JPS63253021A - 生理活性蛋白結合リピツドマイクロスフエア−の製法 - Google Patents

生理活性蛋白結合リピツドマイクロスフエア−の製法

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JPS63253021A
JPS63253021A JP62085876A JP8587687A JPS63253021A JP S63253021 A JPS63253021 A JP S63253021A JP 62085876 A JP62085876 A JP 62085876A JP 8587687 A JP8587687 A JP 8587687A JP S63253021 A JPS63253021 A JP S63253021A
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physiologically active
lms
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lipid microspheres
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Michisato Igarashi
理慧 五十嵐
Miyako Nakagawa
美弥子 中川
Yoko Shoji
東海林　洋子
Yutaka Mizushima
裕 水島
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生理活性蛋白を結合したリピッドマイクロス
フェアー（以下ＬＭＳとする）の製法に関する。
〔従来の技術〕
最近、薬剤の生体内動態を研究する一分野として、生物
薬剤学が脚光を浴びてきており、薬剤を効率良く目的部
位に運ぶために、種々の工夫をこらしたドラッグ・デリ
バリ−・システム（医薬品送達システム）　（ＤＤＳ）
の開発に力が注がれてきている。ＤＯＳの中に、リボゾ
ームや高分子化合物を薬剤のキャリアーとして用いる方
法があるが、そのほかキャリアーとしてＬ！ＩＩｓを用
いる方法がある。ＬｙＳは、現在の薬剤キャリアーの中
では、安全性、生物学的崩壊性、応用範囲の広さ、ター
ゲツティング効果、工業的生産性など可れの面からみて
も、実用価値が高いものと評価できる。
しかし、ＬＭＳは、製剤上の特徴でもあるが、脂肪相を
界面活性剤が取り囲むという構造のために、水溶性の薬
物に応用しにくいという欠点がある。そのため、脂溶性
の低い薬物には、その薬物に脂溶性官能基を導入するか
、或いはＬＭＳを構成する大豆油にエイコサペンタエン
酸又はエイシンなどの薬物溶解性の高い物質を混入する
ことが行われ、それによりＬＭＳＩｍ部に薬物を成る程
度封入させることができる。
このような方法によっても、抗体、インターフェロン、
インターロイキン、組織型プラスミノーゲン活性体、ウ
ロキナーゼなどの生理活性を有する蛋白を、ＬＭＳ内部
に封入させ条ことは、不可能であった。そして、インタ
ーロイキン又はウロキナーゼなど生理活性蛋白の大部分
は、ターゲットとなる細胞や組織への親和性が高く、生
体の他の部分にあまり作用が及ばないように半減期が短
２い。従って、臨床的な効果を得るのに、適当なりＤＳ
が望まれている。
本発明者らは、これら生理活性蛋白をＬＭＳの表面に共
有結合により結合させれば、得られたＬＭＳは、キャリ
アーとしてのＬＭＳのターゲツティング効果の他に、蛋
白がＬＭＳと結釡することにより、生理活性蛋白の半減
期が増大することと細胞親和性が増し、活性蛋白の使用
により期待される効果が、さらに増強されることを見い
出した。
〔発明の概要〕
そして、本発明者らは、この研究をさらに進めて、ＬＭ
Ｓへの結合率が良く、途中の反応過程が簡便であって、
その上活性蛋白の活性が失われない方法について検討し
た結果、本発明を見い出した。
即ち、本発明は、架橋剤としてＮ−サクシンイミジルＳ
−アセチルチオアセテートを含む、生理活性蛋白をリピ
ッドマイクロスフェアーの表面に共有結合により結合さ
せる生理活性蛋白結合リピッ、ドマイクロスフェアーの
製法に関する。
本発明で用いられるＮ−サクシンイミジルＳ−アセチル
チオアセテート（Ｓ　Ａ　Ｔ　Ａ　）は、例えばＳ−ア
セチルチオ酢酸及びＮ−ヒドロキシサクシンイミドを原
料として用い脱水条件下で反応させて得ることが出来る
。
又、本発明で用いられる生理活性蛋白としては、生理活
性を有する蛋白であればどんなものでもよいが、例えば
ウロキナーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、抗体
（癌モノクローナル抗体などの特異性を存する抗体）、
プロティンＡ１インターロイキン１〜３やＭＡＦなどの
各種リンホカイン、インターフェロン又はインクーフｚ
ａン誘導物質、Ｃ５ＦＳＥＰＯＳＩａ、リウマトイド因
子、生理活性を有する醇素、蛋白を置換基に有する葉物
又はその他の蛋白製剤を含む。
又、本発明に用いられるＬＭＳは、従来知られている任
意の方法により製造される。例えば、所定量の大豆油、
リン脂質、そして必要に応じて乳化補助剤、安定剤、界
面活性剤などの添加物を混合し、加熱して溶液とし、通
常のホモジナイザーにより均質化することにより製造さ
れる。この際、本発明では、生理活性蛋白に含まれる架
橋剤即ち５ＡＴＡと共有結合を行う物質を原料の一つと
して用いる。この物質どしては、例えばＮ−サクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）とジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＰＰＥ）との結合物（ＦＤＰ−ＰＥ）、Ｎ−サ
クシンイミジルー４−（ｐ−マレインイミドフェニル）
ブチレート（ＳＭＰＢ）とＤＰＰＥとの結合物（ＭＰＢ
−ＰＥ）などがある。これら物質の使用量は、得られる
脂肪乳剤に対して０．０２０．０６重量％が好ましい。
本発明を行うには、前記の生理活性蛋白に架橋剤である
５ＡＴＡを導入させる。導入に当たっては５ＡＴＡを生
理活性蛋白に対して等モル以上好ましくは１〜５倍モル
用い、好ましくは室温で反応させる。反応生成物をカラ
ムクＣマドグラフィにかけて生理活性蛋白のアセチルチ
オアセチレート化物を得る。この生成物を脱アセチル化
してチオアセチレート化物とする。脱アセチル化は常法
で行われ例えば塩酸ヒドロキシルアミン、ヘベス（Ｈｅ
ｐｅｓ　）バッファー、εＤＴＡなどを用い中性で室温
で反応させる。得られた生理活性蛋白のチオアセチレー
ト化物を前述のＬｊＳとガラプリングさせる。カップリ
ングに当たっては両者をおだやかな条件例えば室温でゆ
るやかに撹拌して行うのが好ましい。
本発明の方法を式で示すと以下の通りである。
（生理活性蛋白としてＩｇＧを例にして示す）。
ＩｇＧ−ＮＨＣＯＣＨよＳＨＩｇＧ−ＮＨＣＯＣＨｔＳ
ＳＣ）ｌｔｃＨｘｃＯＮＨ−ＬＭＳ↑ ＰＤＰ−ＰＥ−１１３’ これに対して、架橋剤としてＮ−サクシンイミジル−３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ） を用いた場合には、以下の通りとなる。（生理岩性蛋白
としてＳＯＤを例にして示す）。
ＳＯＤ　＋　５ＰＤＰ　−５ＯＤ−ＰＤＰ　−（ＤＴＴ
還元）−Ｆ’ＤＰ−ＰＥ−ＬＭＳ この反応式から判る様に、蛋白に結合させる架橋剤とし
てＳＦ’ＤＰを用いたときには、還元剤例えばジチオス
レイトールを用いて還元を行う必要がある。本発明では
、このような還元を行う必要がないため、この従来法に
比べてＬＭＳへの結合率が良く、反応過程が簡便になり
５、活性蛋白の活性が失われないという利点がある。
〔実施例〕
次に本発明の実施例を示す。
参考例　１ ＳＡＴＡの合成 Ｓ−アセチルチオ酢酸２．６８９（０，０２モル）を無
水ジクロロメタン５祿に溶解した。得られた溶液にジク
ロロメタン３０雇中のＮ−ヒドロキシサクシンイミド２
．３９（０，０２モル）の溶液を加え、室温で１０分間
撹拌した。次に、ジクロロメタン２　ｘ（ｌ中のジシク
ロへキシルカルボジイミド４．１５９（０，０２モル）
を加え、室温で１８時間撹拌して５ＡＴＡを得た。
実施例　１ （Ａ）　１０ｇモルのジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＰＰＥ）のクロロホルム・メタノー
ル（９：１）混合溶液に、１２ｇモルのＮ−サクシンイ
ミジルー３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（
ＳＰＤＰ）及び２０ｇモルのトリエチルアミンを加え、
２時間室温で撹拌して、ＤＰＰＥと５ＰＤＰとの結合物
（ＰＤＰ−ＰＥ）を得た。
（Ｂ）　（Ａ）で得たＰＤＰ−ＰＥ　４０１９．　Ｍ製
大豆油２０２、ｆｆ製大豆レシチン２．４７を予備乳化
後、グリセリン５ｇと蒸留水を加えて総量を１００顧と
し、マントンゴーリンホモジナイザーで乳化し、ＰＤＰ
−ＰＥ含有り、ＭＳ（大豆油含有率２０％）を得た。
（Ｃ）　ＳＯＤ　１５ｚｙ（５ｘｌＯリモル）の０．０
５モルリン酸バブファー（ｐＨ７，５）の溶液に、１５
０１モルのＳ　Ａ　Ｔ　Ａのジメチルホルムアミド溶液
５ｍ（７，５ｘ１０−？モル）を加え、３０分間室温で
撹拌した。
Ｇ−２５ゲル濾過により、５ＯＤ−アセチルチオアセチ
レートを採取した。０．５モルの塩酸ヒドロキシルアミ
ン、＝ａ、Ｓモルのへベスバブフ７−１２５１モルのＥ
ＤＴＡ水溶液を１ＯＮ　　ＭａＯＨによりｐＨ１７，０
とし、その５０Ａｄ２を５ＯＤ−アセチルチオアセチレ
ート溶液５００パに加えて、室温で３０分間撹拌して、
５ＯＤ−チオアセチレートを得た。
（Ｄ）　（Ｃ）で得られた５ＯＩ）−チオアセチレート
溶液１　ｘＱと（Ｂ）テ得られたＰＤＰ−ＰＥ含有ＬＭ
ＳＩ、ｗ（とを混合し、２時間室温でゆるやかに混合−
させて、ＳＯＤ−ＬＭＳを得た。
（Ｅ）　ＳＯＤのＬＭＳへの結合率を測定するため、（
Ｄ）の生成物を２０倍希釈して、０．　ｘＡＩｘのメン
ブレンフィルターにより濾過し、溶液中のＳＯＤをＬ！
ＩＩｓ未結合ＳＯＤとした。また、セファロース４Ｂゲ
ルを用いて濾過し、ＳＯＤ−ＬＭＳ分画を採取し、ＳＯ
Ｄ活性及びＳＯＤのＬＭＳに対する結合率を測定した。
ＳＯＤ活性の測定は、キサンチン−キサンチンオキシダ
ーゼのチトクローム法により定法通り行った。その結果
、ＳＯＤ活性は失われず、ＳＯＤのＬＭＳに附する結合
率は７９．６％であった。
実施例　２ （Ａ）　”７１　ＩｇＧを用い、その４５ｇｇを０．０
５モルのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，５、ｌ
ｘモルのＥＤＴＡを含む）に溶解し、１５０Ｒモルの５
ＡＴＡのジメチルホルムアミド溶液Ｘ６Ｊｔ１．を加え
、室温で３０分間撹拌した。得られた反応液をＧ−２５
のクロマトグラフィ？こかは、Ｌ＊ｍｆ　１ｇに−アセ
チルチオアセチレートを採取した。次に、０．５モルの
塩酸ヒドロキシルアミン、０．５モルのへベスバッファ
ー、２５スモルのＥＤＴＡ溶液をＩＯＮ　ＭＩＯＦｉに
よすｐＨ７，０とし、その５０ｄを”’Ｉ　　ｒｇＧ−
７セｆルチオアセチレート溶液５００バに加え、室温で
３０分間撹拌して、ＩＩＪ　ＩｇＧ−チオアセチレート
とした。
（Ｂ）実施例１（Ａ）において、５ＰＤＰの代わりにＮ
−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレインイ°ミドフニ
ニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）を用いて同様な方法によ
りＤＰＰＥとＳＭＰＢとの結合物（ＭＰ　Ｂ−ＰＥ）を
得た。このＭＰＢ−ＰＥを用いて実施例１（Ｂ）の方法
に従ってＭＰＢ−ＰＥ含育ＬＭＳを製造した。又、実施
例１（人）及び（Ｂ）の方法に従ってＰＤＰ−ＰＥ含育
１．Ｉｓを得た。
（Ｃ）（Ａ）の１１！１　　ｊｇＱ−チオアセチレート
溶液゛１スＣと（Ｂ）のＭＰＢ−ＰＥ含有ＬＭＳ　　１
雇或いはＰＤＰ−ＰＥ含宵ＬＭＳ１ｘＩ２とを混合し、
室温で２時間反応させた。（最終の目’ｒ　ｒｇＧｉ１
１度を５ｘ９／ｘＱとした）。
この［ＳＨのキャビング剤としてＮ−エチルマレインイ
ミドを用いた。
（Ｄ）得られた反応生成物中のＬＭＳに結合した１１１
１　ＩｇＧの割合は、セファロース４Ｂカラムクロマト
グラフイによる分離、デキストラン勾配による分離、０
．１μのメンブレンフィルターによる分離の３Ｆ！！の
方法で測定した。何れの方法においてら、３２〜４６％
の結合率を示し、５ｎ／ｘａ（Ｄ””Ｉ　　ＩｇＧ（１
）うち、１．．６〜２２．３１９がＬ’Ｍ　Ｓ　！、：
：共宵結合していた。
実施例　３ ｒｇＧの代わりに少量のモノクローナル抗体を用いて、
実施例２と同様にＬＭＳと共有結合させると、必要量の
抗体、ｈ＜　Ｌ　Ｍ　Ｓと結合していることが晦認され
た。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 架橋剤としてＮ−サクシンイミジルＳ−アセチルチオア
    セテートを含む生理活性蛋白をリピッドマイクロスフェ
    アーの表面に共有結合により結合させる生理活性蛋白結
    合リピッドマイクロスフェアーの製法。
JP62085876A 1987-04-09 1987-04-09 生理活性蛋白結合リピツドマイクロスフエア−の製法 Pending JPS63253021A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992005773A1 (en) * 1990-10-09 1992-04-16 Vestar, Inc. Phospholipid analogue vesicle with a succinimidyl moiety
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