JPS63258582A - コンポジットｄｎａ配列及びその成長ホルモンの生産への利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なコンポジットＤＮＡ配列に関するもの
であり、これは先駆体の形態で合成された成長ホルモン
の上流及び該遺伝子を制御下においているプロモータの
下流に置がれた場合、細菌中の該ホルモンの発現２分泌
及び正しい成熟を助けるものである。

遺伝子工学の進歩は、多くの医薬の活性成分を形成する
ことができる真核源の蛋白質を得る従来方法に欠点を克
服することを可能にした。

これらの方法には特に器官又は生理液体がらの抽出があ
るが、生成医薬は充分な量生産されないし、特に常に一
定の品質ではない。

遺伝子工学は微生物を使用することにより蛋白合成を達
成することを可能にした。これは、ある微生物のゲノム
に他の微生物からの遺伝子を挿入しこのクローン遺伝子
を発現させることによって行われる。

若干の蛋白は先駆体の形態で合成される。この先駆体は
、シグナル　ペプチドと呼ばれる短アミノ酸でそのＮ−
末端が延長された蛋白自体である。

これは合成された細胞媒体から細胞外媒体又はゲノム陰
性菌の場合にはペリブラスムに排出される。

この排出Ｃｅｘｐｏｒｔａｔｉｏｎコは、シグナル　ペ
プチド及び成熟蛋白が酵素の作用で分離される細胞質膜
を通る通路で特徴付けられる。成熟蛋白は細胞外媒体又
はペリブラスムから回収される６本発明は、先駆体の形
態で合成される成長ホルモンの生産に関し、特に、１９
１のアミノ酸を含み。

かつ　２１７のアミノ酸を含む先駆体［以後、　ｐｒｅ
−ｈＧＨと称するコの形態で合成されるヒト成長ホルモ
ン［以後、ｈＧＨと称する］に関する。

これまでに得られた多くの細菌発現ベクタは先駆体の形
態で合成された真核源の成熟蛋白の重要な工業的生産に
適していないことが分った。

例えば、極めて僅かの量のインシュリンが得られている
［Ｋ、ＴＡＬＭＡＤＧＥ　　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂ　ａｃｔｏｒｔａ　ｌ１ａｔｕｒ（３ｐｒｅｐｒｏｉ
ｎｓｕｌｉｎ　ｔｏ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ。

Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｆ、、Ｕ
　Ｓ　Ａ　、　　１９８０．７７゜３９８８−３９９２
　］　、同様に繊維芽細胞源のヒト　インターフェロン
が得られたが生物学活性を示さなかった［Ｔ、　　ＴＡ
Ｎ　Ｉ　Ｇ　Ｕ　ＣＨＩ　　ｅｔ　ａｌ、、’Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ’　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　Ｎｂｒｏ
ｂｌａｓｔ　１ｎｔｅｒｌ’ｅｒｏｎ　ｇｅｎｅｌｎ　
　　Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　　ｃｏｌｌ　　、　　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

グレイ等［Ｇ、　　ＧＲＡＹ　ａｔ　ａｌ、、Ｐｅｒｌ
ｐｌａｓａｌｃｐｒｏｄｕｃｔｌｏｎ　　ｏｒ　　ｃｏ
ｒｒｅｃｔｌｙ　　ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　　ｈｕｍａｎ
ｈｏｒｍｏｎ　　ｌｎ　　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌｔ　　：　　ｎａｔｕｒａｌ　　ａｎｄｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ　　ｓｉｇｎａｌ　　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ
　　ａｒｅ　　１ｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂＩｅ、　Ｇ
ｅｎｅ、１９８５．３９．２４７−２５４１は、大腸菌
［Ｅ。

ｃｏ１１］内のペリブラスマｈＧＨの生産を記載した。

この場合、　　ｈＧＨ先駆体をコードする配列はトリプ
トファン　プロモータの制御下におかれていることを指
摘しなければならない、このプロモータは他のプロモー
タの転写、即ち誘導性を制御する特定の特性を有してい
るが、異遺伝子の発現の活性を制御することは困難であ
る。

逆に、ラクトース　オペロンのプロモーターオペレータ
活性［以後”Ｐｌｏｌａｃと称する］は、誘導性であり
容易に制御できる。ラクトースの不存在下で、ラクトー
ス　オペロンに特異なレプレッサは、ｉ遺伝子でコード
され、オペロンのオペレータ配列と結合しＲＮＡポリメ
ラーゼによる転写の開始を妨げる。ラクトース又はレプ
レッサが結合する他の誘導子の存在下で転写は正常に開
始することができる。

蛋白合成の収量は次の効率に左右されることが知られて
いる。

−それに対応する遺伝子の転写、及び −この方法で生産されたメツセンジャＲＮＡ［以後ｍＲ
ＮＡと称する］の翻訳 転写は酵素、ＲＮＡポリメラーゼの介入を通じて行われ
、これはプロモータと呼ばれる特定の領域に結合する。

プロモータに結合後、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡの転
写を開始し、これに続いてｍＲＮＡが得られる。

翻訳はリポソームの介入によって行われ、これはその５
′末端に近い結合位置でｍＲＮＡに結合する。

リポソーム結合位置の若干の特徴は知られている。これ
は、ＡＵＧ開始コドン［これは翻訳される最初のコドン
である］及びＡＵＧコドンの約１０ヌクレオチド上流に
位置するシャインーダルガノ配列と呼ばれる配列［以後
Ｓ／Ｄ配列と称する］からなるｍＲＮＡ配列である。こ
のＳ／Ｄ配列は。

３〜９ヌクレオチドを包含し、その３−末端がＳ／Ｄ配
列に相補的である１８ＳリポソームＲＮＡ［以後１８ｓ
　　ｒＲＮＡと称する］でｍＲＮＡが認識されるのを可
能にする。

蛋白合成は、特にｍＲＮＡの翻訳の開始の効率にも左右
されることが知られている。これ自体もＳ／Ｄ配列及び
この配列を開始コドンから離している距離に左右される
。

この開始は多くの因子が関係する。

−Ｓ／Ｄ配列及び開始コドンの間の距離が翻訳の効率に
影響し最適距離は９ヌクレオチドであることが知られて
いる［Ｈ，Ｍ、５ＨＥＰＡＲＤｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ、
　１９８２．１．１２５−１３１　］　。

−同様に、Ｓ／Ｄ配列と１６ＳｒＲＮ　Ａとの相補性が
大きくなればなるほど、　１６ｓ　　ｒＲＮＡに関して
特定ｍＲＮＡの翻訳効率とその相補性との間の単純な関
係は知られていないが、リポソームの結合は強くなるこ
とが認識されている［Ｇ、Ｄ。

Ｓ　　ＴＯＲＭＯｅｔ　　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ、　　Ｒｅｓ、、１９８２゜１０．２９７１−２９９
６］　　。

−　また、Ｓ／Ｄ配列及びＡＵＧコドンの間に位置する
「アデニン」及び「チミン」塩基が翻訳に役立つことも
知られている［ＤＥ　　ＢＯＥＲｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ
、　１９ｇ３．２．２３１−２３５］　。

−最適配列が翻訳の効率を確保するのに充分ではないが
、開始コドン及び／又はＳ／Ｄ配列はリポソームに容易
に接近可能でなければならず。

ｍＲＮＡが採用するかもしれない第二次構造でマスクさ
れていてはならないと仮定されている［Ｄ。

Ｇ　ＨＥ　Ｙ　Ｓ　Ｅ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、
１９８２．１７．５５−６３］。

然しなから、上記の全ての因子の使用で蛋白合成が良い
収率を与えることを確保することができない。

新規コンポジットＤＮＡ配列を含むベクタが先駆体の形
態で合成された成熟蛋白を得るのに効率的に用いること
ができることが見出だされた。

その５′末端からその３′末端まで、新規コンポジット
ＤＮＡ配列は次のものからなる：Ｓ／Ｄ配列を含む、大
腸菌のラクトース　オペロンのメツセンジャＲＮＡの非
翻訳５′末端コードするＤＮＡ　［：Ｔｈｅ　　０ｐｅ
ｒｏｎ　　：　Ｊ、　　Ｈ，ＭＩ　ＬＬＥＲａｎｄ　　
Ｗ、Ｓ、ＴＥＺＮＩＫＯＦＦ。

Ｃｏ１ｄ　　Ｓ　　ｐｒｌｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８０コ　　；−構造　５′ ＡＡＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＴ３′；及び −−２１位置のアミノ酸及び１位置のアミノ酸の間で、
ヒト成長ホルモンのシグナル　ペプチドの２１個のアミ
ノ酸をコードする天然ＤＮＡ配列。

事実、ｍＲＮＡの５−末端で採用された三次元構造は、
上記の構造から生じ及びシグナル　ペプチドをコードす
る。リポソームの結合及び翻訳の開始に基本的役割を果
たすように思われる。

本発明は、このように、その−面において、その５′末
端からその３′末端まで： Ｓ／Ｄ配列を含む、大腸菌のラクトース　オペロンのメ
ツセンジャＲＮＡの非翻訳５゛末端をコードするＤＮＡ
　。

−構造　５′ ＡＡＴＴＡＴＧＣ；ＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＴ３′を有す
るオリゴヌクレオチド、この配列は。

２のコドンが修飾された。ＡＣＡからＡＣＣ及びＴＣＣ
からＴＣＴ、　　シグナル　ペプチドのＮ−末端部分を
コードするＤＮＡ配列に対応する。蛋白合成を開始する
コドン［ＡＴＧ］の上流の４のヌクレオチド及びＡＴＧ
の下流の１２のヌクレオチドを包含する：　ＡＣＡから
ＡＣＣ及びＴＣＣからＴＣＴ　、及び　。

−シグナル　ペプチドの第１６構成ヌクレオチドから数
えて、ヒト成長ホルモンのシグナル　ペプチドのＣ−末
端に対応する天然ＤＮＡ配列、即ち、　　−２１位置の
アミノ酸及び１位置のアミノ酸の間の２１のアミノ酸を
コードするＤＮＡ配列。

を含む成長ホルモンの合成のためのコンポジットＤＮＡ
配列に関する。

第１図は、ｈＧＨ先駆体をコードするＤＮＡ配列及び該
先駆体のアミノ酸配列を示す、最初の２６のアミノ酸［
図の一２６位置のアミノ酸から数える］はシグナル　ペ
プチドを形成し、他の１９１のアミノ酸［ここで１から
　１９１の番号を付す］は実際のｈＧＨのものである。

ここにあげる表１は第１図をより良く理解するためのも
ので、アミノ酸はそれぞれ単一の文字で表わされる。

表　　１ アミノ酸　　　　　　　　　　文字 アラニン　　　　　　　　　　Ａ アルギニン　　　　　　　　　Ｒ アスパラギン　　　　　　　　　Ｎ アスパラギン酸　　　　　　　Ｄ システィン　　　　　　　　　Ｃ グルタミン　　　　　　　　　　Ｑ グルタミン酸　　　　　　　　　Ｅ グリシン　　　　　　　　　　Ｇ ヒスチジン　　　　　　　　　Ｈ イソロイシン　　　　　　　　Ｉ ロイシン　　　　　　　　　　し リシン　　　　　　　　　　　Ｋ メチオニン　　　　　　　　　Ｍ フェニルアラニン　　　　　　Ｆ プロリン　　　　　　　　　　　Ｐ セリン　　　　　　　　　　Ｓ トレオニン　　　　　　　　　Ｔ トリプトファン　　　　　　　Ｗ チロシン　　　　　　　　　　Ｙ バリン　　　　　　　　　　Ｖ 第１図に示したＤＮＡコドンにおいて１文字Ａ、Ｃ，Ｔ
及びＧは通常の意義を有し、それぞれ次の塩基を示す：
アデニン、シトシン、チミン及びグアニン。

本発明は、また、該配列の機能が変性されない限り、該
オリゴヌクレオチドの１又は２の塩基が置換されている
コンポジットＤＮＡ配列にも関する。

プロモータの制御下におかれているコンボジッ）ＤＮＡ
配列は、そのリポソーム結合位置が該分子の翻訳を有利
にする線状構造を採用するｍＲＮＡ分子を生産する。

本発明のコンポジットＤＮＡはヒト成長ホルモンの遺伝
子コードの上流［ｕｐｓｔｒｅａａ＋］に位置し。

シグナル　ペプチドのＮ−末端をコードするこの配列の
ヌクレオチドはｈＧＨ先駆体をコードする遺伝子によっ
て通常提供されるものを置換している。

本発明は、他の面において、細菌プロモータ及びｈＧＩ
（をコードするＤＮＡ配列との間に位置する１本発明の
対象を形成する該配列を含む細菌発現ベクタに関する。

本発明は、他の面において、ヒト成長ホルモンをコード
するＤＮＡ配列を含み１本発明のコンポジットＤＮＡ配
列及びこの配列のプロモータ上流を包含するプラスミド
に関する。３の好ましいプラスミドは次に定義するプラ
スミド　り１４９−１４７゜９１８９−３０．及びｐ１
７１−８である。　１９８８年２月２６日に。

プラスミド　ｐ１４９−１４７は微生物培養国立コレク
ション［Ｎ、Ｃ，Ｍ、Ｃバリーフランス］に大腸菌菌株
Ｃ１０２４中で寄託し、ｌ−５３３の番号が付された。

本発明は、また２本発明によるベクタで形質転換された
微生物、特に腸内細菌科［Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｌａｃｅａｅ　］の科に属するものである。

特に、大腸菌［Ｅ　５ｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔコ
の種１例示すれば菌株Ｃ１０２４に関する。

本発明は、他の面では１組換え微生物の培養。

続いて例えば浸透衝撃による。細胞からのホルモンの抽
出、衝撃後に得られた細胞外媒体の生成によるその単離
による。ヒト成長ホルモンの生産方法であって、用いる
組換え微生物が本発明の微生物の１である方法に関する
。

本発明によるコンポジットＤＮＡ配列を含むプラスミド
は、構成成分を提供するプラスミドから形成され、これ
らのプラスミドは酵素消化によりフラグメントに切断さ
れ、関係フラグメントは酵素接合で連結される。コンポ
ジットＤＮＡ配列は合成経路で得ることができる。これ
は次いで上記のフラグメントと同様に処理される。

次の本発明を例によって説明する。勿論１本発明はここ
に指摘した適用態様に限られるものではなく、逆に、特
許請求の範囲に包含される全ての態様を包含するもので
ある。

１−一般的方法 本発明によるプラスミドの構成に必要な全ての操作は、
先行技術に記載されている一般的技術。

及び便宜のため次に述べる特別技術を含む。

プラスミドの精製 ルリア［Ｌ　ｕｒｉａ］液体媒体で培養された形質転換
大腸菌細胞から単離された［Ｔ、ＭＡＮＩＡＴＩ　Ｓ　
ｅｔ　ａｌ、＋ｐ、８８　ａｎｄ　４１０．　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｃｆｏｎｔｎｇ、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ
。

Ｎ、Ｙ、　、　　１９８２コ、プラスミドは、カップ［
Ｌ。

Ｋａｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、１９７３．Ｊ　、　　Ｂａｃ
ｔ、、　１１４　　：　５５７−５９１コの変形法を用
い後期指数増殖期に細胞から単離した。プラスミドは、
まず塩化セシウム／臭化エチジウムのグラジェントの２
の平衡遠心分離に付し。

次いでブタノールで抽出する９次いでクロロフォルム／
イソアミルアルコール混合物［２４：　　’ｌ］による
２抽出サイクル及び０６１容の３Ｍ　　ＮａＣ１を加え
た２容の冷絶対エタノールでの沈澱で精製する。沈澱し
たＤＮＡを１回７０％エタノールで１回絶対エタノール
で洗浄し１次いで真空下で乾燥する。

制限酵素による消化 本発明に用いる制限酵素は米国ニュー　イングランド　
バイオラボ社から入手できる。酵素の単位は、　５０μ
ノの反応容積中３７℃で００分間に１．０μｇのバクテ
リオファージ　ラムダＤＮＡを消化するに必要な量とし
て定義される。

全消化は次の方法で行われる；１μｇのＤＮＡを２０μ
ノの緩衝液中で６０分間３７℃で２−５単位の酵素でイ
ンキュベートする。

部分消化に関しては、１．５μｇのＤＮＡを１０μノの
緩衝液中で３７℃で０．７５単位の酵素でインキュベー
トする。

異なる時間間隔で、１μノの試料をとり、グリセリン、
ＥＤＴＡ及びブロモフェノール　ブルーを含む溶液４μ
ノと混合し１次のものを含む試料を得る：２０ｍＭのＥ
ＤＴＡ　［エチレンジアミンテトラ酢酸〕、１０％のグ
リセリン及び０．０２５％のブロモフェノール　ブルー
。

各種の試料をアガロースゲル上で電気泳動に付す、ＤＮ
Ａフラグメントの臭化エチジウムによる移動及び染色後
、フラグメントを紫外線したで可視化し、特定ＤＮＡフ
ラグメントの最大量を得るための最適時間を定める。

用いる緩衝液は次の組成を有する： ・Ｃ１ａｌ及びＴａｇＩ消化に関してはニトリ（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンＨＣ１［トリスＨＣ１］　　
１０ｍＭ　ＣｐＨ７，５］　、　Ｍｇ　Ｃ１２１０ｍＭ
、ＤＴＴ　［ジチオトレイトール］　　１ｍＭ、　　１
００　ｕ　ｇ／１１ｉのゼラチン。

・ＥｃｏＲＩ消化に関してはニドリスＨＣｌ１００　　
ｍＭ　　［ｐＨ７，６コ　、ＭｇＣｌ２　　　　５ｍＭ
。

ＮａＣ１５０ｍＭ、１００μｇ／１１ｉのゼラチン。

ｅ　Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉ消化に関してはニドリスＨＣｌｌ０
ｍＭ　［１）Ｈ７，６］　、ＭｇＣ１２１０ｍＭ。

ＫＣＩ　　６ｍＭ、ＤＴＴ　　１ｍＭ、１００μｇ／紅
のゼラチン。

＊Ａ１ｕｌ、　　ＢａｍＨＩ、　　Ｈｉｎｄｌ　　Ｉ　
　Ｉ。

スＨＣ１１０ｍＭ　ＣｐＨ７，５］　、　ＭｇＣ１２Ｌ
ＯｍＭ、　　ＤＴＴ　　１　ｍＭ、　　１００　ｉｔ　
ｇ／ｄ！のせラチン。

・ＰｓｔＩ消化に関してはニドリスＨＣＩＬＯｍＭ　Ｃ
ｐＨ７，６］　、ＭｇＣ１２６ｍＭ。

ＮａＣｌ　　５０ｍＭ、ＤＴＴ　　１ｍＭ、１００μｇ
／ｌのゼラチン。

ＤＮＡフラグメントの精製 制限酵素の作用に付した後、異なる大きさのＤＮＡフラ
グメントをアガロース又はポリアクリルアミド　ゲル［
５−１ｏ　Ｖ　／　ｅｌ］上で電気泳動によって分離し
、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ下で可視化する［Ｔ、
　ＭＡＮ　Ｉ　ＡＴ　Ｉ　Ｓ　　ｅｔ　ａｌ、。

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ。

１９８２、　Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｇＨａｒｂｏｒ　Ｐ
　ｒｅｓｓ、　Ｎ　ｅｖＹ　ｏｒｋ。

Ｎ、　Ｙ、　、　１５０−１７８　］　。

ゲルからの特定ＤＮＡフラグメントの回収のため、関係
帯を切断し、電気透析コイルから溶離する。

ＤＮＡは２次いでＤＥＡＥ−セルロースのカラム上で単
離し、エタノールで沈澱し、適当な緩衝液に再懸濁する
［ＨＯＳＭ　Ｉ　ＴＨ，Ｍｅｔｈｏｄｓ１９のヌクレオ
チド［５−ＡＡＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＴコ
及び１７のヌクレオチド［５−ＣＧＡＧＡＧＣＣＧＧＴ
ＡＧＣＣＡＴ　コ　を含む２の一重鎖オリゴヌクレオチ
ドを合成した。

各オリゴヌクレオチドの等モルｍ［約２μｇ］を殺菌エ
ッペンドルフ管内で混合し７０℃に２−３分間加熱する
１次いで、室温に冷却し、オリゴヌクレオチドの５″末
端を、２０μノの反応容積中３７℃で４５分間、２μノ
の１０倍濃縮「キナーゼ」緩衝液［５００ｍＭ　　の　
　ト　　リ　　ス　ＨＣＩ、　　　　　　ｐＨ７，８゜
１００ｍＭのＭｇＣ１２，５０ｍＭのＤＴＴコ、２μｍ
の１０ｍＭ　　ｒＡＴＰ及び１μ）のバクテリオファー
ジＴ４のポリヌクレオチド　キナーゼ［１０Ｕ／ｄ、Ｂ
ＲＬラボラトリイズ、を含むコの添加で燐酸化する。「
キナーゼ」は９０℃で５分間混合物を加熱して不活性化
する４次いで混合物を徐々に一夜室温に冷却しオリゴヌ
クレオチドをハイブリッド形成させる。

ＤＮＡの連結 ＤＮＡ連結はバクテリオファージＴ４のＤＮＡリガーゼ
［ニュー　イングランド　ニュウクレアコを用いて行な
う、連結緩衝液の組成は次の通りである：５０ｍＭのト
リスＨＣ１［ｐＨ７，８コ、１０ｍＭのＭｇ　Ｃ１２、
２０ｍＭのＤＴＴ、１．０　ｍＭのＡＴＰ及び５０μｇ
／ＩＩＪ！のゼラチン、ＤＮＡ′ａ度は１５−５０μｇ
／ｒｔｔｌで変る１反応は、２０μ）の反応容積中で１
０℃で１７−２４時間、約８単位のバクテリオファージ
Ｔ４のＤＮＡリガーゼを用いて行なう。

これらの連結は本発明によるコンポジットＤＮＡ配列を
含むプラスミドを得ることを可能にする。

ホスト細胞の形質転換 大腸菌は１次のようにしてプラスミド及びＤＮＡフラグ
メントに浸透性にする。　　６００ｎｎ＋でΔ１１定し
て０．３の吸光度を有する指数増殖期の細胞の、Ｌ媒体
中の、培養の２紅を氷で冷却する。

細胞は４℃で遠心分離によって［５０００ｒｐｍ。

３０００ｇ　］収得し、　　Ｃａ　Ｃ１２［５０ｍＭ］
の水冷却殺菌溶液１．　２１Ｌｌ中に徐々に再懸濁する
。水中で１０分間インキユベートシ、細胞を遠心分離で
回収し、細胞残留物を冷たい５０ｍＭ　　ＣａＣｌ２の
２００μノ中に再懸濁し、コンピテント細胞を生産する
ため２０−２４時間４℃でインキュベートする。

２００　ｎｇのリンクＤＮＡ　［約９０μ）の連結緩衝
中コを徐々にコンピテント細胞と徐々に混合する。この
混合物を水中に１０分間移し１次いで撹拌することなく
３７℃の水浴中に５分間おく。

５００μノのＬ媒体を管に加え、混合物を振り混ぜるこ
となく５０分間３７℃に放置し２次いで１００μｇ／ｇ
のアンピシリンを含む寒天を添加した４皿のし媒体にの
ばす、アンピシリン抵抗性コロニーは組換えプラスミド
を含む［選択の便宜上、ベータ　ラクタマーゼをコード
するａｍｐ　　遺伝子を運搬し、アンピシリン抵抗性を
付与する］。

２−結果 本発明によるコンポジットＤＮＡを含む３のプラスミド
を構成した。

例１　プラスミドｐ−１４９−１４７の構成プラスミド
ｐ−１４９−１４７の構成は次の３の因子を考慮に入れ
て行われた。

−ＡＵＧコドンからＳ／Ｄ配列を分離するｍＲＮＡの距
離は最適でなければならない、即ち。

９のヌクレオチドに等しい。

−シトシン又はグアニンよりは、アデニン及びチミンが
、Ｓ／Ｄ配列をコードするＤＮＡの近傍及びＡＴＧコド
ンのいずれかの側に位置しなければならない。

−ヌクレオチドの置換により、−２４位置及び−２２位
置に位置するシグナル　ペプチドのアミノ酸をそれぞれ
コードするＡＣＡ及びＴＣＣトリプレットを修飾するこ
とは有利である［Ａ　ＣＡはＡＣＣで、かつＴＣＣはＴ
ＣＴで置換される］［第１図参照］ プラスミドｐ−１４９−１４７は次の連合によって得ら
れる。

−参照９４Ｂ−８で特定されるプラスミドのフラグメン
ト［Ｍｓ　ｐ　Ｉ−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉフラグメントコ　ニ
ー　参照ｐ１２Ｂ−２で特定されるブラスミ・ドの２の
び。

−合成二重鎖オリゴヌクレオチド。

１．１．　　プラスミド９４６−８の構成プラスミドｐ
４ｅ−ｅは、プラスミドｐ４０−４及びｐｌａｃ２から
構成される。

ａ）　プラスミドｐ４０−４の構成［第２図］この構成
の出発は文献に記載されたプラスミドｐｈＧＨ−１であ
る　［Ｗ、ＲＯＳＫＡＭａｎｄ　Ｆ。

ＲＯＵ　Ｇ　Ｅ　ＯＮ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、　Ｒ
ｅｓ、、１９７９．７゜３０５−３２０コ、第３図はプ
ラスミドｐｈＧＨ−１の一定の制限位置［５ｉｔｅ］の
それぞれの位置を示す。

プラスミドｐｈＧＨ−１はｈＧＨ先駆体をコードする天
然ＤＮＡ配列を運搬する。この配列は、矢印で示した２
の位置、ＡｌｕＩ　　［シグナル　ペプチドの一２６位
置のアミノ酸をコードするＡＴＧコドンの５ヌクレオチ
ド上流に位置するコ及びＳｍａｌ［該配列の翻訳の終結
をコードするＴＡＧコドンの６ヌクレオチド下流に位置
する］の間にある。

プラスミドｐ４０−４は１次の方法によるプラスミドｐ
ｈＧ　Ｈ−１の２のフラグメントのプラスミドｐＢＲ３
２２への挿入によって生じる：制限位置Ａ１ｕＩ［ＡＴ
Ｇの５ヌクレオチド上流コ及びＳｍａ　Ｉ　　［ＴＡＧ
の６ヌクレオチド下流］は、ｈＧＨ先駆体をコードする
配列を分離するため選択される。

酵素Ｓｍａ　Ｉ及びＰｓｔＩによるｐｈＧＨの完全消化
及び酵素ＡｌｕＩによる部分消化後２２のフ基対］。

位置Ａｌｕｒ及びＳｍａ　Ｉは、適当なＥｃｏＲＩ及び
ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−を用いてそれぞれ制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｌによる切ｐ　Ｂ　Ｒ３２２に
クローンする。生成プラスミドは大腸菌株Ｃ６００の細
胞内でクローンし増幅する。

該フラグメントは次いでこれらのプラスミドがら精製し
、共にｐ　Ｂ　Ｒ３２２の同一の大配列Ｅｃ。

Ｒ１−ＨｌｎｄＩｌｌ、即ち位置Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒｒ　４
３６１及びＨｉｎｄｌＩＩ２９の間に挿入する。

上記の種々の過程が第２図に図式的に示されている。こ
こで。

−ＰＳはｈＧＨのシグナル　ペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を示し、及び。

−ｈＧＨはｈＧＨをコードする配列を示す。

結合ＰＳ−ｈＧＨはｈＧＨ先駆体をコードする配列を示
す。

ｂ）　プラスミドｐｌａｃ２の構成［第４ａ図コブラス
ミドｐｌａｃ２は９文献記載の方法でプラスミドｐＯＰ
２０３　　（ＵＶ５）から得られた［Ｐ、　　ＣＨＡＲ
ＮＡＹ　　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃｆｄｓ。

Ｒｒｅｓ、、１９７８．５．４４７９−４４９４．及び
に、ＢＡＣＫＭＡＮ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｐ　ｒｏｃ、
Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｌ、　　Ｕ　Ｓ　Ａ　
。

１９７Ｂ、　　７３．　４１７４−４１７８　　コ　。

プラスミドｐＯＰ２０３　　（ＵＶ５）　は、２（１’
）制限位置、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ、の間に長＜２０
５の塩基対のＤＮＡ配列を含み１次のものを包含するニ ー　図において「ｌａｃ　　ｉＪで示した。ラクトース
　オペロンのレプレッサをコードするｉ遺伝子。

−図においてｒＰｌｏ　　１ａｃＪで示した。

突然変異し８及びＵＶ５　［１ａ　ｃＬ８／ＵＶ５］を
運搬するラクトース　プロモーターオペレータ［突然変
異　Ｌ８／ＵＶ５は系をカタボライトリプレッションに
対して不感性にする］。

−図においてｒＳＤ２Ｊで示した。ラクトース　オペロ
ンのＳ／Ｄ配列をコードするＤＮＡ配列、及び −　β−ガラクトシダーゼの遺伝子の最初の８のアミノ
酸をコードするＩａｃＺ遺伝子の当該部分。

このプラスミドは特にプロモーターオペレータの５゛末
端にＡ１ｕＩ位置を含んでいることに留意すべきである
６ 制限酵素による連続消化及び適当な末端の結合の後、長
さの９５の塩基対のＨｉｎｄｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグ
メントがｐＯＰ２０３　　［ＵＶ５］から得られる。

これらの工程は本質的に次の通りである。

−ＥｃｏＲ１消化。

−Ａｌｕ１部分消化。

−Ｈ１ｎｄｌＩＩ末端の結合［ＨｉｎｄｌＩニリンカー
及びＨｉｎｄｌｌｌ消化］、−Ａｌｕｌ消化、及び −ＥｃｏＲＩ末端の結合［ＥｃｏＲＩリンカ−及びＥｃ
ｏＲ１消化コ。

消化柱るフラグメントは２図において「小Ｐ１０　１ａ
ｃＪで示した。その５′末端なしに上！ｃＬ８／ＵＶ５
プロモーターオペレータを含み。

ＤＮＡ領域はラクトース　オペロンのｍＲＮＡの非翻訳
５′末端に対応し、シャイン−ダルガノ配列［ＳＤ　　
］を含む。

プラスミドｐｌａｃ２は１位置ＨｉｎｄＩＩＩ２９及び
Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　４３６１においてプラスミドｐＢＲ
３２２に上記で得られたフラグメントの挿入で生じる。

このプラスミドｐｌａｃ２の構成の種々の過程は第４ａ
図に図式的に示しである。

Ｃ）　プラスミドｐ４ｆ３−６の構成［第４ｂ図コブラ
スミドｐ４Ｂ−６は、プロモーターオペレータ　小Ｐ１
０１ａｃ及びＳＤ　　配列を含むプラスミドｐｌａｃ２
に由来するＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩフラグメント、
及びｈＧＨ先駆体をコードする配列を含むプラスミドｐ
４０−４に由来するＥｃｏＲＩ−Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　
Ｉフラグメントの１位置ＨｉｎｄＩＩＩ　　２９で開い
たプラスミドｐＢＲ３２２への挿入で生じる。

プロモーターオペレータ１ａｃＬ８／ＵＶ５を含み、ラ
クトース　オペロンのｍＲＮＡの非翻訳５′末端に対応
しＳ／Ｄ配列を包含するＤＮＡ領域を含む、９５の塩基
対のフラグメントは、ｐｌａ旦２から再びＨＬｎｄＩ　
Ｉ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ消化によって分離される。このＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、及びプラスミ
ドｐ４０−４から分離され１次にＨｉ　ｎｄ　Ｉ　１１
−ＥｃｏＲＩ消化で分離されｈＧＨ先駆体をコードする
遺伝子を含む、ＥｃｏＲＩ−Ｈｌ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフ
ラグメントは。

位置ＨｉｎｄＩＩＩ２９でｐ　Ｂ　Ｒ８２２に挿入され
。

ｐ４６−６と呼ぶ新規プラスミドを生じる。

プラスミドｐ４６−６の構成の主工程は第４ｂ図に図式
的に示しである。

プラスミドｐ４６−６は５１３９の塩基対を含む。

１．２　プラスミドｐ１２ｆ３−２の構成プラスミドｐ
１２Ｂ−２は、プラスミド９４６−６及びｐＨ９−２か
ら構成する。

ａ）　プラスミドｐＨ９−２の構成［第５図］プラスミ
ドＩ）１１９−２は、プラスミドｐＯＰ２０３　　［Ｕ
Ｖ５］から構成され、これからプロモーターオペレータ
　Ｐｌｏ　　ｌａｃ、ＳＤ　　配列及び１ａｃＺ遺伝子
の５′末端を含むＨｉｎｄＩＩ消化、適当な末端の結合
［Ｈｉｎｄｌｌｌリンカ−］及びＨｉｎｄｌｌｌ消化に
より分離される。このフラグメントは位置Ｈｉｎｄｌｌ
１２９で開いてプラスミドｐＢＲ８２２に挿入し、プラ
スミドｐ１１５−１２を生じる。生成プラスミドｐＬ１
５−１２は。

ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ及びＡｌｕＩによる連
続消化［部分消化コによって、プロモーターオペレータ
　Ｐｌｏｌａｃ及びＳＤ２配列を含む。

１６０の塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｌｕｌフラグメン
トを調製するのに用いる。

プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２にクローンする。

このプラスミドの生産の種々の過程は第５図に図式的に
示しである。

ｂ）　プラスミドｐ１２［ｉ−２の構成［第６図参照］
このプラスミドは、その位置Ｈｉｎｄｌ１１２９及びＥ
ｃｏＲＩで開いてプラスミドｐＢＲ３２２に、　　ｈＧ
Ｈ先駆体をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド９４
Ｂ−８に由来する修飾ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩフラ
グメント、及びプロモーターオペレータＰ１０１ａｃ及
びＳＤ　　配列を含む。

プラスミドＩ）１１９−２に由来するＰｖｕＩ−Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントを挿入して生じる。修飾ＥｃｏＲ１−
ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントは、ＥｃｏＲＩ消化に続く
クレノ　［Ｋ　Ｉｅｎｏｖ　］　Ｄ　ＮＡポリメラーゼ
の助けによるプラント［ｂｌｕｎｔ　］末端の形成及び
Ｈｉｎｄｌｌｌ消化［部分消化］によって得られる。

Ｐｖｕｌｌ−ＥｃｏＲＩは、ＥｃｏＲＩ消化。

次いでＰｖｕｌｌ消化によってプラスミドｐＬ１９−２
から得られる。

プラスミドｐ１２Ｂ−２の調製の種々の過程は第６図に
図式的に示しである。

プラスミド９１２Ｂ−２は５２００の塩基対を含む。

ラスミドｐ４６−８から調製する。これは、第１図に示
したように、制限位置Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉ及びＰｓｔＩの間
にあるｈＧＨ先駆体をコードするＤＮＡ配列の当該部分
を含む、このフラグメントはＥｃｏＲＩ。

ｐｓｔＩ、及びＭｓｐＩでの連続消化によってプラスミ
ド９４Ｂ−６から得られる。

２のＤＮＡフラグメントはプラスミドｐ１２Ｂ−２から
得られる。これらのフラグメントは次の通りである。

−連続ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ消化によって得られる。

プロモーターオペレータ１ａｃＬ８／ＵＶ５及びＳＤ　
　配列を含む、９４７の塩基対のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメント；　及び。

−ＰｓｔＩ消化によって得られる。第１図に示したＰｓ
ｔＩ位置からのｈＧＨのカルボキシ末端をコードするＤ
ＮＡ配列の全部分を含む。

４０２７の塩基対のＰｓｔｌ−ＰｓｔＩフラグメント。

最後に１次の構造の二重鎖オリゴヌクレオチドを調製す
る。

５−ＡＡＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＴＣＴ３　−　　
ＴＡＣＣＧＡＴＧＧＣＣＡＧＡＧＣ上記の３のＤＮＡフ
ラグメント及びオリゴヌクレオチドは共に結合してプラ
スミドｐ１４９−１４７を形成する。これは次のものを
相互に接触させることによって行われる。　２００　ｎ
ｇのＰｓｔｌ−ＰｓｔＩフラグメント、　２５０　ｎｇ
のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ７ラグメント及び４　ｎｇの５
′末端で燐酸化しハイブリッド形成した合成二重鎖オリ
ゴヌクレオチド。

インキュベイジョンは最終容量２０μノで１８時間１０
℃で行ない１反応は次いで０．８μノの０．５Ｍ　　Ｅ
ＤＴＡ　［ｐＨ８コの添加で停止する。

次いで混合物を７０μ）のＨ２Ｏ及び１０μノのトリス
　ＨＣ１［ｐＨ７，６１の添加で１００μ）にする。

この混合物は大腸菌菌株Ｃ１０２４を形質転換するのに
用いる。アンピシリン抵抗性コロニーは。

ＲＩＡによるｈＧＨ生産、及び２０μｇ／ｍｉ！のテト
ラサイクリンを含む　し媒体／寒天の皿の上に広げてテ
トラサイクリン抵抗性を試験する。

組換えプラスミドは本発明によるコンポジット配列を包
含するプラスミドを含む５ このプラスミドｐＬ４９−１４７は次のように特性付け
られるニ ー　酵素ＥｃｏＲＩ及びＣ１ａｌはそれを単一点で切断
する； −酵素ＰｓｔＩはそれを２の点で切断する［２のフラグ
メント、４０２７の塩基対［ｂｐ］のもの及び１１６５
ｂｐの他のものが得られるコ　ニー　酵素ＨｉｎｄＩ　
Ｉ　Ｉはそれを２の点で切断し２のフラグメント、４３
６０ｂｐのもの及び８Ｂ２ｂｐの他のものを生産する；
　及び。

−酵素Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＰｖｕＩ　Ｉは、同時に用
いて、異なる大きさの５のフラグメント［２３３４ｂｐ
、２０２６ｂｐ、４８７ｂｐ。

３１４ｂｐ、及び３２ｂｐ］を生じ、これはプロモータ
ーオペレータ１ａｃＬ８／ＵＶ５．　　コンポジットＤ
ＮＡ配列及びｈＧＨ遺伝子の開始・点を含む３１４ｂｐ
のＨＥ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉを含む。

該プラスミドの配列はサンガーの方法で確認した［　Ｓ
　Ａ　Ｎ　Ｇ　Ｅ　Ｒｅｔ　ａｌ、、Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、ｓ虹、、ＵＳＡ、　１９７７、圓、　
５４３６−５４６７　］　。

ププラスミドル１４９−１７の新規ＤＮＡ配列の転写で
得られるｍＲＮＡの構造は第８図に示しである。

ここで。

−配列１はｍＲＮＡの非翻訳５′末端に対応し１次のも
のを含む： ・　ラクトース　オペロンのリプレッサの結合位置、及
び ・　ラクトース　オペロンのシャイン−ダルガノ配列［
Ｓ／Ｄ］　　； −配列２は合成二重鎖オリゴヌクレオチドの転写に対応
する； −配列３はその最初の１５のヌクレオチドを失ったｐｒ
ｅ−ｈＧ　Ｈをコードする遺伝子の転写に対応する；　
及び。

−ＡＵＧは翻訳を開始するコドンである。

例２　プラスミドｐ１８９−３０の構成［第９図］例１
に記載したのと同様の方法により、プラスミドｐ１８９
−３０を調製する。これは、プラスミドｐＬＢＵ３から
分離されｈＧＨをコードする遺伝子の下流に位置するＨ
ｉｎｄＩ１１位置に挿入されたファージｆｄの翻訳ター
ミネータをコードする３５２の塩基対の付加的フラグメ
ントを含む点でプラスミドＩ）１４９−１４７と異なる
［Ｒ，ＧＥＮＴＺｅｔ　ａｌ、、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａ
ｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　１９
８１゜７８、　４９３８−４９４０　　コ　。

このプラスミドｐ１６９−３０は、プラスミドｐＬＢＵ
３のＨｉｎｄｌＩＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ　　ＤＮＡフラグ
メントを、上記のＨｉｎｄ１１１位置で。

プラスミドＩ）１４９−１４７に挿入することによって
プラスミドＩ）１４９−１４７から得られる。

例３　プラスミドｐ１７１−６の構成［第１０図コ例１
に記載したのと同様の方法に従い、プラスミドｐ１７１
−８を調製する。これは、プロモーターオペレータ１ａ
ｃＬ８／ＵＶ５の代りにハイブリッド　プロモータｔ　
ｒｐ−１ａｃＵＶ５　　［ｒｔ　ａｃＪプロモータ］を
含む点でプラスミドｐ１８９−３０と異なる［Ｈ，Ａ、
ＤＥ　　ＢＯＥＲｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、ｓ　ｃｌ、、Ｕ　Ｓ　Ａ、　　１９８３．８
０．２１−２５　１　　。

第９図は生成プラスミドｐ１７１−８の制限位置のマツ
プを示す。

例４　　　ｈＧＨの生産及び特性付け ａ）　生産 プロモーターオペレータ１ａｃＬ８／ＵＶ５は、ｐＢＲ
３２２のような「マルチコピー」プラスミド又はその誘
導体［例えばｐ１４９−１４７］に存在し。

大腸菌の［正常（ｎｏｒｍａｌ）　Ｊラインに構成的態
様でｈＧＨの遺伝子を発現させる。

プラスミドｐ１４９−１４７又はその誘導体［例えばｐ
ｒｅ９−３０又はｐ１７１−８１で形質転換された大腸
菌Ｃ１０２４は、振り混ぜながら、３７℃で５０ｇｇ／
紅のアンピシリン［又はｐ１４９−１４７の場合には２
０ｇｇ／ＩＩＪ！のテトラサイクリンコと共にＬ媒体で
一夜培養する。この培養は他のし媒体を接種［０，５％
接種物］するのに用い、新規培養物は。

３７℃でインキュベーション後、振り混ぜながら。

ｈＧＨを生産するのに用いるものである６ｂ）　　　ｈ
ＧＨの特性付け： 上述したようにして調製した培養のＩＩＩｊ！を振り混
ぜながら３７℃でＬ媒体でインキュベートする［６００
　ｎｉｌこおける３、０の吸光度が得られるまで］ 最初の半分の培養、即ち０．　５ｍｌ、を遠心分離し全
溶解産物を残留物から回収する。

細胞残留物を、　　ｌｏＯｍｌｌ’当り１５ｇのスクロ
ース。

３０ｍＭのトリス　ＨＣ１［ｐＨ８，０］及び１ｍモル
／、ｌ！のＥＤＴＡを含む溶液の０．５Ｍに懸濁させる
。

細胞の溶解：　２０μノのリゾチームの濃厚溶液［１０
Ｂ／ｍｌを細胞懸濁液に加え、混合物を水中で１０分間
インキュベートする。　　ＬＯＯＭ当り５ｇのポリオキ
シエチレン　２０　　セチル　エーテル［Ｂｒ１ｊ５８
コを含む溶液［０，１Ｍ　　トリスＨＣＩ緩衝液中、　
　ｐＨ７，２］の１００μノ。

１００ｕｌ１００ｕｌｆ）　　［Ｉ　　Ｍ］、　　１０
０ｍ１当り１ｇのデオキシコレートを含む溶液［０，１
Ｍトリス　ＨＣＩ緩衝液中、　　ｐＨ８］の２００μノ
。

１０ｍｇ／ｄのデオキシリボヌクレアーゼを含む溶液の
８０μノを次いで加える。細胞の全溶解は混合物を水中
で１時間インキュベーションした後に生じる。

培養の他の半分をまた遠心分離し、培養媒体をぬき、細
胞残留物を全溶解産物［ＴＬ］に用いたのと同一の溶液
に注意深く懸濁させる。

室温で１０分後、細胞懸濁液を再び遠心分離し。

該「スクロース」上澄み液［ＳＳコを保存する。

残留物を０．５Ｕの冷水に懸濁し１次いで２℃で遠心分
離し、水性上澄み液［ＡＳ］をたくわえておく、全細胞
の新規残留物を同一溶液［スクロース、ＥＤＴＡ及びト
リス　ＨＣ１］に懸濁させ。

全溶解産物［ＴＬ］と同様に溶解する［ＲＬ］。

ｈＧＨはＲＩＡ　［放射免疫測定、　　１　ｎ５ｔ１ｔ
ｕｔｅＰ　ａｓｔｅｕｒＰ　ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、フラ
ンス］によってＴＬ。

ＳＳ、ＡＳ、及びＲＬ分画について測定するＲＩＡによ
る　ｈＧＨの局在［６００ｎａｊこおける３、０の吸光
度に対しＬ媒体中培養のｎｇ／ｌで］。

次のプラスミドの−により形質転換された大腸菌菌株Ｃ
１０２４について。

プラスミド　　ＳＳ　　　ＡＳ　　　ＲＬ　　　ＴＬｐ
１４９−１４７　　　　７２　　４０５　　　５２　　
３５０ｐ１８９−３０　　　　７４　　４２５　　　４
８　　３１３０ｐ１７１−８　　　　３００　　２０５
０　　１００　　８００この表の結果は明らかに生産さ
れたホルモンの大部分が浸透圧衝撃分画ＳＳ［スクロー
ス上澄み］及びＡＳ［水性上澄みコにありｒ　　ｈＧＨ
が大腸菌細胞の細胞周辺空間に分泌きれることを証明し
ている。

Ｃ）　高度生産のための成長条件 上記の結果は一層顕著である。これがラクトース　オペ
レータの完全抑制解除を許容する誘導の不存在下で得ら
れるからであり、また培養に抗生物質が加えられていな
いからである［事実、プラスミドがベータ　ラクタマー
ゼをコードする遺伝子を運搬する場合に、アンピシリン
の添加はプラスミドの多数のコピーを得ることを可能に
することが知られている］。

５０％改良された結果も大腸菌菌株Ｋ　１２−１０８１
で得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明に係るｈＧＨ先駆体のＤＮＡ配列及び
そのアミノ酸配列を示す図である。第２図は、プラスミ
ドの構成過程を示す図である。 第３図は、プラスミドにおける制限位置を示す図である
。第４ａ図、第４ｂ図、第５図、第６図。 第７図は、プラスミドの構成過程を示す図である。 第８図は１本発明に係るｍＲＮＡの構造を示す図である
。第９図は、プラスミドにおける制限位置を示す図であ
る。第１０図は、プラスミドの構成を示す図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）その５′末端からその３′末端まで次のものから
   なるコンポジットＤＮＡ配列。 ａ）シャイン−ダルガノ配列を含む、大腸菌のラクトー
   ス　オペロンのメッセンジャーＲＮＡの非翻訳５′末端
   をコードする天然ＤＮＡ配列；ｂ）構造５′ ＡＡＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＴ ３′を有するＤＮＡ配列；及び、 ｃ）シグナル　ペプチドの第１６構成ヌクレオチドから
   数えてｈＧＨのシグナル　ペプチドのカルボキシ末端に
   対応する天然ＤＮＡ配列。
2. （２）細菌プロモータ及びｈＧＨをコードする遺伝子の
   間に位置する特許請求の範囲第１項記載のコンポジット
   ＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
3. （３）微生物培養国立コレクションに寄託番号Ｉ−５３
   ３で寄託された大腸菌菌株に導入されたプラスミドの特
   性を有するプラスミドである特許請求の範囲第２項記載
   のベクター。
4. （４）特許請求の範囲第２又は３項のいずれかに記載の
   ベクターで形質転換された原核生物細胞。
5. （５）腸内細菌科の科の細菌である特許請求の範囲第４
   項記載の細菌菌株。
6. （６）大腸菌の菌株である特許請求の範囲第５項記載の
   細菌菌株。
7. （７）特許請求の範囲第５又は６項のいずれかに記載し
   た組換え微生物の培養、それに続く例えば浸透圧衝撃に
   よる細胞からのホルモンの抽出、及び衝撃後に得られた
   細胞外物質の精製による単離によって、蛋白質を得るヒ
   ト成長ホルモンの生産方法。