JPS63280100A - 結晶性ヒトプロインシュリンおよびその製造方法 - Google Patents
結晶性ヒトプロインシュリンおよびその製造方法Info
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- JPS63280100A JPS63280100A JP63099297A JP9929788A JPS63280100A JP S63280100 A JPS63280100 A JP S63280100A JP 63099297 A JP63099297 A JP 63099297A JP 9929788 A JP9929788 A JP 9929788A JP S63280100 A JPS63280100 A JP S63280100A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えＤＮＡ法の出現は、広範なペプチドおよびタンパ
ク質を製造する機会を与えた。この様なタンパク質の１
つは、ヒトプロインシュリンである。ヒトプロインシュ
リンは、ヒトインシュリンの製造における中間体、およ
び糖尿病の制御における独立した薬剤の両者として有用
である。
ク質を製造する機会を与えた。この様なタンパク質の１
つは、ヒトプロインシュリンである。ヒトプロインシュ
リンは、ヒトインシュリンの製造における中間体、およ
び糖尿病の制御における独立した薬剤の両者として有用
である。
ヒトプロインシュリンの組換えＤＮＡ製造の場合、生成
物は通常、水溶液中で処理され、凍結乾燥されるので、
非結晶性粉末となる。もし入手し得るなら、結晶形態の
ヒトプロインシュリンは、とりわけその貯蔵性、製剤化
、並びにその単離および精製過程で多くの利点を与える
であろう。
物は通常、水溶液中で処理され、凍結乾燥されるので、
非結晶性粉末となる。もし入手し得るなら、結晶形態の
ヒトプロインシュリンは、とりわけその貯蔵性、製剤化
、並びにその単離および精製過程で多くの利点を与える
であろう。
本発明は、新規な結晶形態のヒトプロインシュリンおよ
びその製造方法に関するものである。
びその製造方法に関するものである。
従って本発明は、ヒトプロインシュリンと２価の亜鉛イ
オンの複合体の塩であって、該塩の陽イオンはリチウム
、カルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、
マグネシウムおよびバリウムからなる群から選ばれる、
結晶性ヒトプロインシュリンを提供するものである。
オンの複合体の塩であって、該塩の陽イオンはリチウム
、カルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、
マグネシウムおよびバリウムからなる群から選ばれる、
結晶性ヒトプロインシュリンを提供するものである。
本発明はまた、上記の塩の製造方法であって、（ａ）ヒ
トプロインシュリン約５〜約５０ｍｇ７ｍＱ、フェノー
ル性物質約０．１〜約５ｍｅ／ｍｌ、リチウム、カルシ
ウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシ
ウムおよびバリウムからなる群から選ばれる陽イオンの
塩約０．０３〜約０．６ミリ当量７ｍ（１、およびＺｎ
”陽イオン約０．２〜約５ミリ当量を含有する水性混合
物を調製し、（ｂ）水性混合物を約５．４〜約６．５の
範囲のｐＨに調節し、 （ｃ）結晶を形成させ、 （ｄ）水性混合物から結晶性ヒトプロインシュリンを回
収することからなる方法を提供する。
トプロインシュリン約５〜約５０ｍｇ７ｍＱ、フェノー
ル性物質約０．１〜約５ｍｅ／ｍｌ、リチウム、カルシ
ウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシ
ウムおよびバリウムからなる群から選ばれる陽イオンの
塩約０．０３〜約０．６ミリ当量７ｍ（１、およびＺｎ
”陽イオン約０．２〜約５ミリ当量を含有する水性混合
物を調製し、（ｂ）水性混合物を約５．４〜約６．５の
範囲のｐＨに調節し、 （ｃ）結晶を形成させ、 （ｄ）水性混合物から結晶性ヒトプロインシュリンを回
収することからなる方法を提供する。
この様に、本発明は、結晶性ヒトプロインシュリンおよ
びその製造方法を提供する。
びその製造方法を提供する。
本発明の結晶性ヒトプロインシュリンは、ヒトプロイン
シュリンと２価の亜鉛イオンの複合体の塩である。この
複合体は通常、６分子のヒトプロインシュリンが２個の
Ｚｎ”イオンに配位結合しているヒトプロインシュリン
のヘキサマー形態によって表わされる。使用される陽イ
オンは１価または２価であり、以下のいずれであっても
よい：リチウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム、
アンモニウム、マグネシウムまたはバリウム。陽イオン
はカルシウム、ナトリウム、カリ２ム、アンモニウムま
Ｉ；はマグネシウムであるのが好ましく、ナトリウム、
カルシウムまｌ；はアンモニウムであるのがより好まし
い。さらに、カルシウムまたはナトリウムであるのが最
も好ましい。
シュリンと２価の亜鉛イオンの複合体の塩である。この
複合体は通常、６分子のヒトプロインシュリンが２個の
Ｚｎ”イオンに配位結合しているヒトプロインシュリン
のヘキサマー形態によって表わされる。使用される陽イ
オンは１価または２価であり、以下のいずれであっても
よい：リチウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム、
アンモニウム、マグネシウムまたはバリウム。陽イオン
はカルシウム、ナトリウム、カリ２ム、アンモニウムま
Ｉ；はマグネシウムであるのが好ましく、ナトリウム、
カルシウムまｌ；はアンモニウムであるのがより好まし
い。さらに、カルシウムまたはナトリウムであるのが最
も好ましい。
本発明の結晶性ヒトプロインシュリンを製造する場合、
多くのパラメーターおよび条件が重要である。これらは
、ヒトプロインシュリンの濃度；フェノール性物質の存
在および濃度；陽イオンの存在、量および種類；亜鉛イ
オンの存在および量：およびｐＨである。
多くのパラメーターおよび条件が重要である。これらは
、ヒトプロインシュリンの濃度；フェノール性物質の存
在および濃度；陽イオンの存在、量および種類；亜鉛イ
オンの存在および量：およびｐＨである。
水性媒質に於けるヒトプロインシュリン濃度は通常、約
５ｍｇ／ｍｌ〜約５Ｏｎ＋ｇ／ｍ（２の範囲となろう。
５ｍｇ／ｍｌ〜約５Ｏｎ＋ｇ／ｍ（２の範囲となろう。
好ましい濃度はこの範囲の下側２分の１で表わされる範
囲である。更に好ましい範囲は、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２
５ｒｓｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ
および約１３ ｍｔｉ／ ｍＱ〜約１７ｍｇ／ｍ（２で
ある。本発明方法は、約１５ｍｇ／ｍｌのヒトプロイン
シュリン濃度を使用して行なわれるのが最適である。
囲である。更に好ましい範囲は、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２
５ｒｓｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ
および約１３ ｍｔｉ／ ｍＱ〜約１７ｍｇ／ｍ（２で
ある。本発明方法は、約１５ｍｇ／ｍｌのヒトプロイン
シュリン濃度を使用して行なわれるのが最適である。
本発明の方法は、フェノール性物質を使用する。
通常入手し得るフェノール類のいずれを使用してもよい
。この様なフェノール類の例は、フェノールそれ自体、
ｑ−タレゾール、−一タレゾール、Ｒ−クレゾール、レ
ゾルシノール、Ｒ−オキシ安息香酸メチル、カテコール
等である。フェノール性物質は、フェノールまたはクレ
ゾールであるのが好ましい。フェノール性物質は、約０
．１〜約５１１Ｉｇ／ｍｌの範囲の量で水性結晶化混合
物に含有される。フェノール性物質を約１〜約３ｍｇ／
ｌ＋ＩＱの範囲の量で存在させるのが好ましい。
。この様なフェノール類の例は、フェノールそれ自体、
ｑ−タレゾール、−一タレゾール、Ｒ−クレゾール、レ
ゾルシノール、Ｒ−オキシ安息香酸メチル、カテコール
等である。フェノール性物質は、フェノールまたはクレ
ゾールであるのが好ましい。フェノール性物質は、約０
．１〜約５１１Ｉｇ／ｍｌの範囲の量で水性結晶化混合
物に含有される。フェノール性物質を約１〜約３ｍｇ／
ｌ＋ＩＱの範囲の量で存在させるのが好ましい。
結晶性ヒトプロインシュリンの陽イオンは、前記の陽イ
オンのいずれかである。これは、広範な塩のいずれかの
形態で水性混合物に加えられる。
オンのいずれかである。これは、広範な塩のいずれかの
形態で水性混合物に加えられる。
しかしながら、使用される塩は塩化物塩であるのが好ま
しい。重炭酸陰イオンはヒトプロインシュリン塩の結晶
化を何らかの理由で妨害するらしいので、重炭酸塩の使
用を避けるのが好ましい。選択した陽イオンを約ｌＯ：
ｌ〜約１５００：１（陽イオン：ヒトプロインシュリン
（モル：モル））の量で水性媒質に加える。もちろん、
陽イオンが２価である時（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｂａ＋
＋）は通常、陽イオンが１価である時（Ｎａ”、Ｋ＋、
Ｌｉ”、ＮＨ，つより少量の陽イオンが使用されるであ
ろう。通常、陽イオンは、陽イオンが２価である時はヒ
トプロインシュリンに対して約５０＝１の割合、１価で
ある時は約２００：１の割合で混合物に含まれるであろ
う。
しい。重炭酸陰イオンはヒトプロインシュリン塩の結晶
化を何らかの理由で妨害するらしいので、重炭酸塩の使
用を避けるのが好ましい。選択した陽イオンを約ｌＯ：
ｌ〜約１５００：１（陽イオン：ヒトプロインシュリン
（モル：モル））の量で水性媒質に加える。もちろん、
陽イオンが２価である時（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｂａ＋
＋）は通常、陽イオンが１価である時（Ｎａ”、Ｋ＋、
Ｌｉ”、ＮＨ，つより少量の陽イオンが使用されるであ
ろう。通常、陽イオンは、陽イオンが２価である時はヒ
トプロインシュリンに対して約５０＝１の割合、１価で
ある時は約２００：１の割合で混合物に含まれるであろ
う。
通常、ヒトグロインシ：ｌ：４ノン濃度が約１３＋＋Ｉ
ｇ／ｒｓＱまｔ；はそれ以下である時、過剰に高い陽イ
オン濃度によって結晶化が遅延されるであろう。
ｇ／ｒｓＱまｔ；はそれ以下である時、過剰に高い陽イ
オン濃度によって結晶化が遅延されるであろう。
本発明の結晶性ヒトプロインシュリンの製造には、可溶
性の亜鉛塩が使用される。代表的なこの様な可溶性塩は
、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、硝酸亜鉛等である。本発明によ
る結晶形態のヒトプロインシュリンのために必要な亜鉛
イオンの化学量論量は、ヒトプロ４フ２１９２３分子当
たり亜鉛ｌｙＫ子である。本発明の方法によれば、より
少量の亜鉛イオンを使用してもよいが、しかしながら、
結晶化は起こっても収量は当然、それに比例して低下す
るであろう。
性の亜鉛塩が使用される。代表的なこの様な可溶性塩は
、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、硝酸亜鉛等である。本発明によ
る結晶形態のヒトプロインシュリンのために必要な亜鉛
イオンの化学量論量は、ヒトプロ４フ２１９２３分子当
たり亜鉛ｌｙＫ子である。本発明の方法によれば、より
少量の亜鉛イオンを使用してもよいが、しかしながら、
結晶化は起こっても収量は当然、それに比例して低下す
るであろう。
従って通常、亜鉛塩は、少なくとも化学量論量に相当す
る量（ｌ Ｚｎ”／３ＨＰ Ｉ）で使用され、ヒトプロ
インシュリン１分子当たり約２Ｚｎ”＋のモル比までの
範囲とすることができる。ヒトプロインシュリン２分子
当たり約ＩＺｎ”＋に相当するＺｎ”＋濃度で結晶化が
行なわれるのが最適となろう。
る量（ｌ Ｚｎ”／３ＨＰ Ｉ）で使用され、ヒトプロ
インシュリン１分子当たり約２Ｚｎ”＋のモル比までの
範囲とすることができる。ヒトプロインシュリン２分子
当たり約ＩＺｎ”＋に相当するＺｎ”＋濃度で結晶化が
行なわれるのが最適となろう。
所望量のヒトプロインシュリン、フェノール性物質、陽
イオンおよびＺｎ”イオンを含有する水性混合物を約３
．５以下または好ましくは約６．５以上のｐＨで調製す
るのが好都合である。
イオンおよびＺｎ”イオンを含有する水性混合物を約３
．５以下または好ましくは約６．５以上のｐＨで調製す
るのが好都合である。
混合物が完成したら、そのｐＨを約５．４〜約６．５の
範囲に調節する。好ましくは約５．８〜約６．３の範囲
内、最も好ましくは約６．０〜約６゜１にｐＨを維持す
る。
範囲に調節する。好ましくは約５．８〜約６．３の範囲
内、最も好ましくは約６．０〜約６゜１にｐＨを維持す
る。
次に、約り℃〜約４０℃の範囲の温度で維持した混合物
から結晶を生成させる。予想される様に、この範囲の低
域、例えば約り℃〜約２５°Ｃの温度で結晶化を行なう
のが好ましい。また、先ず約２５°Ｃ１次いで約５°Ｃ
にて混合物を撹拌することによって、結晶化を早めるこ
とができる。
から結晶を生成させる。予想される様に、この範囲の低
域、例えば約り℃〜約２５°Ｃの温度で結晶化を行なう
のが好ましい。また、先ず約２５°Ｃ１次いで約５°Ｃ
にて混合物を撹拌することによって、結晶化を早めるこ
とができる。
本発明者らは、初期結晶化混合物から母液をデカントし
、次に母液洗液で結晶を洗浄することによって、結晶の
回収率が非常に高められることを見い出した。「母液洗
液」という語句は、フェノール性物質、所望の陽イオン
を与える塩、および亜鉛塩を各々、結晶化混合物に相当
する濃度に近い濃度で含有している調製溶液を意味する
。
、次に母液洗液で結晶を洗浄することによって、結晶の
回収率が非常に高められることを見い出した。「母液洗
液」という語句は、フェノール性物質、所望の陽イオン
を与える塩、および亜鉛塩を各々、結晶化混合物に相当
する濃度に近い濃度で含有している調製溶液を意味する
。
ヒトプロインシュリン結晶の回収率を更に高めるには、
母液洗液中の結晶の濃厚なスラリーを少なくとも約１０
倍容量の無水エタノールに加える。
母液洗液中の結晶の濃厚なスラリーを少なくとも約１０
倍容量の無水エタノールに加える。
この方法は、ヒトプロインシュリンを結晶形態に保持す
るのを助ける。
るのを助ける。
本発明のヒトプロインシュリン結晶を製造するＩ；めの
通常の、かつ好適な方法は、以下の通りである： ヒトプロインシュリンを、約１５ｍｇ／ｍｌの濃度、ｐ
Ｈ約６．５〜約７．０で水に溶解する。フェノールまた
はクレゾール（約０．３％、３ ｍｇ／ ｍＱ）を混合
物に加え、次いで、１価の塩（Ｎａ（ｊ２． ＫＣＱ。
通常の、かつ好適な方法は、以下の通りである： ヒトプロインシュリンを、約１５ｍｇ／ｍｌの濃度、ｐ
Ｈ約６．５〜約７．０で水に溶解する。フェノールまた
はクレゾール（約０．３％、３ ｍｇ／ ｍＱ）を混合
物に加え、次いで、１価の塩（Ｎａ（ｊ２． ＫＣＱ。
ＬｉＣＱまたはＮＨ，Ｃｆ２）の場合は約０．３５Ｍ、
２価の塩（ＣａＣＱ、・２Ｈ＊０％ＭｇＣｌ２．または
ＢａＣｌ２＊）の場合は約０．０７７Ｍ当量の溶液を調
製するために、十分量の陽イオンの塩を加える。得られ
た溶液のｐＨを約６．５に調節し、その後、約１．１６
ｍＭのＺｎＣｆ２ｚ（２％ＺｎＣＱｘ０．８ｍＱ／ １
００ｍ１２）を加える。必要に応じ、希ＮａＯＨまたは
希ＨＣＱを添加して、得られた混合物のｐＨを約６．０
〜６゜１に調節する。次に、混合物を約２５℃で２４時
間、次いで約５°Ｃで約２４時間撹拌する。得られた結
晶を沈澱させ、母液をデカントする。次いで、混合物を
約２５００ｒｐｍで約２〜３分間遠心し、更に母液をデ
カントする。結晶を１〜２倍容量の母液洗液にスラリー
化し、この混合物を再び遠心し、母液をデカントする。
２価の塩（ＣａＣＱ、・２Ｈ＊０％ＭｇＣｌ２．または
ＢａＣｌ２＊）の場合は約０．０７７Ｍ当量の溶液を調
製するために、十分量の陽イオンの塩を加える。得られ
た溶液のｐＨを約６．５に調節し、その後、約１．１６
ｍＭのＺｎＣｆ２ｚ（２％ＺｎＣＱｘ０．８ｍＱ／ １
００ｍ１２）を加える。必要に応じ、希ＮａＯＨまたは
希ＨＣＱを添加して、得られた混合物のｐＨを約６．０
〜６゜１に調節する。次に、混合物を約２５℃で２４時
間、次いで約５°Ｃで約２４時間撹拌する。得られた結
晶を沈澱させ、母液をデカントする。次いで、混合物を
約２５００ｒｐｍで約２〜３分間遠心し、更に母液をデ
カントする。結晶を１〜２倍容量の母液洗液にスラリー
化し、この混合物を再び遠心し、母液をデカントする。
結晶を１〜２倍容量の母液洗液に再びスラリー化し、そ
の後、この混合物を、連続撹拌しながら１０〜１５倍容
量の無水エタノールに徐々に注ぐ。撹拌を１０〜１５分
間続け、次いで結晶を沈澱させた後、アルコール洗液を
デカントする。混合物を遠心し、デカントし、無水エタ
ノールで再び洗浄し、再び遠心してデカントする。次に
、回収した結晶を約１２〜２４時間減圧乾燥する。
の後、この混合物を、連続撹拌しながら１０〜１５倍容
量の無水エタノールに徐々に注ぐ。撹拌を１０〜１５分
間続け、次いで結晶を沈澱させた後、アルコール洗液を
デカントする。混合物を遠心し、デカントし、無水エタ
ノールで再び洗浄し、再び遠心してデカントする。次に
、回収した結晶を約１２〜２４時間減圧乾燥する。
以下に実施例を挙げ、種々の陽イオンを使用する本発明
による結晶性ヒトプロインシュリンの製造を説明する。
による結晶性ヒトプロインシュリンの製造を説明する。
本実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
凍結乾燥した精製ヒトプロインシュリン２２グラムを精
製水１０００ｎ釧こ溶解し、１９．５３ｍｇ／ｍｌのヒ
トプロインシュリン濃度を得た。融解したフェノール２
ｍＱの添加Ｌ Ｏ，２％フェノール２５０ｍｇで溶液を
１５．６２１１１ｇヒトプロインシュリン／ｍｌに希釈
した。溶液のｐＨは６．５であった。
製水１０００ｎ釧こ溶解し、１９．５３ｍｇ／ｍｌのヒ
トプロインシュリン濃度を得た。融解したフェノール２
ｍＱの添加Ｌ Ｏ，２％フェノール２５０ｍｇで溶液を
１５．６２１１１ｇヒトプロインシュリン／ｍｌに希釈
した。溶液のｐＨは６．５であった。
２０ｍｆｆ（３１２，５ｍ９ヒトプロインシユリン）ス
つを分取し、以下の通り、塩化物塩を加えた＝７７ｍＭ
ＣａＣＱ２（５０％ＣａＣＱ、溶液０．４５６ｍＱ）
；７５．１５０および３００ｍＭ ＮａＣＱ（８７，２
，１７５，２および３５０．４ｍｇ）； ７５．１５０
および３００ｍＭ ＫＣ（２（ｌ ｌ ２．２２４およ
び４４８ｍｇ）；および７５．１５０および３００ｍＭ
ＮＨ２Ｏ（２（８０，１６０および３２０ｍｇ）。各々
を２％ＺｎＣ（２，（７６ｐｇＺｎ”／ｍｌまたは１．
１６ｍＭ）０．１６ｍ１２で処理し、ｌＯ％Ｈ（ｌでｐ
Ｈを６．０〜６．１に調節した。この混合物を２５°Ｃ
で２４時間、次いで５℃で２４時間撹拌し、沈澱させた
。
つを分取し、以下の通り、塩化物塩を加えた＝７７ｍＭ
ＣａＣＱ２（５０％ＣａＣＱ、溶液０．４５６ｍＱ）
；７５．１５０および３００ｍＭ ＮａＣＱ（８７，２
，１７５，２および３５０．４ｍｇ）； ７５．１５０
および３００ｍＭ ＫＣ（２（ｌ ｌ ２．２２４およ
び４４８ｍｇ）；および７５．１５０および３００ｍＭ
ＮＨ２Ｏ（２（８０，１６０および３２０ｍｇ）。各々
を２％ＺｎＣ（２，（７６ｐｇＺｎ”／ｍｌまたは１．
１６ｍＭ）０．１６ｍ１２で処理し、ｌＯ％Ｈ（ｌでｐ
Ｈを６．０〜６．１に調節した。この混合物を２５°Ｃ
で２４時間、次いで５℃で２４時間撹拌し、沈澱させた
。
２４および４８時間後、結晶化混合物の試料を取り、濾
過し、ヒトプロインシュリンについて分析して結晶化の
程度を調べた。透明な上澄液をデカントし、ヒトプロイ
ンシュリン結晶のスラリーを、激しく撹拌しながら、１
０〜１５倍容量の冷無水エタノールに徐々に注いだ。１
０−１５分間撹拌した後、結晶を手早く遠心し、ア）レ
コールをデカントし、次いで結晶をアルコールで再び洗
浄し、遠心し、アルコールをデカントした。結晶を減圧
乾燥し、秤量した。以下の表は、得られた結果を示す。
過し、ヒトプロインシュリンについて分析して結晶化の
程度を調べた。透明な上澄液をデカントし、ヒトプロイ
ンシュリン結晶のスラリーを、激しく撹拌しながら、１
０〜１５倍容量の冷無水エタノールに徐々に注いだ。１
０−１５分間撹拌した後、結晶を手早く遠心し、ア）レ
コールをデカントし、次いで結晶をアルコールで再び洗
浄し、遠心し、アルコールをデカントした。結晶を減圧
乾燥し、秤量した。以下の表は、得られた結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトプロインシュリンと２価の亜鉛イオンの複合体
の塩であって、該塩の陽イオンはリチウム、カルシウム
、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム
およびバリウムからなる群から選ばれる、結晶形態のヒ
トプロインシュリン。 ２、複合体が、６分子のヒトプロインシュリンが２個の
Ｚｎ＾＋＾２イオンに配位結合しているヒトプロインシ
ュリンのヘキサマー形態である請求項１に記載のヒトプ
ロインシュリン。 ３、陽イオンがカルシウム、ナトリウム、カリウム、ア
ンモニウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれる
請求項１または２に記載のヒトプロインシュリン。 ４、陽イオンがナトリウム、カリウムおよびアンモニウ
ムからなる群から選ばれる請求項３に記載のヒトプロイ
ンシュリン。 ５、陽イオンがナトリウムである請求項４に記載のヒト
プロインシュリン。 ６、陽イオンがカルシウムである請求項４に記載のヒト
プロインシュリン。 ７、結晶性ヒトプロインシュリンの製造方法であって、 （ａ）ヒトプロインシュリン約５〜約５０ｍｇ／ｍｌ、
フェノール性物質約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌ、リチウム
、カルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、
マグネシウムおよびバリウムからなる群から選ばれる陽
イオンの塩約０．０３〜約０．６ミリ当量／ｍｌ、およ
びＺｎ＾＋＾２陽イオン約０．２〜約５ミリ当量を含有
する水性混合物を調製し、 （ｂ）水性混合物を約５．４〜約６．５の範囲のｐＨに
調節し、 （ｃ）結晶を形成させ、 （ｄ）水性混合物から結晶性ヒトプロインシュリンを回
収することからなる方法。 ８、ヒトプロインシュリンの濃度が約５〜約２５ｍｇ／
ｍｌである請求項７に記載の方法。 ９、ヒトプロインシュリンの濃度が約１３〜約１７ｍｇ
／ｍｌである請求項８に記載の方法。 １０、フェノール性物質がフェノールまたはクレゾール
である請求項７〜９のいずれかに記載の方法。 １１、フェノール性物質が約１〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲
の量で含まれる請求項７〜１０のいずれかに記載の方法
。 １２、塩が塩化物塩である請求項７〜１１のいずれかに
記載の方法。 １３、塩の陽イオンがナトリウム、カルシウムおよびア
ンモニウムからなる群から選ばれる請求項７〜１２のい
ずれかに記載の方法。 １４、塩の陽イオンがナトリウムである請求項１３に記
載の方法。 １５、塩の陽イオンがカルシウムである請求項１３に記
載の方法。 １６、Ｚｎ＾＋＾２イオンが、プロインシュリン３分子
当たりＺｎ＾＋＾２約１個からプロインシュリン１分子
当たりＺｎ＾＋＾２約２個に相当する量で加えられる請
求項７〜１５のいずれかに記載の方法。 １７、ヒトプロインシュリン、フェノール性物質、陽イ
オンおよびＺｎ＾＋＾２を含有している水性混合物が約
３．５以下または約６．５以上のｐＨで調製される請求
項７〜１６のいずれかに記載の方法。 １８、ヒトプロインシュリン、フェノール性物質、陽イ
オンおよびＺｎ＾＋＾２を含有している水性混合物が、
調製後、約５．８〜約６．３のｐＨに調節され、維持さ
れる請求項７〜１７のいずれかに記載の方法。 １９、最終ｐＨが約６．０〜約６．１である請求項１８
に記載の方法。 ２０、水性混合物から、生成した結晶性ヒトプロインシ
ュリンを回収する前に、混合物から母液上澄液をデカン
トし、残留した結晶を母液洗液で洗浄する請求項７〜１
９のいずれかに記載の方法。 ２１、結晶性ヒトプロインシュリンを含有している母液
洗液を少なくとも約１０倍容量の無水エタノールに加え
る請求項２０に記載の方法。 ２２、１またはそれ以上の薬学的に許容し得る担体また
は賦形剤と共に、ヒトプロインシュリンと２価の亜鉛イ
オンの複合体の塩を含む医薬製剤であって、該塩の陽イ
オンはリチウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム、
アンモニウム、マグネシウムおよびバリウムからなる群
から選ばれるものである、ヒトプロインシュリンを含有
する医薬製剤。 ２３、ヒトプロインシュリンと２価の亜鉛イオンの複合
体の塩であって、該塩の陽イオンはリチウム、カルシウ
ム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウ
ムおよびバリウムからなる群から選ばれる医薬用の結晶
形態のヒトプロインシュリン。
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