JPS63258559A - 特に人工栄養摂取および食事療法で用いることのできる、ジペプチドおよびトリペプチドに富むペプチド混合物及びその製造法、ならびにその用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素によるタンパク水解物から、ジペプチド
およびトリペプチドに冨む混合物を製造する方法に関し
、該混合物は、特に経口、腸内または非経口人工栄養摂
取および食事療法で使用することができる。

（従来の技術） 今日では、ジペプチドおよびトリペプチドは、経口投与
であれ腸内投与であれ人工栄養摂取において実際的価値
を有しているという事実が認識されかつ立証されている
。他の経験は非経口栄養摂取も興味あるものであること
を示しているように思われる。

人工栄養摂取は、肉体的損傷（事故、外科手術、食道癌
など）のために、あるいは正常な食事を不可能とする全
身的生理的状態（昏睡、極度の感染症、外傷、火傷など
）のために、正常な様式で食物を摂取できない患者に適
用される技術である。

人工栄養摂取は天然ルート（消化管）を通して投与でき
、その場合該栄養摂取は経口または腸内栄養摂取と呼ば
れる。他の場合において、該栄養物は直接血流中に導入
され、この場合には非経口栄養摂取と呼ばれる。これら
の種々の投与法（経口、腸内、非経口）は十分に確立さ
れたプロトコールに従いかつ病院で良く知られた技術に
従って実施され、その際適当な器具が必要とされる（チ
ューブ、ポンプ、カテーテル）。栄養供給法の選択は患
者の状態に依存し、いくつかの場合には専門医療チーム
がこれを実施するために必要とされる（ＩＩ生法）。極
まれではあるが、人工栄養摂取は家庭で行われる。

完全な栄養摂取では、脂質、炭水化物、ミネラルおよび
ビタミンと混合したプロタイド（タンパク、ペプチド、
アミノ酸）として窒素を投与する必要がある。

正常な栄養供給にあっては、消費される窒素の大部分は
タンパクとして摂取され、かつ消化管内の酵素により消
化される。

しかしながら、人工栄養摂取が必要とされる上記状況の
多くの場合においては、疾病のためあるいは疾病または
外科後には腸の限られた部分のみが機能を維持している
にすぎないという事実のために酵素不足であることから
、タンパクは効率的に消化できない。この問題は純アミ
ノ酸溶液を用いることにより有利に解決されている。

しかしながら、人工栄養摂取においては、これらアミノ
酸混合物は以下のような多数の理論的および実際上の欠
点を有している。

Ｏアミノ酸は能動輸送過程により腸から輸送され、異る
アミノ酸が輸送に対し競合し、この競合のために腸での
吸収が制限される恐れがある。

Ｏいくつかの病理的状態はいくつかのアミノ酸の輸送を
乱す恐れがあり、これは吸収容量の減少を生ずる。

Ｏいくつかのアミノ酸はタンパク中でアミド（アスパラ
ギンおよびグルタミン）として存在し、これらのアミド
形のアミノ酸は溶液中で不安定であり、かつ脱アミノ化
されて夫々アスパラギン酸およびグルタミン酸を与え、
特にグルタミンは、人工栄養摂取において重要であるに
も拘らず、このようにして公知のアミノ酸混合物中で不
足状態となる。

・静脈内用途に対し、所定量の窒素を輸送すべく十分に
濃縮されたアミノ酸溶液は通常の表層静脈を介して注射
するには高すぎるモル浸透圧濃度を有している。なぜな
ら、これは組織破損（静脈炎はこの最も一般的な例であ
る）を住するからである。

この問題は深部の静脈にカテーテルを埋め込むことによ
り回避できる。

しかしながら、この外科処置は複雑であり、かつ敗血症
の高い危険性を有している。これらの問題は、アミノ酸
を主成分とする栄養溶液の静脈内利用を著しく制限する
可能性がある。

最近、ペプチド結合によって結合した２〜３個のアミノ
酸を含むペプチド分子（夫々、ジペプチドまたはトリペ
プチド）が、アミノ酸により利用されていた種々の機序
で腸からそのまま吸収されることが示されたＣＤ、Ｂ、
Ａ、シルク（Ｓｉｌｋ）、ペプチドアブソープション　
イン　マン−ガツト（Ｐｅｐｔｉｄ。

ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｎ−Ｇｕｔ）、１９
７４．１５．１９４；Ｄ、’Ｍ、マシュース（Ｍａｔｔ
ｈｅｗｓ）　、インテステイナル　アブソープション　
オブ　ペプタイズーフィジカル　レビｓ−（Ｉｎｔｅｓ
ｔｉｎａｌ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ−Ｐｈｙｓ、　Ｒｅｖ、）、１９７５．５５．５３
７；Ｓ、Ａ、アンド（Ａｄｉｂｉ）およびｙ、ｓ、キム
（Ｋｉｍ）、ペプチドアブソープション＆ハイトロリシ
ス、イン　フィジオロジー　オプ　ザ　ガストロインテ
ステイナル　トラクト（Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｂｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ　ａｎｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ、　ｉｎ　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｃｌ）　％　Ｌ、　　Ｒ，ジョン
ソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、ラーベンプレス刊（Ｒａｖ
ｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク１０７３参照〕。

腸内の表面細胞は明らかにジペプチドおよびトリペプチ
ドを吸収し、かつこれらをその場でアミノ酸に加水分解
し、生成アミノ酸を血液中に放出する。同様な過程は腎
臓にも存在する（ジペプチドおよびトリペプチドを加水
分解すると共に再吸収し、かつアミノ酸を血流中に通す
）。

上記観点から、窒素源としてのジペプチドおよびトリペ
プチドを含有する栄養混合物は、Ｏアミド形のアミノ酸
の安定性、 Ｏジペプチドおよびトリペプチドの良好な溶解度に基く
高い窒素含有率、および Ｏ低いモル浸透圧濃度 に関連するいくつかの利点を有する。

タンパクの酵素による消化は低級ペプチド即ち“小さな
ペプチド”の混合物を生成する手段として広く利用され
ている。

従って、上記すべての調製物はペプチド鎖長の広いスペ
クトル（２〜２０以上のアミノ酸）を含むが、特別に必
要とされるジペプチドおよびトリペプチドの含量は極め
て低い（約５〜２０％）。

ジペプチドおよびトリペプチドよりも高級なペプチドは
上記の連動性吸収を示さず、従ってこれらの明確に限定
されていないペプチド混合物は、臨床用途において最適
な窒素吸収を生じない。

静脈内利用については、かなりの量の高級ペプチドを含
む混合物は更に以下の２つの理由から不満足なものであ
る。

Ｏまず、３個を越えるアミノ酸を含むペプチドは、後に
再吸収されることなく尿中に排出され、従って窒素利用
は極めて低効率であって、゛その６０％もが失われる。

Ｏ第２に、高級ペプチドは完全な抗原生サイトを有して
いる危険性をもち、抗体の生成あるいはアナフィラキシ
−反応を起こす可能性さえも有している。・ かくして、公知の酵素によるタンパク水解物は、ジペプ
チドおよびトリペプチドのみを含む混合物を製造するに
は不むきである。

ジペプチドおよびトリペプチドは化学的合成によっても
製造でき、経験によればこれらのジペプチド混合物は人
工栄養摂取において有効に使用できることが示されたＣ
Ｐ、ファースト（ＦＵＲＳＴ）、ペプチド　イン　バレ
ンチラル　ヌードリージョン−クリニカル　ヌードリー
ジョン（Ｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎ　ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ
　ｎａｔｒｉｔｉｏｎ−Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｎｕｔｒｉ
ｔｉｏｎ）、１９８５．４（別冊）、ｐ１０５；Ｂ、Ａ
、クルライシック（ＫＲＺＹＳＬＫ）＆Ｓ、　Ａ、　７
ジビ（ＡＤＩＢＩ）、コンパリスン　オブ　メタボリズ
ム　オブ　グリシン　インジェクテッド　イントラビナ
スリーイン　フリー　アンド　ジペプチド　フォームズ
（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
　ｏｆ　ｇｌｙｃｉｎｅ　１ｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｒａ
ｖｅｎｏｕｏｓｌｙ　ｉｎ　ｆｒｅｅ　ａｎｄ　ｄｉｐ
ｅｐｔｔｄｅ　ｆｏｒｍｓ）；Ｈ，Ｊ、スタインハート
　（ＳＴＥ１ＮＨＡＲＤ↑）　、Ｇ、Ａ。

パレオス（ＰＡＬＥＯ５）　、Ｍ、ブランドル（Ｂｌ？
ＡＮＤＬ）、Ｗ、　Ｌ、フエクル（ＰＥＫＬ）　＆Ｓ、
　Ａ、アンド（ＡＤＩＢＩ）、エフィカシーオプ　シン
セティックジペプチド　ミックスチャ−アズ　ザ　ソー
スオブ　アミノ　アシッズ　フォー　トータル　バレン
チラル　ヌードリージョン　イン　ア　サブヒユーマン
　プライメート（Ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｈ
ｅｔｉｃｄｉｐｅｐｔｉｄｅ　ｍ１ｘｔｕｒｅ　ａｓ　
ｔｈｅ　５ｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ
ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　ｎｕｔｒ
ｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　５ｕｂｈｕｎ＋ａｎｐｒｉｍａ
ｔｅ））　＊ しかしながら、この方法も以下の如き欠点をもつ。即ち
、まず可能なジペプチドの全数（４００）を首尾良く合
成することは不可能であり、従って実験はグリシンを含
むジペプチド（即ち、グリシン−ＸｌここでＸはもう一
つのアミノ酸である）の限られた数に基いていた。

この方法は人手可能なジペプチドの数を制限し、かつグ
リシン過剰のために不均衡を生ずる恐れがある。

第２に、化学的合成法のもう一つの限界はジペプチド製
造コストであり、これは栄養摂取に用いるには高価すぎ
る。

（発明の目的および手段） 本発明は、上記従来法の諸欠点を克服することを可能と
するものであって、酵素によるタンパク水解物から、主
としてジペプチドおよびトリペプチドを含有するペプチ
ド混合物の製造方法に係り、該方法はジペプチドおよび
トリペプチドを発熱物質を含まない濃縮された形状でク
ロマトグラフィー抽出することを含み、該混合物は人工
栄養摂取において臨床的に用いるのに適しており、かつ
静脈内投与に適した一定含量のミ・ネラルを含んでいる
。この方法で得られるペプチド混合物は経口および腸内
栄養供給においても利用できる。

既に上記した如く、ジペプチドおよびトリペプチドは、
経口または腸内栄養供給における通常の栄養分（ポリマ
ー性栄養分とも呼ばれる）および必須栄養食（アミノ酸
としてプロタイドを含む）に勝る数種の利点をもたらす
。

第１の利点は運動学的性質である。即ち、腸内において
、窒素の供給は、該プロタイドがジペプチドおよびトリ
ペプチドの状態にある場合には、これらが基本的即ちオ
リゴマー形（胃および膵臓での消化生成物）である場合
よりも、より急速である。

第２の利点は、ジペプチドおよびトリペプチドが吸収に
対してアミノ酸と競合しないという事実に由来する。

第３の利点は、小さなペプチドの極めて良好な溶解性で
ある（高いチロシン含有率；１β当たり２５ｇ以上の窒
素を含む溶液を与える可能性をもつ）。

第４の利点は低いモル浸透圧濃度対窒素比に関連する（
アミノ酸溶液よりも２〜３倍良好である）。

従って、アミノ酸輸送系が乱されているある病理学的状
態の下では、ジペプチドおよびトリペプチドの吸収は変
化を受けないかも知れないことが理解できる。

非経口栄養補給におけるジペプチドおよびトリペプチド
の価値は以下の３点に基くものである。

１、°アミノ酸溶液と同じ量の窒素を含有するジペプチ
ドおよびトリペプチドの溶液は２〜３倍低いモル浸透圧
濃度を有する。

この点は特に重要である。というのは末梢経路で患者の
栄養要求に十分な窒素を供給するからであり、このこと
はアミノ酸溶液では不可能である。

更に、ジペプチドおよびトリペプチド溶液のモル浸透圧
濃度が低いことにより、静脈炎型の合併症および循環系
の他の病理の危険性が低くなる。

最後にかつ結局のところ、敗血症の危険性に関する限り
において、深部の血管よりむしろ末梢血管を利用する方
が容易かつより危険性が低い。

２、°アミノ酸溶液はグルタミンを含んでいない。

というのは、このアミノ酸が同化作用に関して極めて重
要であるにも拘らず、水中で不安定であるからである。

逆に、グルタミンを含むペプチドは水性溶液中で極めて
安定である。

グルタミンについて述べたことはアスパラギンについて
もいえる。

３、°溶解度の観点から、いくつかのアミノ酸はアミノ
酸溶液中に限られた量でしか存在しない。

最も特徴的な例はチロシンの場合である。

チロシンを含有するジペプチドおよびトリペプチドは、
非経口栄養補給に依存して、患者のチロシン要求を満た
すことを可能とする溶解度を有する。

チロシンについて述べた事項は、同様に低溶解度の他の
アミノ酸についてもいえる。

本発明は、ジペプチド、トリペプチドおよびトリペプチ
ドよりも高級なオリゴペプチドを含む酵素によるタンパ
ク水解物から、ジペプチドおよびトリペプチドに富むペ
プチド混合物を調製する方法に関し、この方法は以下の
工程を含む。

Ｏ該水解物を、酸形のカチオン交換樹脂のカラムでクロ
マトグラフィー処理する工程：Ｏ該樹脂カラムを、好ま
しくは滅菌しかつ発熱物質を含まない水で洗浄する工程
： Ｏ該交換樹脂カラムをアルカリの水性溶液で溶離する工
程；および Ｏジペプチドおよびトリペプチドに冨む溶出画分を回収
する工程。

更に詳しくいえば、ジペプチドおよびトリペプチドに富
む溶出画分は該溶出液の屈折率が５に達する時点と、該
溶出液のｐＨが、該画分の回収の完了する８に達する時
点との間に該カチオン交換樹脂カラムから流出する画分
である。

本発明の方法で出発物質として使用する酵素によるタン
パク水解物は、限外濾過されかつペプチドおよびアミノ
酸を含む、タンパクの酵素消化生成物であり、該ペプチ
ドはジペプチド、トリペプチドおよびトリペプチドより
も高級なオリゴペプチドを含む。

工業的観点から、この水解物を製造するのに使用できる
タンパクは例として以下のものを含む。

Ｏ卵白（オボアルブミン）； Ｏ乳タンパク：ラクトアルブミンおよびカゼイン； Ｏ屠殺場で得られるタンパク：血清アルブミンおよび脱
色ヘモグロビン； Ｏ魚工業および魚カンズメ工業の生成物；および Ｏ植物起源の生成物二大豆タンパクおよびアルファルフ
ァタンパク。

工業的観点から、この製造工程に使用できる酵素の例は
以下の通りである。

Ｏ微生物由来の酵素。これは伝統的に３つのカテゴリー
に分類されている。

・酸性培地中で使用できるもの（ｐＨ１，５〜４）；・
はぼ中性ｐＨ（ｐＨ５，０〜８．０）で使用できるもの
；および ・アルカリ性培地中で使用できるもの（ｐＨ７〜１１）
。

モルシン（Ｍｏｌｓｉｎ　：登録商標；フジサワ　シー
。

ケー、　　（Ｐｕｊｉｓａｗａ　Ｃ，に、に、））およ
びサンプローズ（Ｓａｎｐｒｏｓｅ　：登録商標；ハン
キューキョーエイプッサンケー、ケー、　　（Ｈａｎｋ
ｙｕ　Ｋｙｏｅｉ　Ｂｕｓｓａｎ　Ｋ、に、）は第１の
カテゴリーに属し、ニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ
　：登録商標：ノボインダストリー（Ｎｏｖｏ）　）、
プロテアーゼＢ５００ラビダーゼ（Ｐｒｏｔ’ｅａｓｅ
　Ｂ５００：登録商標；ラピダーゼ　ギスト　ブロカデ
ス（Ｒａｐｉｄａｓｅ　Ｇ１５ｔ　Ｂｒｏｃａｄｅｓ）
　）およびエッチ。

ティー、プロテオリティック（Ｈ，Ｔ、Ｐｒｏｔ’　ｅ
ｏｌｙｔｉｑｕｅ：登録商標；マイルズ（Ｍｉｌｅｓ）
　）は第２のカテゴリーに属し、アルカラーゼ（Ａ１ｃ
ａｌａｓｅＨ登録商標；ノボ（Ｎｏｖｏ））　、プロテ
アーゼＡ　２　（Ｐｒｏｔ’ｅａｓｅ　Ａ２：登録商標
；ラピダーゼ　ギスト　ブロカデス（Ｒａｐｉｄａｓｅ
　Ｇ１５ｔ　Ｂｒｏｃａｄｅｓ）　）およびオプティマ
ーゼ（Ｏｐｔｉｍａｓｅ　：登録商標；マイルズ（ＭＨ
ｅｓ）　）は第３のカテゴリーに属する。

Ｏ動物起源の酵素：本質的にペプシン、キモトリプシン
およびトリプシン； Ｏ野菜起源の酵素；最も広範に利用されているのはパパ
イン、フィチンおよびブロメリンである。

これらタンパクの１種またはそれ以上に対しこれら酵素
の１種以上を作用させることにより、１０〜５０％のジ
ペプチドおよびトリペプチドを含有できる水解物が得ら
れる。

本発明により使用できる、酸形のカチオン交換樹脂は以
下の基準を満たす必要がある。

０これらは脱カチオン（脱塩）およびペプチド分離の要
件を満さなければならない； −〇これらは優れた機能抵抗および耐薬品性をもたなけ
ればならない： Ｏこれらは高い安定性と長い耐用寿命をもたなければな
らない： Ｏ高い交換容量をもたなければならない；Ｏ広いｐＨお
よび温度条件下で使用できるものでなければならない； Ｏ最小の膨潤能をもたなければならない；Ｏ容易に再生
できるものでなければならない；Ｏ許容できる価格でな
ければならない；Ｏ入手容易でなければならない；およ
びＯ再現できる特性のものでなければならない。

従来脱イオンまたはアミノ酸分離において利用されてい
た、公知の酸形のカチオン交換樹脂を使用できる。特に
、ポリスチレン主鎖をもち、スルホン酸基を有し、巨孔
性固体（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　５ｏｌｉｄ）状態に
ある強酸型のカチオン交換樹脂を使用することが可能で
あり、特に以下の商品名で市販されているものを使用で
きる。

“デュオライト　（Ｄｕｏｌｉ　ｔｅ）″；デュオライ
トインターナショナル（Ｄｕｏｌｉｔｅ　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａり　；“アンバーライト（八ｍｂｅｒｌｉ
ｔｅ）”：ローム＆ハース（Ｒｏｈｍ　＆　ｔｌａａｓ
　）　　；“ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）″；ダウケミ
カル（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　　； “ロワティット（Ｌｏｗａｔｉｔ）　”　；バイエル（
Ｂａｙｅｒ）。

以下のような巨孔質構造の強酸性カチオン樹脂が好まし
い。

ＯデュオライトタイプＸＥ５２１−２５１　　（スチレ
ン／ジビニルベンゼンコポリマー；スルホン酸基をもつ
；見掛は密度”０．８５　ｇ／ａｍ’　　Ｈ粒径＝　０
．２〜０．７　暑ｌ）　　　； Ｏアンバーライトタイプ２００Ｃ（スルホン酸基をもつ
スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー；見掛は密度＝
０．８０　ｇ／ｃｍ３Ｈ粒径＝０．４５〜０．６０ｍ）
。

交換樹脂カラムを溶離するのに用いるアルカリ水性溶液
は、２Ｎ以下の濃度の水酸化ナトリウムまたは水酸化カ
リウム溶液であり得る。

交換樹脂カラムに投入すべき水解物の量は該交換樹脂を
完全に飽和するに必要な量以下であり、この交換樹脂の
飽和は該交換樹脂１β当たりプロタイド約４００ｇで達
成される。

例として、観測される最適条件は以下の通りである。

Ｏ交換樹脂の体積：Ｖ Ｏ温度：４〜８０℃、好ましくは６０〜８０℃。

Ｏ流１１：１．５〜３Ｖ／ｈ Ｏ水解物の投入量：２〜５Ｖ（水解物のプロタイド濃度
に従って、交換樹脂１１当たりプロタイド４００ｇに対
応） ＯＨｔＯでの洗浄：２〜３■ ０溶離： ・アルカリ溶液の濃度：ＫＯＨ＝０．５〜２Ｎ。

好ましくはＩＨ；またはＮａ０Ｈ＝０．５〜２Ｎ。

好ましくは１Ｎ Ｏジペプチドおよびトリペプチドに冨む溶出画分の回収
： ・開始：ＲＩ＝５ ・終了：ｐＨ＝８ ジペプチドおよびトリペプチドに富む溶出画分は、場合
により限外濾過で精製し、必要に応じて濃縮または希釈
し、次いで滅菌濾過し、かつ液状で包装するか、あるい
は乾燥して粉末とすることもできる。

精製された液体または粉末状態にある、ジペプチドおよ
びトリペプチドに冨む溶出画分は本発明のジペプチドお
よびトリペプチドに富むペプチド混合物を構成する。こ
の混合物は人工栄養摂取および食事療法、特に非経口栄
養摂取で使用できる。

この製品の主な特徴は以下の通りである。

Ｏ無菌かつ発熱物質を含まない液体、 ０２５ｇ／ｊ２までの窒素含有率、 Ｏ窒素含有率１２ｇ／ｌ’で、４００ミリオスモル／Ｉ
ｌ以下のモル浸透圧濃度、 Ｏナトリウム、カリウムおよびカルシウム含有率は実質
的に零、 Ｏ１５剛ｅｑ／１未満の塩素含有率、 Ｏオートクレーブ処理してない製品（滅菌濾過）のアン
モニア含有率５ｍｅｑ／ｊ！未満およびオートクレーブ
処理した製品のアンモニア含有率約１０ｇａｅｑ／ＩＳ Ｏジー、トリーおよびテトラペプチド含有率＝約９０貨
ｔ％、 Ｏジペプチドおよびトリペプチド含有率＝７０−ｔ％以
上、 Ｏ有利アミノ酸含量＝５％未満。

本発明の新規性は単一の処理で脱イオンかつ分画して、
著しくジペプチドおよびトリペプチドに冨む画分を得て
いるという事実にある。

本発明は、またジペプチドおよびトリペプチドに冨むペ
プチド混合物にも係り、これは本発明の方法により直接
得られる。

以下、本発明を添付図を参照しつつ詳細に記載する。

第２図のグラフによれば、分離／精製は４段階で起こる
。段階Ａは限外濾過されたタンパク水解物を該カラムに
投入する段階に対応し、段階Ｂは水で洗浄して樹脂カラ
ムに保持されないペプチドを溶出する段階に相当する。

段階ＣおよびＤは実際のクロマトグラフィ一段階（保持
ペプチドのアルカリ溶液による置換）である。アニオン
とは違い、段階ＡおよびＢで溶出される流出液は、限外
濾過された水解物の最大のペプチドを含む（第１のピー
ク）。これらペプチドの平均サイズは１０〜１５残基の
範囲内である。段階Ｃ（第２ピークの開始点）において
溶出される流出液は中間のペプチド（オクタ−、ヘプタ
−、ヘキサ−およびペンタペプチド）を希薄状態で含む
。段階りを越えると、水解物のカチオン（Ｎａ”　、Ｋ
　”　、Ｎ　Ｈａ”）が小さなペプチドとの混合物とし
て溶出される。

本発明の方法を実施するための装置は垂直カラム１を含
み、これは酸形のカチオン交換樹脂の充填材料２で満た
されている。このカラムの頂部には、別々に以下のもの
が供給される。

Ｏまず、限外濾過されたタンパク水解物がタンク３から
ライン４およびポンプ５を介して導入される： Ｏ第２に、洗浄、溶離または再生用の滅菌かつ発熱物質
を含まない蒸留水がタンク６がらライン７を介して導入
される； Ｏ第３に溶離または再生用アルカリ水性溶液がタンク８
からライン９を介して送られる；最後にＯ再生用の水洗
塩酸溶液がタンク１ｏがらライン１１を通して流入する
。

カラム１からの流出液はライン１２およびポンプ１３を
通してバッファータンク１４に送られ、該バッファータ
ンクは攪拌器１５を備え、そこから流出液はライン１６
およびポンプ１７を介して限外濾過器１８に移され、限
外濾過液はライン１９を通して攪拌器２１を備えたバッ
ファータンク２０に放出され、そこから滅菌濾過ステー
ション２２に送られ、次いで包装あるいは乾燥ステーシ
ョン２３に送られる。

カラムに保持されなかったカラム１がらの流出液部分は
放出カラム２４を介して捨てられる。

以下の記載は、本発明の方法を上記装置で実施する方法
の一般的記載である。

タンク３からくる限外濾過された酵素によるタンパク水
解物はＨ゛形のカチオン交換樹脂カラムに投入される。

該カラムからの流出液の屈折率およびｐＨは監視され、
該流出液はライン２４を通して捨てられる。

限外濾過した水解物をカラム上に投入した後、該交換樹
脂を、タンク６からの無菌かつ発熱物質を含まない蒸留
水で洗浄し、この時の流出液はライン２４を通してｔ舎
てられる。

次いで、該樹脂カラムをタンク８からのアルカリ水性溶
液（水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム水性溶液）
で溶離する。このカラムがらの流出液の屈折率およびｐ
Ｈを注意深く追跡して、該流出液の屈折率が５に満たな
い限り、ライン２４を通して捨て、該流出液の屈折率が
５に達したら即座に、ライン２４に取付けられているバ
ルブ２５を閉じ、かつバルブ２６を開放して該流出液が
ライン１２およびポンプ１３を介してバッファータンク
１４に送られるようにする。また、該流出液のｐｉ（が
８に達したら即座にバルブ２６を閉じ、かつバルブ２５
を再度開放して、流出液をライン２４を通して捨てる。

屈折率５とｐＨ８との間に該カラムから流出する流出液
の画分はジペプチドおよびトリペプチドに冨む画分であ
り、タンク１４に集められたものである。これは限外濾
過フィルタ１８で限外濾過され、バッファータンク２０
に集められ、ステーション２２で滅菌濾過にかけられ、
次いでステーション２３で包装または乾燥される。

必要ならば１８で行われる限外濾過の前またはその後で
、濃縮または希釈段階を設けることができる。

使用済みの樹脂は以下のようにして再生される。

Ｏタンク８からくるアルカリ水性溶液による処理； Ｏ好ましくは滅菌かつ発熱物質を含まない水による洗浄
： Ｏタンク１０からの水性塩酸溶液による酸性化；および Ｏ好ましくは滅菌かつ発熱性物質を含まない水によるす
すぎ。

（実施例） 本発明を以下の非限定的な実施例により説明する。該実
施例は単に例示のために与えられるものである。

実施例１ 食用乳汁カゼインを、アルカリ媒質中で、ニュートラー
ゼ、アルカラーゼおよびペム（Ｎｅｕｔｒａｓｅ。

Ａｌｃａｌａｓｅ　ａｎｄ　Ｐｅｗ　；いずれも登録商
標）〔これら３種の酵素処方物はそのはじめの２種は微
生物起源のプロテアーゼであり、第３のものは膵臓酵素
混合物であり、これらはいずれもノボ　インダストリー
ズ　エンザイム　ニス、ニー（ＮＯＶＯ１ＮＤＵＳＴＲ
ＩＩＩ！Ｓ　ＥＮＺＹＭＥＳ　Ｓ、Ａ、）ニより市販さ
れている〕で加水分解して得られた、酵素によるカゼイ
ン水解物を出発物質とする。加水分解後限外濾過する。

得られる水解物は３３％を越える加水分解度（ＤＨ）に
より特徴付けられ、かつ８％未満の遊離アミノ酸を含む
。この種の水解物に対する計算では、ジペプチドおよび
トリペプチドの含有率は５０−ｔ％程度であることが示
される。

カラム１の体積に対して、ｌ１ｇ／Ｉｌの窒素を含むこ
の水解物の４容をＨ゛形のカチオン交換樹脂に投入する
。この場合、樹脂デュオライト（Ｄｕｏｌｉｔｅ：登録
商標）タイプＸＥ５２１−２５１〔デュオライト　イン
ターナショナル社（ＤｔｌＯＬＩＴＥ１ＮＴｆ！ＲＮＡ
Ｔｌ０ＮＡＬ　）により市販されている〕がカラム１に
詰められている。

このカラムからの流出液の屈折率およびｐＨを追跡する
。

該水解物を投入した後、カラムをまず３倍容の滅菌かつ
発熱物質を含まない蒸留水で洗浄し、次いで３５　ｇ／
ｉ！の水酸ナトリウム水性溶液で溶離する。

このカラムから放出される、ジペプチドおよびトリペプ
チドに冨む溶出画分を、流出液の屈折率が５に達したら
即座に回収を開始し、かつこの回収を、咳画分のｐＨが
８に達したら即座に停止する。

この画分は限外濾過され、次いで滅菌濾過される。

窒素の歩留りは４０〜６０％であり、かつジペプチドお
よびトリペプチドの歩留りは７５％である。

これらの操作は無菌条件下で、発熱物質を含まない水中
で、６０〜８０℃の温度にて、かつ２容／時（ｍ３／時
）なる流量の下で行われる。

ジペプチドおよびトリペプチドに富むこの溶出画分の組
成および特性は第１表に示されている。

この画分が本発明による望ましい製品を構成する。

出発物質としての限外濾過した酵素による水解物の組成
並びに特徴もこの表に示しである。

第１表二本発明の製品および出発水解物（カゼイン水解
物）の組成と特徴 第１表（続き）ニ ジペプチドおよびトリペプチドに富む？容出画分中の、
遊離形またはペプチド形でのアミノ酸含有率は第２表に
与えられている。

第２表ニジペプチドおよびトリペプチドに冨む画分のア
ミノ酸含有率 第２表（続き） 限外濾過された水解物に対して確立された全体としての
ペプチドの平衡は第３表に与えられている。

第３表：限外濾過された水解物に対する、ペプチドの全
体としての平衡 一例として、以下のような段階の流出液の様々な画分に
対する屈折率のプロット、即ちＲ１（カーブＩ）および
ｐＨのプロットのカーブ（カーブ■）を第２図にグラフ
として示した。

Ｏ水解物の投入二段階Ａ ＯＨ，Ｏによる洗浄：段階Ｂ ＯＫＯＨによる溶出、溶出開始二段階Ｃ０ＫＯＨによる
溶出、ジペプチドおよびトリペプチドに富む画分の回収
二段階Ｄ（回収の開始はカーブ■のＲＩ＝５即ち点ａ；
回収終点はカーブ■のｐＨ＝８、即ち点ｂ）。

第２図では、縦軸は屈折率およびｐＨであり、横軸は流
出液の体積Ｖ（樹脂カラムの体積で表示）であり、酸形
カチオン交換樹脂カラムの体積は２００ｃｍ３である。

水解物の投入（段階Ａ）中に得られる流出液の画分は体
積４■で、その屈折率はＯ〜５の範囲で増大し、ｐＨは
２である。水洗中に得られる画分は体積３Ｖであり、屈
折率は５か゛ら８，５まで増大し、次いで零まで減少し
、かつｐＨは２から３．５まで増大する。ＫＯＨによる
溶出中（溶出の開始点まで）に得られる画分は体積０．
７５　Ｖであり、屈折率は０から５まで増大し、かつｐ
Ｈは３．５〜４．５の範囲で増大する。ジペプチドおよ
びトリペプチドに富む、ＲＩ　＝５　　（ｐＨ＝４．５
）とｐｎ＝ｓとの間で回収される溶出画分は体積１．７
５　Ｖである。

以下の第４表に、出発物質としてのカゼイン、限外濾過
された水解物および本発明による最終製品のアミノ酸組
成を与える。

第４表：出発物質、限外濾過処理した水解物および本発
明による最終製品のアミノ酸組成（残基％） 第４表（続き） 実施例２ 出発物質は、卵白をアルカラーゼ、ニュートラーゼおよ
びベム（Ａｌｃａｌａｓｅ、　Ｎｅｕｔｒａｓｅ　ａｎ
ｄ　Ｐｅｗ　二いずれも登録商標）で加水分解して得ら
れる、変性された、酵素によるオボアルブミンの水解物
である。これらろ槽の酵素処方物はノボ　インダストリ
ーズ　エンザイムズ　ニス、アー、　　（ＮＯＶＯ１Ｎ
ＤＵＳＴＲＩＥＳ　ＥＮＺＹＭＥＳ　Ｓ、Ａ、）ニより
市販されティる。

得られる水解物は３０％を越える加水分解度（Ｄｌｌ）
により特徴付けられ、かつ１０％未満の遊離アミノ酸を
含む、計算によれば、この種の水解物ではジペプチドお
よびトリペプチドの含有率は約４５ｗｔ％であることが
示される。加水分解後限外濾過する。

窒素含存率９．５ｇ／ｆに希釈したこの水解物４容（カ
ラム体積に対して）を、カラム１に詰められたＨ“形の
カチオン交換樹脂に投入する。この場合該樹脂はアンバ
ーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　　：登録商標）タイプ
２００Ｇ（ローム＆ハース（ＲＯＨＭ　＆ＨＡＡＳ）社
により市販されている）を用いた。

このカラムからの流出液の屈折率およびｐＨを追跡する
。

該カラムに水解物を投入した後、３容の水でまず水洗し
、次いで１Ｎ水酸化カリウム水性溶液で溶出する。

このカラムから放出される溶出画分は、該溶出液の屈折
率が５に達したら即座に回収し始め、凹収は咳画分のｐ
Ｈが８に達したらすぐに停止する。

この回収した画分を限外濾過し、次いで滅菌濾過する。

窒素歩留には４０％であり、ジペプチドおよびトリペプ
チドの歩留りは約５５％である。

これら操作は無菌条件下で、好ましくは非発熱性の水中
で、６０〜８０℃の温度にて、１．５〜２．５容／時な
る流量の下で実施される。

ジペプチドおよびトリペプチドに富む溶出画分（これは
本発明による望ましい製品を構成する）の組成および特
徴は、第５表に、出発物質としての限外濾過した水解物
の組成および特徴と共に示しである。

第６表にはペプチドおよび遊離形での各アミノ酸の含量
を与えである。

第７表には、上記カチオン交換カラムでの分離／精製の
平衡を示しである。

第８表には、出発物質の卵白、限外濾過した水解物およ
び本発明の最終製品のアミノ酸組成を与えた。

第５表二本発明の製品および出発水解物（オボアルブミ
ン水解物）の組成および特性 第５表（続き） 第６表ニジペプチドおよびトリペプチドに富む画分のア
ミノ酸含量（オボアルブミン水解物） 第６表（続き） ＮＤ：測定されず。

第７表：限外濾過した水解物（オボアルプミン）に対す
る全ペプチドの平衡 第８表二出発物質、限外濾過された水解物および本発明
の最終製品のアミノ酸組成（％で表した残基） 第８表（続き） 実施例３ 本例は腸内栄養補給用食事療法食品としての製剤提示に
関する。　　　　゛ 本発明によるジペプチドおよびトリペプチドに冨む水解
物は実施例１または２に従って調製し、次いで１１当た
りプロタイド３０〜６０ｇとなるように希釈する。

以下の成分を得られたペプチド溶液に加える。

即ち、マルトデキストリンとしての炭水化物、植物油と
しての脂質、ビタミン類、無機塩類および痕跡量の元素
並びに最終製品を乳化状態に維持するのに必要な技術上
の添加物。このようにして作られる腸内投与用食品はＵ
ＨＴ技術（ＵＨＴ＝超高温（Ｕｌｔｒａ　Ｈｉｇｈ　Ｔ
ｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）　）によって滅菌され、次いで
缶、テトラブリック（Ｔｅｔｒａｂｒｉｋ　　：登録商
標）紙パツクあるいはある他の包装形態で、２００〜１
０００Ｉｌβの範囲の容量で分配される。

例えば、４１８０ｋＪ／１　（ＩＩ！ＩＩち１０００ｋ
ｃａｊ！／ｌ＞含み、かつ３００〜４５０ｎｅｓ　／ｋ
ｇなるモル浸透圧濃度をもつ処方物は以下のような組成
を有する。

０小さなペプチドに冨む　固形分２１ｇに相当精製水解
物　　　　　　する体積 Ｏマルトデキストリン　　　　　　６０ｇｏスターチ　
　　　　　　　　　　１０ｇｏ脂質混合物（大豆油、菜
種油、 マツヨイグサ（ｏｅｎｏｔｈｅｒａ）油）　　　８ｇＯ
中鎖トリグリセロール類　　　　８．７ｇｏビタミン混
合物　　　　　　　　０．１ｇＯ硫酸マグネシウム　　
　　　　　０．７ｇｏ塩化カルシウム　　　　　　　　
０．２ｇｏグリセロリン酸カルシウム　　　０．８ｇｏ
硫酸第一鉄　　　　　　　　　０．０１ｇｏ炭酸マンガ
ン　　　　　　　０．００３　ｇｏ硫酸亜鉛　　　　　
　　　　０．００８ｇｏ硫酸銅　　　　　　　　　　０
．００２ｇｏヨウ化カリウム　　　　　　　０．０５ｍ
ｇｏ乳化剤　　　　　　　　　　　　１．３ｇｏ油用油
化酸化防止剤　　　　０．００３　ｇｏ蒸留水　　　　
Ｑ、５．　　　　　５００ｍ　ｊ！実施例４ 本例は窒素供給用注射溶液の製剤提示に関し、これは非
経口栄養補給に利用できる。

本発明によるジペプチドおよびトリペプチドに冨む水解
物は実施例１または２に従い、かつ第２図に示した様式
で調製する。

無菌室で分配する前に製薬工業における良好な製造実務
に従って、０．５〜１．５ｇ／ｊ！の亜ニチオン酸ナト
リウムを酸化防止剤として添加する。

この生成物を、１２５．２５０．５００または１０００
ｔａｌｔのガラスフラスコ中で、オートクレーブ内（１
２０℃、２０分）で最終的に滅菌する。

実施例５ 本例は、深部静脈内に潅流するために、即時使用のため
に調製される注射可能な脂質および注射可能なグルコー
スとの混合物（全非経口栄養補給）として使用できる、
ペプチド濃縮物の製剤提示に係る。このものの調製法は
実施例４を類似するが、付随的な、プロタイド窒素含有
率を１５〜３０ｇ窒素／ｌなる値まで高めるための濃縮
操作を含んでいる。

次いで、得られる生成物は、実施例４記載の生成物と同
じように包装されかつ提示される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するための装置を示す図で
あり、および 第２図は、屈折率Ｒ１の変化および交換樹脂カラムから
の流出液のペプチド変化を追跡したグラフである。 （主な参照番号） １・・・カラム ４．７．９．１１・・・入口 １２・・・出口 １８・・・限外濾過装置 ２２・・・滅菌フィルタ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジペプチド、トリペプチドおよびトリペプチドよ
   り大きなポリペプチドを含む酵素による蛋白水解物から
   、特に人工栄養摂取および食事療法に利用できる、ジペ
   プチドおよびトリペプチドに富むペプチド混合物の製造
   法において、酸形のカチオン交換樹脂カラムで該水解物
   をクロマトグラフィー処理にかけ、 好ましくは無菌かつ発熱物質を含まない水で、該交換樹
   脂カラムを洗浄し、 アルカリの水性溶液で該交換樹脂カラムを溶出し、およ
   び ジペプチドおよびトリペプチドに富む溶出画分を回収す
   る、工程を含むことを特徴とする上記方法。
2. （２）回収されるジペプチドおよびトリペプチドに富む
   溶出画分が、溶出液の屈折率が５に達する時点と、該画
   分の回収が完了する該溶出液のｐＨが８に達する時点と
   の間において交換樹脂カラムから流出した画分であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）水解物のプロタイド濃度に応じて、カラムの体積
   に対して２〜５倍容の酵素によるタンパク水解物を、該
   Ｈ＾＋形のカチオン交換樹脂カラムでクロマトグラフィ
   ー処理し、ここで該カラムに投入される該水解物の全量
   は、該交換樹脂を飽和するに要する量以下で、交換樹脂
   １ｌ当たりプロタイド約４００ｇに対応し、 該交換樹脂カラムを２〜３倍容の水で洗浄し、該交換樹
   脂カラムを、２Ｎ以下の濃度の水性水酸化ナトリウムま
   たは水酸化カリウム溶液で溶離し、かつ 該溶出液の屈折率およびｐＨを追跡して、該溶出液の屈
   折率が５に達する時点と、該溶出液のｐＨが８に達する
   時点との間において該交換樹脂カラムから流出する溶出
   液画分を回収し、この溶出液画分がジペプチドおよびト
   リペプチドに富むペプチド混合物を構成する、 ことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項または第（
   ２）項記載の方法。
4. （４）ジペプチドおよびトリペプチドに富む溶出液画分
   を限外濾過により生成することを特徴とする特許請求の
   範囲第（１）項記載の方法。
5. （５）限外濾過の前またはその後に、濃縮または希釈工
   程が設けられていることを特徴とする特許請求の範囲第
   （４）項記載の方法。
6. （６）限外濾過により精製された、ジペプチドおよびト
   リペプチドに冨む溶出画分を滅菌濾過し、次いで液状で
   包装するか、あるいは乾燥して粉末状態にすることを特
   徴とする特許請求の範囲第（４）項記載の方法。
7. （７）温度を４〜８０℃、好ましくは６０〜８０℃に保
   つことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方
   法。
8. （８）アルカリの水性溶液が１Ｎ以下の濃度の水酸化ナ
   トリウムまたは水酸化カリウムの水性溶液であることを
   特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
9. （９）酵素によるタンパク水解物が卵白またはカゼイン
   の酵素消化生成物であることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１）項記載の方法。
10. （１０）酸形のカチオン交換樹脂が、ポリスチレン主鎖
    をもち、スルホン酸基を有し、巨孔質固体状態にある強
    酸性カチオン樹脂であることを特徴とする特許請求の範
    囲第（１）項記載の方法。
11. （１１）特許請求の範囲第（１）項記載の方法により直
    接得られる、ジペプチドおよびトリペプチドに富むペプ
    チド混合物。
12. （１２）経口または腸内投与人工栄養摂取用組成物の製
    造のための、特許請求の範囲第（１１）項記載のジペプ
    チドおよびトリペプチドに冨むペプチド混合物の使用。
13. （１３）非経口人工栄養摂取用組成物の製造のための、
    特許請求の範囲第（１１）項記載のジペプチドおよびト
    リペプチドに富むペプチド混合物の使用。
14. （１４）食事療法用組成物の製造のための、特許請求の
    範囲第（１１）項記載のジペプチドおよびトリペプチド
    に富むペプチド混合物の使用。
15. （１５）特許請求の範囲第（１）項記載の、酵素による
    タンパク水解物から、ジペプチドおよびトリペプチドに
    富むペプチド混合物の製造方法を実施するための装置で
    あって、 酸形のカチオン交換樹脂カラム１を含み、該カラムが 一方でその頂部部分に 限外濾過されたタンパク水解物用の入口４、洗浄、溶出
    または再生用の無菌で発熱物質 を含まない蒸留水用の入口７、 溶出または再生用のアルカリ水性溶液用入 口９、および 再生用酸水性溶液用入口１１、 を備え、他方でその底部部分に 該カラムからの流出液を放出するための出 口１２、但しこの出口は場合により限外濾過装置１８、
    次いで滅菌フィルタ２２および包装および乾燥ステーシ
    ョン２３に接続されている、および最後に 該カラムからの流出液の屈折率およびｐＨを監視する手
    段、 を備えていることを特徴とする、上記装置。