PT87265B - Processo para a producao de proinsulina humana cristalina - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
Resumo
Este invento proporciona um processo pa_ ra a produção de uma proinsulina humana cristalina, que consiste em: (a) se preparar uma mistura aquosa contendo cerca de 5 a cerca de 50 mg/ml de proinsulina humana, cerca de 0,1 a cerca de 5 mg/ml de uma substância fenólica, cerca de 0,03 a cerca de 0,6 miliequivalentes/ml de um sal de um catião se
ELI LILLY AND COMPANY
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PROINSULINA HUMANA CRISTALINA
leccionado a partir do grupo que consiste em litio, cálcio, sódio, potássio, amónio, magnésio e bário, e cerca de 0,2 a +2 cerca de 5 miliequivalentes de catião Zn ; (b) se ajustar a mistura aquosa a um pH na gama de cerca de 5,4 a cerca de 6,5; (c) se deixar ocorrer a formação de cristais; e (d) se recuperar a proinsulina humana cristalina a partir da mis, tura aquosa.
advento da metodologia do DNA recombinante tem proporcionado a oportunidade de se produzir qua.1 quer um de uma vasta gama de peptideos e proteínas.
Uma dessas proteínas é a proinsulina hu mana. A proinsulina humana é util ou como intermediário na produção de insulir.a humana ou como agente farmacêutico, em si mesmo, no manejo dos diabetes.
Na produção do DNA recombinado de proin sulina humana, o produto é habitualmente lançado numa solução aquosa e é seco por congelação até se obter um pó não-cristalino.
Uma forma cristalina da proinsulina hu mana, se disponível, proporcionaria muitas vantagens em ter mos de entre outras, o seu armazenamento, as estratégias de formulação e os processos para o seu isolamento e purificação.
Este invento está dirigido para uma no va forma cristalina de proinsulina humana e para um processo para a sua produção.
Deste modo este invento está dirigido para uma proinsulina humana cristalina, que compreende um sal de um complexo de proinsulina humana e de um ião zinco divalente sendo o catião do sal referido seleccionado a par tir do grupo que consiste em litio, cálcio, sódio, potássio, amónio, magnésio e bário.
Este invento também está dirigido para um processo para a produção do sal anteriormente descrito, a qual consiste em:
(a) se preparar uma mistura aquosa con ter.do cerca de 5 a cerca de 50 mg/ml de proinsulina humana, cerca de 0,1 a cerca de 5 mg/ml de uma substância fenólica, cerca de 0,03 até 0,6 miliequivalentes/ml de um sal de um catião seleccionado a partir do grupo que consiste em litio, cálcio, sódio, potássio, amónio, magnésio e bário, e cerca de 0,2 até cerca de 5 miliequivalentes de catião Zn+7;
(b) se ajustar a mistura, aquosa a um pH na gama de cerca de 5,4 até cerca de 6,5;
(c) se deixar ocorrer a formação de cristais, e (d) se recuperar a proinsulina humana cristalina a partir da mistura aquosa.
Conforme foi mencionado este invento está dirigido para a proinsulina humana cristalina e para um processo para a sua produção.
A proinsulina humana cristalina deste invento compreende um sal de um complexo de proinsulina hu mana e de um ião zinco divalente.
complexo, em geral é representado por uma forma hexamérica de proinsulina humana, pela qual seis moléculas de proinsulina humana estão coordenadamente liga das a dois iões Zn+ .
catião é monovalente ou divalente e pode ser qualquer um dos seguintes: litio, cálcio, sódio, potássio, amónio, magnésio ou bário. De preferência o catião é cálcio, sódio, potássio, amónio ou magnésio e, com mais preferência, é o sódio, cálcio ou amónio. 0 catião com maior preferência é o cálcio ou o sódio.
Ao produzir-se a proinsulina humana cri£ talina deste invento, são importantes um certo número de pa râmetros e condições. São as seguintes:concentração de proin sulina humana; presença e concentração de uma substância fe nólica; presença, quantidade e identidade de catião; presen ça e quantidade do ião zinco; e pH.
A concentração de proinsulina humana para o meio aquoso, em geral, varia de cerca de 5 mg/ml até cerca de 50 mg/ml. De preferência, a concentração apresenta, -se numa gama representada por menos de metade da gama anterior .
As gamas preferidas de modo crescente são de cerca de 5 mg/ml até cerca de 25 mg/ml; cerca de 10 mg/ml até cerca de 20 mg/ml, e de cerca de 13 mg/ml até cerca de 17 mg/ml.
Optimamente, o processo é conduzido ut_i lizando uma concentração de proinsulina humana de cerca de 15 mg/ml.
O processo deste invento emprega uma substância fenólica. Podem ser empregues qualquer um dos fenóis normalmente disponíveis.
Ilustrativos de tais fenois são o próprio fenol, o cresol, m-cresol, p-cresol, resorcinol, p-hidroxibenzoato de metilo, catecol, e outros afins. De preferência a substância fenólica é fenol ou de um cresol.
A substância é incorporada na mistura de cristalização aquosa numa quantidade que varia de cerca de 0,1 a cerca de 5 mg/ml. De preferência, a substância fe nólica está presente numa quantidade que varia de cerca de 1 até cerca de 3 mg/ml.
O catião da proinsulina humana cristalina é qualquer um dos catiões anteriormente descritos. Ê adicionado a uma mistura aquosa na forma de qualquer uma das vasta gama de sais.
De preferência, contudo o sal que é uti_ lizado é o sal de cloreto. É preferível evitar o emprego de um sal bicarbonato uma vez que, pela mesma razão o anião de bicarbonato parece para inibir a cristalização do sal de proinsulina humana.
O catião seleccionado é adicionado ao meio aquoso numa quantidade, numa base mole; mole de cerca de 10:1 até cerca 1500.1 catião: proinsulina humana.
Certamente que quando*o catião é diva lente (Ca++, Mg++, Ba++), será habitualmente empregue uma quantidade menor de catião do que quando o catião é normalmente (Na+, K+, Li+, NH^+).
-Ί-
Tipicamente7 quando o catião é divalen te, estará presente na mistura numa proporção de cerca de 50:1 relativa à proinsulina humana e, quando monovalente, a uma proporção de cerca de 200:1.
Em geral, quando a concentração de pro insulina humana é de cerca de 13 mg/ml ou menos, a cristalização será retardada por uma concentração de catião excessivamente alta.
z
E utilizado um sal de zinco solúvel na formação da proinsulina humana cristalina deste invento. Os tais sais solúveis típicos são o cloreto de zinco, acetato de zinco, nitrato de zinco, e outros afins. A quantidade es tequiométrica de ião de zinco necessária para a forma cristã,' lina da proinsulina humana, de acordo com este invento é um átomo de zinco por cada três moléculas de proinsulina humana.
De acordo com o processo deste invento, pode ser eirpregue uma quantidade menor de ião de zinco; con tudo, embora a cristalização vá ocorrer, o rendimento, certéi mente, será proporcionalmente reduzido.
Em geral, por isso, o sal de zinco, será utilizado numa quantidade representando> pelo menos, a quantidade estequiométrica (1 Zn++/3 HPI) e pode variar até uma proporção molar de cerca de 2 Zn++ por cada molécula deproinsulina humana.
Optimámente, o processo de cristalização será levado a cabo numa concentração de Zn++; representando cerca de 1 Zn++ por cada 2 moléculas de proinsulina humana.
Por questão de conveniência, a mistura aquosa contendo as quantidades desejadas de proinsulina humana, substância fenoliza, catião, e o ião Ζη+^f é preparada a um pH abaixo de cerca de 3,5 ou, de preferência, acima de cerca de 6,5.
A mistura completa, uma vez formada, é ajustada no pH para se obter um pH na gama de cerca de 5,4 até cerca de 6,5. De preferência, o pH é mantido dentro da gama de cerca de 5,8 até cerca de 6,3, e, de maior preferência, cerca de 6,0 até cerca de 6,1.
Em seguida, deixa-se formar cristais a partir da mistura mantida a uma temperatura na gama de cerca de 0°C até cerca de 40°C. Conforme deve ser esperado, é preferível levar a cabo a cristalização a uma temperatura da parte final, inferior, da gama anterior, por exemplo, a cercãde 5QC até cerca de 25°C. Além disso, a cristalização pode ser acelerada por agitação da mistura, em primeiro lugar, a cerca de 25°C, e, em seguida, a cerca de 5°C.
Foi descoberto que a recuperação de cristais é grandemente aumentada por decantação do líquido-mãe da mistura de cristalização inicial e, em seguida, por lavagem dos cristais com uma solução de lavagem de líquido-mãe. O termo solução de lavagem de água-mãe significa uma solução preparada contendo substância fenóliza, o sal que proporciona o catião desejado, e o sal de zinco, cada um a uma concentração que se aproxima da representada na mis_ tura de cristalização.
Um aumento adicional na recuperação dos cristais de proinsulina humana envolve a adição de uma pasta espessa dos cristais na solução de lavagem de líquido-mãe de pelo menos, cerca de 10 volumes de etanol absoluto.
Este processo facilita a retenção da proinsulina humana na forma cristalina.
Um método geral, preferido para a produção de cristais de proinsulina humana deste invento é como se segue:
A proinsulina humana é dissolvida em água a uma concentração de cerca de 15 mg/ml, pH cerca de 6,5 até cerca de 7,0. O fenol ou cresol (cerca de 0,3%; 3 mg/ml) é adicionado à mistura seguido por sal catiónico su ficiente para fazer a solução equivalente.a cerca de 0,35 M para o sal monovalente (NaCl, KC1, LiCl ou NH^Cl) ou cerca de 0,077 M para o sal divalente (CaCl2.2H2O, MgCl2, ou BaCl2)
O pH da solução resultante é ajustado até cerca de 6,5 após o que é adicionado cerca de 1,16 mM de ZnCl2 (0,8 ml de 2% de ZnCl2/100 ml). O pH da mistura resu_l tante é ajustado até cerca de 6,0-6,1 por adição, se necessário, de NaOH diluido ou HC1 diluído. A mistura, 'em seguida, é agitada durante cerca de 24 horas a cerca de 25°C e, depois, durante cerca de 24 horas a cerca de 5°C.
Os cristais resultantes são deixados a depositar e o líquido-mãe, é decantada. A mistura é, em seguida, centrifugada durante cerca de 2-3 minutos a cerca de 2500 rpm, e a água-mãe adicional é decantada. Os cristais são transformados numa pasta fluida em 1-2 volumes de solução de lavagem de líquido-mãe e a mistura é, de novo, centrji fugada e o líquido-mãe é decantado. Os cristais são, mais uma vez, transformados numa pasta fluida em 1-2 volumes de solução de lavagem de líquido-mãe, após o que, a mistura é lentamente vazada com agitação contínua em 10-15 volumes de etanol absoluto.
-1.Ô-
A agitação é continuada durante 10-15 minutos, depois do que, após a deposição dos cristais, a so lução de lavagem de álcool é decantada. A mistura é centrifugada, decantada, lavada de novo com etanol absoluto; e de novo centrifugado e decantado. Os cristais recuperados são, em seguida, secos in vacuo durante cerca de 12-24 horas.
exemplo seguinte é proporcionado pa. ra ilustrar a produção da proinsulina humana cristalina de acordo com este invento, utilizando uma variedade de catiões. O exemplo não pretende limitar o âmbito amplo deste invento.
Exemplo
Vinte e dois gramas de proinsulina hu mana purificada e liofilizada foram dissolvidas em 1000 ml de água purificada de modo a proporcionar uma concentração de proinsulina humana de 19,53 mg/ml. Depois da adição de 2 ml de fenol liguefeito, a solução foi diluida até se obter 15,62 mg de proinsulina humana/ml com 250 ml de fenol a 0,2%.
O pH da solução foi de 6,5. Foram t% radas partes aliquotas de 20 ml cada (312,5 mg de proinsulina humana), e os sais cloreto foram adicionados como se segue :
mM CaCl2 (0,456 ml de uma solução de CaCl2 a 50%); 75,150 e 300 mM NaCl (87,2; 175,2 e 350,4 mg); 75,150 e 300 mM KC1 (112, 224, e 448 mg); 75,150 e 300 mM NH4C1 (80,160 e 320 mg).
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Cada uma delas foi tratada com 0,16 ml de ZnCl2 a 2% (76 jig Zn++/ml ou 1,16 mM) e o pH foi ajustado até 6,0-6,1 com HC1 a 10%. A mistura foi agitada durante 24 horas a 25°C e,em seguida, durante 24 horas a 5°C e deixada a repousar. Foram tiradas amostras das misturas de cristalização depois de 24 e 48 horas, foram filtradas e ensaiadas para a proinsulina humana a fim de determinar a extensão da cristalização. O líquido sobrenadante, claro foi decantado, e foi vazado lentamente, uma pasta fluida dos cristais de proinsulina humana em 10-15 volumes de etanol absoluto frio, enquanto se agita rapidamente. Depois da agitação durante 10-15 minutos, os cristais foram centrifugados sumariamente, o álcool foi decantado, e os cristais lavados de novo com álcool, centrifugados, e o álcool foi decantado. Os cristais foram secos in vacuo e foram pesados. O quadro que se segue, mostra os resultados que foram obtidos.
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Proinsulina humana cristalina
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Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a produção de proinsulina humana cristalina, caracterizado por compreender os passos de: (a) se preparar uma mistura aquosa contendo cerca de 5 a cerca de 50 mg/ml de proinsulina humana, cerca de 0,1 a cerca de 5 mg/ml de uma abundância fenólica, cerca de 0,03 a cerca de 0,6 miliequivalentes/ml de um sal de um catião seleccionado a partir do grupo que consiste em lítio, cálcio, sódio, potássio, amónio, magnésio e bário, e, cerca de 0,2 a cerca de 5 miliequivalentes de catião Zn+2; (b) se ajustar a mistura aquosa a um pH na gama de cerca de5,4 a cerca de 6,5; (c) se deixar ocorrer a formação de cristais; e (d) se recuperar a proinsulina humana cristalina a partir da mistura aquosa.
- 2â. - Processo de acordo com a reivin dicação 1, caracterizado por a concentração da proinsulina humana ser de cerca de 5 a cerca de 25 mg/ml.
- 3â. - Processo de acordo com a reivin dicação 2, caracterizado por a concentração de proinsulina humana ser de cerca de 13 a cerca de 17 mg/ml.
- 4â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a substância fenólica ser fenol ou um cresol.
- 5§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a substância fenólica estar presente numa quantidade que varia entre cerca de 1 a cerca de 3 mg/ml.I
- 6^. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o sal ser um sal cloreto.I
- 7â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o catião do sal ser seleccionado a partir do grupo que consiste em sódio, cálcio e amónio.
- 8â. - Processo de acordo com a reivin dicação 7, caracterizado por o catião do sal ser sódio.
- 9a. - Processo de acordo com a reivin I dicação 7, caracterizado por o catião do sal ser cálcio.lOê. _ Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o ião Zn+^ ) ser adicionado numa quantidade representando cerca de umZn+2 por cada três moléculas de proinsulina até cerca de dois Zn+2 por cada molécula de proinsulina.llâ. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por a mistura aquosa contendo proinsulina humana, substância fenólica, catião e Zn+2 ser preparada a um pH inferior a cerca de 3,5 ou superior a cerca de 6,5.
- 12i. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por a mistura aquosa contendo proinsulina humana, substância fenólica, catião e Zn+2, uma vez preparada, ser ajustada e mantida a um pH de cerca de 5,8 até cerca de 6,3.
- 13a. - Processo de acordo com a reivin dicação 12, caracterizado por o pH final ser de cerca de 6,0 até cerca de 6,1.
- 14a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por, antes da recuperação da proinsulina humana cristalina formada a partir da mistura aquosa o liquido-mãe sobrenadante ser decant tado da mistura, e os cristais residuais serem lavados atra vés de uma lavagem com o líquido-mãe.
- 15â. - Processo de acordo com a reivin dicação 14, caracterizado por a lavagem com o líquido-mãe,-16contendo proinsulina humana cristalina, ser adicionada a pelo menos, cerca de 10 volumes de etanol absoluto.
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