JPS63249053A - 乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の属する分野］ 本発明は液体中の特定成分の検出定量に有用な乾式分析
要素、特に過酸化水素を生成し得るが過酸化水素を生成
する反応に関与する、液体中の特定成分の検出に適する
乾式分析要素に関する。

［従来技術］ 液体中の特定成分を、その成分が関与する反応の結果生
成する過酸化水素を検出して定量する分析方法は、種々
知られている。それらの中で、米国特許４，０８９，７
４７号や特開昭５９−１９３３５２号に記載されたイミ
ダゾール核を有するロイコ色素を利用する方法がある。

これらロイコ色素は、１モルの過酸化水素がら１モルの
色素を生成し、色素の分子吸光係数が高いので、検出怒
度が高い利点をもつ、しかし分析要素の保存中に発色性
能の劣化する欠点があった。

［発明の解決しようとする３題］ 液体中の特定成分を、その成分が関与する反応の結果生
成する過酸化水素をロイコ色素の発色により検出し定量
する乾式分析要素において、分析要素の保存中、特に氷
点以下の低温でのロイコ色素の発色性能の劣化を実質的
に防ぐことである。

［技術的課題の解決手段］ 上記の技術的課題は、下記一般式［Ｉ］で表されるロイ
コ色素の２種以上の酸との塩の混合物を疎水性溶媒に溶
解した溶液の親水性媒体中への分散物として、水浸透性
層に含む乾式分析要素によって、解決された。

目 一般式［Ｉ］において、Ｒ１は置換されてもよいアリー
ル基をＲ２は置換されてもよいアルキル基を、Ｒ３は置
換されてもよいアリール基を表す。

Ｒ１で表されるアリール基例えばフェニル基の、有して
もよい置換基は、例えばヒドロキシ基、アルコキシ基、
アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基等で
あるが、ジアルキルアミノ基、例えばジメチルアミノ基
、ジエチルアミノ基が好ましい。

Ｒ２で表されるアルキル基、例えばメチル基、エチル基
等は、無置換でもよいが、置換されてもよく、例えばフ
ェニル基、フェノキシ基、４−ジメチルアミノフェニル
基等で置換されてもよい。

Ｒ３で表されるアリール基の有してもよい置換基は、例
えばヒドロキシ基、アルコキシ基（炭素原子数１ないし
４が好ましい〉等である。

Ｒ１で表されるアリール基の代表例は４−ジメチルアミ
ノフェニル基および４−ジエチルアミノフェニル基であ
る　Ｒ２で表されるアルキル基の代表例はベンジル基お
よびフェネチル基であり、好ましいのはフェネチル基で
ある　Ｒ３で表されるアリール基の代表例は４−ヒドロ
キシフェニル基および３，５−ジメトキシ−４−ヒドロ
キシフェニル基である。

上記ロイコ色素の合成法は特開昭５９−１９３３５２号
に記載されている。

上記ロイコ色素は、本発明の分析要素において２種以上
の酸との混合塩として導入される。単なる酢酸塩、塩酸
塩等、単独の塩を用いた場合には、分析要素の保存中に
発色性能の劣化が起きるが、混合塩を用いると発色性能
が維持される。また、混合塩の方が単純塩より疎水性溶
媒中に溶解され易い、ｖｉは無機酸、有機酸のいずれで
もよく、それらの組み合わせでもよい０例えば、塩酸、
硝酸、酢酸、しゆう酸、くえん酸、安息香酸、サリチル
酸、フタール酸等から、選ぶことができる。混合の割合
は特に制限されないが、１種の酸が５モル％以上を占め
るのが有利である。

疎水性溶媒、親水性媒体、および分散方法は、後に述べ
るように、公知のものを用いることができる。

体液などに含有されている生化学物質を定量するに適す
る乾式分析要素はすでに知られており、例えば特開昭４
９−５３８８８号（米国特許第３，９９２，１５８号に
対応）、同５５−１６４３５６号、同５９−１０２３８
８号等に記載されている。乾式分析要素では一最に、被
検成分と分析要素内に含まれる試薬との反応の反応生成
物または未反応成分の旦を、光学的に、例えば発色、変
色、蛍光、発光等の分光測光により測定し、被検成分を
定量する。乾式分析要素を用いると、簡便、迅速に、し
かも高い精度で液体中の特定成分、例えば生化学的活性
物質の分析ができる。

本発明の分析要素は、少なくとも１つの水浸透性層を有
する。好ましくは、少なくとも２層の水浸透性層を有す
る。支持体を有しなくてもよいが、支持体を有すること
が好ましい、支持体は光透過性であることが好ましく、
さらに水不浸透性であることが好ましい。

本発明の分析要素において、ロイコ色素から生成する色
素は、試料液中の所要の特定成分と分析要素中の組成物
との相互作用によって生成してもよいし、上記特定成分
の関与、例えば触媒作用の下に、分析要素中の成分の間
の相互作用によって生成してもよい、相互作用は単一の
反応から成ってもよいし、複数の反応から成ってもよい
、「相互作用」なる用語は、化学活性、酵素−基質複合
体の形成におけるような触媒活性、抗原−抗体反応にお
けるような免疫原活性、その他、染料の濃度５　　が直
接的また間接的に特定の分析物質の存在または濃度を示
すような検出可能な染料を生成できる全ての型の化学的
または物理的相互作用を指す。

上記の相互作用組成物は、選択される分析反応系によっ
て決まる。試料液中の酵素活性を測定する場合には、相
互作用組成物に当該酵素に対する基質を含むことを必要
とする。試料液中の被検成分が酵素の基質である場合に
は、相互作用組成物に当該基質に対する酵素活性物質を
含むことにより、分析を実行することができる。

本発明で有用な相互作用組成物は、例えば酸化酵素活性
を有する物質を含むものである。酵素、例えばグルコー
スオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ等のようなオキシダーゼ活性物質を
、このような酵素に対する基質である成分の分析のため
に分析要素の試Ｍ層や液体展開層（後述）に含ませるこ
とができる。またこれらの基質を別の酵素反応や免疫反
応（抗原抗体反応）の結果生ずる酵素、基質、抗原′、
抗体等の分析にも適用できる。

本発明に用いる有用なロイコ色素の具体例を、その遊離
の形で以下に示す。

［発明の具体的実施態様］ 前記一般式のロイコ色素の混合塩は、乾式分析要素の少
なくとも１つの水浸透性層に含まれる。

水浸透性層は多孔性層であってもよいが、親水性ポリマ
ーを結合剤とする無孔層が好ましい、Ｉｌｌ水性ポリマ
ーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの誘導体く例え
ばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒド
ロキシメチルセルロース）、アガロース、アクリルアミ
ド重合体、メタアクリルアミド重き体、アクリルアミド
またはメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの
共重き体等が利用できる。

前記ロイコ色素混合塩は、これらの親水性ポリマーの連
続相の巾に、疎水性溶媒に溶解した溶液の分散物として
含まれる。疎水性溶媒としては、重一層ゼラチン／ハロ
ゲン化銀カラー写真感光材料で普通に用いられる疎水性
溶媒を利用できる０例えば、米国特許２，３２２，０２
７号に記載された溶媒を用いることができる０例えば、
フタル酸ジエステル類、例えばジプチルフタレート、ジ
シクロヘキシルフタレート、ジー２−エチルへキシルフ
タレート、デシルフタレート等；リン酸エステル類、例
えばトリフェニルホスフェート、トリクレジルホスフェ
ート、２−エチルヘキシルジフェニルホスフェート、ト
リシクロへキシルホスフェート、トリー２−エチルへキ
シルホスフェート；安、？２．香酸エステル類、例えば
２−エチルへキシルベンゾエート；アミド類、例えばＮ
、Ｎ−ジエチルラウリルアミド、Ｎ−テトラデシルピロ
リドン；フェノール類、例えば２．４−ジ−ｔ−アミル
フェノール、脂゛　　肪酸エステル類、例えばくえん酸
トリオクチル：炭化水素類、例えばパラフィン；ハロゲ
ン化炭化水素、例えば塩素化パラフィン等を挙げること
ができる。これらは一般に高沸点溶媒である。

ロイコ色素塩をこれらの高沸点溶媒中に溶解する際、高
沸点溶媒のみを用いてもよいが、低沸点溶媒を同時に用
いてもよいし、またまず低沸点溶媒に溶解した後、高沸
点溶媒と混合してもよい。

低沸点溶媒としては、沸点が５０℃以上、１６０℃以下
の有機溶媒、例えば脂肪酸エステル類、例えば酢酸エチ
ル、酢酸ブチル、酢酸−２−エトキシエチル；ケトン類
、例えばメチルエチルケトン；アミド類、例えばジメチ
ルホルムアミド等が利用できる。

ロイコ色素塩の溶液を前記親水性ポリマーの水溶液中に
分散するためには、公知の種々の分散方法、特に水中油
滴型分散物の調製に適する分散方法を用いることができ
る０分散に当たってドデシルベンゼンスルホン酸す１−
リウム等の、界面活性剤を用いることが有利であ仝。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る０分析要素は多孔性層、試薬層のほか、支持体、展
開層、検出層、光反射層、接着層、ろ過層、吸水層、下
塗り層その他の層を含む多重層の構成を有してもよい、
かような分析要素として、米国特許第３，９９２，１５
８号、同４，０４２，３３５号および特開昭５５−１６
４３５６号各明細書に開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は（１）支持体上に試
薬層、その上に展開層を有するもの。

（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。

（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この順に有するもの。

（６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（７）支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、第一
試薬層、展開層をこの順に有するもの。

上記（１）ないしく５）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい、支持体と試薬層または検出層との
間には吸水層を設けてもよい、上記（１）ないしく３）
と（６）において試薬層と検出層または展開層の間にろ
過層を設けてもよい。

上記（３）ないしく７）において光反射層と検出層、試
薬層または展開層との間、試薬層と検出層との間または
試薬層と展開層との間に、さらにろ過層を設けてもよい
、試薬層が複数層から成る場合に、試薬層と試薬層の間
にさらにろ過層を設けてもよい。

本発明は全血、血漿、血清、尿等の中の種々の分析物質
の定量に有用である０本発明は、例えばグルコース、コ
レステロール、尿酸、グリセロール、トリグリセリド、
尿酸、ビリルビンなどの代謝物質の定量に有用であるの
みならず、クレアチンキナーゼ、トランスアミナーゼ（
例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギ
ンアミノトランスフェラーゼ）、加水分解酵素（例えば
アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファタ
ーゼ等）等の酵素活性の測定にも有用である０本発明は
又、特定の抗体または抗原を用いた免疫分析にも使用で
きる。

本発明の乾式分析要素の試薬層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば特開
昭５８−７０１６３号、特開昭６１−４９５９号、特願
昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８５９号、同
６０−２７９８６０号、同６０−２７９８６１号等に記
載されたような多孔性層も用いることができる。

試薬層は、相互作用組成物の総てを含んでもよく、また
一部のみを含んでもよい、ただし試薬層は前記ロイコ色
素塩を少なくとも含むものとする。

試薬層にはロイコ色素塩のほか、酵素、補酵素、酵素に
対する基質、酸化剤、緩衝剤、硬膜剤等を含有させるこ
とができる。

本発明の分析要素の試薬層に含有させることができるＩ
Ｉ＠剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ペー
ジより４７７ページ（１９６６年）に記載されているグ
ツド（Ｇｏｏｄ　）のＭＷ剤などを挙げることができる
。これらの緩衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法１（堀
尾武−ほか著、甫江堂、’１９８１年）、前記１１ｉｏ
ｃｂｅ＋ｅｉｓｔｒｙ誌第５巻等の文献を参考にして選
択することができる。

多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用を
有する層であることが好ましい、液体計量作用とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、面の方向に単
位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。

展開層その他の多孔性層を構成する材料としては、ｒ紙
、不織布、織物生地（例えば平織生地）、ｔａ物生地（
例えば、トリコット編）、ガラス繊維ｒ紙等を用いるこ
とができる。展開層としては、これらのうち織物、編物
等が好ましい、１１ａ！ｌｌ１５等は特開昭５７−６６
３５９号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよ
い。展１７ＦＩ層には、展開面積、展開速度等を調節す
るため、特開昭６０−２２２７７０号、特願昭［３１−
１２２８７５号、６１−１２２８７６号、６１−１４３
７５４号に記載したような親水性高分子あるいは界面活
性剤を含有してもよい。

多孔性層を接着し積層するための接着層を、試薬層、光
反射層、−過層、吸水層、検出層等の層の上に設けても
よい、接着層は一般に、水で膨潤したときに多孔性層を
接着することができるような親水性ポリマー、例えばゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等
からなる。

本発明の分析要素は光反射層を有してもよい。

例えば、試薬層と検出層との間、または試薬層と液体展
開層との間に、光反射層を設けることができる。光反射
層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化（色変
化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光
する際に、展開層に点着供給された被検液の色、特に試
料が全血である場合のヘモグロビンの赤色、ビリルビン
の黄色等を遮蔽するとともに光反射層または背景層とし
て機能する。光反射層は、親水性ポリマーをバインダー
として、酸化チタン、硫酸バリウム等の光反射性微粒子
が分散された水浸透性の層であることが好ましい、バイ
ンダーとしてはゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリ
ルアミド等が好ましい。

ゼラチンのような硬化可能なポリマーには硬膜剤を加え
てもよい０分析要素には、必要に応じ展開層、試薬層、
検出層等に酸化チタン等の粒子を含有させてもよい。

本発明の分析要素は、液体展開層とは別に全血球を実質
的にろ過して除去する層を有してもよい。

例えば特開昭５８−７０１６３号、特開昭６１−４９５
９号、特願昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８
５９号、同６〇−２７９８６０号、同６０−２７９８６
１号等に記載されたような多孔性層は好適である。

試料液を適用後、試験結果を早く又は正確に得るために
、インキュベーション（加熱）を要素に対して行なうこ
とができる。

分析成分が存在するならば、サンプル中の分析成分の濃
度に基づく速度で分析物質が相互作用組成物と相互作用
する。あるいはサンプル中の分析成分の濃度に基づく量
の相互作用が生ずる０色素を検出するための適当な装置
に分析要素を通すことによって、色素の形成速度を測定
するか、分析成分濃度に対応して形成された色素の量を
測定する９色素は当業者に公知の適当な分光光度測定装
置、例えば米国特許４，５８４，２７５号や、特願昭６
１−２５５８３号に記載された装置を用いて検出できる
。

本発明をさらに具体的に説明するため以下に実施例を記
載する。

［実施例１］ 下記組成Ａのロイコ色素溶液を調製した。

Ａ　： ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４−（４−（ジメチルアミノ）フェニルツー５−フェ
ネチルイミダゾール （ロイコ色素）酢酸塩　　　　４．４９２−（４−ヒド
ロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４−（４−（
ジメチルアミノ）フェニルツー５−フェネチルイミダゾ
ール 塩酸塩　　　　　　　　　　　０．６　　ｇ塩化メチレ
ン　　　　　　　　　１０社Ｎ、Ｎ−ジエチルラウリル
アミド　　　９０Ｍ１髪う４９合［【 下記組成りのゼラチン溶液を作成した。

Ｂ　： アルカリ処理ゼラチン　　　　２３０　＃水　　　　　
　　　　　　　　　　　　１４０Ｇ　ｇグルコースオキ
シダーゼ　　４００００　Ｕペルオキシダーゼ　　　　
　７００００　Ｕ（Ｕは国際単位を表す） ジー２−エチルへキシルスルホ コハク酸ナトリウム　　　　　　５゜ ビス〔（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミンコメタン　　２．３ｇ割１１久１設 Ｂ液をＴＫオートホモミキサー（特殊機械工業社製乳化
器）で約６０００回転／分でかくはんしながらＡ液を添
加し、約３０分間分散して、乳化物を調製した。

１−２．ル亡抜菓薩ａ１１ 上記乳化物を、ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μ
ｌの透明ポリエチレン−テレフタレート（ＰＥＴ）フィ
ルム（支持体）の上に１ｍ２当たり１５０ｇの割合で塗
布し、乾燥した。

１−３．兄叉肚１ 発色試薬層の上に、各成分について下記の被覆量から成
る光反射層（乾燥層厚７μｍ）を、水分散液の塗布・乾
燥により設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　２．９　ｇ／ｌル
チル型二酸二酸化チタン微粒子　１３　ｇｅｍ”ノニル
フェノキシポリグリシド （平均１０グリシド一ル単位含有）　４００　ｍｇ７ｍ
”ｌ−４，災１１ 光反射層の上に下記の被覆量で（乾燥厚５μＲ）接着層
を、水分散液の塗布・乾燥により設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　６．７ｙ７ｍ２ノ
ニルフェノキシポリグリシド （平均１０グリシド一ル単位含有）　６００　ｍｇ７ｍ
”１−５．！ｉ！を 上記接着層の表面に水を３０ｇ７ｍ２の割合でほぼ一様
に供給して湿潤させ、その上に５０デニール相当のＰＥ
Ｔ紡績糸を３６ゲージ編みした厚さ約２５０μｌのトリ
コット編物布地を軽く圧着しくラミネート）接着させて
、多孔性展開層とした。

次に、ポリマー含有エタノール分散液を下記の被覆Ｉに
なるように展開層の上から塗布し、乾燥して、グルコー
ス定量分析用多層分析フィルムを作製しな。

ヒドロキシプロピルセルロース （メトキシ基２８〜３０％。

ヒドロキシプロポキシ基７〜１２％含有。

２％水溶液の２０℃での粘度５０６ＥＩＳ）　　５　ｇ
７ｍ２ノニルフェノキシポリエトキシ エタノール （平均４０オキシ工チレン単位）　　　　５００　ｘｇ
／ｘ”１−６１分逝ジ（ｉ工上− 得られたグルコース定量分析用分析フィルムを一辺１５
１１の正方形チップに裁断し、特開昭５８−３２３５０
号に記載のスライド枠に収めてグルコース定量用生化学
分析スライドを完成した。

［比較例１］ Ａ液の組成を下記に変更した以外はすべて実施例１と同
じ方法で、ロイコ色素の単一の酸の塩を用いた分析スラ
イドを完成しな。

ＡＩ　＝ ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４−（４−（ジメチルアミノ）フェニル〕−５−フェ
ネチルイミダゾール　酢酸塩　５．０９塩化メチレン　
　　　　　　　　　　　１０　ｍｌＮ、Ｎ−ジエチルラ
ウリルアミド　　　　　９０　ｘｉ［測定例１］ 下記のようにして分析要素の保存安定性を評価した。

実施例１および比較例１で作成した分析スライドを一２
０℃で１ケ月保存したものと、４℃で保存したものとに
ついて、発色の比較を行った。

正常人の血漿、およびそれにグルコースを５０ｍｙ／ｄ
ｉ、１００ｍ９／ｄｆ、２００ｘｇ／ｄｉそれぞれ添加
した血漿を用意し、グルコース電極法を用いて正確なグ
ルコース量を定量しな、異なる条件で保存した２種類の
グルコース定量用生化学分析スライドの展開層上に４種
の血漿を各１０μ１点着し、３７℃で６分インクベーシ
ョン後、中心波長５４０　ｎ　ｒｎの可視光でＰＥＴ支
持体側から反射測光により、分析スライドの発色光学濃
度を測定した。結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、混合塩を用いた本発明によ
る分析要素は低温での貯蔵でも、ロイコ色素の発色が変
化しない、単−塩を用いた比較例は低温で貯蔵すると、
発色性能が低下する（特に高濃度領域）。

［実施例２］ 実施例１のＡ液のロイコ色素の塩を第２表に示したよう
に変更し、その他は実施例１と同様にしてグルコース分
析スライドを作製した。

分析スライドを４℃と一２０℃で各１ケ月保存した後、
３３２　ｍｇ／ｄｌｌのグルコースを含む血漿を用いて
発色を測定した。

第２表中、「差」は４℃保存と一２０℃保存の分析スラ
イドの発色濃度の差を意味する。第２表の結果から単−
塩を用いた分析スライドは一２０℃保存したときの発色
濃度の低下が大きいことがわかる。

［実施例３］ 実施例１のＡ液の（溶媒） 塩化メチレン　　　　　　　１Ｏ−１ Ｎ、Ｎ−ジエチルラウリルアミド９０　ｍｌの代わりに
トリクレジルホスフェート　１００ｅａｌを用い、ロイ
コ色素の塩を第３表に余したように変更した以外は、実
施例２と同様に分析スライドを作製した。

分析スライドを４℃と−２０”Ｃで各１ケ月保存した後
、３３２　ｍｇ／ｄｌのグルコースを含む血漿を用いて
発色を測定した。

第３表 第３表中、「差」は４℃保存と一２０℃保存の分析スラ
イドの発色濃度の差を意味する。第３表から明らかなよ
うに、単−塩を用いた分析スライドは一２０℃保存した
ときの発色濃度の低下が大きい。

［参考例］ 第２表に示したロイコ色素塩（計５ｇ）をＮ、Ｎ−ジエ
チルラウリルアミドのみ１００ｍＮに溶解する場合、塩
酸、酢酸または安息香酸各車−塩は６５℃でも全く溶解
しなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）光透過性支持体の上に少なくとも一つの水浸透性層
   を有し、該水浸透性層のうち少なくとも一つに液体中の
   特定成分に対し相互作用する組成物を含む、前記液体中
   の前記特定成分を検出するための乾式分析要素であって
   、前記組成物が下記一般式［ I ］で表されるロイコ色
   素の少なくとも２種の酸との塩の混合物を含み、該塩が
   疎水性溶媒に溶解された溶液の親水性媒体中への分散物
   として、水浸透性層に含まれることを特徴とする乾式分
   析要素。 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （一般式［ I ］において、Ｒ＾１は置換されてもよい
   アリール基を、Ｒ＾２は置換されてもよいアルキル基を
   、Ｒ＾３は置換されてもよいアリール基を表す）２）光
   透過性支持体の上に少なくとも２つの水浸透性層を有し
   、該水浸透性層のうち少なくとも一つに前記塩を含む特
   許請求の範囲１）の乾式分析要素。