JPS6325554A - 免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、体液試料中の配位体及び配位体を結合するパ
ートナ−を検出するための免疫分析の実行法、更に特に
陽性の結果に対して作用対照（ｎｏｒｋｉｎＦｉｃｏｎ
ｔｒｏｌ）が必要である免疫グロブリンの分析の遂行の
対照法に関する。

免疫分析が病気の診断の目的で患者の体液試料中の被検
体を検出するのに有用であることは良く知られている。

そのような被検体は例えば以下互換的に配位体及び配位
体を結合するパートナ−として言及される抗原又はハブ
テンと特異的に反応する蛋白質である抗体を含む。その
ような反応の特異性、及びフルオロクローム（ｆ　ｌｕ
ｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ）、酵素、光散乱粒子などの光学
的に検出しうる標識とのそのような反応の、標識成分例
えば生物学的に活性な分子に対する能力に基づけば、尿
、血液、血清、脳を髄液、可溶化された身体排泄物など
の試料中の配位体又は配位体を結合するパートナ−の存
在を大きい感度で決定することができる。これらの物質
の存在の病気との関連は病気の診断及び治療処置に大い
に役立つ。

斯くして病気の初期を検出するために大きい感度の免疫
分析が絶えず必要とされている。しかしながらそのよう
な分析を実用上最適化するには、有利には高価な装置又
は他の健康と関連した危険例えば同位体標識と関連した
ものへの依存性を避けることである。確かに本明ｍ書に
参考文献として引用される関連米国特許顧第８７２，３
５５号（ＯＲＤ−６３）及び第８７２，３５７号く○Ｒ
ＤＤ−６５）は、コロイド状金を、可視的に検出しうる
結果をもたらす標識として使用することに基づく２種の
新しい免疫分析技術を報告している。

通常の分析は、しばしば光学的に検出しうる物質のある
場所における存在又は不存在に基づく陽性の結果と陰性
の結果との開を識別する技術者の能力に依存する。しば
しばそのような存在又は不存在は簡単なスポットで同定
でき、多くの場合にはそのような方法が完全に適切であ
る。しかし検出すべき生物学的に活性な分子が低濃度で
存在する時には、弱い陽性の反応しか起こらない。その
ような弱い陽性はしばしば検出が或いは目的に合った分
類が困難である。

本発明の目的はコロイド状金による免疫分析に対して有
用な方法及び一般に陽性の結果の同定を改良するための
他の免疫分析に有用な方法を提供することである。

操作工程の改善は一般に分析の劇的な信頼性、即ち特に
高感度をもたらしたけれど、実質的にすべての分析は、
分析成分が適切に機能していること、分析の操作が適切
に行なわれていることを保証するために、また経験の浅
い分析者にとって或いは定量的指標が有用である場合に
特に有用な対照結果を与えるために、対照物の性能から
恩恵を受けることができる。

本発明の他の観点は、免疫分析系内に対照操作を導入す
る新規な方法を提供することである。

本発明の更なる観点は、分析を行なうのと同時に対照操
作が行なえる方法を提供することである。

本発明の更に他の観点は、対照操作の機能を、陽性の結
果の可視的検出性における改良と組合わせることである
。

免疫分析に対する通常の対照は、試料の添加が行なわれ
たことを保証しない。これは例外というよりもむしろい
つも中断しなければならない臨床の現場でしばしば遭遇
する開運である。

本発明の依然他の観点は、分析成分が活性であり、また
試料の添加及び洗浄工程を含む分析操作が適切に行なわ
れていることを保証するために特に免疫グロブリン分析
に有用な対照法を提供することである。

本発明の本質及び観点によれば、免疫分析の実行の総合
的部分を形成する新規な対照法が提供される。この場合
、観察しうる陽性反応を達成するためには、活性な免疫
分析の成分を陽性試料と共に組合わせられた操作の適切
な実行が必要である。

そのような陽性の結果の検出性を改良するために、対照
物と試料の結果が理想的にはパターンで組合わせられる
。この時パターンは、操作者が陽性の結果を陰性又は結
果のない状態から識別するのに役立つ１本発明は、試料
が免疫グロブリン分析において適切に添加され且つ洗浄
されていることを保証するのに特に有用である。

最も好適な具体例では、「プラス」のパターンが使用さ
れる。プラスの１つの足（ｌｅｇ）は良好な対照に由来
し、一方プラスの他の足は試料中の検出すべき配位体又
は配位体を結合するパートナ−の存在に由来する。試剤
の不足又は操作者が正しい具合に分析を行なわない場合
には、表示の対照部分又は領域が欠けており、従って「
プラス」の表示は現われず、誤った陽性が避けられる。

同様に分析成分が活性であり且つ分析が適切に行なわれ
ている場合、「マイナス」の表示は試料中配位体又は配
位体を結合するパートナ−の不存在を示す。試剤が活性
であり、分析が適当に行なわれ、１つ配位体又は配位体
を結合するパートナ−が試料中に存在する場合だけ、対
照と試験領域の双方の「標識化」のために「プラス」が
得られる。

本発明は、分析の対照部分又は領域からの表示が試料の
添加の場合にだけ起こるという点で、免疫グロブリンに
基づく分析に関して特に有用である。これは、臨床実験
者が多くの仕事を行なっていて常に中断され、従ってそ
のような中断中に患者の試料を特別な試験箇所に添加し
たかしないかが不確かになった時特に重要である。その
ような好適な試験においては、試験領域が付着した且つ
水性の人間の試料で検出すべき免疫グロブリンに特異的
な配位体を有する。対照領域はすべての同様な人間の試
料中に至るところに存在する人間の免疫グロブリンを非
特異的に捕捉するために固定化された抗−人間のＩｇＧ
又はＩｇＭを有する。

洗浄工程は結合していない物質、即ち標識された抗−人
間のＩｇＧ又はＩｇＭと接触する前に標識化する部位を
除去する。

本発明は異なった検出しうる標識を用いる種々の異なっ
た免疫分析法に関して利用しうるけれど、説明を簡単に
するために、前述した米国特許項第８７２．３５５号（
ＯＲＤ−６３）及び第８７２゜３５７号（ＯＲＤ−６５
）のコロイド状金による分析を用いて本発明を例示する
。しかしながら本発明はそのような分析又は標識に制限
されるものではなく、同業者は異なる標識又は表面を用
いる免疫分析に関して適当な代替法を容易に決定できる
ことが理解される。

米国特許顯第８７２，３５５号（ＯＲＤ−６３）のＣＯ
ＧＭＡ分析は、本質的により明白でない「スポット」よ
りも「プラス」又は「マイナス」が容易に同定されると
いう点で、本発明の１つの観点にとって非常に有用であ
る。風疹（Ｒｕｂｃｌｌ［Ｌ）に特異的な人間の免疫グ
ロブリン（風疹にさらされたことの指示剤）の検出を適
当な例として用いると、次のように配置された生物学的
に活性な成分又は分子を有する膜を用いる： 風 疹 マウスの抗−人間の抗体 抗 原 多くの異なった特異性の免疫グロブリンを含有する全血
試料又は血液成分（例えば血清又は血ｉ）は風疹に特異
的な免疫グロブリンを含有しうる。

その試料の膜への添加は、マウス（又はいずれかの種）
の抗−人間の抗体による非特異的な免疫グロブリンの捕
捉を可能にする。風疹に特異的な免疫グロブリンも存在
するならば、それは垂直の領域に捕捉されるであろう。

風疹の抗原は直接に又は化学的な結合剤を介して或いは
免疫学的な複合化によって膜に付着していてよい。次い
でさもなければ標識した試剤が非局在的に付着するから
、付着してない免疫グロブリンを表面から除去するため
に洗浄工程を行なう。

続いてコロイド状金で標識された抗−人間のＩｇＧ又は
ＩｇＭを膜と接触させ、これは今や水平線に固定化され
た免疫グロブリン並びに試料中に存在し且つ垂直領域に
捕捉された風疹に特異的な免疫グロブリンと反応させる
。斯くして試料中に風疹の免疫グロブリンが存在するな
らば、「プラス」が得られる。尿中に風疹の免疫グロブ
リンがなければ垂直線に免疫グロブリンは付着せず、従
って標識された免疫グロブリンと同様に、ポリクロナー
ル又はモノクロナールのいずれかの起源のＩｇＧ又はＩ
ｇＭであってよい抗−人間の免疫グロブリンを含む水平
の対照領域だけにコロイド状金で標識された抗−人間の
抗体が付着する。更に線を用いた円、四角、三角、実際
の単語などを含めて他のパターンも同様に使用できる。

製造上の立場及び特に一般に対する操作の簡便さからは
「プラス」及び「マイナス」のパターンが最も好適であ
る。他の代替法は容易に明らかであり、例えば抗原又は
配位体の膜への直接適用（一般に抗体−配位体複合物よ
りも付着しにくい）、並びに異なった種類の標識又は異
なった種からの免疫グロブリンでの代替を包含する。同
様に上述の対照法は、他の免疫グロブリン試験、標識法
又は表面に対して明確な代替を行なっても同様に良好に
機能する。

例えば、風疹、トキソブラスマ症、サイトメガロウィル
ス症、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　（エイズに対する）、感染性
単核症、ヘルペス、肝炎などの病気の検出に重要である
体液例えば尿、血清、血漿などの存在下に免疫グロブリ
ンを検出する場合、抗体が特異的である配位体又は同等
の免疫学的に反応性の成分を膜上に置いて、該抗体を捕
捉せしめる。この時Ｈ’Ａされた成分は適当且つ理想的
には適切な抗−人間のＩｇＧ又はＩｇＭとして選択され
、−方膜の対照部分は標識した成分を捕捉するために適
当には抗−人間のＩｇＧ又はＩｇＭであるように選択す
ることができる。他に、すべてのそのような試料中に存
在していることが既知である試料中の成分を結合する生
物学的に活性な分子を対照領域においてもよい。この時
標識された試剤は試料成分及び配位体に特異的な試料の
免疫グロブリンの双方と反応することができる同様の標
識された生物学的に活性な分子及び／又は標識された抗
−人間の免疫グロブリンを含有しうる。

従って検出すべき抗体が存在すれば「プラス」が得られ
、一方抗体が存在しなければ「マイナス」になる、その
ようなマイナスは、膜の抗−人間の抗体及び標識された
抗−人間の免疫グロブリンの両方が働いていることを示
す、更にそれは試料が適当に添加されていること（さも
なければ標識された抗−人間の免疫グロブリンは局在化
しな）＞）、また試料添加後の洗浄工程が行なわれてい
ること（さもなければ「マイナス」よりも「スポットｊ
が見える）、そしてこれらの工程がＪ切な手段で行なわ
れていることを示す、それ故に「マイナス」が現われな
ければ、試験の失敗を示す６更に本発明は米国特許願第
８７２，３５７号（ＯＲＤ−６５）に記述されているス
トリップ要素（ｓｔｒｉｐ　ｅｌｅｍｅｎｔ）分析の場
合にも有用である。

そのような分析では、ストリップ要素の長軸に交叉する
ように適用される第１の即ち下の方のバンドは風疹又は
他の抗原を付着し、これによって血液試料中の風疹に特
異的な免疫グロブリンを検出するための試験領域を形成
する。試料と接触せしめられるストリップ要素の端のよ
り遠くに位置する上の方のバンドは抗−人間の免疫グロ
ブリンを付着し、対照領域として役立つ。血液試料はス
トリップ要素の端まで適用される。風疹の免疫グロブリ
ンが存在すると下の方のバンドに付着し、一方池の試料
の免疫グロブリンは非特異的に上の方のバンドに付着す
る。コロイド状金で標識された抗−人間の抗体（ＩｇＧ
又はＩｇＭ）をストリップの底部と接触させ、未反応の
成分を洗い落しな後に移動させる。この結果上の方の対
照バンドは、ストリップ要素成分とコロイド状金で標識
された成分が活性であり、適当にストリップ要素に適用
されていることを示すのに役立つ。最初の例に記述した
ものと同一の成分の代替の可能性はこのストリップ分析
にも当てはまる。更にストリップ分析は多数の試験領域
及び可能ならば多数の対照領域を提供し、ストリップを
、多くの状態の試験に適用［例えばトーチ法（ｔｏｒｃ
ｈ）　Ｊ可能にし或いは異なった試料のＮ顕／配位体又
は配位体を結合するパートナ−の試験に有用ならしめる
。

以上本発明の対照法の思想は免疫グロブリン試験に対し
てかなりの利点を提供する。試料添加における人間の血
清が膜に結合したくマウスのモノクロナールの）抗−人
間のＩｇＧ（又はｒ　ｇＭ）と反応する免疫分析のすべ
ての工程が対照される。

試料を添加してないならば、人間のＩｇＧ（又はＩ　ｇ
Ｍ）は膜に結合した抗ＩｇＧ領域に結合しない、更に対
照は洗浄が適当に具合に行なわれていることを保証する
。適当に洗浄されていないならば、標識された抗−人間
の免疫グロブリン試剤を中和する遊離の人間のＩｇＧが
表面中又は上に存在し、従って標識された抗体及び膜に
結合した抗体領域間の反応が少なくなり或いは現われな
い。

更にｉ識された成分を添加しないならば全熱シグナルは
見られず、又は添加したが洗浄工程による如くして適当
に除去されていないならば識別できる「プラス」又は「
マイナス」が現れない。結果として、従来公知でない真
の対照が活性成分、試料の添加、適切な洗浄工程、及び
標識された成分の添加の保証を達成する。

上述に対する多くの改変が本発明の精神又は特許請求の
範囲から離れずして行ないえないことは同業者のすでに
理解するところである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の免疫グロブリンを、これに特異的な１種又
   はそれ以上の配位体を結合するパートナーを用いて検出
   する免疫分析であって、該配位体を結合するパートナー
   の少なくとも１つが、免疫グロブリンと配位体を結合す
   るパートナーとの間の反応が起こる時を決定するために
   付着された検出しうる標識を有する免疫分析において、
   同時に且つ免疫分析の一部として行なうべき免疫分析の
   対照を付与し、但し該対照が試料の、配位体を結合する
   パートナーへの付加の実行及び必要な洗浄工程の実行を
   含む分析の処理工程を確認する、ことを含んでなる該免
   疫グロブリンを検出するための免疫分析法。 ２、表示（ｒｅａｄｏｕｔ）の対照部分と表示の試験部
   分が一緒に合さって識別しうるパターンを形成する特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３、そのようなパターンが「プラス」であり、また対照
   部分が「プラス」の１つの足（ｌｅｇ）であり、一方試
   験部分が「プラス」の他の足である特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 ４、ａ）免疫グロブリンが特異的である配位体を有する
   第１域及びすべての人間の体液試 料中のいたるところに存在して同様の免疫 分析試験を受ける試料中の成分と反応しう る結合する物質を有する第２域を準備し ｂ）該第１及び第２域を人間の体液試料と接触させ； ｃ）結合していない物質を該第１及び第２域から除去し
   ； ｄ）該第１及び第２域を、該試料の免疫グロブリン及び
   該試料の成分の両方と反応しう る標識された抗−人間のＩｇＧ又はＩｇＭ を含んでなる標識試剤と接触させ； ｅ）未反応の物質を該第１及び第２域から除去し；そし
   て ｆ）該第１及び第２域を標識の存在に対して観察し、但
   し該第１及び第２域の両方における標識の存在は陽性の
   結果を得るために必要である、 工程を含んでなる人間の体液試料中の免疫グロブリンを
   検出するための免疫分析。 ５、該第１及び第２域が一緒になって同定しうるパター
   ンを形成し、また該第１又は第２域のいずれかだけの標
   識の存在が陰性の結果を構成し、該第１及び第２域の両
   方の標識の不存在が免疫分析の失敗を示し、そして同定
   しうるパターンを形成しない該域の標識の存在が免疫分
   析の失敗を示す特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、標識がコロイド状金、蛍光分子、及び酵素からなる
   群から選択される特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７、該試料成分が人間の免疫グロブリンであり、そして
   該結合する物質が抗−人間の免疫グロブリンである特許
   請求の範囲第４項記載の方法。 ８、該試料成分が免疫グロブリン以外の蛋白質であり、
   そして該標識された試剤が更に標識された蛋白質を結合
   するパートナーを含んでなる特許請求の範囲第４項記載
   の方法。 ９、試料中の免疫グロブリンを、これに特異的な１種又
   はそれ以上の配位体を結合するパートナーを用いて検出
   する免疫分析であって、該配位体を結合するパートナー
   の少なくとも１つが、免疫グロブリンと配位体を結合す
   るパートナーとの間の反応が起こる時を決定するために
   付着された検出しうる標識を有する免疫分析において、
   試料が付加されたことを保証するために試料成分と反応
   しうる域を含んでなり、該試料成分が更に該標識された
   試剤と反応することを含んでなる該免疫グロブリンを検
   出するための免疫分析。