JPS6328593B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるアルフア−イソプロピル
リンゴ酸の製法に関連する。詳細には、酵母の新
菌株、ヤロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）を、同化のできる炭素、窒素及びＬ
−ロイシン源、無機塩を含有する水性培地中好気
的深部培養条件下で培養しアルフア−イソプロピ
ルリンゴ酸を製造する方法及び、培養培地中か
ら、アルフア−イソプロピルリンゴ酸を回収する
改良法に関連する。 ロイシン要求性変異株ニユーロスポラ クラツ
サ（Neurospora Crassa）の培養培地から、ア
ルフア−イソプロピルリンゴ酸を単離する方法は
Burns等によるBiochemistry ２、1053（1963）
及びCalvo等によるBiochemistry ３、2044
（1964）中に報告されている。 ロイシン要求性変異株（生長因子を要する変異
株、auxotrophs）サツカロマイセス セレビシ
ア（Saccharomyces cerevisiae）の代謝産物と
してアルフア−イソプロピルリンゴ酸〔ベータ−
カルボキシ−ベータ−ヒドロキシイソカプロン酸
又はＳ（−）−２−ヒドロキシ−２−（１−メチル
エチル）ブタンジオイツク アシド）の蓄積、及
びそれを含む培養培地を酸性にし、エーテル抽出
による単離に関しては、SaiによるAgr.Biol.
Chem.32、522−４（1968）中に報告されている。 トルロプシス ウテイリス（Torulopsis
utilis）におけるロイシン生合成の前駆体として、
生成にロイシンを必要とするバクテリア、及びカ
ビの数菌株における代謝産物としてアルフア−イ
ソプロピルリンゴ酸の発見に関する参考文献の一
部はSaiにより報告されている（上記引用文献）。 1979年10月19日認可のフランス特許2417548に
はブレビバクテリウム（Brevibacterium）又は
コリネバクテリウム（Corynebacterium）種の好
気的培養によりアルフア−イソプロピルリンゴ酸
の製造について記載されている。 Fultz等はJ.Bacteriol.142、513−520（1980）に
おいて、一連のP22−介在、人工的抗原変換によ
り二種のサルモネラ テイフイムリウム
（Salmonella typhimurium）菌株の調製を報告
している。一方の菌株は、アルフア−イソプロピ
ルリンゴ酸のみを蓄積、排泄する。培養液から単
離できる上述酸の量は、ニユーロスポラ クラツ
サ（Neurospora Crassa）から得られる量の５
倍以上である。他の菌株は、アルフア−及びベー
タ−イソプロピルリンゴ酸を蓄積、排泄する。 アルフア−イソプロピルリンゴ酸はMiKami等
により、Agr.Biol.Chem.34(6)、977−９（1970）
に、植物成長調節因子として報告されている。
1970年10月23日の日本特許70032919（Chem.
Absti.75、31511V、1971）にはタバコの香りを
改良するための使用を記述されている。1977年９
月24日発行の日本特許公開77113945中には、タバ
コの香り修正剤、２−イソプロピル−４，４−ジ
メチル−５−メチレン−２−シクロペンテン−１
−オン及び２，５−ジイソプロピル−２−シクロ
ペンテン−１−オンの乾燥蒸留による製造中間体
としての使用を記載している（Chem.Abstr.88、
62045u、1978）。1979年12月13日発行のドイツ
Offenlegungsschrift、2922222中には石膏の固形
化抑制剤としての使用及びそのナトリウム、アン
モニウム塩の使用を記載している。 本発明は既知微生物により製造せしめるより
も、実質的に多量のアルフア−イソプロピルリン
ゴ酸を製造するための発酵法及びそれを含有する
培養液中からアルフア−イソプロピルリンゴ酸を
単離するための改良法を供給する。 発酵工程はＬ−ロイシンを要求する変異株、ヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）新菌株、ATCC 20628を、同化の出
来る炭素、窒素、Ｌ−ロイシン源及び無機塩を含
む栄養培養液中、好気的深部培養し、培養液中に
実質的な量のアルフア−イソプロピルリンゴ酸を
蓄積せしめる事を特徴としている。 アルフア−イソプロピルリンゴ酸を、それを含
む培養液中から単離する改良法は、培養液を浄化
し酸性にした後、メチルエチルケトンで抽出する
事を特徴としている。 本発明の方法によれば、培養液での効力は従来
報告されている多くの方法に比べ10倍高く、発
酵／単離工程を合わせると、従来の方法より30倍
の高収率が得られる。 アルフア−イソプロピルリンゴ酸のみを独占的
に製造するための本発明の発酵工程は新菌株、ヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）を初期のPH、約6.0〜7.0（PH6.0〜6.5が
好適）の栄養培養液中好気的条件下で培養する事
を特徴とする。本新菌株はアメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨン（American Type
Culture Collection）メリーランド州、ロツクビ
ルで保存されており、この保存所はその保存の永
続性が認められており、もし特許が許可されれ
ば、容易に一般に入手が出来る。本微生物は、ヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）ATCC20628と命名された。1987年11
月17日付でブダペスト条約下での寄託として再寄
託された。米国特許商標庁の長官により、
37CFR1114及び35USC122のもとに権利を与えら
れたものと本申請との係属中に、本微生物の取得
は可能である。保存された微生物の一般への取得
に関する全ての制限は、特許の許可により最終的
に除去される。 新菌株ヤロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）ATCC20628はフアイザー・インコ
ーポレーテツドのカルチヤーコレクシヨン
（Pfizer Inc.Culture Collection）において
PC30781として決定されている。培養物の分類研
究（下記）は「The Yeast」第２版、N.Holland
Publishing Co.、アムステルダム、1970、中に
Lodderにより紹介された如く、J.R.DeZeeuw及
びI.Staskoにより行われたが、この場合培地に関
して、全ての合成培地は、アミノ酸補足としてＬ
−ロイシンエチルエステル塩酸塩を149mg／リツ
トル含有している。 【表】 どの菌株も37℃で生育しないが、6.7ｇ／リツ
トルのBacto−イースト窒素源、200mcg／リツ
トルの塩酸チアミン、149mg／リツトルのＬ−ロ
イシンエチルエステル塩酸塩、5.0ｇ／リツトル
のＤ−グルコースを含む培養液中28℃で良く生育
する。各菌株は成長にチアミン要求性である。
又、各々、硫酸アンモニウム、及び尿素を同化す
る。 Ｃ．リポリテイカ（Ｃ．lipolytica）CBS599、
PC30781との比較分類により、ATCC 20628はヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）の菌株である。 栄養培養液は、同化の出来る炭素、窒素、Ｌ−
ロイシン源及び無機塩を含有せねばならない。代
表的な炭素源は、Ｄ−グルコース、グリセロー
ル、Ｄ−マンニトール、トウモロコシデンプン加
水分解物、酵素的に加水分解したトウモロコシ粉
及びトウモロコシひきわり粉の如き、炭水化物；
白色グリース、トウモロコシ油の如き、脂肪及び
油；ｎ−ヘキサデカン及びｎ−パラフイン混合物
（C12-16の範囲、Exxon Chemical社、Baytown、
Texas、で入手可能）の如き、ｎ−パラフインで
ある。好適な炭素源はＤ−グルコース、トウモロ
コシデンプン加水分解物、トウモロコシ粉加水分
解物であり、この炭素源の量は、そのグルコース
等価量で計算した価であり、アルフア−イソプロ
ピルリンゴ酸の至適収率を得る。炭素源は一般に
グルコース含有量又は等価量に基ずいて、約80〜
100ｇ／リツトルを用いる。 好適な窒素源は大豆加水分解物、カゼインの酵
素分解物、イースト抽出物、尿素、硫酸アンモニ
ウム、トウモロコシ浸出液（CSL）、アミノ酸及
びペプトンである。成長物質源として、醸造家の
可溶成分、イースト抽出物、糖蜜抽出残サ、及
び、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム
（緩衝液としても使用）、の如きミネラル塩、亜
鉛、鉄、銅の如き微量ミネラル、が成長に有益で
ある。さらに、チアミン、（通常塩酸として使用）
の如き特定のビタミンが良好な成長に必要であ
る。 培地の必須物質はＬ−ロイシン源である。Ｌ−
ロイシンはそのまま、又は前駆体の形で加える事
が出来る。すなわち、前駆体とは培養中にＬ−ロ
イシン源に変換される物質である。代表的なＬ−
ロイシン前駆体はロイシン含有ペプチド又はタン
パク質加水分解物、例えば大豆粉である。Ｌ−ロ
イシン又はその前駆体の濃度は、そのＬ−ロイシ
ン等価量に基ずいて計算し、約0.2〜5.0ｇ／リツ
トル（培地）を用いるとアルフア−イソプロピル
リンゴ酸の好適な製造量を得るのに有益である。
Ｌ−ロイシン又は、その前駆体の好適濃度はＬ−
ロイシンに換算して、0.5〜1.0ｇ／リツトルであ
る。良好なＬ−ロイシン源はＬ−ロイシンそのも
のである。 上述の如く、培養は好気的培養である。好気的
培養の多くの方式が用いられるが通気制御方式が
良好である。例えば、空気中培養液を撹拌する
か、培養液中に空気を導入する。約24〜30℃で培
養するが28℃が好適である。 シリコン、植物油、非イオン性界面活性剤、特
に、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイ
ドのブロツク重合体の如き消泡剤を培養液中に加
えて、泡立ちを制御する。 培養に必要な接種物はヤロウイア リポリテイ
カ（Yarrowia lipolytica）ATCC20628を培養
したスラントから生成した細胞を取り出して得
る。スラント培養に適当な固形培地は次のとおり
である。 バクト（Bacto）−ペプトン 25.0ｇ／リツトル バクト−栄養培地 8.0ｇ／リツトル バクト−イースト抽出物 5.0ｇ／リツトル Ｄ−グルコース 5.0ｇ／リツトル ゲンタマイシン 50.0mg／リツトル 寒 天 20.0ｇ／リツトル ヤロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）をスラントに接種し、28℃で24時間
インキユベートする。生育した細胞を取り上述の
培地で寒天のみ含まない培養液を入れた管、又は
振とうフラスコ中に接種する。これを回転式振と
う機で28℃、22時間インキユベートする。こうし
て得られた生長細胞を大量培養器中に接種する。
例えば生長に必要な適当な培地（例えばここに示
した培地）を含む４リツトルの培養容器を用い
る。これを24−28℃で９日間、通気速度２リツト
ル分／容器の割合で培養する。この場合常時無菌
状態を保つ。 培養終了後、培養液のPHを約1.0〜2.0（硫酸、
塩酸の如き、鉱酸を加えてPH1.5にするのが好適
である）にし、アルフア−イソプロピルリンゴ酸
を得る。酸性にした培養液を１〜２時間撹拌し、
次に過する。過した培養液をメチルエチルケ
トンで抽出し、留去してアルフア−イソプロピル
リンゴ酸を得る。抽出後の培養液を上述の如く、
もう１度抽出して、更に生成物を得る事が出来
る。 培養液はアルフア−イソプロピルリンゴ酸を得
る前に過する必要はない。しかし抽出の前に
過すると収得工程が簡単になる。 水に不溶の、メチルイソブチルケトン、ｎ−ブ
タノール、イソブタノール、酢酸エチル、の如き
溶媒も、使用できる。しかしながら、メチルエチ
ケトンは、操作が安全で、抽出液の濃縮により、
結晶性のアルフア−イソプロピルリンゴ酸が容易
に得られるので好適である。 本発明は、上の記述に十分付号し、例示した目
的のためのみに、上述の微生物を用いる事を制限
するものではない事を理解されたい。天然産、又
は、Ｘ線照射、紫外線照射、ナイトロージエンマ
スタード処理の如き、手段による上述微生物の人
工的変異株及び／又は変種の使用をも、本発明の
範囲に含まれる事が特に望ましく、そのように企
図している。 外観、又は生理学的挙動にかかわらず、ここに
述べた種から得られる核酸もしくはその等価物を
用い変換、人工的抗原変換、遺伝子組み換え、又
はその他の遺伝的方法等、ここに述べた生産物を
製造し、生化学的変化を行わせる事のできる能力
を得るための手法により開発出来る多くの微生物
を本発明の範囲内に包含させたい。 実施例 １ Ｄ−グルコースを炭素源としたアルフア−イソ
プロピルリンゴ酸の製造及び回収。 培養物の製造 基準凍結乾燥管中のヤロウイア リポリテイカ
（Yarrowia lipolytica）ATCC20628の固形物を
1.0mlの無菌水中に懸濁させる。次にBacto−寒
天（20ｇ／リツトル）で固形化した培地Ａを25×
150mmの試験管に全17mlずつ入れたスラントに上
述懸濁液を0.2mlずつ接種する。 培地Ａ バクト−ペプトン 2.5.0ｇ／リツトル バクト−栄養培地 8.0ｇ／リツトル バクト−イースト抽出物 5.0ｇ／リツトル Ｄ−グルコース 5.0ｇ／リツトル ゲンタマイシン 0.05mg／リツトル 培地のPHは6.8−6.9である。混合物をオートク
レーブで30分間1.02気圧（15psi）で滅菌するが、
グルコースは別に滅菌する。 接種物を製造する前に、スラントを24時間28℃
でインキユベートする。 接種物の製造 上述で製造したスラントを20mlの無菌蒸留水で
洗浄する。細胞懸濁物を、10mlの培地Ａを含む70
本の試験管（25×150mm）中に各々0.2mlずつ接種
する。綿栓した試験管を28℃で22時間、200回
転／分（rpm）で、１回転2.54cm（１インチ）の
回転振とう機で30゜の角度でインキユベートする。
次に試験管からの成長菌を集めてプールする。 発酵培養 次の培養培地を製造する （NH4）2SO4 4.0ｇ／リツトル トウモロコシ浸出液 5.0ｇ／リツトル KH2PO4 0.5ｇ／リツトル MgSO4・7H2O 0.25ｇ／リツトル CaCO3（マーブル白） 15.0ｇ／リツトル Ｌ−ロイシン 1.0ｇ／リツトル 塩酸チアミン 400.0mcg／リツトル 水道水 加えて80％容量にする （PH＝6.1−6.2） Ｄ−グルコースを除く全ての成分を最終容量の
80％になるように混合する。これを1600mlずつ４
リツトル培養容器８個に撹拌下加え1.02気圧
（15psi）で30分間滅菌する。50％（Ｗ／Ｖ）のＤ
−グルコース溶液を別に、15psi（1.02気圧）で30
分間オートクレーブで滅菌し、400ml／容器の割
合で各容器に入れる。Pluronic Ｌ−81〔BASF
Wyandotteから入手した、平均分子量2750のポ
リ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）
の非イオン性界面活性剤〕、1.0ml／容器（上述の
如く滅菌）を消泡剤として加える。 上述でプールした接種物を80mlずつ加え、26℃
で９日間1750rpmで２リツトル／分／容器の通気
で撹拌培養する。 培地浄化 各培養溶器からの培養液を合併し（PH4.13）、
濃硫酸を加えてPH1.5にし、１時間撹拌する。こ
れを真空下過し、11.55リツトルの透明培養液
が得られる。（検定のための50ml中には、アルフ
ア−イソプロピルリンゴ酸量が42.8mg／ml含有さ
れ、全体で494.3ｇ） アルフア−イソプロピルリンゴ酸の回収 上述で浄化した培養液（11.5リツトル）を等量
のメチルエチルケトンで抽出し、抽出液を減圧下
ロータリーエバポレーターを用い、水浴40〜41℃
で留去する。最初に抽出した培養液、PH1.77に硫
酸を加えてPH1.5にし、真空下過する。液を、
水で飽和した等量のメチルエチルケトンで抽出
し、上述の如く溶媒留去する。二回抽出した培養
液（PH1.57）を硫酸でPH1.5にし、水で飽和した
等量のメチルエチルケトンで抽出し上記の如く溶
媒留去する。濃縮した抽出物を合併し（全量1800
ml）13.0ｇの活性炭で処理して脱色し、得られた
透明な、こはく色溶液を減圧下70℃で濃縮し一部
固形化する。これを１リツトルビーカーに移し、
85℃で十分量の水を加え溶液にする。溶液を撹拌
し、室温にまで冷却する。室温で一晩放置後、結
晶したアルフア−イソプロピルリンゴ酸を真空
過し、少量の冷水で洗浄する。結晶を蒸気熱容器
中で１晩乾燥し、381.9ｇの無色結晶を得る。 合併した母液及び洗浄液を70℃で真空下濃縮
し、濃縮物を上述の如く操作し、62.9ｇの淡褐色
結晶を得る。この母液と洗浄液を、更に真空下濃
縮し、粘性液を得るが結晶化しない。この中には
24.8ｇのアルフア−イソプロピルリンゴ酸が含ま
れる。11.5リツトルの浄化培養液から得たアルフ
ア−イソプロピルリンゴ酸の全量は469.6ｇであ
る。 合併した抽出後の培地中には1.38mg／mlのアル
フア−イソプロピルリンゴ酸が含有し、全体で
17.9ｇが含有している。 生成物のアルフア−イソプロピルリンゴ酸〔Ｓ
（−）−２−ヒドロキシ−２−（１−メチルエチル）
ブタン ジオイツク アシド〕としての同定は、
ニユーロスポラ クラツサ（Neurospora
crassa）で製造されたアルフア−イソプロピルリ
ンゴ酸の融点、IR、 13C−NMR、 1H−NMR
により比較、決定した。 実施例 ２ アルフア−イソプロピルリンゴ酸の製造及び回
収−トウモロコシ粉炭素源培養 実施例１の如く製した接種物を次の組成の培地
を入れた培養容器（４リツトル）中に入れる。 粗トウモロコシシロツプ（263mgＤ−グルコー
ス／ｇを含む） 380.0ｇ／リツトル トウモロコシ浸出液 5.0ｇ／リツトル （NH4）2SO4 4.0ｇ／リツトル KH2PO4 0.5ｇ／リツトル MgSO4・7H2O 0.25ｇ／リツトル CaCO3（マーブル白） 15.0ｇ／リツトル Ｌ−ロイシン 1.0ｇ／リツトル 塩酸チアミン 400.0mcg／リツトル プルロニツク（Pluronic）Ｌ−81
0.5ml／リツトル 水道水 （PH＝6.1−6.2） ４リツトル容器８個に、760ｇの粗トウモロコ
シシロツプを入れ水と共に1000mlにし、水酸化カ
リウムでPH6.1にする。炭酸カルシウム（30.0
ｇ）、水500mlを加え、1.02気圧（15psi）で30分
間滅菌する。残りの成分（プルロニツク、Ｌ−81
以外）を最終容量の25％にし、500mlずつ別々に
1.02気圧（15psi）で30分間滅菌し、各容器に加
える。PluronicL−81を上述の如く滅菌し、各容
器に１mlずつ加える。 各容器を、実施例１の方法に従い接種物80mlと
インキユベートする。 培地浄化及び回収 ４個の容器からの培養液を実施例１の方法に従
い浄化し6.2リツトルの透明培地を得、これを検
定するとアルフア−イソプロピルリンゴ酸が39.7
ｇ／リツトル含有する。 実施例１の方法に従い6.19リツトルの浄化培養
液から238.5ｇのアルフア−イソプロピルリンゴ
酸を得る。合併した抽出後培養液（8500ml）中に
0.98mg／mlが含有し全体として、この中に、8.3
ｇのアルフア−イソプロピルリンゴ酸が含有して
いる。 検定法 （Calvo等、Anal.Biochem.28、164−181、
1969、の方法を適応）。 アルフア−IDM含有培養物 培養液10mlを希硫酸でPH1.5にし、十分量の蒸
留水を加えて全50mlにする。この一部（10〜20
ml）を遠心して透明溶液にし、５mlを取つて５ml
の緩衝液（0.2MNa2SO4、0.2MH2SO4でPH1.5に
調節）と混合する。 緩衝化した溶液４mlをクリンエリユート・デイ
スポーザル・抽出カラム（ClinElut Disposable
Extraction Column）（Fisher Scientific社、
Pittsburgh、PA.、カタログNo.1005）にチヤージ
する。試料を３分間カラム上に吸着させ、８mlの
メチルエチルケトン（MEK）をゆつくり自然通
過させる。溶出液を25mlのVolumetricフラスコ
に取る。更に２回、８mlのMEKを通過させ、溶
出液を合併し、MEKを加えて25mlにする。 溶出液1.0ml試料を試験管中で、窒素気流下、
65℃で留去する。残サに0.4mlの95％濃硫酸を加
え、30℃の水浴中で20分インキユベートし冷却す
る。次に0.25mlの1.84M冷却レゾルシノール水溶
液を加え30℃の水浴中30分間インキユベートす
る。9.35mlの水を加え、出来た溶液の0.1mlをPH
10.0緩衝液（0.1MH3BO3−0.4MNa2CO3）で希
釈して10mlとし、アミンコ・ボーマン（Aminco
−Bowman）測定機を用い、最高螢光度360nｍ
（励起）453nｍ（放出）に設定して螢光測定し基
準物の強度と比較する。
リンゴ酸の製法に関連する。詳細には、酵母の新
菌株、ヤロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）を、同化のできる炭素、窒素及びＬ
−ロイシン源、無機塩を含有する水性培地中好気
的深部培養条件下で培養しアルフア−イソプロピ
ルリンゴ酸を製造する方法及び、培養培地中か
ら、アルフア−イソプロピルリンゴ酸を回収する
改良法に関連する。 ロイシン要求性変異株ニユーロスポラ クラツ
サ（Neurospora Crassa）の培養培地から、ア
ルフア−イソプロピルリンゴ酸を単離する方法は
Burns等によるBiochemistry ２、1053（1963）
及びCalvo等によるBiochemistry ３、2044
（1964）中に報告されている。 ロイシン要求性変異株（生長因子を要する変異
株、auxotrophs）サツカロマイセス セレビシ
ア（Saccharomyces cerevisiae）の代謝産物と
してアルフア−イソプロピルリンゴ酸〔ベータ−
カルボキシ−ベータ−ヒドロキシイソカプロン酸
又はＳ（−）−２−ヒドロキシ−２−（１−メチル
エチル）ブタンジオイツク アシド）の蓄積、及
びそれを含む培養培地を酸性にし、エーテル抽出
による単離に関しては、SaiによるAgr.Biol.
Chem.32、522−４（1968）中に報告されている。 トルロプシス ウテイリス（Torulopsis
utilis）におけるロイシン生合成の前駆体として、
生成にロイシンを必要とするバクテリア、及びカ
ビの数菌株における代謝産物としてアルフア−イ
ソプロピルリンゴ酸の発見に関する参考文献の一
部はSaiにより報告されている（上記引用文献）。 1979年10月19日認可のフランス特許2417548に
はブレビバクテリウム（Brevibacterium）又は
コリネバクテリウム（Corynebacterium）種の好
気的培養によりアルフア−イソプロピルリンゴ酸
の製造について記載されている。 Fultz等はJ.Bacteriol.142、513−520（1980）に
おいて、一連のP22−介在、人工的抗原変換によ
り二種のサルモネラ テイフイムリウム
（Salmonella typhimurium）菌株の調製を報告
している。一方の菌株は、アルフア−イソプロピ
ルリンゴ酸のみを蓄積、排泄する。培養液から単
離できる上述酸の量は、ニユーロスポラ クラツ
サ（Neurospora Crassa）から得られる量の５
倍以上である。他の菌株は、アルフア−及びベー
タ−イソプロピルリンゴ酸を蓄積、排泄する。 アルフア−イソプロピルリンゴ酸はMiKami等
により、Agr.Biol.Chem.34(6)、977−９（1970）
に、植物成長調節因子として報告されている。
1970年10月23日の日本特許70032919（Chem.
Absti.75、31511V、1971）にはタバコの香りを
改良するための使用を記述されている。1977年９
月24日発行の日本特許公開77113945中には、タバ
コの香り修正剤、２−イソプロピル−４，４−ジ
メチル−５−メチレン−２−シクロペンテン−１
−オン及び２，５−ジイソプロピル−２−シクロ
ペンテン−１−オンの乾燥蒸留による製造中間体
としての使用を記載している（Chem.Abstr.88、
62045u、1978）。1979年12月13日発行のドイツ
Offenlegungsschrift、2922222中には石膏の固形
化抑制剤としての使用及びそのナトリウム、アン
モニウム塩の使用を記載している。 本発明は既知微生物により製造せしめるより
も、実質的に多量のアルフア−イソプロピルリン
ゴ酸を製造するための発酵法及びそれを含有する
培養液中からアルフア−イソプロピルリンゴ酸を
単離するための改良法を供給する。 発酵工程はＬ−ロイシンを要求する変異株、ヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）新菌株、ATCC 20628を、同化の出
来る炭素、窒素、Ｌ−ロイシン源及び無機塩を含
む栄養培養液中、好気的深部培養し、培養液中に
実質的な量のアルフア−イソプロピルリンゴ酸を
蓄積せしめる事を特徴としている。 アルフア−イソプロピルリンゴ酸を、それを含
む培養液中から単離する改良法は、培養液を浄化
し酸性にした後、メチルエチルケトンで抽出する
事を特徴としている。 本発明の方法によれば、培養液での効力は従来
報告されている多くの方法に比べ10倍高く、発
酵／単離工程を合わせると、従来の方法より30倍
の高収率が得られる。 アルフア−イソプロピルリンゴ酸のみを独占的
に製造するための本発明の発酵工程は新菌株、ヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）を初期のPH、約6.0〜7.0（PH6.0〜6.5が
好適）の栄養培養液中好気的条件下で培養する事
を特徴とする。本新菌株はアメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨン（American Type
Culture Collection）メリーランド州、ロツクビ
ルで保存されており、この保存所はその保存の永
続性が認められており、もし特許が許可されれ
ば、容易に一般に入手が出来る。本微生物は、ヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）ATCC20628と命名された。1987年11
月17日付でブダペスト条約下での寄託として再寄
託された。米国特許商標庁の長官により、
37CFR1114及び35USC122のもとに権利を与えら
れたものと本申請との係属中に、本微生物の取得
は可能である。保存された微生物の一般への取得
に関する全ての制限は、特許の許可により最終的
に除去される。 新菌株ヤロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）ATCC20628はフアイザー・インコ
ーポレーテツドのカルチヤーコレクシヨン
（Pfizer Inc.Culture Collection）において
PC30781として決定されている。培養物の分類研
究（下記）は「The Yeast」第２版、N.Holland
Publishing Co.、アムステルダム、1970、中に
Lodderにより紹介された如く、J.R.DeZeeuw及
びI.Staskoにより行われたが、この場合培地に関
して、全ての合成培地は、アミノ酸補足としてＬ
−ロイシンエチルエステル塩酸塩を149mg／リツ
トル含有している。 【表】 どの菌株も37℃で生育しないが、6.7ｇ／リツ
トルのBacto−イースト窒素源、200mcg／リツ
トルの塩酸チアミン、149mg／リツトルのＬ−ロ
イシンエチルエステル塩酸塩、5.0ｇ／リツトル
のＤ−グルコースを含む培養液中28℃で良く生育
する。各菌株は成長にチアミン要求性である。
又、各々、硫酸アンモニウム、及び尿素を同化す
る。 Ｃ．リポリテイカ（Ｃ．lipolytica）CBS599、
PC30781との比較分類により、ATCC 20628はヤ
ロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）の菌株である。 栄養培養液は、同化の出来る炭素、窒素、Ｌ−
ロイシン源及び無機塩を含有せねばならない。代
表的な炭素源は、Ｄ−グルコース、グリセロー
ル、Ｄ−マンニトール、トウモロコシデンプン加
水分解物、酵素的に加水分解したトウモロコシ粉
及びトウモロコシひきわり粉の如き、炭水化物；
白色グリース、トウモロコシ油の如き、脂肪及び
油；ｎ−ヘキサデカン及びｎ−パラフイン混合物
（C12-16の範囲、Exxon Chemical社、Baytown、
Texas、で入手可能）の如き、ｎ−パラフインで
ある。好適な炭素源はＤ−グルコース、トウモロ
コシデンプン加水分解物、トウモロコシ粉加水分
解物であり、この炭素源の量は、そのグルコース
等価量で計算した価であり、アルフア−イソプロ
ピルリンゴ酸の至適収率を得る。炭素源は一般に
グルコース含有量又は等価量に基ずいて、約80〜
100ｇ／リツトルを用いる。 好適な窒素源は大豆加水分解物、カゼインの酵
素分解物、イースト抽出物、尿素、硫酸アンモニ
ウム、トウモロコシ浸出液（CSL）、アミノ酸及
びペプトンである。成長物質源として、醸造家の
可溶成分、イースト抽出物、糖蜜抽出残サ、及
び、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム
（緩衝液としても使用）、の如きミネラル塩、亜
鉛、鉄、銅の如き微量ミネラル、が成長に有益で
ある。さらに、チアミン、（通常塩酸として使用）
の如き特定のビタミンが良好な成長に必要であ
る。 培地の必須物質はＬ−ロイシン源である。Ｌ−
ロイシンはそのまま、又は前駆体の形で加える事
が出来る。すなわち、前駆体とは培養中にＬ−ロ
イシン源に変換される物質である。代表的なＬ−
ロイシン前駆体はロイシン含有ペプチド又はタン
パク質加水分解物、例えば大豆粉である。Ｌ−ロ
イシン又はその前駆体の濃度は、そのＬ−ロイシ
ン等価量に基ずいて計算し、約0.2〜5.0ｇ／リツ
トル（培地）を用いるとアルフア−イソプロピル
リンゴ酸の好適な製造量を得るのに有益である。
Ｌ−ロイシン又は、その前駆体の好適濃度はＬ−
ロイシンに換算して、0.5〜1.0ｇ／リツトルであ
る。良好なＬ−ロイシン源はＬ−ロイシンそのも
のである。 上述の如く、培養は好気的培養である。好気的
培養の多くの方式が用いられるが通気制御方式が
良好である。例えば、空気中培養液を撹拌する
か、培養液中に空気を導入する。約24〜30℃で培
養するが28℃が好適である。 シリコン、植物油、非イオン性界面活性剤、特
に、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイ
ドのブロツク重合体の如き消泡剤を培養液中に加
えて、泡立ちを制御する。 培養に必要な接種物はヤロウイア リポリテイ
カ（Yarrowia lipolytica）ATCC20628を培養
したスラントから生成した細胞を取り出して得
る。スラント培養に適当な固形培地は次のとおり
である。 バクト（Bacto）−ペプトン 25.0ｇ／リツトル バクト−栄養培地 8.0ｇ／リツトル バクト−イースト抽出物 5.0ｇ／リツトル Ｄ−グルコース 5.0ｇ／リツトル ゲンタマイシン 50.0mg／リツトル 寒 天 20.0ｇ／リツトル ヤロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）をスラントに接種し、28℃で24時間
インキユベートする。生育した細胞を取り上述の
培地で寒天のみ含まない培養液を入れた管、又は
振とうフラスコ中に接種する。これを回転式振と
う機で28℃、22時間インキユベートする。こうし
て得られた生長細胞を大量培養器中に接種する。
例えば生長に必要な適当な培地（例えばここに示
した培地）を含む４リツトルの培養容器を用い
る。これを24−28℃で９日間、通気速度２リツト
ル分／容器の割合で培養する。この場合常時無菌
状態を保つ。 培養終了後、培養液のPHを約1.0〜2.0（硫酸、
塩酸の如き、鉱酸を加えてPH1.5にするのが好適
である）にし、アルフア−イソプロピルリンゴ酸
を得る。酸性にした培養液を１〜２時間撹拌し、
次に過する。過した培養液をメチルエチルケ
トンで抽出し、留去してアルフア−イソプロピル
リンゴ酸を得る。抽出後の培養液を上述の如く、
もう１度抽出して、更に生成物を得る事が出来
る。 培養液はアルフア−イソプロピルリンゴ酸を得
る前に過する必要はない。しかし抽出の前に
過すると収得工程が簡単になる。 水に不溶の、メチルイソブチルケトン、ｎ−ブ
タノール、イソブタノール、酢酸エチル、の如き
溶媒も、使用できる。しかしながら、メチルエチ
ケトンは、操作が安全で、抽出液の濃縮により、
結晶性のアルフア−イソプロピルリンゴ酸が容易
に得られるので好適である。 本発明は、上の記述に十分付号し、例示した目
的のためのみに、上述の微生物を用いる事を制限
するものではない事を理解されたい。天然産、又
は、Ｘ線照射、紫外線照射、ナイトロージエンマ
スタード処理の如き、手段による上述微生物の人
工的変異株及び／又は変種の使用をも、本発明の
範囲に含まれる事が特に望ましく、そのように企
図している。 外観、又は生理学的挙動にかかわらず、ここに
述べた種から得られる核酸もしくはその等価物を
用い変換、人工的抗原変換、遺伝子組み換え、又
はその他の遺伝的方法等、ここに述べた生産物を
製造し、生化学的変化を行わせる事のできる能力
を得るための手法により開発出来る多くの微生物
を本発明の範囲内に包含させたい。 実施例 １ Ｄ−グルコースを炭素源としたアルフア−イソ
プロピルリンゴ酸の製造及び回収。 培養物の製造 基準凍結乾燥管中のヤロウイア リポリテイカ
（Yarrowia lipolytica）ATCC20628の固形物を
1.0mlの無菌水中に懸濁させる。次にBacto−寒
天（20ｇ／リツトル）で固形化した培地Ａを25×
150mmの試験管に全17mlずつ入れたスラントに上
述懸濁液を0.2mlずつ接種する。 培地Ａ バクト−ペプトン 2.5.0ｇ／リツトル バクト−栄養培地 8.0ｇ／リツトル バクト−イースト抽出物 5.0ｇ／リツトル Ｄ−グルコース 5.0ｇ／リツトル ゲンタマイシン 0.05mg／リツトル 培地のPHは6.8−6.9である。混合物をオートク
レーブで30分間1.02気圧（15psi）で滅菌するが、
グルコースは別に滅菌する。 接種物を製造する前に、スラントを24時間28℃
でインキユベートする。 接種物の製造 上述で製造したスラントを20mlの無菌蒸留水で
洗浄する。細胞懸濁物を、10mlの培地Ａを含む70
本の試験管（25×150mm）中に各々0.2mlずつ接種
する。綿栓した試験管を28℃で22時間、200回
転／分（rpm）で、１回転2.54cm（１インチ）の
回転振とう機で30゜の角度でインキユベートする。
次に試験管からの成長菌を集めてプールする。 発酵培養 次の培養培地を製造する （NH4）2SO4 4.0ｇ／リツトル トウモロコシ浸出液 5.0ｇ／リツトル KH2PO4 0.5ｇ／リツトル MgSO4・7H2O 0.25ｇ／リツトル CaCO3（マーブル白） 15.0ｇ／リツトル Ｌ−ロイシン 1.0ｇ／リツトル 塩酸チアミン 400.0mcg／リツトル 水道水 加えて80％容量にする （PH＝6.1−6.2） Ｄ−グルコースを除く全ての成分を最終容量の
80％になるように混合する。これを1600mlずつ４
リツトル培養容器８個に撹拌下加え1.02気圧
（15psi）で30分間滅菌する。50％（Ｗ／Ｖ）のＤ
−グルコース溶液を別に、15psi（1.02気圧）で30
分間オートクレーブで滅菌し、400ml／容器の割
合で各容器に入れる。Pluronic Ｌ−81〔BASF
Wyandotteから入手した、平均分子量2750のポ
リ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）
の非イオン性界面活性剤〕、1.0ml／容器（上述の
如く滅菌）を消泡剤として加える。 上述でプールした接種物を80mlずつ加え、26℃
で９日間1750rpmで２リツトル／分／容器の通気
で撹拌培養する。 培地浄化 各培養溶器からの培養液を合併し（PH4.13）、
濃硫酸を加えてPH1.5にし、１時間撹拌する。こ
れを真空下過し、11.55リツトルの透明培養液
が得られる。（検定のための50ml中には、アルフ
ア−イソプロピルリンゴ酸量が42.8mg／ml含有さ
れ、全体で494.3ｇ） アルフア−イソプロピルリンゴ酸の回収 上述で浄化した培養液（11.5リツトル）を等量
のメチルエチルケトンで抽出し、抽出液を減圧下
ロータリーエバポレーターを用い、水浴40〜41℃
で留去する。最初に抽出した培養液、PH1.77に硫
酸を加えてPH1.5にし、真空下過する。液を、
水で飽和した等量のメチルエチルケトンで抽出
し、上述の如く溶媒留去する。二回抽出した培養
液（PH1.57）を硫酸でPH1.5にし、水で飽和した
等量のメチルエチルケトンで抽出し上記の如く溶
媒留去する。濃縮した抽出物を合併し（全量1800
ml）13.0ｇの活性炭で処理して脱色し、得られた
透明な、こはく色溶液を減圧下70℃で濃縮し一部
固形化する。これを１リツトルビーカーに移し、
85℃で十分量の水を加え溶液にする。溶液を撹拌
し、室温にまで冷却する。室温で一晩放置後、結
晶したアルフア−イソプロピルリンゴ酸を真空
過し、少量の冷水で洗浄する。結晶を蒸気熱容器
中で１晩乾燥し、381.9ｇの無色結晶を得る。 合併した母液及び洗浄液を70℃で真空下濃縮
し、濃縮物を上述の如く操作し、62.9ｇの淡褐色
結晶を得る。この母液と洗浄液を、更に真空下濃
縮し、粘性液を得るが結晶化しない。この中には
24.8ｇのアルフア−イソプロピルリンゴ酸が含ま
れる。11.5リツトルの浄化培養液から得たアルフ
ア−イソプロピルリンゴ酸の全量は469.6ｇであ
る。 合併した抽出後の培地中には1.38mg／mlのアル
フア−イソプロピルリンゴ酸が含有し、全体で
17.9ｇが含有している。 生成物のアルフア−イソプロピルリンゴ酸〔Ｓ
（−）−２−ヒドロキシ−２−（１−メチルエチル）
ブタン ジオイツク アシド〕としての同定は、
ニユーロスポラ クラツサ（Neurospora
crassa）で製造されたアルフア−イソプロピルリ
ンゴ酸の融点、IR、 13C−NMR、 1H−NMR
により比較、決定した。 実施例 ２ アルフア−イソプロピルリンゴ酸の製造及び回
収−トウモロコシ粉炭素源培養 実施例１の如く製した接種物を次の組成の培地
を入れた培養容器（４リツトル）中に入れる。 粗トウモロコシシロツプ（263mgＤ−グルコー
ス／ｇを含む） 380.0ｇ／リツトル トウモロコシ浸出液 5.0ｇ／リツトル （NH4）2SO4 4.0ｇ／リツトル KH2PO4 0.5ｇ／リツトル MgSO4・7H2O 0.25ｇ／リツトル CaCO3（マーブル白） 15.0ｇ／リツトル Ｌ−ロイシン 1.0ｇ／リツトル 塩酸チアミン 400.0mcg／リツトル プルロニツク（Pluronic）Ｌ−81
0.5ml／リツトル 水道水 （PH＝6.1−6.2） ４リツトル容器８個に、760ｇの粗トウモロコ
シシロツプを入れ水と共に1000mlにし、水酸化カ
リウムでPH6.1にする。炭酸カルシウム（30.0
ｇ）、水500mlを加え、1.02気圧（15psi）で30分
間滅菌する。残りの成分（プルロニツク、Ｌ−81
以外）を最終容量の25％にし、500mlずつ別々に
1.02気圧（15psi）で30分間滅菌し、各容器に加
える。PluronicL−81を上述の如く滅菌し、各容
器に１mlずつ加える。 各容器を、実施例１の方法に従い接種物80mlと
インキユベートする。 培地浄化及び回収 ４個の容器からの培養液を実施例１の方法に従
い浄化し6.2リツトルの透明培地を得、これを検
定するとアルフア−イソプロピルリンゴ酸が39.7
ｇ／リツトル含有する。 実施例１の方法に従い6.19リツトルの浄化培養
液から238.5ｇのアルフア−イソプロピルリンゴ
酸を得る。合併した抽出後培養液（8500ml）中に
0.98mg／mlが含有し全体として、この中に、8.3
ｇのアルフア−イソプロピルリンゴ酸が含有して
いる。 検定法 （Calvo等、Anal.Biochem.28、164−181、
1969、の方法を適応）。 アルフア−IDM含有培養物 培養液10mlを希硫酸でPH1.5にし、十分量の蒸
留水を加えて全50mlにする。この一部（10〜20
ml）を遠心して透明溶液にし、５mlを取つて５ml
の緩衝液（0.2MNa2SO4、0.2MH2SO4でPH1.5に
調節）と混合する。 緩衝化した溶液４mlをクリンエリユート・デイ
スポーザル・抽出カラム（ClinElut Disposable
Extraction Column）（Fisher Scientific社、
Pittsburgh、PA.、カタログNo.1005）にチヤージ
する。試料を３分間カラム上に吸着させ、８mlの
メチルエチルケトン（MEK）をゆつくり自然通
過させる。溶出液を25mlのVolumetricフラスコ
に取る。更に２回、８mlのMEKを通過させ、溶
出液を合併し、MEKを加えて25mlにする。 溶出液1.0ml試料を試験管中で、窒素気流下、
65℃で留去する。残サに0.4mlの95％濃硫酸を加
え、30℃の水浴中で20分インキユベートし冷却す
る。次に0.25mlの1.84M冷却レゾルシノール水溶
液を加え30℃の水浴中30分間インキユベートす
る。9.35mlの水を加え、出来た溶液の0.1mlをPH
10.0緩衝液（0.1MH3BO3−0.4MNa2CO3）で希
釈して10mlとし、アミンコ・ボーマン（Aminco
−Bowman）測定機を用い、最高螢光度360nｍ
（励起）453nｍ（放出）に設定して螢光測定し基
準物の強度と比較する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヤロウイア リポリテイカ（Yarrowia
lipolytica）、ATCC 20628（ブダペスト条約に基
づく国際寄託）を、同化性炭素、窒素及びＬ−ロ
イシン源、及び無機塩を含有する水性栄養培地
中、好気的深部培養条件下で、実質的な量のアル
フア−イソプロピルリンゴ酸が培地中に蓄積する
まで培養し、それを回収することからなる、アル
フア−イソプロピルリンゴ酸の製法。 ２ Ｌ−ロイシン源がＬ−ロイシンそのものであ
る特許請求の範囲第１項の方法。 ３ 炭素源が、Ｄ−グルコースである特許請求の
範囲第１項の方法。 ４ 炭素源が、酵素的に加水分解したトウモロコ
シ粉である特許請求の範囲第１項の方法。 ５ Ｌ−ロイシン源がＬ−ロイシンそのものであ
る特許請求の範囲第３又は第４項の方法。 ６ 培養培地をPH1.0〜2.0で、メチルエチルケト
ンにて抽出し、アルフア−イソプロピルリンゴ酸
を回収する特許請求の範囲第１項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US06/381,595 US4407953A (en) | 1982-05-24 | 1982-05-24 | Fermentation process for production of alpha-isopropylmalic acid |
| US381595 | 1995-01-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS592692A JPS592692A (ja) | 1984-01-09 |
| JPS6328593B2 true JPS6328593B2 (ja) | 1988-06-09 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58091407A Granted JPS592692A (ja) | 1982-05-24 | 1983-05-24 | アルフア−イソプロピルリンゴ酸の発酵による製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0095862B1 (ja) |
| JP (1) | JPS592692A (ja) |
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| DE (1) | DE3364913D1 (ja) |
| DK (1) | DK158234C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US4880741A (en) * | 1983-10-06 | 1989-11-14 | Pfizer Inc. | Process for transformation of Yarrowia lipolytica |
| US4628033A (en) * | 1983-10-06 | 1986-12-09 | Pfizer Inc. | Novel host strain for transformation of Yarrowia lipolytica |
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