JPS6328389A - β−グルコシダ−ゼ及びその製造法 - Google Patents
β−グルコシダ−ゼ及びその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
近年、セルロースが安価なグルコース源として脚光をあ
び、これを発酵原料として工業用アルコールなどを大量
に安定供給する技術の開発が進められている。本発明は
このセルロースを効率よく分解しうる酵素を提供するも
のである。
び、これを発酵原料として工業用アルコールなどを大量
に安定供給する技術の開発が進められている。本発明は
このセルロースを効率よく分解しうる酵素を提供するも
のである。
セルロースからグルコースを製造する方法のひとつにセ
ルラーゼを用いた酵素法がある。このセルラーゼには反
応を効率よく行なわせるために一般に複合酵素系が利用
され、セルラーゼ反応の中間生成物であるセロビオース
からグルコースへの反応はβ−グルコシダーゼが分担し
ている。
ルラーゼを用いた酵素法がある。このセルラーゼには反
応を効率よく行なわせるために一般に複合酵素系が利用
され、セルラーゼ反応の中間生成物であるセロビオース
からグルコースへの反応はβ−グルコシダーゼが分担し
ている。
しかしながら、従来のセルラーゼでは多量の酵素を用い
ても実用レベルの高濃度のグルコースを生成させるため
の条件ではセルロースを１００％糖化することはできず
、特に反応の後半においてグルコースの生成速度が大幅
に低下するという問題があった。本発明者らはこのよう
な問題点を解決するべく鋭意検討の結果、セルラーゼ複
合酵素系のうち最終段階の反応を受は持つβ−グルコシ
ダーゼが生成物であるグルコースによって強く阻害を受
けることを動力学的解析により確認した。
ても実用レベルの高濃度のグルコースを生成させるため
の条件ではセルロースを１００％糖化することはできず
、特に反応の後半においてグルコースの生成速度が大幅
に低下するという問題があった。本発明者らはこのよう
な問題点を解決するべく鋭意検討の結果、セルラーゼ複
合酵素系のうち最終段階の反応を受は持つβ−グルコシ
ダーゼが生成物であるグルコースによって強く阻害を受
けることを動力学的解析により確認した。
そこで、グルコース阻害の少ないβ−グルコシダーゼを
取得するべ〈従来のセルラーゼ産生菌の変異操作や細胞
融合を行なったが満足しうる結果は得られなかった。
取得するべ〈従来のセルラーゼ産生菌の変異操作や細胞
融合を行なったが満足しうる結果は得られなかった。
本発明者らはこのような問題点を解決するべくさらに検
討を進め、新たに自然界から分離したストレプトミセス
属に属する微生物がこの目的とする酵素を産生しうろこ
とを見出し、この知見に基いて本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、１Ｍグルコース存在下の相対
活性がグルコース不在時の６５％以上であるβ−グルコ
シダーゼとこの酵素を産生しうるストレプトミセス属微
生物を用いてこの酵素を製造する方法に関するものであ
る。
討を進め、新たに自然界から分離したストレプトミセス
属に属する微生物がこの目的とする酵素を産生しうろこ
とを見出し、この知見に基いて本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、１Ｍグルコース存在下の相対
活性がグルコース不在時の６５％以上であるβ−グルコ
シダーゼとこの酵素を産生しうるストレプトミセス属微
生物を用いてこの酵素を製造する方法に関するものであ
る。
次に、実施例で得られた本酵素の理化学的性質を示す。
（１）作用及び基質特異性
本酵素の各種基質に対する作用を測定した結果を下表に
示す。
示す。
測定方法は、表に示した濃度の各基質、２０μｇ蛋白の
ＡＪ ９４５６又は２５μｇ蛋白のＡＪ ９４５７の酵
素、及び０．１ Ｍ ＭＥＳ （２（Ｎ −Ｍｏｒｐｈ
ｏｌｉｎｏ） ｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃ
ｉｄ） ｐＨ６，５緩衝液を含む全容積０．２）１１１
の反応液を５０℃で１時間反応させ、生成したグルコー
スをグルコースオキシダーゼを用いた比色定量法で測定
することによって求めた。表中の数字はセロビオースに
ついて得られた値を１００とした相対値で表示した。従
来品にはアーモンド由来のβ−グルコシダーゼを用いた
。表から明らかなように本酵素は従来品と比較するとソ
ホロースとサリシンに対する作用が太き（異なっている
。
ＡＪ ９４５６又は２５μｇ蛋白のＡＪ ９４５７の酵
素、及び０．１ Ｍ ＭＥＳ （２（Ｎ −Ｍｏｒｐｈ
ｏｌｉｎｏ） ｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃ
ｉｄ） ｐＨ６，５緩衝液を含む全容積０．２）１１１
の反応液を５０℃で１時間反応させ、生成したグルコー
スをグルコースオキシダーゼを用いた比色定量法で測定
することによって求めた。表中の数字はセロビオースに
ついて得られた値を１００とした相対値で表示した。従
来品にはアーモンド由来のβ−グルコシダーゼを用いた
。表から明らかなように本酵素は従来品と比較するとソ
ホロースとサリシンに対する作用が太き（異なっている
。
すなわち、ソホロースに対する活性は従来品の２以下で
あり、サリシンに対する活性は１／１０以下である。
あり、サリシンに対する活性は１／１０以下である。
（２） 至適ｐＨ
ＡＪ ９４５６菌から得られた酵素の至適ｐＨ曲線を第
１図にそしてＡＪ ９４５７菌から得られた至適ｐＨ曲
線を第２図に示す。測定方法としては、基質に５ｍＭｐ
−ニトロフェニル−β−グルコシドヲ用い、各ｐＨにお
いて５０℃で１０分間反応後生成したｐ−ニトロフェノ
ール量を４００ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。
１図にそしてＡＪ ９４５７菌から得られた至適ｐＨ曲
線を第２図に示す。測定方法としては、基質に５ｍＭｐ
−ニトロフェニル−β−グルコシドヲ用い、各ｐＨにお
いて５０℃で１０分間反応後生成したｐ−ニトロフェノ
ール量を４００ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。
図中丸印は０．１ Ｍクエン酸−リン酸緩衝液を、×印
は０．１ＭＭＥＳ緩衝液を、そして三角印は０．１ Ｍ
ＴＥＳ （Ｎ −Ｔｒｉｓ （Ｈｙｄｒｏｘｙ−ｍｅ
ｔｈｙｌ） ｎｅｔｈｙｌ −２−ａｍｉｎｏｅｔｈａ
ｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液を用いた場合
をそれぞれ示している。これらの図に示すように本酵素
の至適ｐＨはいずれもｐＨ６〜６．５にある。尚、同じ
条件で測定したアーモンド由来のβ−グルコシダーゼの
至適ｐＨは５．５であった。
は０．１ＭＭＥＳ緩衝液を、そして三角印は０．１ Ｍ
ＴＥＳ （Ｎ −Ｔｒｉｓ （Ｈｙｄｒｏｘｙ−ｍｅ
ｔｈｙｌ） ｎｅｔｈｙｌ −２−ａｍｉｎｏｅｔｈａ
ｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液を用いた場合
をそれぞれ示している。これらの図に示すように本酵素
の至適ｐＨはいずれもｐＨ６〜６．５にある。尚、同じ
条件で測定したアーモンド由来のβ−グルコシダーゼの
至適ｐＨは５．５であった。
（３）安定ｐＨ範囲
ＡＪ ９４５６菌から得られた酵素のｐＨ安定性を示す
曲線を第３図に丸印でそしてＡＪ ９４５７菌から得ら
れた酵素のｐＨ安定性を示す曲線を同図に×印でそれぞ
れ示す。測定方法としては、各ｐＨにおいて５０°Ｃで
２０分間加温し、残存活性を測定することにより求めた
。用いた緩衝液はｐＨ３〜６は０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液、ｐＨ７〜８は０、１ Ｍ ＴＥＳ緩衝液、ｐ
Ｈ９〜１０は０．１ Ｍ トリス緩衝液、そしてｐＨ１
１は０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液である。図に示
すように本酵素の安定ｐＨ範囲はいずれもｐＨ５〜９．
５にある。
曲線を第３図に丸印でそしてＡＪ ９４５７菌から得ら
れた酵素のｐＨ安定性を示す曲線を同図に×印でそれぞ
れ示す。測定方法としては、各ｐＨにおいて５０°Ｃで
２０分間加温し、残存活性を測定することにより求めた
。用いた緩衝液はｐＨ３〜６は０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液、ｐＨ７〜８は０、１ Ｍ ＴＥＳ緩衝液、ｐ
Ｈ９〜１０は０．１ Ｍ トリス緩衝液、そしてｐＨ１
１は０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液である。図に示
すように本酵素の安定ｐＨ範囲はいずれもｐＨ５〜９．
５にある。
（４）力価の測定法
０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５，０，５ｍＭｐ−ニトロフ
ェニル−β−グルコサイドと酵素を含む全容１ｍｌを６
０℃１０分間反応させて１ ｍｌの１ＭＮ８２ＣＯ１を
加えて反応を停止し、生成したｐ−ニトロフェノール量
を４００ｎｍでの吸光度の測定により求めた。この条件
で１分間当り１μｍｏｌ のｐ−ニトロフェノールを生
成させる酵素量をｌ ｕｎｉｔとした。
ェニル−β−グルコサイドと酵素を含む全容１ｍｌを６
０℃１０分間反応させて１ ｍｌの１ＭＮ８２ＣＯ１を
加えて反応を停止し、生成したｐ−ニトロフェノール量
を４００ｎｍでの吸光度の測定により求めた。この条件
で１分間当り１μｍｏｌ のｐ−ニトロフェノールを生
成させる酵素量をｌ ｕｎｉｔとした。
（５）熱安定性
ｐ Ｈ５，０の０．１Ｍ酢酸緩衝液中で各温度で１時間
加熱後の残存活性を測定した結果を第４図に示す。図中
、白丸はＡＪ ９４５６菌から得られた酵素を、Ｘ印は
ＡＪ ９４５７菌から得られた酵素を、そして黒丸はア
ーモンド由来の酵素をそれぞれ表わしている。この図に
示すようにＡＪ ９４５６菌から得られた酵素は６０°
ｃ、 ＡＪ９４５７菌から得られた酵素は５５°Ｃま
で安定である。それに対し、アーモンド由来の酵素の熱
安定性は５０℃までであった。
加熱後の残存活性を測定した結果を第４図に示す。図中
、白丸はＡＪ ９４５６菌から得られた酵素を、Ｘ印は
ＡＪ ９４５７菌から得られた酵素を、そして黒丸はア
ーモンド由来の酵素をそれぞれ表わしている。この図に
示すようにＡＪ ９４５６菌から得られた酵素は６０°
ｃ、 ＡＪ９４５７菌から得られた酵素は５５°Ｃま
で安定である。それに対し、アーモンド由来の酵素の熱
安定性は５０℃までであった。
（６） グルコース阻害定数
本酵素及び従来のβ−グルコシダーゼについてグルコー
ス阻害定数を測定した結果を下表に示す。
ス阻害定数を測定した結果を下表に示す。
反応はｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸緩衝液中で行なわせｓ
Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを利用して
阻害定数を求めた。
Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを利用して
阻害定数を求めた。
（７） グルコースン農度の影古
本酵素の活性に対するグルコースの影響を測定した結果
を第５図に示す。図中ＡはＡＪ ９４５６菌の洗浄菌体
そのものを酵素として使用した場合を示し、Ｂは超音波
で菌体を破壊して抽出した菌細胞抽出液を示す。Ｃはア
ーモンド由来の酵素をそしてＤは従来優秀な酵素である
とされているスボロトリクムセルロフィルム由来の酵素
を示している。
を第５図に示す。図中ＡはＡＪ ９４５６菌の洗浄菌体
そのものを酵素として使用した場合を示し、Ｂは超音波
で菌体を破壊して抽出した菌細胞抽出液を示す。Ｃはア
ーモンド由来の酵素をそしてＤは従来優秀な酵素である
とされているスボロトリクムセルロフィルム由来の酵素
を示している。
測定方法は０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐ Ｈ５，０，５ｍＭ
ｐ−ニトロフェニル−β−グルコサイドと酵素を含む全
容積１ ｍｊ！を６０℃１０分閘反応させて上記に示し
た方法で４００ｎｍでの吸光度を測定した。
ｐ−ニトロフェニル−β−グルコサイドと酵素を含む全
容積１ ｍｊ！を６０℃１０分閘反応させて上記に示し
た方法で４００ｎｍでの吸光度を測定した。
同図に示すように本酵素は１Ｍグルコース存在下におい
ても初期の６５％以上、特に８０％以上の活性を保持し
ているがアーモンド由来のものは約６０％にそしてスボ
ロトリクム由来の酵素に至っては１０％以下に低下して
いる。
ても初期の６５％以上、特に８０％以上の活性を保持し
ているがアーモンド由来のものは約６０％にそしてスボ
ロトリクム由来の酵素に至っては１０％以下に低下して
いる。
以上の如く、本酵素は従来のβ−グルコシダーゼと理化
学的性質が大きく異なり、持にグルコースによる活性低
化が少ないことで従来の酵素と明らかに異なる。そこで
本酵素を新規酵素であると認定するに至った。
学的性質が大きく異なり、持にグルコースによる活性低
化が少ないことで従来の酵素と明らかに異なる。そこで
本酵素を新規酵素であると認定するに至った。
かかる本酵素は例えばストレプトミセス・エスピーＡＪ
９４５６ （ＦＥＲ？Ｉ Ｐ−８８６１）、同＾Ｊ
９４５７などを培養することにより産生させることがで
きる。
９４５６ （ＦＥＲ？Ｉ Ｐ−８８６１）、同＾Ｊ
９４５７などを培養することにより産生させることがで
きる。
ストレプトミセス・エスピーＡＪ ９４５６及び同ＡＪ
９４５７の菌学的性質を次に示す。
９４５７の菌学的性質を次に示す。
１形態的性質
ｌ５Ｐ−１寒天平板培地、５０℃、７日間培養したもの
の形態的性質 基中菌糸および気菌糸を有する。
の形態的性質 基中菌糸および気菌糸を有する。
気菌糸上の胞子柄に分節胞子の連鎖を形成する。
胞子柄はらせん状ないし直線状を呈する。
２細胞壁のタイプ
ｌ５Ｐ−ＩＩ寒天平板培地、５０゛Ｃ１７日間培養した
菌体を集め、６Ｎｌ（Ｃβにて１００℃、１８時間加水
分解し、濾過により残渣を除去した上滑液を「放線菌の
同定実験法」 （口木放線菌研究会編）６７頁記載の薄
層クロマトグラフィー法により分析 ＬＬ−ジアミノピメリン酸及びグリシンを含有する。以
上の菌学的性質より木菌はいずれもストレプトミセス属
に属するものと認定し、ストレプトミセス・エスピーと
命名した。
菌体を集め、６Ｎｌ（Ｃβにて１００℃、１８時間加水
分解し、濾過により残渣を除去した上滑液を「放線菌の
同定実験法」 （口木放線菌研究会編）６７頁記載の薄
層クロマトグラフィー法により分析 ＬＬ−ジアミノピメリン酸及びグリシンを含有する。以
上の菌学的性質より木菌はいずれもストレプトミセス属
に属するものと認定し、ストレプトミセス・エスピーと
命名した。
これらの菌を培養する培地にはβ−グルコシド拮合を有
する糖を主炭素源として好ましくは唯一の炭素源として
含有せしめることによって本酵素を誘導産生させる。こ
の糖の例としてはフェニル−β−Ｄ−グルコシド、セロ
ビオース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビ
オース、ラクトース、シュクロース、メチル−β−グル
コシド、エスクリン、アルブチン、サリシン等を挙げる
ことができる。これらのなかでフェニル−β−グルコシ
ド、セロビオース、ソホロース、メチル−β−グルコシ
ド及びエスクリンが好ましい。
する糖を主炭素源として好ましくは唯一の炭素源として
含有せしめることによって本酵素を誘導産生させる。こ
の糖の例としてはフェニル−β−Ｄ−グルコシド、セロ
ビオース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビ
オース、ラクトース、シュクロース、メチル−β−グル
コシド、エスクリン、アルブチン、サリシン等を挙げる
ことができる。これらのなかでフェニル−β−グルコシ
ド、セロビオース、ソホロース、メチル−β−グルコシ
ド及びエスクリンが好ましい。
炭素源以外の成分はストレプトミセス属菌を培養する通
常の培地と同様でよく、ペプトン、肉エキス、麦芽エキ
ス、酵母エキス、大豆蛋白加水分解物などの有機窒素化
合物、アンモニウム塩硝酸塩等の無段窒素化合物さらに
はビタミン等の微量栄養物等を適宜含む培地を用いる。
常の培地と同様でよく、ペプトン、肉エキス、麦芽エキ
ス、酵母エキス、大豆蛋白加水分解物などの有機窒素化
合物、アンモニウム塩硝酸塩等の無段窒素化合物さらに
はビタミン等の微量栄養物等を適宜含む培地を用いる。
このような培地をｐＨ４〜８程度、好ましくは中性付近
に調整して前記微生物を接種し、１６〜４８時間程度Ｂ
’ｌｉあるいは通気攪拌培養することにより本酵素を主
として菌体内に生成蓄積させることができる。前記２例
の微生物はいずれも好熱菌であり、培養温度は４０〜５
５℃程度が適当である。
に調整して前記微生物を接種し、１６〜４８時間程度Ｂ
’ｌｉあるいは通気攪拌培養することにより本酵素を主
として菌体内に生成蓄積させることができる。前記２例
の微生物はいずれも好熱菌であり、培養温度は４０〜５
５℃程度が適当である。
本酵素を分離精製する方法としては、まず培養液から菌
体と培養液上清画分を分離し、菌体画分は超音波処理な
どによる物理的方法あるいは薬剤を用いた化学的方法で
凹体を破壊する。そして、両両分をゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフィー、硫安塩析等公知の酵素精製法を
利用して精製を行なえばよい。
体と培養液上清画分を分離し、菌体画分は超音波処理な
どによる物理的方法あるいは薬剤を用いた化学的方法で
凹体を破壊する。そして、両両分をゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフィー、硫安塩析等公知の酵素精製法を
利用して精製を行なえばよい。
本発明の酵素はグルコースによる生成物阻害が少なく、
セロビオースを分解してグルコースを生成する反応を後
半においても効率よく進行させることができる。
セロビオースを分解してグルコースを生成する反応を後
半においても効率よく進行させることができる。
実施例１
ストレプトミセス・エスピーＡＪ ９４５６ ＦＥＲＭ
Ｐ−８８６１を下表に示す組成の寒天培地（ＩＳＰ−
ＩＴ）に５０℃で２４ｈｒ培養した。
Ｐ−８８６１を下表に示す組成の寒天培地（ＩＳＰ−
ＩＴ）に５０℃で２４ｈｒ培養した。
成分 添加量
酵母エキス ４ｇ／ｌ
麦芽エキス １０ｇ／６
グルコース ４ ｇ ／ １
寒 天 １５ｇ／１
（ｐＨ７，３）
この菌体を下表に示す組成のβ−グルコシダーゼ生生産
培地５０ｍ合含む坂ロフラスコ（５００ｍｌ）に接種し
、５０℃で２４ｈｒ振盪培養した。
培地５０ｍ合含む坂ロフラスコ（５００ｍｌ）に接種し
、５０℃で２４ｈｒ振盪培養した。
成 分 添加量Ｂａｃｔｏ
Ｙｅａｓｔ Ｎｉｇｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ ６
．７ ｇ ／ １セロビオース ２０
ｇｅｌ。
Ｙｅａｓｔ Ｎｉｇｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ ６
．７ ｇ ／ １セロビオース ２０
ｇｅｌ。
硝酸カルシウム ３ｇ／ｆｆ炭酸カル
シウム（別殺菌） ２０ｇ／／！（ｐＨ７，０） 得られた菌体５ｇ（湿重量）を０．２％ＫＣ１で２回洗
浄後、１０ｍ７！のＯ，］、 Ｍ ＴＥＳにＱｉした。
シウム（別殺菌） ２０ｇ／／！（ｐＨ７，０） 得られた菌体５ｇ（湿重量）を０．２％ＫＣ１で２回洗
浄後、１０ｍ７！のＯ，］、 Ｍ ＴＥＳにＱｉした。
１５°Ｃ以下の温度で音波破砕し、１６．００Ｏｒｐｍ
で１ｈｒ遠心した。得られた上清５ｍ！ （蛋白量１０
０■）をＩＩＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（
１，５Ｘ ８ Ｃｌ１１）のカラムに導入した。このカ
ラムは予め０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣ２緩衝液、ｐ
Ｈ８，０で平衡化しておき、上記上清を通液した後に再
び同緩衝液３０ｍ１ｌをカラムに通した。引きつづき同
緩衝液１００ｍ！！と０．５ＭＮａＣｊ！を含む同緩衝
液１００とを用いてグラジェント溶出を行ない、第６図
に示す２つの活性のピークのうち大きいピークの画分障
７３〜７８を集めて酵素液として使用した。尚、図中白
丸はセロビオースを基質として生成したグルコースを比
色法で測定したＯＤ５゜、を示し、黒点はｐ−ニトロフ
ェニル−β−グルコースを基質として生成したｐ−二ト
ロフェノールを測定した○Ｄ ４０１）を示している。
で１ｈｒ遠心した。得られた上清５ｍ！ （蛋白量１０
０■）をＩＩＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（
１，５Ｘ ８ Ｃｌ１１）のカラムに導入した。このカ
ラムは予め０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣ２緩衝液、ｐ
Ｈ８，０で平衡化しておき、上記上清を通液した後に再
び同緩衝液３０ｍ１ｌをカラムに通した。引きつづき同
緩衝液１００ｍ！！と０．５ＭＮａＣｊ！を含む同緩衝
液１００とを用いてグラジェント溶出を行ない、第６図
に示す２つの活性のピークのうち大きいピークの画分障
７３〜７８を集めて酵素液として使用した。尚、図中白
丸はセロビオースを基質として生成したグルコースを比
色法で測定したＯＤ５゜、を示し、黒点はｐ−ニトロフ
ェニル−β−グルコースを基質として生成したｐ−二ト
ロフェノールを測定した○Ｄ ４０１）を示している。
図中の斜線はＮａＣ１濃度を示している。
０、１ Ｍ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６，５，９■セロビオー
スと上記の酵素液０．０５ｍｆｆ１（蛋白質５０ｍｇ）
を含む全容０，２ｍｌを５０゛Ｃで１時間インキユヘー
トした。生成物を３層クロマト（ブタノール：ピリジン
：水＝６：４：３）法によって同定した結果、グルコー
スに相当したＲｆ値を示すスポットが検出された。この
生成グルコース量を、グルコースオキシターゼ法（グル
コース−〇−テスト、和光純薬■製）を用いて定量した
結果５■のグルコースが生成していた。次にセロビオー
スの代りにｐ−ニトロフェニルーβ−グルコサイド０．
３■を添加して５０°Ｃ１１０分インキュベートしたと
ころ０．１■のグルコース及び０．０７７■のｐ−ニト
ロフェノールが生成していた。
スと上記の酵素液０．０５ｍｆｆ１（蛋白質５０ｍｇ）
を含む全容０，２ｍｌを５０゛Ｃで１時間インキユヘー
トした。生成物を３層クロマト（ブタノール：ピリジン
：水＝６：４：３）法によって同定した結果、グルコー
スに相当したＲｆ値を示すスポットが検出された。この
生成グルコース量を、グルコースオキシターゼ法（グル
コース−〇−テスト、和光純薬■製）を用いて定量した
結果５■のグルコースが生成していた。次にセロビオー
スの代りにｐ−ニトロフェニルーβ−グルコサイド０．
３■を添加して５０°Ｃ１１０分インキュベートしたと
ころ０．１■のグルコース及び０．０７７■のｐ−ニト
ロフェノールが生成していた。
ワットマンセルロース粉末ＣＣ４１２００■、０．１Ｍ
＃酸緩衝液、ｐＨ５，０、スポロトリウムセルロフィル
ムへＴＣＣ２０４９３（ＡＪ ６９８７）のセルラーゼ
（蛋白２０■）、及び前述のβ−グルコシダーゼの酵素
液２ ｍｌ （蛋白２■）を含む全容量１０ｍ７！の反
応液を５０℃で１時間攪拌しながらインキュベートした
後、生成グルコースを定量したところ下表に示す結果が
得られた。
＃酸緩衝液、ｐＨ５，０、スポロトリウムセルロフィル
ムへＴＣＣ２０４９３（ＡＪ ６９８７）のセルラーゼ
（蛋白２０■）、及び前述のβ−グルコシダーゼの酵素
液２ ｍｌ （蛋白２■）を含む全容量１０ｍ７！の反
応液を５０℃で１時間攪拌しながらインキュベートした
後、生成グルコースを定量したところ下表に示す結果が
得られた。
酵 素 生成グルコース（■）セルラーゼ
３４ セルラーゼ＋“β−グルコシダーゼ” ５１実施例
２ ストレプトミセス・エスピーＡＪ ９４５７を実施例１
と同様に培養し、得られた菌体から酵素液を得た。
３４ セルラーゼ＋“β−グルコシダーゼ” ５１実施例
２ ストレプトミセス・エスピーＡＪ ９４５７を実施例１
と同様に培養し、得られた菌体から酵素液を得た。
本発明の酵素を用いることによりセルロースから酵素法
でグルコースを効率よくかつ高収率で取得することがで
きる。
でグルコースを効率よくかつ高収率で取得することがで
きる。
第１図及び第２図はいずれも本酵素の至適ｐＨを示す曲
線の図であり、第３図は安定ｐＨ範囲をそして第４図は
熱安定性をそれぞれ示す曲線の図である。第５図は本酵
素と従来の酵素についてグルコース濃度と活性の関係を
示す曲線の図である。 第６図は本酵素をイオン交換クロマトグラフィーで精製
した際の溶離曲線を示す図である。 特許出願人 新燃料油開発技（、トｊ研究組合代理人
弁理士 １）中 政 浩 はか１名ＶｉＡｉｚ５．ｌ、
、ヒ’ ｌ’ｉ ’（’ｉ’ を二 −しパ１−）第１
図 ｐＨ 第２図 ０４↓ □ ｐＨ 第 ３１４ ｐＨ 第４図 ８− て （°Ｃ） 第５図 ７ＩＬフ一人 （Ｍｌ 第６図 手 続 補 正 肉 〈自発） １３！１ｆ４１６１り丁９月８［１ 特許庁艮官 黒 １）ｌ′ｆ１ 雄 殿１事ｎの表示 特願昭６１−１７０８６７号 ２）明の名称 β−グルコシダーぜ及びその製ＴｉＦ去３補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 新燃料油開発技術研究組合 ４代 理 人 居所 〒１０４東京都中央区八丁堀三丁目２）番３−６
０７号電話（０３）５５５−００２２ ５補正の１唖 図面 ６補正の内容
線の図であり、第３図は安定ｐＨ範囲をそして第４図は
熱安定性をそれぞれ示す曲線の図である。第５図は本酵
素と従来の酵素についてグルコース濃度と活性の関係を
示す曲線の図である。 第６図は本酵素をイオン交換クロマトグラフィーで精製
した際の溶離曲線を示す図である。 特許出願人 新燃料油開発技（、トｊ研究組合代理人
弁理士 １）中 政 浩 はか１名ＶｉＡｉｚ５．ｌ、
、ヒ’ ｌ’ｉ ’（’ｉ’ を二 −しパ１−）第１
図 ｐＨ 第２図 ０４↓ □ ｐＨ 第 ３１４ ｐＨ 第４図 ８− て （°Ｃ） 第５図 ７ＩＬフ一人 （Ｍｌ 第６図 手 続 補 正 肉 〈自発） １３！１ｆ４１６１り丁９月８［１ 特許庁艮官 黒 １）ｌ′ｆ１ 雄 殿１事ｎの表示 特願昭６１−１７０８６７号 ２）明の名称 β−グルコシダーぜ及びその製ＴｉＦ去３補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 新燃料油開発技術研究組合 ４代 理 人 居所 〒１０４東京都中央区八丁堀三丁目２）番３−６
０７号電話（０３）５５５−００２２ ５補正の１唖 図面 ６補正の内容
Claims (2)
- （１）１Ｍグルコース存在下の相対活性がグルコース不
在時の６５％以上であるβ−グルコシダーゼ - （２）１Ｍグルコース存在下の相対活性がグルコース不
在時の６５％以上であるβ−グルコシダーゼを産生しう
る能力を有するストレプトミセス属微生物をβ−グルコ
シダーゼ生産培地で培養して培養液中に該β−グルコシ
ダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する１Ｍグルコース存在下の相対活性がグルコース不在
時の６５％以上であるβ−グルコシダーゼの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17086786A JPS6328389A (ja) | 1986-07-22 | 1986-07-22 | β−グルコシダ−ゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17086786A JPS6328389A (ja) | 1986-07-22 | 1986-07-22 | β−グルコシダ−ゼ及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6328389A true JPS6328389A (ja) | 1988-02-06 |
Family
ID=15912783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17086786A Pending JPS6328389A (ja) | 1986-07-22 | 1986-07-22 | β−グルコシダ−ゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6328389A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2706907A1 (en) * | 1993-06-21 | 1994-12-30 | Ifremer | Beta-glucosidase, microorganism producing it and process for obtaining it |
| CN103114100A (zh) * | 2013-02-27 | 2013-05-22 | 广西科学院 | β-葡萄糖苷酶基因S-bgl3及其应用 |
-
1986
- 1986-07-22 JP JP17086786A patent/JPS6328389A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2706907A1 (en) * | 1993-06-21 | 1994-12-30 | Ifremer | Beta-glucosidase, microorganism producing it and process for obtaining it |
| CN103114100A (zh) * | 2013-02-27 | 2013-05-22 | 广西科学院 | β-葡萄糖苷酶基因S-bgl3及其应用 |
| CN103114100B (zh) * | 2013-02-27 | 2014-08-13 | 广西科学院 | β-葡萄糖苷酶基因S-bgl3及其应用 |
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