JPS63267294A - 複合セルピンおよびこれらをコードするｄｎａ - Google Patents
複合セルピンおよびこれらをコードするｄｎａInfo
- Publication number
- JPS63267294A JPS63267294A JP63067041A JP6704188A JPS63267294A JP S63267294 A JPS63267294 A JP S63267294A JP 63067041 A JP63067041 A JP 63067041A JP 6704188 A JP6704188 A JP 6704188A JP S63267294 A JPS63267294 A JP S63267294A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hls2
- gene
- exon
- serpin
- composite
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
欧州特許出願（ＥＰ−Ａ ）公開第０．１９０，６５２
号には、そのときから「ロイセルピン−２」（ｈＬＳ２
）と命名されたヒトセルピンが開示されている。このＥ
Ｐ−Ａでは、また、ｈ Ｌ Ｓ ２のｃＤＮＡを再生し
ており、個々のアミノ酸が置換、削除または挿入されて
いる適宜に修飾されたタンパク質を産生ずる修飾遺伝子
または部分遺伝子の調製の可能性についても指摘してい
る。例えば、「構築ブロック原理」について言及してい
るが、これは、活性中心の上流のアミノ酸配列をコード
する部分遺伝子Ｉを、活性中心の下流のアミノ酸配列を
コードする部分遺伝子■と結合させて、その間に活性中
心をコードする遺伝子フラグメントを挿入するものであ
る。
号には、そのときから「ロイセルピン−２」（ｈＬＳ２
）と命名されたヒトセルピンが開示されている。このＥ
Ｐ−Ａでは、また、ｈ Ｌ Ｓ ２のｃＤＮＡを再生し
ており、個々のアミノ酸が置換、削除または挿入されて
いる適宜に修飾されたタンパク質を産生ずる修飾遺伝子
または部分遺伝子の調製の可能性についても指摘してい
る。例えば、「構築ブロック原理」について言及してい
るが、これは、活性中心の上流のアミノ酸配列をコード
する部分遺伝子Ｉを、活性中心の下流のアミノ酸配列を
コードする部分遺伝子■と結合させて、その間に活性中
心をコードする遺伝子フラグメントを挿入するものであ
る。
ｈＬＳ２をコードするゲノムクローンが今や見出され、
その遺伝子構造が決定された。この遺伝子構造は、本発
明によって新規の複合セルピンの製造に利用される。
その遺伝子構造が決定された。この遺伝子構造は、本発
明によって新規の複合セルピンの製造に利用される。
セルピンは、血液凝固、補体の活性化および炎症反応の
種々の局面においてプロテアーゼインヒビターとして機
能する一群のタンパク質である。
種々の局面においてプロテアーゼインヒビターとして機
能する一群のタンパク質である。
セルピンは、相互のアミノ酸の相同率が約２０−３５％
であるタンパク質の一族に属している（Ｒ。
であるタンパク質の一族に属している（Ｒ。
Ｆ、 ０ｏｏｌｉｔｔｌｅ、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２２
（１９８３） ４１７−４１９： ＬＲａｇ３、Ｎｕ
ｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、 Ｒｅｓ、 １４ （１９８６）
１０７３−１０８８）。
（１９８３） ４１７−４１９： ＬＲａｇ３、Ｎｕ
ｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ、 Ｒｅｓ、 １４ （１９８６）
１０７３−１０８８）。
これらのプロテアーゼインヒビターの特異性は、一方で
は、反応中心のＰ１位置のアミノ酸によって決定され（
Ｍ 、 Ｌａｓｋｏｗｓｋ ｉおよび１．１ｃａｔｏ、
Ａｎｎｕ、 Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ４９ （１
９８０） ５９３−６２９）、他方では、明らかにまた
セルピンの活性に影響を及ぼす他のアミノ酸配列および
構造因子によっても決定される。これに加えて、あるセ
ルピン、例えば、アンジオテンシノーゲンなとでは、Ｎ
末端領域が独立した機能的および構造的役割を果してい
る（Ｓ、 ５ｙｎｄｅｒおよびＲ，１ｎｎｉｓ、 Ａｎ
ｎｕ、 Ｒｅｖ。
は、反応中心のＰ１位置のアミノ酸によって決定され（
Ｍ 、 Ｌａｓｋｏｗｓｋ ｉおよび１．１ｃａｔｏ、
Ａｎｎｕ、 Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ４９ （１
９８０） ５９３−６２９）、他方では、明らかにまた
セルピンの活性に影響を及ぼす他のアミノ酸配列および
構造因子によっても決定される。これに加えて、あるセ
ルピン、例えば、アンジオテンシノーゲンなとでは、Ｎ
末端領域が独立した機能的および構造的役割を果してい
る（Ｓ、 ５ｙｎｄｅｒおよびＲ，１ｎｎｉｓ、 Ａｎ
ｎｕ、 Ｒｅｖ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ４８ （１９７９） ７５５−７８
２）。
２）。
セルピンの一次および三次構造は、相互に類似している
（ Ｈ、Ｌｏｅｂｅｒｍａｎｎら： 、Ｊ、 Ｍｏ１
． Ｂｉｏｌ。
（ Ｈ、Ｌｏｅｂｅｒｍａｎｎら： 、Ｊ、 Ｍｏ１
． Ｂｉｏｌ。
１７７ （１９８４） ５３１−５５６； Ｓ、 Ｃ，
Ｂｏｃｋら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５ （１９
８６） ４２９２−４３０１）が、驚いたことには、こ
れは、例えば、グロビンなどの他の多くのタンパク質族
の場合のように同一の遺伝子構造に基づくものではない
。これまでに述べられてきたセルピン遺伝子の中では、
ヒトα１−抗トリシンおよびラットアンジオテンシノー
ゲンをコードする遺伝子のみが相同するエクソン／イン
トロン構造を有する（Ｔ、 Ｔａｎａｋａら： Ｊ、
Ｂｉｏｌ。
Ｂｏｃｋら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５ （１９
８６） ４２９２−４３０１）が、驚いたことには、こ
れは、例えば、グロビンなどの他の多くのタンパク質族
の場合のように同一の遺伝子構造に基づくものではない
。これまでに述べられてきたセルピン遺伝子の中では、
ヒトα１−抗トリシンおよびラットアンジオテンシノー
ゲンをコードする遺伝子のみが相同するエクソン／イン
トロン構造を有する（Ｔ、 Ｔａｎａｋａら： Ｊ、
Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、 ２５９ （１９８４） ８０６３−８０６
５）。各々、５個のエクソンが対応する位置で４個のイ
ン）Ｃｆンで分断されている。しかしながら、これまで
に知られている他のセルピン遺伝子の構造は、このパタ
ーンとはかなり異なっている。ヒト抗トロンビン■遺伝
子は、６個のエクソンを含む（Ｅ、 Ｖ。
５）。各々、５個のエクソンが対応する位置で４個のイ
ン）Ｃｆンで分断されている。しかしながら、これまで
に知られている他のセルピン遺伝子の構造は、このパタ
ーンとはかなり異なっている。ヒト抗トロンビン■遺伝
子は、６個のエクソンを含む（Ｅ、 Ｖ。
Ｐｒｏｃｈｏｗｎ ｉ ｋ ら： Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
ＣＩ＋ｅｍ、 ２６０ （１９８５）９６０８−９６
１２）が、相同性は、αｌ−ｌ−抗トリプシンはアンジ
オテンシノーゲンの５個のイントロン位置のひとつとの
間に認められるだけである。ヒトＣ１インヒビターをコ
ードする遺伝子は、少なくとも７個のイントロンを有す
るが、これらの位置はまだわかっていない（Ｓ、 Ｃ，
Ｂｏｃｋら： 前出）。
ＣＩ＋ｅｍ、 ２６０ （１９８５）９６０８−９６
１２）が、相同性は、αｌ−ｌ−抗トリプシンはアンジ
オテンシノーゲンの５個のイントロン位置のひとつとの
間に認められるだけである。ヒトＣ１インヒビターをコ
ードする遺伝子は、少なくとも７個のイントロンを有す
るが、これらの位置はまだわかっていない（Ｓ、 Ｃ，
Ｂｏｃｋら： 前出）。
イントロンの数および位置の点から、ｂ Ｌ Ｓ ２遺
伝子構造は、α −抗トリプシンおよび（ラット）アン
ジオテンシノーゲンの遺伝子構造に対応することが現在
明らかになった。この相同性は、本発明によって、複合
セルピンの製造に利用される。
伝子構造は、α −抗トリプシンおよび（ラット）アン
ジオテンシノーゲンの遺伝子構造に対応することが現在
明らかになった。この相同性は、本発明によって、複合
セルピンの製造に利用される。
本発明は、その種々の態様について特許請求の範囲に定
義されている。本発明の展開および好ましい実施態様は
、以下に説明される通りである。
義されている。本発明の展開および好ましい実施態様は
、以下に説明される通りである。
本発明は、また、第１図および第２図、および表１によ
って表される（ここで、あるいは以下にいう「第２図」
は、その連続である第２ａ図をも含むものとする）。
って表される（ここで、あるいは以下にいう「第２図」
は、その連続である第２ａ図をも含むものとする）。
第１図は、ｂ Ｌ Ｓ ２遺伝子構造を図式化して示し
たものである。 「ＥＸｌ」〜ｒＥｘ５Ｊはエクソンを
表す。制限酵素切断部位は、次のように略称されている
。
たものである。 「ＥＸｌ」〜ｒＥｘ５Ｊはエクソンを
表す。制限酵素切断部位は、次のように略称されている
。
Ｂ ＝ＢａｍＨＩ Ｎ ＝ＮｃｏＩＢ
ｇ＝ＢｇｌＩＩ ５ｓ＝Ｓｓ ｔ ＩＥ
＝ＥｃｏＲＩ Ｘ ＝ＸｂａＩＨ＝Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ＢｇｌＩＩおよびＮ ｃ ｏ ［の場合、第２図のよう
に複合遺伝子の構築に必要な切断部位のみが表示されて
いる。
ｇ＝ＢｇｌＩＩ ５ｓ＝Ｓｓ ｔ ＩＥ
＝ＥｃｏＲＩ Ｘ ＝ＸｂａＩＨ＝Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ＢｇｌＩＩおよびＮ ｃ ｏ ［の場合、第２図のよう
に複合遺伝子の構築に必要な切断部位のみが表示されて
いる。
第２図（正しい比例尺ではない）は、複合セルピン遺伝
子の構造を示したもので、この遺伝子は、ｈ Ｌ Ｓ
２のエクソン１から４までを有し、第１図のように中実
棒線て表示されて「ＥＸｌ」〜ｒ Ｅ ｘ ４Ｊと命名
されている。この遺伝子は、さソンを有し、これは、図
中斜線つき棒線て示され制限酵素の慣例名称の略称は、
第１図と同様であるが、さらに次の略号を用いた。
子の構造を示したもので、この遺伝子は、ｈ Ｌ Ｓ
２のエクソン１から４までを有し、第１図のように中実
棒線て表示されて「ＥＸｌ」〜ｒ Ｅ ｘ ４Ｊと命名
されている。この遺伝子は、さソンを有し、これは、図
中斜線つき棒線て示され制限酵素の慣例名称の略称は、
第１図と同様であるが、さらに次の略号を用いた。
Ｐ ＝Ｐｓｔｌ
Ｓ ＝Ｓａ口
Ｓｍ＝Ｓｍａｌ
Ｘｈ＝ＸｈｏＩ
Ｉ（＝クレノウボリメラーセで埋填
５１＝５１ヌクレアーゼで分解
Ｐ ｈ ＝アルカリホスファターゼ
Ｌ ＝リンカー
△は、突出末端を分解または埋填によって平滑末端にし
た切断部位を表す。
た切断部位を表す。
表１は、エクソンおよびｈＬＳ２遺伝子の側面（ｆｌａ
ｎｋｉｎｇ）領域のＤＮＡ配列を示す。ここで、イント
ロン配列は、小文字で表示されている。正しい３′転写
末端の形成に必要なシグナルペプチドおよびシグナルＡ
ＡＴＡＡＡには下線を施した。
ｎｋｉｎｇ）領域のＤＮＡ配列を示す。ここで、イント
ロン配列は、小文字で表示されている。正しい３′転写
末端の形成に必要なシグナルペプチドおよびシグナルＡ
ＡＴＡＡＡには下線を施した。
エクソン／イントロン境界は、既知の１１ ｒ−Ｓ ２
ｃＤＮＡとの比較から明らかにされたものである。
ｃＤＮＡとの比較から明らかにされたものである。
矢印は、今までに見出された最長のｈ Ｌ Ｓ ２ｃＤ
ＮＡクローンの５゛開始を示す。
ＮＡクローンの５゛開始を示す。
本発明において用いる用語「複合セルピン」は、当該タ
ンパク質が、実質的にはｈＬＳ２エクソンに対応するア
ミノ酸ブロックおよび同じ遺伝子構造を有する相似セル
ピンから成り、ブａテアーゼ阻害作用を示す物であるこ
と、を意味する。 「複合セルピン」という表現は、ま
た、異なる起源からの同一のエクソンの組合せによって
理論向に得られる自然の産生物を除外する意味をもつ。
ンパク質が、実質的にはｈＬＳ２エクソンに対応するア
ミノ酸ブロックおよび同じ遺伝子構造を有する相似セル
ピンから成り、ブａテアーゼ阻害作用を示す物であるこ
と、を意味する。 「複合セルピン」という表現は、ま
た、異なる起源からの同一のエクソンの組合せによって
理論向に得られる自然の産生物を除外する意味をもつ。
「実質的ごこ」とは、遺伝子操作によって得られる産
生物は、公知の方法、例えは、アミノ酸の追加、削除ま
たは置換などによって修飾することができるという事実
を表すものである。これらのタイプの修飾は、例えば、
適当なリンカ−またはアダプターの挿入によって可能で
ある。
生物は、公知の方法、例えは、アミノ酸の追加、削除ま
たは置換などによって修飾することができるという事実
を表すものである。これらのタイプの修飾は、例えば、
適当なリンカ−またはアダプターの挿入によって可能で
ある。
本発明に係る組換え遺伝子の製造においては、合成遺伝
子フラグメントを用いることも可能である。この方法に
は、制限酵素の切断部位が追加されて導入される可能性
があり、これによってコードされるアミノ酸配列の追加
修飾が可能になるという利点がある。このようにして、
例えば、活性中心を修飾すること、一般には、変化した
基質特異性および／または活性を有する複合セルピンを
製造することも可能になる。
子フラグメントを用いることも可能である。この方法に
は、制限酵素の切断部位が追加されて導入される可能性
があり、これによってコードされるアミノ酸配列の追加
修飾が可能になるという利点がある。このようにして、
例えば、活性中心を修飾すること、一般には、変化した
基質特異性および／または活性を有する複合セルピンを
製造することも可能になる。
エクソンの組換えにおいて、エクソンは、スプライシン
グおよび他の転写後の処理に必要なイントロン内の全て
の必要配列を包括して有効に用いられる。連結のために
は、例えば、突出しているＤＮＡ配列を分解または埋填
によって平滑末端にすることができ、こうしてエクソン
は、必要であれば、有用な制限酵素の基質として作用す
る合成オリゴヌクレオチドリンカーの挿入物と適宜連結
することができる。
グおよび他の転写後の処理に必要なイントロン内の全て
の必要配列を包括して有効に用いられる。連結のために
は、例えば、突出しているＤＮＡ配列を分解または埋填
によって平滑末端にすることができ、こうしてエクソン
は、必要であれば、有用な制限酵素の基質として作用す
る合成オリゴヌクレオチドリンカーの挿入物と適宜連結
することができる。
このタイプのエクソンモジュールは、本発明によると、
相互に正しい相対的配置方向にあって、正しい配列であ
れば、実質的にはいかなる所望の組合せにおいてもリガ
ーゼ反応で組み立てることができる。このようにして得
られる複合遺伝子は、用いられるプロモーターがセルピ
ン固有のものでなければ、適切な真核細胞のプロモータ
ーに連結することができ、必要に応じて、ポリアゾニレ
−ジョンシグナルに連結できて、さらに、適当な真核細
胞に導入した後、それらの発現をそこで行うことが可能
である。
相互に正しい相対的配置方向にあって、正しい配列であ
れば、実質的にはいかなる所望の組合せにおいてもリガ
ーゼ反応で組み立てることができる。このようにして得
られる複合遺伝子は、用いられるプロモーターがセルピ
ン固有のものでなければ、適切な真核細胞のプロモータ
ーに連結することができ、必要に応じて、ポリアゾニレ
−ジョンシグナルに連結できて、さらに、適当な真核細
胞に導入した後、それらの発現をそこで行うことが可能
である。
昆虫や哺乳類細胞のような高等細胞を、宿主／ベクター
システムとして既知の方法で用いることが可能である。
システムとして既知の方法で用いることが可能である。
これらのタイプの真核細胞発現システムが、今や多数知
られている。必要に応じて、形成されている複合セルピ
ンｍＲＮＡを単離すること、およびこれを用いてｃＤＮ
Ａを合成して、これに適当な転写シグナルを付けた後、
細菌または酵母中で発現させるの用いることも可能であ
る。
られている。必要に応じて、形成されている複合セルピ
ンｍＲＮＡを単離すること、およびこれを用いてｃＤＮ
Ａを合成して、これに適当な転写シグナルを付けた後、
細菌または酵母中で発現させるの用いることも可能であ
る。
酵母が用いられる場合には、酵母に特徴的な糖化タンパ
ク質を得ることが可能である。
ク質を得ることが可能である。
変化させた基質特異性または活性を有する複合セルピン
の産生の可能性の他に、本発明は、ふたつの機能を有す
るタンパク質の製造方法を提供する。これらタンパク質
は、例えば、アンジオテンシン■および抗トリプシンの
活性を含み、したがって、水分平衡を調節するだけでな
く、エラスターゼ機能に対する阻害効果をも有する。
の産生の可能性の他に、本発明は、ふたつの機能を有す
るタンパク質の製造方法を提供する。これらタンパク質
は、例えば、アンジオテンシン■および抗トリプシンの
活性を含み、したがって、水分平衡を調節するだけでな
く、エラスターゼ機能に対する阻害効果をも有する。
ざらに、本発明は、ｈＬＳ２のゲノムＤＮＡの全部また
は一部を含む診断的補助物に関する。これら補助物は、
ｈ Ｌ Ｓ ２遺伝子中の遺伝的欠損の検出またはヒト
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む材料を対応する遺伝子プロー
ブとハイブリダイゼーション（対合）させる診断的方法
に使用されるものである。
は一部を含む診断的補助物に関する。これら補助物は、
ｈ Ｌ Ｓ ２遺伝子中の遺伝的欠損の検出またはヒト
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む材料を対応する遺伝子プロー
ブとハイブリダイゼーション（対合）させる診断的方法
に使用されるものである。
本発明の詳細は、次の諸例に説明される通りである。と
くに記載がない限り、パーセント表示は重量パーセント
を表す。
くに記載がない限り、パーセント表示は重量パーセント
を表す。
１鳳
コスミドバンクの構築は、Ｗ、 Ｌ団ｄｅｎｍａｉｅｒ
らの方法（３５ｔｈ Ｍｏ５ｈａｃｈ ＣＣｏ１１ｏｑ
ｕｉｕ １９８４、” Ｔ ｈ ｅＩｍｐａｃｔ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１ｎＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ”、Ｓｐｒｉｎ３ｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎ、
）Ｉｅｉｄｅｌｂｅｒｇ １９８５）によって、Ｃ１
ａＩおよびアルカリホスファターゼで処理しておいたベ
クターｐ ＨＣ７９−２ｃ ｏ ｓ ／ Ｔ Ｋに結合
させた、Ｍ ｓ ｐ Ｉで部分切断しておいたヒトゲノ
ムＤＮＡフラグメントを用いて行った。コスミドバンク
は、約ａｏｏ、ｏｏｏｉの独立したクローンを含む。
らの方法（３５ｔｈ Ｍｏ５ｈａｃｈ ＣＣｏ１１ｏｑ
ｕｉｕ １９８４、” Ｔ ｈ ｅＩｍｐａｃｔ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１ｎＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ”、Ｓｐｒｉｎ３ｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎ、
）Ｉｅｉｄｅｌｂｅｒｇ １９８５）によって、Ｃ１
ａＩおよびアルカリホスファターゼで処理しておいたベ
クターｐ ＨＣ７９−２ｃ ｏ ｓ ／ Ｔ Ｋに結合
させた、Ｍ ｓ ｐ Ｉで部分切断しておいたヒトゲノ
ムＤＮＡフラグメントを用いて行った。コスミドバンク
は、約ａｏｏ、ｏｏｏｉの独立したクローンを含む。
１．８Ｘ１０ 個にパッケージングされたコスミドを、
δｍｌのＴＭ緩衝ｔ＆（５０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７
，５，１０ｍＭＭｇ５Ｏ）および５ｍｌの大腸菌ＤＨＩ
の一晩培養物と混合して、３７℃で２０分分間上うせず
にインキュベートした。この大腸菌培養は、０．４％マ
ルトースを含むＮＺ培地（１０ｇ／リットルＮＺアミン
、 ５８７リツトル塩化ナトリウム、 ２ｇ／リット
ＩＬＭｇＣｌ ２・ ６ Ｈ２Ｏ，４ｍｇ／リット
ルチアミン）中で３７℃で増殖させておいたものである
。
δｍｌのＴＭ緩衝ｔ＆（５０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７
，５，１０ｍＭＭｇ５Ｏ）および５ｍｌの大腸菌ＤＨＩ
の一晩培養物と混合して、３７℃で２０分分間上うせず
にインキュベートした。この大腸菌培養は、０．４％マ
ルトースを含むＮＺ培地（１０ｇ／リットルＮＺアミン
、 ５８７リツトル塩化ナトリウム、 ２ｇ／リット
ＩＬＭｇＣｌ ２・ ６ Ｈ２Ｏ，４ｍｇ／リット
ルチアミン）中で３７℃で増殖させておいたものである
。
４ｍｇ／’）ッ）１１のチアミンを含む４０ｍ１のＬＢ
培地（１０ｇ／リッ目バクトドリブトン（ディフコ社製
）、５８７リツトル酵母抽出物（ディフコ社製）、１０
８／リツトル塩化ナトリウム）を添加後、培養液を３７
℃て１時間振とうした。
培地（１０ｇ／リッ目バクトドリブトン（ディフコ社製
）、５８７リツトル酵母抽出物（ディフコ社製）、１０
８／リツトル塩化ナトリウム）を添加後、培養液を３７
℃て１時間振とうした。
このタイプの細菌培養の試料５ｍｌを寒天プレート（２
３Ｘ２３ｃｍ、１．４％寒天および５０℃ｇ／ｍ１アン
ピシリンを含む）表面の高圧滅菌したニトロセルロース
膜上にまいた。コロニーの半径が０、 ５ｍｍになるま
で、プレートを３７°Ｃて培養した。レプリカフィルタ
ーの調製、ハイブリダイゼーションのためのコロニーの
溶解および固定は、既知の方法にて行った（Ｄ、 Ｈａ
ｎａｈａｎおよびＮ。
３Ｘ２３ｃｍ、１．４％寒天および５０℃ｇ／ｍ１アン
ピシリンを含む）表面の高圧滅菌したニトロセルロース
膜上にまいた。コロニーの半径が０、 ５ｍｍになるま
で、プレートを３７°Ｃて培養した。レプリカフィルタ
ーの調製、ハイブリダイゼーションのためのコロニーの
溶解および固定は、既知の方法にて行った（Ｄ、 Ｈａ
ｎａｈａｎおよびＮ。
Ｍｅｓｅｌｓｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｎ＋ｏｌｏｇｙ １００ （１９８３）３３３−３４２
； Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ら： Ｍｏ１ｅｃ旧
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
ｎ＋ｏｌｏｇｙ １００ （１９８３）３３３−３４２
； Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ら： Ｍｏ１ｅｃ旧
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）Ｉａｒｂｏｒ、１９８２）
。フィルターは、前洗浄ｔａ （Ｍａｎｉａｔｉｓら：
前出、３２６頁）にて４２°Ｃで１時間洗浄した。前ハ
イブリダイゼーション（４−６時間）およびハイブリダ
イゼーション（６０℃で１６時間）を、次の溶液中で行
フた。
。フィルターは、前洗浄ｔａ （Ｍａｎｉａｔｉｓら：
前出、３２６頁）にて４２°Ｃで１時間洗浄した。前ハ
イブリダイゼーション（４−６時間）およびハイブリダ
イゼーション（６０℃で１６時間）を、次の溶液中で行
フた。
０．９ Ｍ ＮａＣ１
０，１８Ｍ ）リス−塩酸、ｐＨ８，０５×デンハー
トの溶液 ０．２％（ｗ／ｖ） Ｓ Ｄ Ｓ （ソジウムドデシル
サルフエート） ２００ノ１ｇ／ｍｌせん断加熱仔つシ拘腺ＩＩＪＡ２０
０ Ｉｔ ｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ ０．５％（Ｖ／Ｖ）非イオン系洗浄°剤（ノニデトＰ−
４０、シグマ社製） ハイブリダイゼーションに用いたプローブは、次のｈＬ
Ｓ２ｃＤＮＡ制限酵素フラグメントてあった（Ｅ Ｐ−
Ａ第０．１９０，６５２号）。
トの溶液 ０．２％（ｗ／ｖ） Ｓ Ｄ Ｓ （ソジウムドデシル
サルフエート） ２００ノ１ｇ／ｍｌせん断加熱仔つシ拘腺ＩＩＪＡ２０
０ Ｉｔ ｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ ０．５％（Ｖ／Ｖ）非イオン系洗浄°剤（ノニデトＰ−
４０、シグマ社製） ハイブリダイゼーションに用いたプローブは、次のｈＬ
Ｓ２ｃＤＮＡ制限酵素フラグメントてあった（Ｅ Ｐ−
Ａ第０．１９０，６５２号）。
Ａ）プラスミドｐＨ１４からの１． ０７ｋｂＨｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントであって、ｈＬＳ２ｃＤＮＡの５′
側半分を包含する。
ＩＩＩフラグメントであって、ｈＬＳ２ｃＤＮＡの５′
側半分を包含する。
Ｂ）プラスミドｐＬ １０／２からの０． ５ｋｂＸｍ
ｎＩフラグメント。このフラグメントは、ｈＬＳ２ｃＤ
ＮＡの３′側半分（位置１１２１−１６１９）に位置し
ている。
ｎＩフラグメント。このフラグメントは、ｈＬＳ２ｃＤ
ＮＡの３′側半分（位置１１２１−１６１９）に位置し
ている。
上記のフラグメントは、各々、関連のプラスミドを記述
の制限酵素で処理することによって切断して取り出して
、アガロースゲルにて分画し、電気的に溶出させた後に
ニックトランスレーション法に供した。 （≧１０ ”
ｃｐｍ／ ｕ ｇ ； Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）。
の制限酵素で処理することによって切断して取り出して
、アガロースゲルにて分画し、電気的に溶出させた後に
ニックトランスレーション法に供した。 （≧１０ ”
ｃｐｍ／ ｕ ｇ ； Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）。
ハイブリダイゼーションの後、膜を、室温、４５°Ｃお
よび６０℃で０．１％ＳＤＳを含む０、ｌＸ５ＳＣ（Ｉ
ＸＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナト
リウム、ｐＨ７，０）で各々３０分間洗浄した。
よび６０℃で０．１％ＳＤＳを含む０、ｌＸ５ＳＣ（Ｉ
ＸＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナト
リウム、ｐＨ７，０）で各々３０分間洗浄した。
乾燥後、これらの膜をＸ線フィルムの露出に使用した。
ハイブリダイゼーションしているコロニーを、希釈によ
って単離して、ニトロセルロース膜上て培養し、溶解し
、さらに記述したように、ハイブリダイゼーションに供
した。ざらに単離操作を行った後に、全７５０，０００
個の分析されたコロニーのうち、３個の独立したハイブ
リダイゼーション陽性のクローンが残フた。クローンｐ
４Ｒは、プローブＡとのみ対合し、プローブＢとは対合
しなかった。これとは逆に、クローンｐ６Ｒおよび１）
９Ｒは、プローブＢとのみ対合し、プローブＡとは対合
しなかった。
って単離して、ニトロセルロース膜上て培養し、溶解し
、さらに記述したように、ハイブリダイゼーションに供
した。ざらに単離操作を行った後に、全７５０，０００
個の分析されたコロニーのうち、３個の独立したハイブ
リダイゼーション陽性のクローンが残フた。クローンｐ
４Ｒは、プローブＡとのみ対合し、プローブＢとは対合
しなかった。これとは逆に、クローンｐ６Ｒおよび１）
９Ｒは、プローブＢとのみ対合し、プローブＡとは対合
しなかった。
クローンｐ４Ｒ，ｐ６Ｒおよびｐ９ＲからのコスミドＤ
ＮＡをアルカリ溶解法にて分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら：前出）。ＤＮＡ調製物を種々の制限エンドヌクレア
ーゼで切断して、０．７％または１％のアガロースゲル
にて分画し、ニトロセルロース膜上にまいた（Ｅ、 ５
ｏｕｔｈｅｒｎ： Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃ。
ＮＡをアルカリ溶解法にて分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら：前出）。ＤＮＡ調製物を種々の制限エンドヌクレア
ーゼで切断して、０．７％または１％のアガロースゲル
にて分画し、ニトロセルロース膜上にまいた（Ｅ、 ５
ｏｕｔｈｅｒｎ： Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃ。
Ｂｉｏｌ、 ９８ （１９７５） ５０３−５１７）。
コスミドのエクソンを含むＤＮＡフラグメントの同定は
、放射線ラベルした下記のｈＬＳ２ｃＤＮＡの種々の制
限酵素フラグメントとのハイブリダイゼーションによっ
て行った。
、放射線ラベルした下記のｈＬＳ２ｃＤＮＡの種々の制
限酵素フラグメントとのハイブリダイゼーションによっ
て行った。
プローブ１ ： ｈ Ｌ Ｓ ２ ｃ Ｄ Ｎ Ａの位
置１と３１０との間の領域を含むＨｉｎｄｌｌＩ／Ｂａ
ｍＨＩフラグメント（ＨｉｎｄＩ１１部位は、ｈＬＳ２
ｃＤＮＡがクローニングされるベクターｐＵｃ１３のポ
リリンカー領域に位置する）。
置１と３１０との間の領域を含むＨｉｎｄｌｌＩ／Ｂａ
ｍＨＩフラグメント（ＨｉｎｄＩ１１部位は、ｈＬＳ２
ｃＤＮＡがクローニングされるベクターｐＵｃ１３のポ
リリンカー領域に位置する）。
プローブ２： ｈＬＳ２ｃＤＮＡの位置３１１から８３
４までを包含するＢａｍＨＩフラグメント。
４までを包含するＢａｍＨＩフラグメント。
プローブ３：位置９８４と１３９９の間の領域を含むＰ
ｖｕｎフラグメント。
ｖｕｎフラグメント。
プローブ４：位置１１２１と１６１９の間の領域を包含
するＸｍｎＩフラグメント。
するＸｍｎＩフラグメント。
プローブ５：位置１５６０と２０８１の間の領域を包含
するＥｃｏＲＩフラグメント （ＥｃｏＲ１部位のひとつは、ベクターｐＵＣ１３のポ
リリンカー領域に位置している）。
するＥｃｏＲＩフラグメント （ＥｃｏＲ１部位のひとつは、ベクターｐＵＣ１３のポ
リリンカー領域に位置している）。
ここに明記した制限酵素切断部位の位置は全て、ｃＤＮ
Ａのコード鎖に係るものである。
Ａのコード鎖に係るものである。
ハイブリダイゼーションは、各々４２℃で一晩上記のハ
イブリダイゼーション緩衝液で行った。
イブリダイゼーション緩衝液で行った。
その後、膜を、０．１％ＳＤＳを含む２ｘｓｓｃ中で室
温で２×１５分間、次いで、０．１％ＳＤＳを含む０．
ｌＸ５ＳＣ中で４２℃で２×１０分間洗浄して、乾燥し
てＸ線フィルム上に露出させた。プローブを除くために
、膜を各々熱湯槽中で２分間インキュベートして、これ
を再びリハイブリダイゼーションに用いた。
温で２×１５分間、次いで、０．１％ＳＤＳを含む０．
ｌＸ５ＳＣ中で４２℃で２×１０分間洗浄して、乾燥し
てＸ線フィルム上に露出させた。プローブを除くために
、膜を各々熱湯槽中で２分間インキュベートして、これ
を再びリハイブリダイゼーションに用いた。
第一のエクソン（Ｅｘｌ）の同定のために、ＤＮＡ配列
３’−ＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣ
ＴＣ−５’（これは、通常の５’−３’方向とは逆に表
示されている）を有するオリゴヌクレオチドをホスホル
アミダイト法（Ｍ、 Ｄ、 Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ら：
Ｊ、、Ａｍ。
ＴＣ−５’（これは、通常の５’−３’方向とは逆に表
示されている）を有するオリゴヌクレオチドをホスホル
アミダイト法（Ｍ、 Ｄ、 Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ら：
Ｊ、、Ａｍ。
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 １０３ （１９８１） ３１８
５−３１９１）によって合成し、ポリアクリルアミド／
尿素ゲルにて精製した。
５−３１９１）によって合成し、ポリアクリルアミド／
尿素ゲルにて精製した。
オリゴヌクレオチドの配列は、Ｔ、Ｈｕｙｎｈらの方法
によって得られたλｇｔｌｏｃＤＮＡバンクから分離さ
れたヒ）ｈＬＳ２ｃＤＮＡ配列に基づいた。
によって得られたλｇｔｌｏｃＤＮＡバンクから分離さ
れたヒ）ｈＬＳ２ｃＤＮＡ配列に基づいた。
この方法は、Ｄ、 Ｍ、 Ｇｌｏｖｅｒ （編集）、Ｄ
ＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ、 Ｖｏｌ、 ｌ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、０ｘ
ｆｏｒｄ ＵＫ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＳ Ｄ、Ｃ，
１９８５，４９−７８頁に記述されている。クローンＴ
）４ＲのコスミドＤＮＡを、サザンテクニックを用いて
上記のように分析した。上記のＤＮＡ配列を有するオリ
ゴヌクレオチドをγ−Ｐ−ＡＴＰ （ＮＥＮ）およびポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）
を用いて放射線ラベルした。ハイブリダイゼーション温
度は４２℃であった。
ＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ、 Ｖｏｌ、 ｌ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、０ｘ
ｆｏｒｄ ＵＫ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＳ Ｄ、Ｃ，
１９８５，４９−７８頁に記述されている。クローンＴ
）４ＲのコスミドＤＮＡを、サザンテクニックを用いて
上記のように分析した。上記のＤＮＡ配列を有するオリ
ゴヌクレオチドをγ−Ｐ−ＡＴＰ （ＮＥＮ）およびポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）
を用いて放射線ラベルした。ハイブリダイゼーション温
度は４２℃であった。
膜を、６ＸＳＳＣで室温で（２Ｘ１５分間）および３３
℃で（２Ｘ３０分間）洗浄した。
℃で（２Ｘ３０分間）洗浄した。
ハイブリダイゼーション実験を基にして、コスミドの重
複している制限酵素フラグメントを、標準法によってベ
クターｐＵｃ１３にサブクローニングした。エクソンお
よび隣接するイントロン領域をマクサム−ギルバート化
学分解法にて配列決定した（Ａ、 Ｍａｘａｍおよび−
，Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ６５ （１９８０） ４９９−５６０）。
複している制限酵素フラグメントを、標準法によってベ
クターｐＵｃ１３にサブクローニングした。エクソンお
よび隣接するイントロン領域をマクサム−ギルバート化
学分解法にて配列決定した（Ａ、 Ｍａｘａｍおよび−
，Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ６５ （１９８０） ４９９−５６０）。
第１図は、配列決定、さらに制限酵素切断およびサザン
ブロッティングによって得られたｈＬＳ２遺伝子の構造
を図示したものである。
ブロッティングによって得られたｈＬＳ２遺伝子の構造
を図示したものである。
発現可能な複合セルピン遺伝子の構築は、例を示すこと
によって、また、表１（および第２図）を参照して説明
される。もちろん、記述されている制限フラグメントの
代わりに、他の適当なりＮＡフラグメントおよびＤＮＡ
フラグメンＩ・の他の組合せを用いることは可能である
。とくに、ｈＬＳ２特異性ブロモター領域の代わりに、
他の真核細胞プロモーター、例えば、他のセルピン遺伝
子からのものを用いることも可能である。
によって、また、表１（および第２図）を参照して説明
される。もちろん、記述されている制限フラグメントの
代わりに、他の適当なりＮＡフラグメントおよびＤＮＡ
フラグメンＩ・の他の組合せを用いることは可能である
。とくに、ｈＬＳ２特異性ブロモター領域の代わりに、
他の真核細胞プロモーター、例えば、他のセルピン遺伝
子からのものを用いることも可能である。
Ｌ２
■制限フラグメント ■含有物 ■末端の修飾お■プロ
モーター領域を含むｈＬＳ２遺伝子のエクソン１ ■大ｇ［からのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグ
メントによる埋填；５ａｌｌによる切断およびＳｌヌク
レアーゼによる処理をしておいたベクターｐＵｃ１３へ
のサブクローニング■１．３ｋｂＸｂａＩ／Ｈｚｎｄｍ ■ｈＬＳ２遺伝子のエクソン２（中でもシグナルペプチ
ドをコードする） ■フレノウフラグメントによる埋填；ＢａｍＨＩおよび
Ｓｌヌクレアーゼによって処理しておいた■ｈＬＳ２遺
伝子のエクソン３ ■Ｓｌヌクレアーゼによる切断；５ａｌＩによる切断お
よびＳ１ヌクレアーゼによる処理をしておいたベクター
ｐＨｃ１３へのサブクローニング■１． ０ｋｂＢ ｇ
Ｉ ＩＩ／ Ｂ ａｔｎＨＩ■ｈＬＳ２遺伝子のエク
ソン４ ■フレノウフラグメントによる埋Ｑ；ＳｍａＩおよびア
ルカリホスファターゼによる処理をしておいたベクター
ｐＵｃ１３へのサブクローニング全てのエクソン含有制
限フラグメントは、エクソン／イントロン境界部に正し
いスプライシングに必要なりＮＡ配列をも含んでいる（
Ｂ、 Ｒｕ５ｋｉｎら一： Ｃｅ１ｌ ３８
（１９８４） ３１７−３３１； Ｅ、 Ｋｅｌ
ｌｅｒ ら：Ｐｒｏｃ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｌ
ＩＳＡ ８１ （１９８４） ７４１７−７４２０；
Ｂ。
モーター領域を含むｈＬＳ２遺伝子のエクソン１ ■大ｇ［からのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグ
メントによる埋填；５ａｌｌによる切断およびＳｌヌク
レアーゼによる処理をしておいたベクターｐＵｃ１３へ
のサブクローニング■１．３ｋｂＸｂａＩ／Ｈｚｎｄｍ ■ｈＬＳ２遺伝子のエクソン２（中でもシグナルペプチ
ドをコードする） ■フレノウフラグメントによる埋填；ＢａｍＨＩおよび
Ｓｌヌクレアーゼによって処理しておいた■ｈＬＳ２遺
伝子のエクソン３ ■Ｓｌヌクレアーゼによる切断；５ａｌＩによる切断お
よびＳ１ヌクレアーゼによる処理をしておいたベクター
ｐＨｃ１３へのサブクローニング■１． ０ｋｂＢ ｇ
Ｉ ＩＩ／ Ｂ ａｔｎＨＩ■ｈＬＳ２遺伝子のエク
ソン４ ■フレノウフラグメントによる埋Ｑ；ＳｍａＩおよびア
ルカリホスファターゼによる処理をしておいたベクター
ｐＵｃ１３へのサブクローニング全てのエクソン含有制
限フラグメントは、エクソン／イントロン境界部に正し
いスプライシングに必要なりＮＡ配列をも含んでいる（
Ｂ、 Ｒｕ５ｋｉｎら一： Ｃｅ１ｌ ３８
（１９８４） ３１７−３３１； Ｅ、 Ｋｅｌ
ｌｅｒ ら：Ｐｒｏｃ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｌ
ＩＳＡ ８１ （１９８４） ７４１７−７４２０；
Ｂ。
Ｗｉｅｒｉｎｇａ ら： Ｃｅ１ｌ ３７ （１９８
４） ９１５−９２５）。
４） ９１５−９２５）。
アガロースゲルでのＤＮＡフラグメントの単離、フラグ
メント末端の処理およびベクターｐＵＣ１３へのサブク
ローニングは、標準法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：面出）に
て行う。挿入物の位置方向は、制限酵素切断によって確
認して、正しい挿入位置方向を有するプラスミドを複合
セルピン遺伝子の構築に用いる。
メント末端の処理およびベクターｐＵＣ１３へのサブク
ローニングは、標準法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：面出）に
て行う。挿入物の位置方向は、制限酵素切断によって確
認して、正しい挿入位置方向を有するプラスミドを複合
セルピン遺伝子の構築に用いる。
正しい配列におけるｈＬＳ２遺伝子のエクソンｌから４
の連結およびエクソンの相互に正しい位置方向へ配置は
、同様に既知の方法にて行う。
の連結およびエクソンの相互に正しい位置方向へ配置は
、同様に既知の方法にて行う。
遺伝子の３′末端エクソンを有する１、７ｋｂの長さの
Ｘ ｈ ｏ Ｉ ／ Ｈｉ １１ ｄ ＩＩＩフラグメ
ントをヒトα −抗トリプシン遺伝子を含むゲノムクロ
ーンから単離する（に、 Ｌｏｎｇら： Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９８４） ４８２８−４８３
７； Ｍ、 Ｌｅｉｃｈｔら： Ｎａｔｕｒｅ ２９
７（１９８２） ６５５−６５９）。このエクソンは、
なかでも、タンパク質の反応中心をコードする（Ｇ、
Ｌｏｎｇら：前出； Ｒ，Ｃａｒｒｅｌｌ ら： Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９８ （１９８２）３２９−３３４）。
Ｘ ｈ ｏ Ｉ ／ Ｈｉ １１ ｄ ＩＩＩフラグメ
ントをヒトα −抗トリプシン遺伝子を含むゲノムクロ
ーンから単離する（に、 Ｌｏｎｇら： Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９８４） ４８２８−４８３
７； Ｍ、 Ｌｅｉｃｈｔら： Ｎａｔｕｒｅ ２９
７（１９８２） ６５５−６５９）。このエクソンは、
なかでも、タンパク質の反応中心をコードする（Ｇ、
Ｌｏｎｇら：前出； Ｒ，Ｃａｒｒｅｌｌ ら： Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９８ （１９８２）３２９−３３４）。
末端の（Ｉ条復およびＥｃｏＲＩリンカ−５’ＣＣＧＡ
ＡＴＴＣＣＧ ３’ の取り付けの後、フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびア
ルカリホスファターゼで処理しておいたベクターｐＵｃ
１３に連結させる。
ＡＴＴＣＣＧ ３’ の取り付けの後、フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびア
ルカリホスファターゼで処理しておいたベクターｐＵｃ
１３に連結させる。
反応中心のアミノ酸メチオニンおよびセリンをコートす
る。自然に産生されるα −抗トリプシンの変異体にお
いては、メチオニル基がアルギニル基に置換されていた
。この変化は、突然変異タンパク質に抗血栓的性質をも
たらす（Ｍ、 ０ｖｅｎら：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｊ、 Ｍｅｄ、 ３０９ （ｆ９８３） ６９４−６９
８）。このタイプの突然変異は、既知の方法、例えば、
インビトロ突然変異（Ｗ、 Ｋｒａｍｅｒら： Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １２ （１９８４）
９４４１−９４５６）によって導入できる。このように
１１条飽きれるエクソンは、もちろん、複合セルピン遺
伝子の本発明による構築にも用いることができる。
る。自然に産生されるα −抗トリプシンの変異体にお
いては、メチオニル基がアルギニル基に置換されていた
。この変化は、突然変異タンパク質に抗血栓的性質をも
たらす（Ｍ、 ０ｖｅｎら：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｊ、 Ｍｅｄ、 ３０９ （ｆ９８３） ６９４−６９
８）。このタイプの突然変異は、既知の方法、例えば、
インビトロ突然変異（Ｗ、 Ｋｒａｍｅｒら： Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １２ （１９８４）
９４４１−９４５６）によって導入できる。このように
１１条飽きれるエクソンは、もちろん、複合セルピン遺
伝子の本発明による構築にも用いることができる。
ｈＬＳ２遺伝子のエクソン１から４まで（例２）既知の
方法で連結させる（第２図）。
方法で連結させる（第２図）。
第１図は、本発明のｈＬＳ２遺伝子の構造を図示する、
説明図である。 第２図および第２ａ図は、本発明の複合セルピン遺伝子
の構築を示す、説明図である。 出１人代理人 佐 藤 −雄
説明図である。 第２図および第２ａ図は、本発明の複合セルピン遺伝子
の構築を示す、説明図である。 出１人代理人 佐 藤 −雄
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトロイセルピン−２（ｈＬＳ２）の遺伝子構造を
有するエクソンに実質的に対応するアミノ酸の部分配列
を含む、複合セルピン。 ２、ｈＬＳ２、α＿１−抗トリプシンまたはアンジオテ
ンシノーゲンのエクソンに対応するアミノ酸の部分配列
を含む、請求項１に記載の複合セルピン。 ３、ｈＬＳ２のエクソン／イントロン構造を有してセル
ピンをコードする少なくとも二つの遺伝子からのエクソ
ンからの、ｈＬＳ２に対応する遺伝子構造を有する遺伝
子の組換え工程およびこの組換え遺伝子の宿主細胞での
発現工程からなることを特徴とする、複合セルピンの製
造法。 ４、宿主細胞が高等真核細胞である、請求項３に記載の
製造法。 ５、ｈＬＳ２に対応する遺伝子構造を有するセルピン遺
伝子のエクソンを含み、ｈＬＳ２に対応する遺伝子構造
を有する組換え遺伝子。 ６、エクソンが、関連イントロンのスプライシングシグ
ナルおよび分枝ポイントを側面に有している、請求項５
に記載の遺伝子。 ７、ｈＬＳ２のエクソンを含むゲノムＤＮＡフラグメン
ト。 ８、ｈＬＳ２からのゲノムＤＮＡ。 ９、請求項５から７までのいずれか１項に記載のＤＮＡ
でトランスフェクションさせた宿主細胞。 １０、請求項１または２に記載の複合セルピンを含む、
医薬物。 １１、請求項７または８に記載のゲノムＤＮＡの全部ま
たは一部を含む、診断補助物。 １２、ヒトＤＮＡと、請求項７または８に記載のＤＮＡ
とのまたは対応するＲＮＡとのハイブリダイゼーション
からなる、診断法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873709255 DE3709255A1 (de) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | Hybridserpine und dafuer kodierende dna |
| DE3709255.3 | 1987-03-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63267294A true JPS63267294A (ja) | 1988-11-04 |
Family
ID=6323634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63067041A Pending JPS63267294A (ja) | 1987-03-20 | 1988-03-19 | 複合セルピンおよびこれらをコードするｄｎａ |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0283932A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63267294A (ja) |
| KR (1) | KR880011340A (ja) |
| AU (1) | AU611676B2 (ja) |
| DE (1) | DE3709255A1 (ja) |
| DK (1) | DK151788A (ja) |
| FI (1) | FI881268A7 (ja) |
| HU (1) | HUT46740A (ja) |
| IL (1) | IL85789A0 (ja) |
| PT (1) | PT87009B (ja) |
| ZA (1) | ZA881948B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7247704B2 (en) | 2000-12-18 | 2007-07-24 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional protease inhibitors and their use in treatment of disease |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0730660A4 (en) * | 1993-10-29 | 1998-02-25 | Incyte Pharma Inc | CHIMEAN PROTEINE PROTEASE NEXIN-1 CONTAINING VARIANTS |
| DE19742725A1 (de) * | 1997-09-26 | 1999-04-01 | Abts Harry Frank Dr | Hurpin/PI13: Ein neuer, UV-reprimierbarer, Serin Protease Inhibitor aus der Familie der Ovalbumin-Serpine |
| EP1366175B1 (en) * | 2000-12-18 | 2008-01-23 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional protease inhibitors and their use in treatment of disease |
| EP1903113A1 (en) * | 2000-12-18 | 2008-03-26 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional protease inhibitors and their use in treatment of disease |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3521226A1 (de) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gene fuer biologisch aktive proteine |
-
1987
- 1987-03-20 DE DE19873709255 patent/DE3709255A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-03-17 FI FI881268A patent/FI881268A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-03-17 EP EP88104248A patent/EP0283932A3/de not_active Withdrawn
- 1988-03-18 IL IL85789A patent/IL85789A0/xx unknown
- 1988-03-18 DK DK151788A patent/DK151788A/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-18 HU HU881365A patent/HUT46740A/hu unknown
- 1988-03-18 PT PT87009A patent/PT87009B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-03-18 AU AU13288/88A patent/AU611676B2/en not_active Ceased
- 1988-03-18 ZA ZA881948A patent/ZA881948B/xx unknown
- 1988-03-19 KR KR1019880002920A patent/KR880011340A/ko not_active Ceased
- 1988-03-19 JP JP63067041A patent/JPS63267294A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7247704B2 (en) | 2000-12-18 | 2007-07-24 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional protease inhibitors and their use in treatment of disease |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI881268L (fi) | 1988-09-21 |
| HUT46740A (en) | 1988-11-28 |
| DE3709255A1 (de) | 1988-09-29 |
| AU611676B2 (en) | 1991-06-20 |
| FI881268A0 (fi) | 1988-03-17 |
| KR880011340A (ko) | 1988-10-27 |
| DK151788A (da) | 1988-09-21 |
| IL85789A0 (en) | 1988-09-30 |
| PT87009B (pt) | 1992-06-30 |
| DK151788D0 (da) | 1988-03-18 |
| EP0283932A3 (de) | 1989-10-25 |
| EP0283932A2 (de) | 1988-09-28 |
| FI881268A7 (fi) | 1988-09-21 |
| ZA881948B (en) | 1988-12-28 |
| AU1328888A (en) | 1988-09-22 |
| PT87009A (pt) | 1988-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU604953B2 (en) | Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology, process, expression vector and recombinant host therefor and pharmaceutical use thereof | |
| Loskutoff et al. | Structure of the human plasminogen activator inhibitor 1 gene: nonrandom distribution of introns | |
| JP2599585B2 (ja) | ヒトα▲下１▼−アンチトリプシン誘導体及びその製造法 | |
| JPH10501404A (ja) | 有効な組換えセリンプロテアーゼインヒビターの製造方法及びこれらのインヒビターの利用 | |
| JP2625412B2 (ja) | ヒト第９因子ポリペプチドをコードするｃｄｎａ | |
| US5252725A (en) | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production | |
| GB2199582A (en) | Analogues of pancreatic secretory trypsin inhibitor | |
| AU621281B2 (en) | Hybrid proteins | |
| JPH08504568A (ja) | ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子ＶＩＩａ−組織因子複合体の阻害因子 | |
| US5079336A (en) | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production | |
| HK1005037B (en) | Hybrid plasminogen activators | |
| KR950012972B1 (ko) | 인체 췌장 엘라스타제 i | |
| US5266465A (en) | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production | |
| US5827662A (en) | Methods for detecting genetic mutations resulting in protease inhibitor insufficiencies | |
| GB2125409A (en) | Genetic engineering | |
| EP0189784A1 (en) | Human natural inhibitor of collagenases | |
| US6025161A (en) | DNA sequences expressing mammalian α1 -antitrypsin | |
| WO1994019371A1 (en) | Novel peptide having elastase inhibitor activity and process for producing the same | |
| US4849349A (en) | Genes for biologically active proteins | |
| AU611676B2 (en) | Hybrid serpins and dna coding for them | |
| JPH04506897A (ja) | 修飾されたクリングルドメインを有する血栓溶解剤 | |
| Tomonari et al. | Two new nonsense mutations in type Ia antithrombin III deficiency at Leu 140 and Arg 197 | |
| US5242819A (en) | DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase | |
| US5580559A (en) | Hybrid plasminogen activator | |
| JP2681253B2 (ja) | ペルオキシダ−ゼ転写調節遺伝子及びその利用方法 |