JPS63264530A - 腎成長促進剤及びその製造法 - Google Patents
腎成長促進剤及びその製造法Info
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- JPS63264530A JPS63264530A JP62095277A JP9527787A JPS63264530A JP S63264530 A JPS63264530 A JP S63264530A JP 62095277 A JP62095277 A JP 62095277A JP 9527787 A JP9527787 A JP 9527787A JP S63264530 A JPS63264530 A JP S63264530A
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- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は腎成長促進剤及びその製造法に関するものであ
る。
る。
更に詳細には、本発明は、腎成長促進活性を有する黄体
化ホルモンイソ体を有効成分とする腎成長促進剤とその
製造法に関するものである。
化ホルモンイソ体を有効成分とする腎成長促進剤とその
製造法に関するものである。
本発明においては、黄体化ホルモンイソ体に腎成長促進
作用のあることを確認したもので、本発明の腎成長促進
剤を投与すれば、腎細胞が減少した腎臓や腎機能の低下
した腎臓を活性化し、腎細胞の増加、腎機能の増強を期
待できるものであり、医薬界に貢献するところ大なるも
のがある。
作用のあることを確認したもので、本発明の腎成長促進
剤を投与すれば、腎細胞が減少した腎臓や腎機能の低下
した腎臓を活性化し、腎細胞の増加、腎機能の増強を期
待できるものであり、医薬界に貢献するところ大なるも
のがある。
（従来の技術）
従来、黄体化ホルモン又は黄体化ホルモンイソ体に腎成
長促進作用があることは知られていない。
長促進作用があることは知られていない。
本発明者らは、先に、下垂体を摘出したマウスにおいて
、腎重量の減少が顕著であるところから、下垂体に腎成
長を司る何らかの因子が存在するのではないかとの発想
から、下垂体に存在する腎成長因子を求めて鋭意研究し
たところ、下垂体から腎成長を促進するホルモン様成分
を分離し、これにＲＧＦ （又はレノトロピン）と名づ
けたのである。（日本臨休第４４巻第１号（昭和６１年
１月号）別冊８４〜８８頁）（発明が解決しようとする
問題点） しかしながら、ここに得られたＲＧＦは活性が一定しな
い粗精製物で、種々のアンタボニスチックに働く狭雑物
を含むことが明らかとなったのである。
、腎重量の減少が顕著であるところから、下垂体に腎成
長を司る何らかの因子が存在するのではないかとの発想
から、下垂体に存在する腎成長因子を求めて鋭意研究し
たところ、下垂体から腎成長を促進するホルモン様成分
を分離し、これにＲＧＦ （又はレノトロピン）と名づ
けたのである。（日本臨休第４４巻第１号（昭和６１年
１月号）別冊８４〜８８頁）（発明が解決しようとする
問題点） しかしながら、ここに得られたＲＧＦは活性が一定しな
い粗精製物で、種々のアンタボニスチックに働く狭雑物
を含むことが明らかとなったのである。
本発明者らは、ＲＧＦを単一物質として収得するために
更に研究を行い、先に粗精製物として得たＲＧＦを等電
点の差異によって分離精製処理したところ、意外にも有
効成分が単一バンドになることを見出したのである。
更に研究を行い、先に粗精製物として得たＲＧＦを等電
点の差異によって分離精製処理したところ、意外にも有
効成分が単一バンドになることを見出したのである。
ここに単一バンド成分の分析を行い、−次構造を決定し
たところ、全く意外なことには、黄体化ホルモンのイソ
体の内の１種であることが判明したのである。
たところ、全く意外なことには、黄体化ホルモンのイソ
体の内の１種であることが判明したのである。
従来黄体化ホルモンは単一でなく複数のイソ体よりなる
糖蛋白質であることが知られている。その現象は微小構
造上の多型性に帰因する。
糖蛋白質であることが知られている。その現象は微小構
造上の多型性に帰因する。
羊黄体化ホルモンについては、構成するサブユニットα
のアミノ酸鎖のアミノ基末端、及びサブユニットβのア
ミノ酸鎖のカルボキシル基末端が幾通りかの切断を受け
ていることが報告されている。（Ｄ、Ｎ。
のアミノ酸鎖のアミノ基末端、及びサブユニットβのア
ミノ酸鎖のカルボキシル基末端が幾通りかの切断を受け
ていることが報告されている。（Ｄ、Ｎ。
ＷＡＲＤ ； Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｒｅｓ、２７．１９８６７０〜７８）又、入費
体化ホルモンが、カラムエレクトロフォーカシングによ
り７つのピークに分かれることも報告されている。（矢
野まり子；日本産科婦人科学会誌ＶＯ１，３７，Ｎ（１
５７０３〜７１２（１９８５））−勿論、従来は、黄体
化ホルモン及び黄体化ホルモンの各イン体に腎成長促進
作用のあることは全く知られていなかったのである。
ｅｉｎ Ｒｅｓ、２７．１９８６７０〜７８）又、入費
体化ホルモンが、カラムエレクトロフォーカシングによ
り７つのピークに分かれることも報告されている。（矢
野まり子；日本産科婦人科学会誌ＶＯ１，３７，Ｎ（１
５７０３〜７１２（１９８５））−勿論、従来は、黄体
化ホルモン及び黄体化ホルモンの各イン体に腎成長促進
作用のあることは全く知られていなかったのである。
更に研究を進め、本発明においては、黄体化ホルモンイ
ソ体がサブユニットα３とサブユニットβ、が結合した
ものである場合に最も強い腎成長促進活性を有すること
も明らかとしたのである。
ソ体がサブユニットα３とサブユニットβ、が結合した
ものである場合に最も強い腎成長促進活性を有すること
も明らかとしたのである。
本発明は、これら知見から完成されたものである。
本発明は、黄体化ホルモンイソ体を有効成分とする腎成
長促進剤に関するものである。そして、黄体化ホルモン
イソ体がサブユニットα、とサブユニットβ３と結合し
たものであることが好ましい。
長促進剤に関するものである。そして、黄体化ホルモン
イソ体がサブユニットα、とサブユニットβ３と結合し
たものであることが好ましい。
また、本発明は、下垂体より分離した腎成長因子粗精製
物を等電点の差異によって分離精製処理することを特徴
とする腎成長促進活性を有する黄体化ホルモンイソ体の
製造法である。
物を等電点の差異によって分離精製処理することを特徴
とする腎成長促進活性を有する黄体化ホルモンイソ体の
製造法である。
ここでいう等電点の差異によって分離精製する処理とは
、蛋白質等の両性電解質を、個有の等電点に従って相互
分離し、分取する処理のことをいう。たとえばクロマト
フオーカシングやエレクトロフォーカシング等が用いら
れる。
、蛋白質等の両性電解質を、個有の等電点に従って相互
分離し、分取する処理のことをいう。たとえばクロマト
フオーカシングやエレクトロフォーカシング等が用いら
れる。
本発明において、原料となる腎成長因子粗精製物は、マ
ウス、ヒツジ、ブ°りなど咄乳動物の尿、血液あるいは
臓器より得られる粗黄体化ホルモン抽出物が使用される
。
ウス、ヒツジ、ブ°りなど咄乳動物の尿、血液あるいは
臓器より得られる粗黄体化ホルモン抽出物が使用される
。
たとえば、臓器より得る場合には下垂体に硫安水溶液を
加えて、ホモゲナイズし、遠心分離し、上清液を精製し
、凍結乾燥し、凍結乾燥物を溶解して。
加えて、ホモゲナイズし、遠心分離し、上清液を精製し
、凍結乾燥し、凍結乾燥物を溶解して。
ＳＰセファデックスクロマト、セファデックスＧ１００
クロマト、ＣＭセルロースクロマト、Ｃａｎ、 Ａクロ
マト、セファデックスＧ１００クロマト等の精製処理を
重ねて腎成長因子（ＲＧＦ）粗精製物が得られる。
クロマト、ＣＭセルロースクロマト、Ｃａｎ、 Ａクロ
マト、セファデックスＧ１００クロマト等の精製処理を
重ねて腎成長因子（ＲＧＦ）粗精製物が得られる。
得られた腎成長因子（ＲＧＦ）粗精製物は等電点の差異
によって分離精製する処理を行うことによって、腎成長
促進活性を有する物質を単一バンドとして収得すること
ができる。
によって分離精製する処理を行うことによって、腎成長
促進活性を有する物質を単一バンドとして収得すること
ができる。
ここに得られた単一バンドの腎成長促進活性を有する物
質は、構成成分であるαとβのサブユニットに分離する
ことができる。勿論各々のサブユニットへと分離するこ
とで腎成長促進活性は失なわれてしまう。
質は、構成成分であるαとβのサブユニットに分離する
ことができる。勿論各々のサブユニットへと分離するこ
とで腎成長促進活性は失なわれてしまう。
分離を行なう方法としてたとえば逆相系液体クロマトグ
ラフィーがある。分離パターンは、アミノ酸の長さに応
じてα、βサブユニット共にそれぞれ複数のピークを得
ることができる。これ等のピークは、既に報告されてい
るα、βサブユニットのアミノ酸が幾通りかに切断され
て短くなっているものに相当することが確認された。
ラフィーがある。分離パターンは、アミノ酸の長さに応
じてα、βサブユニット共にそれぞれ複数のピークを得
ることができる。これ等のピークは、既に報告されてい
るα、βサブユニットのアミノ酸が幾通りかに切断され
て短くなっているものに相当することが確認された。
サブユニットα３とサブユニットβ、の結合体は、黄体
化ホルモン活性をわずかに残しているが、著しるしい腎
成長促進活性を有する点で他の黄体化ホルモンイソ体と
異なるものである。
化ホルモン活性をわずかに残しているが、著しるしい腎
成長促進活性を有する点で他の黄体化ホルモンイソ体と
異なるものである。
サブユニットα３．β、とは、最も切断を受ていないも
のをいう。サブユニットを再結合した場合、最も強い腎
成長促進活性は、各種の組合わせの中でα１．β、の組
合わせに見い出された。
のをいう。サブユニットを再結合した場合、最も強い腎
成長促進活性は、各種の組合わせの中でα１．β、の組
合わせに見い出された。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
豚脳下垂体約３５０ｇと０．１５Ｍ硫安水溶液１１２に
フェニルメチルスルフォニルフルオライド１０ｍＭ加え
たのち、冷却しながらワーリング・ブレンダーにて２分
間ホモゲナイズした。ＰＨを４．０に調節したのち、冷
却下に充分放置したのち遠心分離を行い、上澄液を集め
、更に、０．５Ｍメタリン酸水溶液にてｐＨを３．０に
調節したのち遠心分離を行い、上澄液を集めた。上澄液
のｐＨを６．５〜７．０に調節したのち、０．５飽和に
なるまで硫安を添加し、再び冷却下に充分放置した。
フェニルメチルスルフォニルフルオライド１０ｍＭ加え
たのち、冷却しながらワーリング・ブレンダーにて２分
間ホモゲナイズした。ＰＨを４．０に調節したのち、冷
却下に充分放置したのち遠心分離を行い、上澄液を集め
、更に、０．５Ｍメタリン酸水溶液にてｐＨを３．０に
調節したのち遠心分離を行い、上澄液を集めた。上澄液
のｐＨを６．５〜７．０に調節したのち、０．５飽和に
なるまで硫安を添加し、再び冷却下に充分放置した。
遠心分離を行い、沈澱を集め、５０〜１００ｍＭの０．
２Ｍリン酸二カリウム溶液に懸濁させた。透析チューブ
へ移し、冷却下で充分透析を行ったのち、内容液を採り
出し、ｐＨを再度８．５に調節し、凍結乾燥した。
２Ｍリン酸二カリウム溶液に懸濁させた。透析チューブ
へ移し、冷却下で充分透析を行ったのち、内容液を採り
出し、ｐＨを再度８．５に調節し、凍結乾燥した。
得られた凍結乾燥粉末を、０，０１Ｍリン酸二ナトリウ
ム溶液で溶解したのち、同緩衝液で平衡化した５Ｐ−５
ｅｐｈａｄｅｘ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにかけ
、 ０．１Ｍリン酸二ナトリウム溶出画分を集めた。該
当画分を凍結乾燥した。
ム溶液で溶解したのち、同緩衝液で平衡化した５Ｐ−５
ｅｐｈａｄｅｘ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにかけ
、 ０．１Ｍリン酸二ナトリウム溶出画分を集めた。該
当画分を凍結乾燥した。
この凍結乾燥粉末を少量の０．０５Ｍ炭酸水素アンモニ
ウム溶液に溶解したのち、同緩衝液系を用いた５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを
用いて分子篩による分画を行った。約４万前後の両分を
集めたのち、凍結乾燥を行った。
ウム溶液に溶解したのち、同緩衝液系を用いた５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを
用いて分子篩による分画を行った。約４万前後の両分を
集めたのち、凍結乾燥を行った。
乾燥粉末を少量の１０＋＋＋Ｍ ’ｒ−リスー塩酸（Ｐ
）１７．５）、 Ｏ。
）１７．５）、 Ｏ。
３Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解したのち、同緩衝液系を
用いたＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて分画し、０
．２Ｍメチルマンノシドにて溶出される両分を集めた。
用いたＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて分画し、０
．２Ｍメチルマンノシドにて溶出される両分を集めた。
該当画分を冷却下にて充分に透析を行ったのち凍結乾燥
を行い、腎生長因子（ＲＧＦ）粗精製特約２５ｍｇを得
た。 つづいて、該粗精製物を等電点による分画精製を
行った。ＬＫＢ等電点電気泳動用カラム（ＬＫＢ Ｐｒ
ｏｄｕｋｔｅｒ ＡＢ、 Ｂｒｏｍｍａ、 Ｓｗｅｄｅ
ｎ） （１１０ｍＱ容量）を用いた。キャリアーアンホ
ライトとして Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ３，５〜１０
（ＬＫＢ）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ９〜１１（ＬＫ
Ｂ）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ７〜９（ＬＫＢ）を用
いた。５〜５０％のソルビトール密度勾配を作成し、該
粗精製物を２ｍ１ｌｌのｄｅｎｓｅ ５ｏｌｕｔｉｏｎ
に溶解したのちカラム中央部に重層した。電極液として
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液及び０．０１Ｍ酢酸溶液を用
いたａ４℃、８００ｖの条件下で２４時間の通電を行っ
た。通電終了後分取用フラクションコレクターを用いて
１ 、５ｎａｆｌづつ分取した。
を行い、腎生長因子（ＲＧＦ）粗精製特約２５ｍｇを得
た。 つづいて、該粗精製物を等電点による分画精製を
行った。ＬＫＢ等電点電気泳動用カラム（ＬＫＢ Ｐｒ
ｏｄｕｋｔｅｒ ＡＢ、 Ｂｒｏｍｍａ、 Ｓｗｅｄｅ
ｎ） （１１０ｍＱ容量）を用いた。キャリアーアンホ
ライトとして Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ３，５〜１０
（ＬＫＢ）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ９〜１１（ＬＫ
Ｂ）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ７〜９（ＬＫＢ）を用
いた。５〜５０％のソルビトール密度勾配を作成し、該
粗精製物を２ｍ１ｌｌのｄｅｎｓｅ ５ｏｌｕｔｉｏｎ
に溶解したのちカラム中央部に重層した。電極液として
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液及び０．０１Ｍ酢酸溶液を用
いたａ４℃、８００ｖの条件下で２４時間の通電を行っ
た。通電終了後分取用フラクションコレクターを用いて
１ 、５ｎａｆｌづつ分取した。
直ちに各画分のＰＨ（４℃）を測定した（電気化学工業
■製Ｃ０Ｍ−１１、電極タイプＣＥ １０５Ｇ、’和光
純薬工業■製標準緩衝液）。同時に各両分の蛋白質の定
量を行った。電気泳動の態様は第１図に示される。
■製Ｃ０Ｍ−１１、電極タイプＣＥ １０５Ｇ、’和光
純薬工業■製標準緩衝液）。同時に各両分の蛋白質の定
量を行った。電気泳動の態様は第１図に示される。
その結果、腎生長因子粗精製物約１ 、５ｍｇより、Ｐ
Ｉ＞１０．３２、ＰＩ １０．３２〜１０．１５、ＰＩ
１０．１５〜９．８９、ｐＩ＜９．８９の各画分をそ
れぞれおよそ１０４μｇ、２８１μｇ、４１５μｇ、１
０３μｇ得た。
Ｉ＞１０．３２、ＰＩ １０．３２〜１０．１５、ＰＩ
１０．１５〜９．８９、ｐＩ＜９．８９の各画分をそ
れぞれおよそ１０４μｇ、２８１μｇ、４１５μｇ、１
０３μｇ得た。
それぞれの両分を冷却下にて充分に透析を行い、Ａｍｐ
ｈｏｌｉｎｅ及びソルビトールを除去したのち、凍結乾
燥を行って粉末化した。
ｈｏｌｉｎｅ及びソルビトールを除去したのち、凍結乾
燥を行って粉末化した。
全く同一条件で数回の等電点電気泳動法により腎成長因
子粗精製物の精製をくり返し、各々の各両分を合一した
。尚、標準蛋白質として用いたウマ心臓ミオグロビン（
Ｔｙｐｅ ｍ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、
、）のｐＨ値は７．９７であった。
子粗精製物の精製をくり返し、各々の各両分を合一した
。尚、標準蛋白質として用いたウマ心臓ミオグロビン（
Ｔｙｐｅ ｍ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、
、）のｐＨ値は７．９７であった。
（腎成長促進活性の測定）
上述のいずれの両分が腎成長促進を有するか判定した。
なお、レノトロピンの作用による腎成長促進効果は、腎
細胞のＤＮＡ合成能の促進を指標とした。
細胞のＤＮＡ合成能の促進を指標とした。
平均体重１００ｇ、同日出生日のＣＤラット（日本チャ
ールス・リバー株式会社）オスを下垂体摘出手術及び去
勢手術を施し、９日間飼育した。手術が適切に行なわれ
たラットを確認したのち、対照区も含めて５匹以上のラ
ットを一群としてそれぞれの実験区を設けた。
ールス・リバー株式会社）オスを下垂体摘出手術及び去
勢手術を施し、９日間飼育した。手術が適切に行なわれ
たラットを確認したのち、対照区も含めて５匹以上のラ
ットを一群としてそれぞれの実験区を設けた。
等電点電気泳動により分画したそれぞれの分画特番ｓｏ
μｇを１５０ ｐ Ｑ（５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ７，
５，０，１％ＢＳＡ）に溶解し、ラットに皮下注射した
。８時間後、断頭し、脱血したのち直ちに左及び右腎を
摘出し、被膜を剥離したのち ｃｏｒｔｉｃｏｍｅｄｕｌｌａｒｙ ａｘｉｓに沿って
スライスを各々２枚作成した。２枚のスライスは２ｍＱ
のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｓｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ
緩衝液（ｐＨ７，５）中にて３７℃２時間のインキュベ
ーションを行った。同緩衝液は、予じめ９５％酸素、５
％炭酸ガス混合ガスにて通気を行い、且つ１，２−メチ
ル３Ｈ−サイミジン （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ （、ｏｒ
ｐｓ、）を２μＣ１／ｍ１２添加した。インキュベー、
シ３ン終了後、４ｍＭサイジミン溶液にてスライスをリ
ンスしたのち一２０℃にて保存した。
μｇを１５０ ｐ Ｑ（５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ７，
５，０，１％ＢＳＡ）に溶解し、ラットに皮下注射した
。８時間後、断頭し、脱血したのち直ちに左及び右腎を
摘出し、被膜を剥離したのち ｃｏｒｔｉｃｏｍｅｄｕｌｌａｒｙ ａｘｉｓに沿って
スライスを各々２枚作成した。２枚のスライスは２ｍＱ
のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｓｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ
緩衝液（ｐＨ７，５）中にて３７℃２時間のインキュベ
ーションを行った。同緩衝液は、予じめ９５％酸素、５
％炭酸ガス混合ガスにて通気を行い、且つ１，２−メチ
ル３Ｈ−サイミジン （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ （、ｏｒ
ｐｓ、）を２μＣ１／ｍ１２添加した。インキュベー、
シ３ン終了後、４ｍＭサイジミン溶液にてスライスをリ
ンスしたのち一２０℃にて保存した。
保存されたスライスに蒸留水４ｍＱを加え、ウルトラブ
イスパーサ（ヤマト科学）を用いホモゲナイズしたのち
、Ｆｌｅｃｋ Ａ ａｎｄ Ｍｕｎｒｏ ＨＮ（１９６
２゜Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ
５５．５７１）の方法に従ってＤＮＡの抽出を行い、
Ｗａｎｎｅｍａｃｈｅｒ ＪＲＩｌｌａｎｄ Ｂａｎｋ
ｓＪＷＬ。
イスパーサ（ヤマト科学）を用いホモゲナイズしたのち
、Ｆｌｅｃｋ Ａ ａｎｄ Ｍｕｎｒｏ ＨＮ（１９６
２゜Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ
５５．５７１）の方法に従ってＤＮＡの抽出を行い、
Ｗａｎｎｅｍａｃｈｅｒ ＪＲＩｌｌａｎｄ Ｂａｎｋ
ｓＪＷＬ。
Ｗｕｎｎｅｒ ＷＨ（１９６５，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋＋＋ １１ ： ３２０）の方法に従ってＤＮＡの
加水分解を行い、Ｂｕｒｔｏｎ Ｋ （１９５６，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ Ｊ、 ６２ ： ３１５）の方法に従っ
て牛胸腺ＤＮＡ （ｔｙｐｅＴ 、 Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅ＠１ｃａｌ Ｃｏ、）を標準ＤＮＡとしてＤＮＡ定量
を行った。又、同時に、抽出ＤＮＡ ０．５＋＋＋Ｑ中
のラジオアクティビティ−を常法に従い測定した。
ｅ＋＋＋ １１ ： ３２０）の方法に従ってＤＮＡの
加水分解を行い、Ｂｕｒｔｏｎ Ｋ （１９５６，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ Ｊ、 ６２ ： ３１５）の方法に従っ
て牛胸腺ＤＮＡ （ｔｙｐｅＴ 、 Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅ＠１ｃａｌ Ｃｏ、）を標準ＤＮＡとしてＤＮＡ定量
を行った。又、同時に、抽出ＤＮＡ ０．５＋＋＋Ｑ中
のラジオアクティビティ−を常法に従い測定した。
青細胞のＤＮＡ合成促進能は、ラジオアクティビティ−
／総ＤＮＡ量で計算し、対照区を１００％ととした実験
区の百分率で算出した。その結果、 ｐＩ＞ １０．３
２画分ニ１０９％、ＰＩ １０．３２〜１０．１５画分
４：１３０％（第１図の太い矢印）、最も蛋白質含量が
高いｐｌｌｏ、１５〜９゜８９画分にはＤＮＡ合成促進
能は無く（９８％）、 ｐＩ＜９．８９画分に１１５％
（第１図の細い矢印）の活性があった。
／総ＤＮＡ量で計算し、対照区を１００％ととした実験
区の百分率で算出した。その結果、 ｐＩ＞ １０．３
２画分ニ１０９％、ＰＩ １０．３２〜１０．１５画分
４：１３０％（第１図の太い矢印）、最も蛋白質含量が
高いｐｌｌｏ、１５〜９゜８９画分にはＤＮＡ合成促進
能は無く（９８％）、 ｐＩ＜９．８９画分に１１５％
（第１図の細い矢印）の活性があった。
従ってｐＩ １０．３２〜１０．１５画分及びｐＩ＜９
．８９ （９，８９〜９．３２）画分が腎生長促進成分
であった。尚、ｐＩ＞１０゜３２画分も弱いながらも腎
生長促進成分が混入しているものと考えられた。
．８９ （９，８９〜９．３２）画分が腎生長促進成分
であった。尚、ｐＩ＞１０゜３２画分も弱いながらも腎
生長促進成分が混入しているものと考えられた。
尚、同じバッチである腎成長因子粗精製物についても同
時にＤＮＡ合成促進能を測定した結果、１１２％の活性
があった。
時にＤＮＡ合成促進能を測定した結果、１１２％の活性
があった。
（腎生長促進成分のｉｎ ｖｉｖｏにおける腎成長効果
）平均体重１７ｇ、同日出生日のＣＤ−１マウスオス（
日本チャールス・リバー株式会社）を下垂体摘出手術及
び去勢手術を施し、９日間飼育した。手術が適切に行な
われていたマウスを確認したのち、対照区及び実験区そ
れぞれ１０匹づつの群にわけた６ 等電点電気泳動によ
り分画したＰｌｌｏ、３２〜１０．１５画分４０μｇづ
つ各々を１５０ μｍの５０ｍ ｐ Ａホウ酸緩衝液Ｐ
Ｈ７，５，０゜１％ＢＳＡ溶液に溶解し、−匹当り１５
０μＱ／日づつ５日間連続皮下注射した。６日目に断頭
し脱血したのち、直ちに左及び右腎を摘出し、被膜を剥
離したのち、腎を凍結乾燥した。ラットの最終体重当り
の腎乾燥重量を算出し、対照区と実験区における腎重量
の差を検定した。その結果、実験区は対照区に比べ１１
６％の増加が見られ、当該両分が腎成長効果を有するこ
とが判った。
）平均体重１７ｇ、同日出生日のＣＤ−１マウスオス（
日本チャールス・リバー株式会社）を下垂体摘出手術及
び去勢手術を施し、９日間飼育した。手術が適切に行な
われていたマウスを確認したのち、対照区及び実験区そ
れぞれ１０匹づつの群にわけた６ 等電点電気泳動によ
り分画したＰｌｌｏ、３２〜１０．１５画分４０μｇづ
つ各々を１５０ μｍの５０ｍ ｐ Ａホウ酸緩衝液Ｐ
Ｈ７，５，０゜１％ＢＳＡ溶液に溶解し、−匹当り１５
０μＱ／日づつ５日間連続皮下注射した。６日目に断頭
し脱血したのち、直ちに左及び右腎を摘出し、被膜を剥
離したのち、腎を凍結乾燥した。ラットの最終体重当り
の腎乾燥重量を算出し、対照区と実験区における腎重量
の差を検定した。その結果、実験区は対照区に比べ１１
６％の増加が見られ、当該両分が腎成長効果を有するこ
とが判った。
（腎生長促進成分のサブ空ニットαとβへの分離と再会
合） 等電点電気泳動により分画したｐｌｌｏ、３２〜１０．
１５画分を高速液体クロマトグラフィーによりサブユニ
ット分離分取した。０．１％トリフルオロ酢酸 （ＴＦ
Ａ）水溶液の少量に溶解したのち、逆相カラム（Ｂａｋ
ｅｒＢｏｎｄ ｗｉｄｅ ｐｏｒｅ ｂｕｔｙｌ Ｃ，
： Ｂａｋｅｒ Ｒａ５ｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
）を使用し、０．１％ＴＦＡ入り２−プロパツール／ア
セトニトリル（７： ３）を溶媒とし１０％から５０％
の直線勾配にて分離し分取した。
合） 等電点電気泳動により分画したｐｌｌｏ、３２〜１０．
１５画分を高速液体クロマトグラフィーによりサブユニ
ット分離分取した。０．１％トリフルオロ酢酸 （ＴＦ
Ａ）水溶液の少量に溶解したのち、逆相カラム（Ｂａｋ
ｅｒＢｏｎｄ ｗｉｄｅ ｐｏｒｅ ｂｕｔｙｌ Ｃ，
： Ｂａｋｅｒ Ｒａ５ｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
）を使用し、０．１％ＴＦＡ入り２−プロパツール／ア
セトニトリル（７： ３）を溶媒とし１０％から５０％
の直線勾配にて分離し分取した。
サブユニットのα及びβはそれぞれ主たる３本づつのピ
ークとして得られ、溶出順にα１．α２．α、。
ークとして得られ、溶出順にα１．α２．α、。
β１．β２．β３と名付けた。試料３ｍｇを分離した場
合。
合。
収量はそれぞれ２３０μｇ、 ４５０μｇ、 ３５０μ
ｇ、 ４１０μｇ。
ｇ、 ４１０μｇ。
５７０μｇ、６０μｇであった。アミノ酸組成分析等の
分析の結果、α３．β、が共に最も分解の少ない黄体化
ホルモンであることが判った。
分析の結果、α３．β、が共に最も分解の少ない黄体化
ホルモンであることが判った。
α、とβ８．α２とβ２．α、とβ、をそれぞれ等モル
づつ混合し、少量の１％炭酸アンモニウム水溶液中にて
３７℃４８時間保温し両サブユニットの再会合を行った
。つづいてＴＳＫ ｇｅｍ Ｇ ３０００ＳＩＩＩカラ
ム（東洋曹達製）を用いて脱塩を行ったのち凍結乾燥を
行った。
づつ混合し、少量の１％炭酸アンモニウム水溶液中にて
３７℃４８時間保温し両サブユニットの再会合を行った
。つづいてＴＳＫ ｇｅｍ Ｇ ３０００ＳＩＩＩカラ
ム（東洋曹達製）を用いて脱塩を行ったのち凍結乾燥を
行った。
それぞれのサンプルについて前述したＤＮＡ合成促進能
により活性の強さを比較した。 その結果α、−β□の
組合わせが最も強く、対照区との差においてα□−β□
の組合わせの約２．５倍 の活性があることが判った。
により活性の強さを比較した。 その結果α、−β□の
組合わせが最も強く、対照区との差においてα□−β□
の組合わせの約２．５倍 の活性があることが判った。
実施例２
羊腸下垂体粉末（Ｗａｉｔａｋｉ ＮＺ Ｒｅｆｒｉｇ
ｅｒａｔｉｎｇＬＴＤ）を４００＋ｎＱ冷水に懸濁させ
たのち、１．５１１の０．１５Ｍ硫安溶液を加え、１０
ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド１０ｍＭ
加えたのち、冷却しながらポリトロン・にて２分間ホモ
ゲナイズした。ｐＨを４．０に調節したのち、冷却下に
充分放置したのち遠心分離を行い、上澄液を集めた。以
下実施例１と同様にして処理したのち、 ５ｐ−Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘカラム、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラ
ム、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラムにかけ腎生長因子粗精製物を得た。
ｅｒａｔｉｎｇＬＴＤ）を４００＋ｎＱ冷水に懸濁させ
たのち、１．５１１の０．１５Ｍ硫安溶液を加え、１０
ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド１０ｍＭ
加えたのち、冷却しながらポリトロン・にて２分間ホモ
ゲナイズした。ｐＨを４．０に調節したのち、冷却下に
充分放置したのち遠心分離を行い、上澄液を集めた。以
下実施例１と同様にして処理したのち、 ５ｐ−Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘカラム、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラ
ム、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラムにかけ腎生長因子粗精製物を得た。
更に、実施例１と同様に腎生長因子粗精製物５Ｂを等電
点電気泳動法による分画を行った。その結果。
点電気泳動法による分画を行った。その結果。
ｐＩ＞９．８５、ｐ Ｉ ＞ ９ 、８５〜９ 、６０
、ｐＨ９，６０〜９．１０、ｐＨ９，１０〜８．６０．
ｐＨ８，６０〜７．３０、ｐＩ＞７．３０の両分に分
けた。
、ｐＨ９，６０〜９．１０、ｐＨ９，１０〜８．６０．
ｐＨ８，６０〜７．３０、ｐＩ＞７．３０の両分に分
けた。
実施例１と同様のバイオアッセイの結果ｐＩ＞９．８５
の両分に腎生長促進成分が存在するのが確認された。
の両分に腎生長促進成分が存在するのが確認された。
実施例３
大脳下垂体抽出物（ＫａｂｉＶｉｔｒｕｎ ＡＢ） ７
５０ｍＱを遠心分離して沈澱物を集めた。７０ｍΩ０．
２Ｍリン酸二カリウム水溶液に懸濁したのち６０℃に３
分間加熱し、つづいて冷却下に透析を２日行った。内容
物をとり出し、０．１３Ｍ硫安を加えたのちｐＨを４．
０に調節したのち、０．５Ｍメタリン酸溶液にてｐＨ３
，０に調節し、冷却下に放置したのち、遠心分離を行い
、上澄液を集めた。
５０ｍＱを遠心分離して沈澱物を集めた。７０ｍΩ０．
２Ｍリン酸二カリウム水溶液に懸濁したのち６０℃に３
分間加熱し、つづいて冷却下に透析を２日行った。内容
物をとり出し、０．１３Ｍ硫安を加えたのちｐＨを４．
０に調節したのち、０．５Ｍメタリン酸溶液にてｐＨ３
，０に調節し、冷却下に放置したのち、遠心分離を行い
、上澄液を集めた。
冷却下にて充分に透析を行ったのち、凍結乾燥を行った
・ 以下実施例１と同様に５ｐ−５ｅｐｈａｄｅｘカラム、
５ｅｐｈａｄｓｘ Ｇ−１００カラムにかけて粗黄体化
ホルモン抽出物を得た。
・ 以下実施例１と同様に５ｐ−５ｅｐｈａｄｅｘカラム、
５ｅｐｈａｄｓｘ Ｇ−１００カラムにかけて粗黄体化
ホルモン抽出物を得た。
粗黄体化ホルモン抽出物をｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけ腎生長因子粗精製
物を得た。
Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけ腎生長因子粗精製
物を得た。
得られた該粗精製物を等電点電気泳動法による分画を行
った。得られた各分画につき実施例１と同様のバイオア
ッセイを行った結果、ＰＩ９．１２〜９．９０の両分に
腎生長促進成分が存在するのが確認された。
った。得られた各分画につき実施例１と同様のバイオア
ッセイを行った結果、ＰＩ９．１２〜９．９０の両分に
腎生長促進成分が存在するのが確認された。
第１図は、実施例１において、腎生長因子粗精製物を等
電点電気泳動処理した各蛋白含量を示す図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 フラクレヨ′／を号 手続補正書 昭和６２年１１月１３日
電点電気泳動処理した各蛋白含量を示す図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 フラクレヨ′／を号 手続補正書 昭和６２年１１月１３日
Claims (2)
- （１）黄体化ホルモンイソ体を有効成分とする腎成長促
進剤。 - （２）腎成長因子粗精製物を等電点の差異によって分離
精製処理することを特徴とする腎成長促進活性を有する
黄体化ホルモンイソ体の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62095277A JPS63264530A (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | 腎成長促進剤及びその製造法 |
| PCT/JP1988/000385 WO1988008307A1 (fr) | 1987-04-20 | 1988-04-19 | Accelerateur de la croissance renale et procede de preparation dudit accelerateur |
| DE88903384T DE3881396T2 (de) | 1987-04-20 | 1988-04-19 | Nieren-wachstumsbeschleuniger und verfahren zu seiner herstellung. |
| EP88903384A EP0373218B1 (en) | 1987-04-20 | 1988-04-19 | Kidney growth accelerator and process for its preparation |
| CN88107233A CN1037154A (zh) | 1987-04-20 | 1988-10-18 | 肾生长促进剂及其生产方法 |
| KR1019880013617A KR890015750A (ko) | 1987-04-20 | 1988-10-19 | 신장 생장 촉진제 및 그의 제조방법 |
| US07/299,928 US5055554A (en) | 1987-04-20 | 1988-12-01 | Renal growth promoter and process for the production of the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62095277A JPS63264530A (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | 腎成長促進剤及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63264530A true JPS63264530A (ja) | 1988-11-01 |
| JPH0478618B2 JPH0478618B2 (ja) | 1992-12-11 |
Family
ID=14133278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62095277A Granted JPS63264530A (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | 腎成長促進剤及びその製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0373218B1 (ja) |
| JP (1) | JPS63264530A (ja) |
| KR (1) | KR890015750A (ja) |
| CN (1) | CN1037154A (ja) |
| DE (1) | DE3881396T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988008307A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989005153A1 (fr) * | 1987-12-03 | 1989-06-15 | The Calpis Food Industry Co., Ltd. | Accelerateur de la croissance du rein |
| WO1997012631A1 (en) * | 1995-09-29 | 1997-04-10 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Drug for ameliorating renal function |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5743696A (en) * | 1980-08-27 | 1982-03-11 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of human luteinizing hormone |
-
1987
- 1987-04-20 JP JP62095277A patent/JPS63264530A/ja active Granted
-
1988
- 1988-04-19 DE DE88903384T patent/DE3881396T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-19 WO PCT/JP1988/000385 patent/WO1988008307A1/ja not_active Ceased
- 1988-04-19 EP EP88903384A patent/EP0373218B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-18 CN CN88107233A patent/CN1037154A/zh active Pending
- 1988-10-19 KR KR1019880013617A patent/KR890015750A/ko not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989005153A1 (fr) * | 1987-12-03 | 1989-06-15 | The Calpis Food Industry Co., Ltd. | Accelerateur de la croissance du rein |
| WO1997012631A1 (en) * | 1995-09-29 | 1997-04-10 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Drug for ameliorating renal function |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1037154A (zh) | 1989-11-15 |
| DE3881396T2 (de) | 1993-12-16 |
| KR890015750A (ko) | 1989-11-25 |
| EP0373218B1 (en) | 1993-05-26 |
| EP0373218A4 (en) | 1990-04-10 |
| EP0373218A1 (en) | 1990-06-20 |
| JPH0478618B2 (ja) | 1992-12-11 |
| WO1988008307A1 (fr) | 1988-11-03 |
| DE3881396D1 (de) | 1993-07-01 |
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