ工は４２
３アミノ酸のポリペプチド（残基１０４〜５２６、Ｍｒ
４５５４１、グリコジル化されない場合）である。Ｆは
。

４つの潜在的グリフシル化部位、すなわち、Ｆ２上に１
つ３よびＦ１上に３つ含む。

実施例−２酵母中のＮＤＶ融合タンパク質の発現Ａ、物質および方法１ｉ［１）細菌：用いるイー・コリ株はＭＭ２９４（ｈ
ｓｄＲ１７，すなわち、ｒＫｍＫ）である。

２）ｌ：用いるニス・セレビシアエ（３゜１ｒ）（バッ
ト、ティー・アールら、プロシーディンゲス・オフ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシーズ・オ
フ・ニー・ニス・ニー（Ｂｕｔｔ、　Ｔ、　Ｒ，ｅｔ　
ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ。

ｔＪｓＡ）、８１．３３３２〜３３３６　（１９８４）
である。

プラスミド：第４図；こ概略を示した酵母シャトルベク
ターｐｃＤ１９２は印＃＠の複製開始点としての、よく
知られた２−ｕｍプラスミド（形態Ｂ）の１部、　（Ｈ
Ｈ＋酵母中の選択可能なマーカーとしてのＴＲＰ−１酵
母遺伝子（ストルール、ケーら。

プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ニー・ニス・ニー（
５ｔｒｕｈ＋、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　）　、　７６．１０３５
〜１０３９（１９７９）（Ｉｉｉ）イー・コリ複製開始
点およびその中に挿入される選択可能なマーカー（Ａｐ
）としての、よく知られたｐＢＲ３２２プラスミドの大
部分、　　（ｉＶ）　Ｅｃｏ　ＲＩ　ｇａｌ　Ｋフラグ
メントを欠失し、Ｐｖｕ　Ｕ制限部位を含むＥｃｏＲＩ
ＩＪンヵーで置換されたｐＹｓＫ１２に由来する発現カ
セット（バット、ティー・アールら（Ｂｕｔｔ　、　Ｔ
、Ｒ，ｅｔ　ａｔ）　。

１市内己文「獣）を菖む多喰複製プラスミドである。（
要約すると、咳発現カセットは、ＣＵＰ〜１座の凹め、
すなわち、Ｃｕ−ＭＴプロモーター（バット。

ティー・アーＩしら（Ｂｕｔｔ　、Ｔ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ
、）、　前記文献）、　ＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕｎ−Ｅｃｏ
ＲＩリンカ−およびＣＹ　Ｃ１４伝子の末端、すなわち
、ＣＹＣＩターミネータ−（スミス、エムら、セル（’
３ｍ１ｔｈ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　）　、１６．７５３〜
７６１（１９７９）をａむ。）したがって５このプラス
ミドは、該プロモーターおよび該ターミネータ−の間に
位置する１つの抽持のＰｖｕ［Ｉ制限部位を含む。

ＮＤＶ融合遺伝子を含む発現プラスミドの組み立ての方
法を第４図１こ慨格する。該結合混合物は、該イー・コ
リ株Ｍ　Ｍ　２９４をアンピシリン耐性曇こ形質転換す
るために用いられた。さらに、該クローンを、Ｆの正＠
な配向を含むプラスミドの同定を許容するＥｃｏＲＩｊ
ｊよびＡ　ｖａ　Ｉ消化により、°それぞれ、該１重入
吻の存在および該プロモーターレこ対するその配向につ
いてスクリーニングした。そのようなプラスミドの１つ
は、ｐＹＤＥｌであった。

Ｃｕ　−Ｍ　Ｔプロモーターの調節下、Ｆ遺云子の発現
のテスト：イト−、エッチら、ジャーナル・オフ・バク
テリオロン−（Ｉｔｏ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１５３．１６３〜１６８（
１９８３）の記載と同様にして無傷細胞を用いてｐｙＤ
Ｅｌｌこより酵母株ＢＲＩＯを形質転換し、形質６ｔｆ
８したクローンをトリプトファン不含最少培地（０，６
７％酵＠窒素噸基、アデニン、ウラシルおよびヒスチジ
ン（各２ｏμｙＡｎｅ　）　ヲＭ足した２％グリコース
）上で選択した。ついで、誘発時間を２時間とし、誘発
剤を０．１’　ｍＭの最終濃度のＣａＳＯ３とする以外
バット、ティー・アールら（Ｂｕｔｔ　、Ｔ、Ｒ，ｅｔ
　ａｌ、）（前記文献）の記載と同様にしてＣｕ−ＭＴ
プロモーターを誘発した。緩衝液Ａ（５０ｍＭｈリスー
ＨＣ１！、ｐＨ８，０、２ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ、０．１　
ｍＭジチオスレイトール、５％グリセロール）中グラス
ビーズで粉砕して細胞抽出物を調製した（バット、ティ
ー・アールら（Ｂｕｔｔ。

Ｔ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、）、前記文献）。ツいで、全抽出
物（ペレットおよび上清）の一部を１０％ポリアクリル
アミド−３ＤＳゲル上で電気泳動して該タンパク質を分
離し、ざらに、それをニトロセルロースフィルターに移
・萌させた。移動は、０．０２５Ｍトリス、０．２Ｍグ
リセリン、２０％メタノール（ｐＨ８，３）中２５０　
ｍＡで２時間行った。ｇｖＪＬ該ニトロセルロースフィ
ルターをＰＢＳ緩ｉＭ（１４０ｍＭＮａｃｅ、　２．５
ｍＭＫＣｌ！、１．５ｍＭＫＨ２ＰＯ４，７、８ｍＭＮ
　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４）中シこ浸漬すること醗こよって
室温にて５分間３回洗浄し、さらにＰＢＳ緩所液中３％
ウン１ｍ清アルブミンとともに３７℃番ごて１時間イン
キュベートした。ＲＩＰＡ緩衝液（１５゜ｍＭＮａＣｅ
、２０ｍＭ　トリス−ＨＣ１，ｐＨ７，５，１０ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．５％トリ　ドアＸ−１００，０，１％５Ｄ
Ｓ）中室盆答ごて５分間で３回洗浄した後、さら【こ該
ニトロセルロースフィルターをＲＩＰＡｇ衝液中１００
０倍１こ金沢したＮＤＶ＋こ対するポリクローナル抗体
中３７℃にて１時間インキュベートし、ついでＲＩＰＡ
緩衝液緩衝液４申インキュベーションした（タンパクＷ
Ａは，３５μＣｉ／μ７の比牧肘能＄こてヨウ素〔ヒさ
れた。）。

最後しこ、該ニトロセルロースフィルターをＲＩＰＡ援
衝液で６回洗浄し．屹燥し，コダックＸ−ＡＲ５フィル
ムを用いてオートラジオグラフィーに付した。

公知のごとく他の株ｓよびプラスミド−酵母の発現のた
めのシャトルプラスミド−が同じ目的醗ご用いることが
できるので，明らの）すどとく、前記の株２よびプラス
ミド≦こ対する言及は例示的目的のためにのみなされて
いる）仁すぎない。

Ｂ．ＢＲＩＯ／ｐＹＤＥ１１こおけるＦの発現のテストＦ−特異的ポリヘフチトがＢＲ　１　０／ｐ　ＹＤＥ１
警こて竜生されているか否かを決定するため、０．１ｍ
Ｍ　Ｃｕ　Ｓ　０４を用いてＣｕ−ＭＴプロモーターを
２時間誘発し，細胞抽出物を調製し，さらシこＮＤＶ　
（　Ｉｔａｌｉｅｎ　株）１こ対するポリクローナル抗
体を用いてウェスタンプロット実験にて分析した。

結果を第５図ｔこポす。該図１オ．ネイティブＦ１ポリ
ペプチドのすぐ’ＰＩｃ約５０ｋｄの２つのバンドの出
現を示しているが，対照ＢＲＩＯ／ｐｃＤ１９２の誘発
１こおいてはパン１１才年在しない。したがって、Ｆタ
ンパク質は、分子債の少し異っている２つの杉ｆＱＨこ
で酵母で合成されると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図へ、ら、ｃ３よびｄ）は、；ニーカッスル膚ウィ
ルス融合タンパク質ｃＤＮＡの一重鎖ヌクレオチド配列
およびＦ□タンパク質の推定アミノ酸配列を示す。第２
図は、ＮＤＶ感染細、泡から抽出し。かつ、クローン■、５（レーン１　）、　　１．５０　
　（レーア２　）　、　１１．１４　（レーア３　）　
、　ｉｌＴ、３１　（Ｌ、−７５）。［［，３６（レーン６）、１．５および１．５０（レー
ン７）からの３２ｐ　　＠識プラスミドＤＮＡｊこでハ
イブリッド形成した全ポ’Ｊ　（Ａ）−ｍＲＮＡのノザ
ンプロットを示す図面代用写真である。第３図は、部分
的制限エンドヌクレアーゼ開裂マツプＢよびクローン０
．１４　（ＮＤＶのＦ）ｌこ対して用いた配列決定法を
示している。第４図は、ＮＤＶ：ｐＹＤＥＩからのＦ−
ｃＤＮＡ神入物を含有する酵母プラスミドベクターの構
造を記載している。第５図は、酵母中のＦタンパク質の
発現を示したウェスタンプロットを示す図面代用写真で
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ニューカッスル病ウィルス融合タンパク質のＤＮ
Ａコーディング配列またはそのフラグメントもしくは誘
導体からなり、該フラグメントまたは誘導体がニューカ
ッスル病ウィルス融合タンパク質に対する免疫応答を誘
発しうるポリペプチドをコードすることを特徴とする組
換え型ＤＮＡ分子。
（２）式：【遺伝子配列があります。】で示されるＤＮＡ配列コーディング鎖ならびにその、ニ
ューカッスル病ウィルス融合タンパク質またはニューカ
ッスル病ウィルスに対する免疫応答を誘発しうるポリペ
プチドをコードするフラグメントおよび誘導体。
（３）調節領域に対して下流に前記第（１）項または第
（２）項のＤＮＡ配列を含有する酵母における発現が可
能なベクター。
（４）ｐＹＤＥ１シャトルベクター。
（５）少なくとも１種の前記第（１）項の組換え型ＤＮ
Ａ分子で形質転換した宿主微生物。
（６）前記第（５）項の宿主により産生されるニューカ
ッスル病ウィルスに対する免疫応答を誘発しうるニュー
カッスル病ウィルス融合タンパク質またはポリペプチド
。
（７）ニューカッスル病ウィルスに対する免疫応答を誘
発し、かつ、前記第（５）項の宿主によつて生じる細胞
侵入を起しうる少なくとも有効量のニューカッスル病ウ
ィルス融合タンパク質またはポリペプチドからなること
を特徴とするニューカッスル病ウィルス感染に対する保
護を促す組成物。
（８）ＮＤＶ感染細胞ポリ（Ａ）＾＋−ｍＲＮＡから合
成したｃＤＮＡのライブラリーからのクローンからＦ遺
伝子を単離し、かつ、該Ｆ遺伝子をフレーム中に発現ベ
クター中のプロモーターの後で、かつ、ターミネーター
の前に右配向で挿入することを特徴とする前記第（３）
項のベクターの産生法。
（９）該発現ベクターが細菌発現ベクターである前記第
（８）項の産生法。
（１０）該発現ベクターが酵母発現ベクターである前記
第（８）項の産生法。
（１１）前記第（１）項の組換え型ＤＮＡ分子を供給し
、適当な宿主を該組換え型ＤＮＡ分子で形質転換し、該
形質転換宿主を培養し、該融合タンパク質または核ポリ
ペプチドを収集することを特徴とするニューカッスル病
ウィルスに対する免疫応答を誘発し、かつ、細胞浸入を
起こしうるニューカッスル病ウィルス融合タンパク質ま
たはポリペプチドの産生法。