JPS6327659B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6327659B2 JPS6327659B2 JP54156460A JP15646079A JPS6327659B2 JP S6327659 B2 JPS6327659 B2 JP S6327659B2 JP 54156460 A JP54156460 A JP 54156460A JP 15646079 A JP15646079 A JP 15646079A JP S6327659 B2 JPS6327659 B2 JP S6327659B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- low
- density lipoproteins
- cholesterol
- weight
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はヒト血清中の高密度リポタンパク質と
低密度リポタンパク質との選択的分離に関する。
本発明のもうひとつの対象は、２価の金属イオン
を含まない試薬を使つてヒト血清から低密度リポ
タンパク質を選択的に沈殿させることに関する。
本発明のさらにもうひとつの対象は、ヒト血清中
の高密度リポタンパク質を低密度リポタンパク質
から選択的に分離し、ヒト血清中の高密度リポタ
ンパク質成分を定量する方法に関する。 今日まで長い間、医学の専門家はヒト血清中に
存在するコレステロールの量に関心を持つてい
た。全血清コレステロールの分析は、高リポタン
パク質症、アテローム性動脈硬化症、肝疾患、お
よび甲状腺疾患の診断に有用であることが証明さ
れている。過去において、ヒト血清中のコレステ
ロール量が多いことは冠状脈心疾患に結びつけら
れ、このような場合医者は血清中のコレステロー
ルを取り除くかまたは大きく減らすための薬を処
方することが多かつた。コレステロールまたはリ
ポタンパク質は同じではないが関連している分子
種のクラス２個に分けることができる。各クラス
に含まれる構成員は均一なものではないが、それ
らの化学的性質、物理的性質、および代謝につい
て相互関係からみて、単離法に基づく任意的分類
というよりむしろ分子種に基づく確定的な分類と
いえる。最近、血清の高密度リポタンパク質（高
密度コレステロール）量と冠状脈心疾患の危険性
との間に反比例関係が存在することが確認され
た。さらに、低密度リポタンパク質（低密度コレ
ステロール）は動脈内に斑を沈着させるのに対
し、高密度リポタンパク質は実は動脈内の斑を溶
解することが確かめられた。従つて、高密度リポ
タンパク質の有益な効果と低密度リポタンパク質
の有害な効果とを考えれば、診断医学にとつて正
確で再現性のある、そして信頼できる生体外での
定量試験が重要である。高密度リポタンパク質の
分析は、見掛けは正常である者の冠状脈心疾患に
なる危険性を評価するために特に重要である。 これまで低密度リポタンパク質は、リンタング
ステン酸ナトリウム塩と塩化マグネシウムとによ
り、中性PH下の硫酸化多糖類により、中性PH下の
高分子量多糖類により、または２価の陽イオンの
存在下の低分子量多糖類たとえばヘパリンによ
り、沈殿させていた。これらの方法は、
Cornwell.D.G.およびF.A.Kruger、J.Lipid
Res.2：10（1961）とBurstein.M.、H.R.
ScholnickおよびR.Mofin、J.Lipid Res.11：583
（1970）に記載されている。もう１つの高密度リ
ポタンパク質を分離する方法は超遠心分離であ
り、これは時間がかかり、わずらわしい。 高密度リポタンパク質を低密度リポタンパク質
と分離するこれらの方法を実施する時、特に定量
する場合、問題が起こりうる。たとえば、従来の
定量法は、マンガンの２価陽イオンとヘパリン、
マグネシウムの２価陽イオンとリンタングステン
酸ナトリウム、およびカルシウムの２価陽イオン
とデキストランサルフエート等の各種組合せを含
む金属・ポリ陰イオンによる沈殿法に基づいてい
る。しかし金属陽イオンの存在は次に行なうコレ
ステロールの酵素的検定を妨害する。また、従来
はポリ陰イオンの濃度が高いことが必要であり、
これもまたコレステロールの酵素的検定を阻害す
るので高密度リポタンパク質の成分の正確かつ再
現性のある定量はできなかつた。従来の沈殿法は
時間および温度に対する依存性があつた。 すなわち、コレステロール検定に対する妨害を
避けるために、金属イオンを使わずにポリ陰イオ
ンを低濃度で使う、そして正確かつ再現性があ
り、時間や温度に対する依存性のない、沈殿化剤
および沈殿方法が必要とされていた。 そして本発明は高密度リポタンパク質と低密度
リポタンパク質を分離するための沈殿化剤と方
法、および高密度リポタンパク質コレステロール
の定量方法を提供する。ヒト血清から低密度リポ
タンパク質を選択的に沈殿させる沈殿化剤は、リ
ンタングステン酸、約4.8〜5.8の範囲に緩衝能を
持ち約0.2〜1.2モルの濃度である有機緩衝剤、中
性重合体たとえばポリビニルピロリドンまたはポ
リエチレングリコールを含む。本沈殿化剤は、リ
ンタングステン酸約0.4重量％、緩衝剤としての
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、およ
び分子量約6000のポリエチレングリコール約2.5
重量％を含むことが好ましい。本発明によりヒト
血清試料に本沈殿化剤を加えると、沈殿と上澄液
を得る。本沈殿化剤は血清のPHを低密度タンパク
質の等電点をほぼ等しい点まで下げ、高密度リポ
タンパク質を沈殿させることなしに低密度リポタ
ンパク質だけを沈殿させる。上澄液を沈殿と分離
する。沈殿は低密度リポタンパク質を含み、上澄
は高密度リポタンパク質を含む。この高密度リポ
タンパク質と酵素的に反応して特定波長の光線を
吸収する物質を生成する試薬を上澄に加える。こ
の酵素反応の終了後、上澄の吸光度を測定し、検
定用標準試料の吸光度と比較する。 本沈殿化剤およびこれを使う方法は時間と温度
に対する依存性がなく、正確でかつ再現性があ
る。それに加えて、金属イオンが導入されずポリ
陰イオンも低濃度で使うので、次に行なうコレス
テロール検定が妨害されることはない。 本発明の沈殿化剤はポリ陰イオン、約0.2〜1.2
モルの濃度で存在しPH約4.8〜5.8の範囲に緩衝能
を持つ有機緩衝剤、および中性重合体を含む。 本発明の好ましい緩衝剤は２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸（MES）である。MESは
20℃で約6.15のpkaを持ち、PH約5.2〜6.8に有効
な緩衝作用を持つ双性イオン性緩衝剤である。好
ましい緩衝剤はMESであるが、約0.2〜1.2モルの
濃度で存在するときPH4.8〜5.8に緩衝能を持つ緩
衝剤であれば、本発明の沈殿化剤は有効に作用す
る。たとえば20℃でpkaが約5.40のクエン酸塩緩
衝剤、20℃でpkaが約5.57のコハク酸塩緩衝剤が
適当である。低密度リポタンパク質を効果的に沈
殿させるために血清の最終的なPHは5.8以下にす
るべきであり、低密度リポタンパク質の等電点と
同じか、またはそれに近くするのが好ましい。緩
衝剤は血清のPHを低密度リポタンパク質の等電点
近くまで下げるために使用され、緩衝剤の濃度は
それに適するものでなければならない。双性イオ
ン性緩衝剤の使用は、金属と結合する性質および
酵素的コレステロール検定への妨害が最小限であ
ることから、普通のイオン性緩衝剤の使用より有
利である。 好ましいポリ陰イオンは、約6000ｇ／モルの分
子量を持つリンタングステン酸である。リンタン
グステン酸の濃度は、沈殿化剤に対して約0.2〜
3.0重量％の範囲にあるべきであり、好ましくは
約0.4重量％である。すなわち本発明では低濃度
のリンタングステン酸を使うことができ、ポリ陰
イオンによるコレステロール検定への妨害を防ぐ
ことができる。 本発明によつて、中性重合体を使用することが
低密度リポタンパク質の沈殿中のポリ陰イオン濃
度を低くすることを可能にし、従つてポリ陰イオ
ンによるコレステロールの酵素的反応への妨害は
最小限になる。好ましい中性重合体はポリビニル
ピロリドン（PVP）とポリエチレングリコール
（PEG）であり、PEGが最も好ましい中性重合体
である。本発明に従つて使つてもよい他の中性重
合体は、ポリ−ｎ−ビニル−５−メチル−２−オ
キサゾリジノンであり、Dow Chemical社の商品
名“Devlex”として入手可能である。 本発明によれば、PVPの分子量は約30000〜
50000ｇ／モルの範囲内でよいが、約40000ｇ／モ
ルが好ましい。ポリエチレングリコールの分子量
は約5000〜6500ｇ／モルの範囲内がよいが、約
6000ｇ／モルが好ましい。PVPとPEGは共に沈
殿化剤に対して約２〜18重量％の量存在する時、
効果的である。好ましい濃度は、沈殿化剤の重量
に対してPVPは約６重量％、PEGは約2.5重量％
である。PEGは無色でPVPより熱に対して安定
であるために、適用法によつてはPEGの方が
PVPより有利であり、輸送や長期保存に適して
いる。 本沈殿化剤におけるポリ陰イオン、中性重合体
および緩衝剤の組合せは、非常に低い密度のリポ
タンパク質および乳ビ球を含め、低密度リポタン
パク質をヒト血清から完全に、迅速に、選択的
に、かつ金属イオンを加えることなしに沈殿させ
ることを可能にしている。本沈殿化剤をそのため
の好ましい検定方法に従つて使うと、高密度リポ
タンパク質コレステロール0.1mg／dlの感度を得
る。本発明の沈殿化剤においては、ポリ陰イオ
ン、緩衝剤、中性重合体の最終濃度が低く、従つ
て酵素的コレステロール検定剤との相容性も最大
であり、正確さと再現性も増す。 本沈殿化剤について高密度リポタンパク質コレ
ステロールの定量を参照して述べたが、本発明の
沈殿化剤および沈殿方法によつて得られる上澄に
適当な検定を行なうことによつて、他のリポタン
パク質成分、たとえばトリグリセリド、リン脂
質、アポタンパク質Ａ、ＢおよびＣの濃度を測定
することができることは明らかである。 高密度リポタンパク質コレステロールの本発明
による好ましい定量法は、次に記載する工程から
成り、試験全体でも30分はかからない。血清試料
および沈殿化剤を、周囲と同じ温度にすることが
好ましい。沈殿化剤と血清とを等容量ずつ混合す
る。それぞれの好ましい量は0.50mlである。血清
と沈殿化剤とを等容量で使う時の沈殿化剤の好ま
しい組成は、 リンタングステン酸0.4重量％ MES0.2モル PEG2.5重量％ である。等容量の血清試料に対してこの組成物は
必要な試料量を最小化する一方、実験の感度を最
適化する。試料の量を変化させ、同時に加える沈
殿化剤の量を適当に変化させるまたは沈殿化剤中
の成分の濃度を変化させることが可能である。た
とえば自動機器を使う場合、機器の容量的制限か
ら、さら高濃度の沈殿化剤が必要となることがあ
る。しかし沈殿化反応は機構が複雑であるので、
より高濃度の試剤を使つても最適な結果を与える
試剤の量と濃度変化とが反比例するとは限らな
い。試剤中の成分の相対的な量も変えることがで
きる。たとえば、血清試料0.5mlに沈殿化剤わず
か0.1mlを加えることが要求される場合、沈殿化
剤の最適な組成は、 リンタングステン酸2.4重量％ MES1.0モル、PH5.20 PEG12重量％ である。この具体例における各成分は、リンタン
グステン酸が約1.8〜3.0重量％、PEGが約６〜18
重量％、MESが約0.6〜1.2モル、そしてPHが約
4.8〜5.8の範囲で変えることができる。また、こ
の試剤はエチレンジアミン四酢酸を約10〜60ミリ
モルの範囲で好ましくは約30ミリモル含むことが
できる。エチレンジアミン四酢酸の効果は以下に
記載する。 本発明により血清試料に沈殿化剤を加えた混合
物は沈殿化剤の各成分であるリンタングステン酸
を約0.1〜0.5重量％、中性重合体を約1.0〜4.0重
量％、そして有機緩衝剤を約0.1〜0.25モルの量
で含みみ、反応混合物のPHは低密度リポタンパク
質の等電点とほぼ等しい。場合により金属錯化剤
たとえばエチレンジアミン四酢酸を、血清試料に
沈殿化剤を添加した後の金属錯化剤の濃度が約
1.6〜10ミリモルになる量で、沈殿化剤に加えて
もよい。 本沈殿化剤はその成分の組合せのもつ相乗作用
により、従来行なわれてきた方法と比べてずつと
低い濃度のポリ陰イオンおよび中性重合体しか使
わずに、非常に低い密度のリポタンパク質と乳ビ
球を含む低密度リポタンパク質の完全で迅速な沈
殿生成が可能となる。 沈殿化剤の添加により、血清のPHは低密度リポ
タンパク質の等電点（PH約5.7）近くまで下がり、
そこでは、低密度リポタンパク質分子が全部電気
的に中性で存在するので、沈殿生成が容易であ
る。このPHで、リンタングステン酸は低密度リポ
タンパク質と共に不溶性の錯体を形成し、従つて
上澄分と分離できる。中性重合体の存在は、たと
えば水素結合の働きによるのかまたは溶液のイオ
ン強度が効果的に下がることによるのか、その機
構については不明であるが沈殿反応をさらに促進
する。中性重合体を低濃度で使うことがポリ陰イ
オンを今まで当該技術分野において使われていた
濃度より低い濃度で使うことを可能にし、この新
規の組合せこそが時間にも温度にも依存しないし
かも定量性のある沈殿化剤を提供する。すなわ
ち、好ましい沈殿化剤を使うことによつて高密度
リポタンパク質を他の血清リポタンパク質から迅
速かつ完全に、雰囲気温度の下で分離することが
できる。得られた沈殿物を好ましくは遠心分離に
よつて上澄液と分離する。試料を10分間750×Ｇ
で遠心分離するのが最も好ましい。上澄液または
上澄分は高密度リポタンパク質を含み、沈殿物は
低密度リポタンパク質を含む。 あるいは、本発明によよれば、ヒト血清中の高
密度リポタンパク質コレステロールの量は金属イ
オンを加えることなしに試薬の成分を別別に加え
ることにより、定量することができる。すなわ
ち、 (a) 有機緩衝剤によより血清のPHを低密度リポタ
ンパク質の等電点付近に調整し、 (b) リンタングステン酸を血清中に導入し、 (c) 中性重合体を血清中に導入して沈殿分および
上澄分を形成できる。その後、得られた沈殿分
は前記のように上澄液から除去することができ
る。 低密度リポタンパク質を高密度リポタンパク質
から分離した後、高密度リポタンパク質を含む上
澄のコレステロールを分析する。コレステロール
検定にはすでに確立されているどのコレステロー
ル定量法を使つてもよいが、特別な検定試薬が好
ましく、以下にそれを使つた方法について記載す
る。コレステロール検定試薬を上澄分に加える。
この試薬には以下に記載する各量の成分を含む。
コレステロールエステラーゼ約0.36U／試験、コ
レステロールオキシターゼ約0.40U試験、パーオ
キシターゼ約100U／試験、４−アミノアンチピ
リン約0.4mg／試験、およびフエノール約6.0mg／
試験。このコレステロール検定は次に記載する酵
素的反応経路に基づいている。
低密度リポタンパク質との選択的分離に関する。
本発明のもうひとつの対象は、２価の金属イオン
を含まない試薬を使つてヒト血清から低密度リポ
タンパク質を選択的に沈殿させることに関する。
本発明のさらにもうひとつの対象は、ヒト血清中
の高密度リポタンパク質を低密度リポタンパク質
から選択的に分離し、ヒト血清中の高密度リポタ
ンパク質成分を定量する方法に関する。 今日まで長い間、医学の専門家はヒト血清中に
存在するコレステロールの量に関心を持つてい
た。全血清コレステロールの分析は、高リポタン
パク質症、アテローム性動脈硬化症、肝疾患、お
よび甲状腺疾患の診断に有用であることが証明さ
れている。過去において、ヒト血清中のコレステ
ロール量が多いことは冠状脈心疾患に結びつけら
れ、このような場合医者は血清中のコレステロー
ルを取り除くかまたは大きく減らすための薬を処
方することが多かつた。コレステロールまたはリ
ポタンパク質は同じではないが関連している分子
種のクラス２個に分けることができる。各クラス
に含まれる構成員は均一なものではないが、それ
らの化学的性質、物理的性質、および代謝につい
て相互関係からみて、単離法に基づく任意的分類
というよりむしろ分子種に基づく確定的な分類と
いえる。最近、血清の高密度リポタンパク質（高
密度コレステロール）量と冠状脈心疾患の危険性
との間に反比例関係が存在することが確認され
た。さらに、低密度リポタンパク質（低密度コレ
ステロール）は動脈内に斑を沈着させるのに対
し、高密度リポタンパク質は実は動脈内の斑を溶
解することが確かめられた。従つて、高密度リポ
タンパク質の有益な効果と低密度リポタンパク質
の有害な効果とを考えれば、診断医学にとつて正
確で再現性のある、そして信頼できる生体外での
定量試験が重要である。高密度リポタンパク質の
分析は、見掛けは正常である者の冠状脈心疾患に
なる危険性を評価するために特に重要である。 これまで低密度リポタンパク質は、リンタング
ステン酸ナトリウム塩と塩化マグネシウムとによ
り、中性PH下の硫酸化多糖類により、中性PH下の
高分子量多糖類により、または２価の陽イオンの
存在下の低分子量多糖類たとえばヘパリンによ
り、沈殿させていた。これらの方法は、
Cornwell.D.G.およびF.A.Kruger、J.Lipid
Res.2：10（1961）とBurstein.M.、H.R.
ScholnickおよびR.Mofin、J.Lipid Res.11：583
（1970）に記載されている。もう１つの高密度リ
ポタンパク質を分離する方法は超遠心分離であ
り、これは時間がかかり、わずらわしい。 高密度リポタンパク質を低密度リポタンパク質
と分離するこれらの方法を実施する時、特に定量
する場合、問題が起こりうる。たとえば、従来の
定量法は、マンガンの２価陽イオンとヘパリン、
マグネシウムの２価陽イオンとリンタングステン
酸ナトリウム、およびカルシウムの２価陽イオン
とデキストランサルフエート等の各種組合せを含
む金属・ポリ陰イオンによる沈殿法に基づいてい
る。しかし金属陽イオンの存在は次に行なうコレ
ステロールの酵素的検定を妨害する。また、従来
はポリ陰イオンの濃度が高いことが必要であり、
これもまたコレステロールの酵素的検定を阻害す
るので高密度リポタンパク質の成分の正確かつ再
現性のある定量はできなかつた。従来の沈殿法は
時間および温度に対する依存性があつた。 すなわち、コレステロール検定に対する妨害を
避けるために、金属イオンを使わずにポリ陰イオ
ンを低濃度で使う、そして正確かつ再現性があ
り、時間や温度に対する依存性のない、沈殿化剤
および沈殿方法が必要とされていた。 そして本発明は高密度リポタンパク質と低密度
リポタンパク質を分離するための沈殿化剤と方
法、および高密度リポタンパク質コレステロール
の定量方法を提供する。ヒト血清から低密度リポ
タンパク質を選択的に沈殿させる沈殿化剤は、リ
ンタングステン酸、約4.8〜5.8の範囲に緩衝能を
持ち約0.2〜1.2モルの濃度である有機緩衝剤、中
性重合体たとえばポリビニルピロリドンまたはポ
リエチレングリコールを含む。本沈殿化剤は、リ
ンタングステン酸約0.4重量％、緩衝剤としての
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、およ
び分子量約6000のポリエチレングリコール約2.5
重量％を含むことが好ましい。本発明によりヒト
血清試料に本沈殿化剤を加えると、沈殿と上澄液
を得る。本沈殿化剤は血清のPHを低密度タンパク
質の等電点をほぼ等しい点まで下げ、高密度リポ
タンパク質を沈殿させることなしに低密度リポタ
ンパク質だけを沈殿させる。上澄液を沈殿と分離
する。沈殿は低密度リポタンパク質を含み、上澄
は高密度リポタンパク質を含む。この高密度リポ
タンパク質と酵素的に反応して特定波長の光線を
吸収する物質を生成する試薬を上澄に加える。こ
の酵素反応の終了後、上澄の吸光度を測定し、検
定用標準試料の吸光度と比較する。 本沈殿化剤およびこれを使う方法は時間と温度
に対する依存性がなく、正確でかつ再現性があ
る。それに加えて、金属イオンが導入されずポリ
陰イオンも低濃度で使うので、次に行なうコレス
テロール検定が妨害されることはない。 本発明の沈殿化剤はポリ陰イオン、約0.2〜1.2
モルの濃度で存在しPH約4.8〜5.8の範囲に緩衝能
を持つ有機緩衝剤、および中性重合体を含む。 本発明の好ましい緩衝剤は２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸（MES）である。MESは
20℃で約6.15のpkaを持ち、PH約5.2〜6.8に有効
な緩衝作用を持つ双性イオン性緩衝剤である。好
ましい緩衝剤はMESであるが、約0.2〜1.2モルの
濃度で存在するときPH4.8〜5.8に緩衝能を持つ緩
衝剤であれば、本発明の沈殿化剤は有効に作用す
る。たとえば20℃でpkaが約5.40のクエン酸塩緩
衝剤、20℃でpkaが約5.57のコハク酸塩緩衝剤が
適当である。低密度リポタンパク質を効果的に沈
殿させるために血清の最終的なPHは5.8以下にす
るべきであり、低密度リポタンパク質の等電点と
同じか、またはそれに近くするのが好ましい。緩
衝剤は血清のPHを低密度リポタンパク質の等電点
近くまで下げるために使用され、緩衝剤の濃度は
それに適するものでなければならない。双性イオ
ン性緩衝剤の使用は、金属と結合する性質および
酵素的コレステロール検定への妨害が最小限であ
ることから、普通のイオン性緩衝剤の使用より有
利である。 好ましいポリ陰イオンは、約6000ｇ／モルの分
子量を持つリンタングステン酸である。リンタン
グステン酸の濃度は、沈殿化剤に対して約0.2〜
3.0重量％の範囲にあるべきであり、好ましくは
約0.4重量％である。すなわち本発明では低濃度
のリンタングステン酸を使うことができ、ポリ陰
イオンによるコレステロール検定への妨害を防ぐ
ことができる。 本発明によつて、中性重合体を使用することが
低密度リポタンパク質の沈殿中のポリ陰イオン濃
度を低くすることを可能にし、従つてポリ陰イオ
ンによるコレステロールの酵素的反応への妨害は
最小限になる。好ましい中性重合体はポリビニル
ピロリドン（PVP）とポリエチレングリコール
（PEG）であり、PEGが最も好ましい中性重合体
である。本発明に従つて使つてもよい他の中性重
合体は、ポリ−ｎ−ビニル−５−メチル−２−オ
キサゾリジノンであり、Dow Chemical社の商品
名“Devlex”として入手可能である。 本発明によれば、PVPの分子量は約30000〜
50000ｇ／モルの範囲内でよいが、約40000ｇ／モ
ルが好ましい。ポリエチレングリコールの分子量
は約5000〜6500ｇ／モルの範囲内がよいが、約
6000ｇ／モルが好ましい。PVPとPEGは共に沈
殿化剤に対して約２〜18重量％の量存在する時、
効果的である。好ましい濃度は、沈殿化剤の重量
に対してPVPは約６重量％、PEGは約2.5重量％
である。PEGは無色でPVPより熱に対して安定
であるために、適用法によつてはPEGの方が
PVPより有利であり、輸送や長期保存に適して
いる。 本沈殿化剤におけるポリ陰イオン、中性重合体
および緩衝剤の組合せは、非常に低い密度のリポ
タンパク質および乳ビ球を含め、低密度リポタン
パク質をヒト血清から完全に、迅速に、選択的
に、かつ金属イオンを加えることなしに沈殿させ
ることを可能にしている。本沈殿化剤をそのため
の好ましい検定方法に従つて使うと、高密度リポ
タンパク質コレステロール0.1mg／dlの感度を得
る。本発明の沈殿化剤においては、ポリ陰イオ
ン、緩衝剤、中性重合体の最終濃度が低く、従つ
て酵素的コレステロール検定剤との相容性も最大
であり、正確さと再現性も増す。 本沈殿化剤について高密度リポタンパク質コレ
ステロールの定量を参照して述べたが、本発明の
沈殿化剤および沈殿方法によつて得られる上澄に
適当な検定を行なうことによつて、他のリポタン
パク質成分、たとえばトリグリセリド、リン脂
質、アポタンパク質Ａ、ＢおよびＣの濃度を測定
することができることは明らかである。 高密度リポタンパク質コレステロールの本発明
による好ましい定量法は、次に記載する工程から
成り、試験全体でも30分はかからない。血清試料
および沈殿化剤を、周囲と同じ温度にすることが
好ましい。沈殿化剤と血清とを等容量ずつ混合す
る。それぞれの好ましい量は0.50mlである。血清
と沈殿化剤とを等容量で使う時の沈殿化剤の好ま
しい組成は、 リンタングステン酸0.4重量％ MES0.2モル PEG2.5重量％ である。等容量の血清試料に対してこの組成物は
必要な試料量を最小化する一方、実験の感度を最
適化する。試料の量を変化させ、同時に加える沈
殿化剤の量を適当に変化させるまたは沈殿化剤中
の成分の濃度を変化させることが可能である。た
とえば自動機器を使う場合、機器の容量的制限か
ら、さら高濃度の沈殿化剤が必要となることがあ
る。しかし沈殿化反応は機構が複雑であるので、
より高濃度の試剤を使つても最適な結果を与える
試剤の量と濃度変化とが反比例するとは限らな
い。試剤中の成分の相対的な量も変えることがで
きる。たとえば、血清試料0.5mlに沈殿化剤わず
か0.1mlを加えることが要求される場合、沈殿化
剤の最適な組成は、 リンタングステン酸2.4重量％ MES1.0モル、PH5.20 PEG12重量％ である。この具体例における各成分は、リンタン
グステン酸が約1.8〜3.0重量％、PEGが約６〜18
重量％、MESが約0.6〜1.2モル、そしてPHが約
4.8〜5.8の範囲で変えることができる。また、こ
の試剤はエチレンジアミン四酢酸を約10〜60ミリ
モルの範囲で好ましくは約30ミリモル含むことが
できる。エチレンジアミン四酢酸の効果は以下に
記載する。 本発明により血清試料に沈殿化剤を加えた混合
物は沈殿化剤の各成分であるリンタングステン酸
を約0.1〜0.5重量％、中性重合体を約1.0〜4.0重
量％、そして有機緩衝剤を約0.1〜0.25モルの量
で含みみ、反応混合物のPHは低密度リポタンパク
質の等電点とほぼ等しい。場合により金属錯化剤
たとえばエチレンジアミン四酢酸を、血清試料に
沈殿化剤を添加した後の金属錯化剤の濃度が約
1.6〜10ミリモルになる量で、沈殿化剤に加えて
もよい。 本沈殿化剤はその成分の組合せのもつ相乗作用
により、従来行なわれてきた方法と比べてずつと
低い濃度のポリ陰イオンおよび中性重合体しか使
わずに、非常に低い密度のリポタンパク質と乳ビ
球を含む低密度リポタンパク質の完全で迅速な沈
殿生成が可能となる。 沈殿化剤の添加により、血清のPHは低密度リポ
タンパク質の等電点（PH約5.7）近くまで下がり、
そこでは、低密度リポタンパク質分子が全部電気
的に中性で存在するので、沈殿生成が容易であ
る。このPHで、リンタングステン酸は低密度リポ
タンパク質と共に不溶性の錯体を形成し、従つて
上澄分と分離できる。中性重合体の存在は、たと
えば水素結合の働きによるのかまたは溶液のイオ
ン強度が効果的に下がることによるのか、その機
構については不明であるが沈殿反応をさらに促進
する。中性重合体を低濃度で使うことがポリ陰イ
オンを今まで当該技術分野において使われていた
濃度より低い濃度で使うことを可能にし、この新
規の組合せこそが時間にも温度にも依存しないし
かも定量性のある沈殿化剤を提供する。すなわ
ち、好ましい沈殿化剤を使うことによつて高密度
リポタンパク質を他の血清リポタンパク質から迅
速かつ完全に、雰囲気温度の下で分離することが
できる。得られた沈殿物を好ましくは遠心分離に
よつて上澄液と分離する。試料を10分間750×Ｇ
で遠心分離するのが最も好ましい。上澄液または
上澄分は高密度リポタンパク質を含み、沈殿物は
低密度リポタンパク質を含む。 あるいは、本発明によよれば、ヒト血清中の高
密度リポタンパク質コレステロールの量は金属イ
オンを加えることなしに試薬の成分を別別に加え
ることにより、定量することができる。すなわ
ち、 (a) 有機緩衝剤によより血清のPHを低密度リポタ
ンパク質の等電点付近に調整し、 (b) リンタングステン酸を血清中に導入し、 (c) 中性重合体を血清中に導入して沈殿分および
上澄分を形成できる。その後、得られた沈殿分
は前記のように上澄液から除去することができ
る。 低密度リポタンパク質を高密度リポタンパク質
から分離した後、高密度リポタンパク質を含む上
澄のコレステロールを分析する。コレステロール
検定にはすでに確立されているどのコレステロー
ル定量法を使つてもよいが、特別な検定試薬が好
ましく、以下にそれを使つた方法について記載す
る。コレステロール検定試薬を上澄分に加える。
この試薬には以下に記載する各量の成分を含む。
コレステロールエステラーゼ約0.36U／試験、コ
レステロールオキシターゼ約0.40U試験、パーオ
キシターゼ約100U／試験、４−アミノアンチピ
リン約0.4mg／試験、およびフエノール約6.0mg／
試験。このコレステロール検定は次に記載する酵
素的反応経路に基づいている。
【表】
パーオキシダーゼ
３．2H２O２＋4−アミノアンチピリン＋フエノー
ル
パーオキシダーゼ
３．2H２O２＋4−アミノアンチピリン＋フエノー
ル
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト血清試料に (a) Ph4.8〜6.8の緩衝能をもつ有機緩衝剤を血清
試料に対して0.1〜0.25モル／の濃度で、 (b) リンタングステン酸を血清試料に対して0.1
〜0.5重量％の濃度で、そして、 (c) ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコ
ールおよびポリ−ｎ−ビニル−５−メチル−２
−オキサゾリジノンから成る群から選んだ中性
重合体を血清試料に対して1.0〜4.0重量％の濃
度で、 加えることを特徴とする、ヒト血清試料中の高密
度リポタンパク質コレステロールと低密度リポタ
ンパク質コレステロールとを分離する方法。 ２ 中性重合体として、分子量30000〜50000ｇ／
モルのポリビニルピロリドンまたは分子量5000〜
6500ｇ／モルのポリエチレングリコールを使う、
前項１に記載の方法。 ３ 有機緩衝剤として、２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸を使う、前項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/966,145 US4215993A (en) | 1978-12-04 | 1978-12-04 | Precipitating reagent and method for isolation and determination of high density lipoproteins in human serum |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5578254A JPS5578254A (en) | 1980-06-12 |
| JPS6327659B2 true JPS6327659B2 (ja) | 1988-06-03 |
Family
ID=25510978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15646079A Granted JPS5578254A (en) | 1978-12-04 | 1979-12-04 | High density lipoprotein identification and quantitative determination method of human serum and precipitant for excuting the same |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4215993A (ja) |
| JP (1) | JPS5578254A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0714032U (ja) * | 1993-08-03 | 1995-03-10 | 勇 神谷 | ソトーバスタンド |
| JP2009125049A (ja) * | 2007-11-28 | 2009-06-11 | Fujifilm Corp | 高密度リポ蛋白コレステロールの測定方法 |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3117455A1 (de) * | 1981-05-02 | 1982-11-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagens zur praezipitation apo-b-haltiger lipoproteine, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung bei der bestimmung von hdl-cholesterin |
| JPS5826212U (ja) * | 1981-08-11 | 1983-02-19 | 三洋電機株式会社 | 差動増幅器 |
| DE3133937A1 (de) * | 1981-08-27 | 1983-03-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von ldl |
| DE3276390D1 (en) * | 1981-09-10 | 1987-06-25 | Intermedicat Gmbh | Method for the selective extracorporeal precipitation of low-density lipoproteins from serum or plasma |
| FR2513766B1 (fr) * | 1981-09-28 | 1985-09-13 | Biomerieux Sa | Procedes et reactifs de separation selective des lipoproteines de faible densite ldl et de quantification de leurs composants |
| DE3422407A1 (de) * | 1984-06-16 | 1986-03-06 | B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen | Verwendung von heparinderivaten zur selektiven extrakorporalen praezipitation von low-density-lipoproteinen aus vollserum oder plasma |
| DE3719196A1 (de) * | 1987-06-09 | 1988-12-29 | Behringwerke Ag | Verwendung von polyinylpyrrolidon (pvp) zur truebungsminderung von seren, kontrollseren enthaltend pvp und verfahren zu deren herstellung |
| EP0378395B1 (en) * | 1989-01-13 | 1996-08-14 | Robert Q. Maines | Method of measuring cholesterol, diagnosing vascular disease, and raising HDL cholesterol levels |
| US5213964A (en) * | 1990-07-16 | 1993-05-25 | Cholestech Corporation | High-density lipoprotein solid-base precipitation assay method |
| US5213965A (en) * | 1990-07-16 | 1993-05-25 | Cholestech Corporation | Solid-phase precipitation assay device |
| US5344571A (en) * | 1992-02-18 | 1994-09-06 | University Of Texas System Board Of Regents | Method for separating isoanalytes and measuring analytes in fluids |
| JP2600065B2 (ja) | 1994-03-08 | 1997-04-16 | 協和メデックス株式会社 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
| JP2799835B2 (ja) * | 1995-01-31 | 1998-09-21 | 第一化学薬品株式会社 | コレステロールの定量方法 |
| US5925534A (en) * | 1998-06-08 | 1999-07-20 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for measuring LDL-cholesterol |
| EP1148142B1 (en) * | 1999-01-20 | 2008-02-27 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for quantitating triglyceride in lipoprotein |
| EP1357383B1 (en) | 2002-04-09 | 2005-11-09 | Cholestech Corporation | High-density lipoprotein assay device and method |
| ATE505731T1 (de) | 2002-12-06 | 2011-04-15 | Denka Seiken Kk | Verfahren zur quantifizierung von kleinen lipoproteinen mit geringer dichte |
| US20050032141A1 (en) * | 2003-07-17 | 2005-02-10 | Dimagno Theodore John | Dry analytical element for high-density lipoprotein cholesterol quantification |
| GB0428130D0 (en) * | 2004-12-22 | 2005-01-26 | Oxford Biosensors Ltd | Selective HDL cholesterol assay |
| US7824879B2 (en) | 2007-01-09 | 2010-11-02 | Cholestech Corporation | Device and method for measuring LDL-associated cholesterol |
| EP2065708B1 (en) | 2007-11-28 | 2014-01-01 | FUJIFILM Corporation | Method for measuring high-density lipoprotein cholesterol |
| JP5313537B2 (ja) | 2008-04-10 | 2013-10-09 | 富士フイルム株式会社 | 高密度リポ蛋白コレステロール測定用乾式分析素子 |
| KR101933621B1 (ko) | 2012-09-28 | 2018-12-28 | 삼성전자주식회사 | 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3770631A (en) * | 1971-06-29 | 1973-11-06 | Baxter Laboratories Inc | Clarification of blood serum and plasma |
| GB1385319A (en) * | 1971-09-22 | 1975-02-26 | Nat Res Dev | Enzyme preparations |
| US3955925A (en) * | 1973-11-12 | 1976-05-11 | Proksch Gary J | Preparation of optically clear serum |
| US4086218A (en) * | 1975-04-11 | 1978-04-25 | Edward Shanbrom, Inc. | Method of preserving blood plasma II |
| US4110077A (en) * | 1976-10-08 | 1978-08-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Determination of β-lipoproteins in blood serum with polyanethole sulfonate |
| US4126416A (en) * | 1977-11-21 | 1978-11-21 | The Trustees Of Boston University | Method for determining the level of LDL cholesterol in blood plasma |
-
1978
- 1978-12-04 US US05/966,145 patent/US4215993A/en not_active Expired - Lifetime
-
1979
- 1979-12-04 JP JP15646079A patent/JPS5578254A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0714032U (ja) * | 1993-08-03 | 1995-03-10 | 勇 神谷 | ソトーバスタンド |
| JP2009125049A (ja) * | 2007-11-28 | 2009-06-11 | Fujifilm Corp | 高密度リポ蛋白コレステロールの測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5578254A (en) | 1980-06-12 |
| US4215993A (en) | 1980-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4215993A (en) | Precipitating reagent and method for isolation and determination of high density lipoproteins in human serum | |
| Seigler et al. | Separation of serum high-density lipoprotein for cholesterol determination: ultracentrifugation vs precipitation with sodium phosphotungstate and magnesium chloride. | |
| US4226713A (en) | Diagnostic agents | |
| De Cristofaro et al. | Lipid and protein oxidation contribute to a prothrombotic state in patients with type 2 diabetes mellitus | |
| JP2600065B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 | |
| JP2799835B2 (ja) | コレステロールの定量方法 | |
| US4110077A (en) | Determination of β-lipoproteins in blood serum with polyanethole sulfonate | |
| Warner et al. | Prognostic role of antioxidant enzymes in sepsis: preliminary assessment | |
| US4414326A (en) | Diagnostic agents | |
| Bush et al. | Bromcresol purple dye-binding methods underestimate albumin that is carrying covalently bound bilirubin. | |
| CN113109578B (zh) | 生化质控物质 | |
| CN112695071B (zh) | 一种高密度脂蛋白3的测定试剂、方法和试剂盒 | |
| EP0455225A2 (en) | Method for measuring the percentage of glycation of a particular protein | |
| CN111983239A (zh) | 一种t-PAI-C标志物检测试剂盒及其配制方法 | |
| JP2003028882A (ja) | ＳｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬの測定方法 | |
| Dahlen et al. | In vitro studies of the interaction of calcium ions and other divalent cations with the Lp (a) lipoprotein and other isolated serum lipoproteins | |
| Fung et al. | Spin-label detection of sickle hemoglobin-membrane interaction at physiological pH | |
| JPH0236182B2 (ja) | ||
| JP3694121B2 (ja) | Ｈｄｌコレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法 | |
| JP2002525106A (ja) | フルクトサミンオキシダーゼアッセイ：方法及び材料 | |
| EP0676642A1 (en) | Method for quantitatively analyzing a component in a lipoprotein fraction | |
| JPS62134100A (ja) | ペルオキシダ−ゼ活性測定用薬剤およびその製法 | |
| US5116762A (en) | Method for determining the concentration of fructosamine using a standard solution and method of calibrating the standard solution | |
| Pochynok et al. | Peroxidative degradation of proteins and lipids in undifferentiated connective tissue dysplasia in children, Ukraine | |
| Akizuki et al. | Genetic and immunological analyses of patients with increased serum butyrylcholinesterase activity and its C5 variant form. |