JPS632930A - 巨大分子ポリペプチドの放出速度調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の技術的背景］ （発明の利用分野） この発明は、約１０００またはそれ以」二の分子用を有
する巨大分子ポリペ１チド活性物質、とくにインターフ
ェロンを長時間速度調節しながら投与するための活性物
質送達システノ＼に関するものである。 （技術的背景ならびに１」連文献） 従来、治療用薬物の操り、には経口による投与方法が広
く用いられてきた。しかし巨人ポリペプチドの場合は、
消化酵素によってペプチドが加水分解を受（）るためそ
のような送達形態をとることができない、ポリペプチド
治療薬の投与に最もＩＹ通に用いられる方法は、筋肉内
（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）に反復して注射するか、または
靜脈内（１■）に点滴注入する方法である。これらの方
法は、ごく限られた回数の注射を必要とする状況の場合
は忍容し得るが、慢性投与（例えばインシュリン療法）
においては好ましくない、ポリペプチドの投１７によっ
て改善を期待し得る疾患、障害および状ｆＪＪは本質的
に急性よりむしろ慢性のものが多く、そのため長期にわ
たって頻回に注射することが必要となる。 したがって巨大ポリペプチドの有効かつ経済的な活性１
１′１１１質送達システムの必要作がある０本来その生
物分解性の故に、ポリ乳酸またはポリ乳酸とポリグリコ
ール酸のような他のコモノマーとの共重合体から作成さ
れた生物分解性を有する高分子７トリツクスが、多くの
活性物質の徐放付送達システムとして使用されてきた（
例えば、米１１特許第４２９３５３９　Ｆｆおよび同第
４４１４）３４０号参照）、幾つかの治療薬の送達のた
め、これらのポリマーを埋め込む使用法が科学出版物お
よび特許文献上に開示された［例えば、アンダーソンら
（Ａｒｕｌ＋：ｒｓｏｎ　Ｌ、　Ｃ，）、「アン・イン
ジェクタプル・→ノースデインド・リリーズ・ファーテ
ィリティー・コントロール・システム（Ａｎ　１ｎｊｃ
ｃＬａｂｌｅ　５ｕｓｔａｉｎｅｄｒｅｌＣａｓｅ　ｆ
ｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｙｓｔｅｍ）」
、コントラセプテイブ（ＣｏｎＬｒａｃｅｐｔ！ｏｎ）
、１３巻、３７５へ３８４頁（１９７６年）、ベックら
（ｆｌｃｃｋ）、［ニュー・ロング・アクティング・イ
ンジェクタプルマイクロカプセル・コントラセプテイブ
・システム（Ｎｅ＋ｓ　ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ　１ｎ
ｊｅｃｔａｂｌｅ　ｍ１ｃｒｏｃａｐｓｕｌｃｃｏｎｔ
ｒａｃｅｐｔ、ｉｖｅ　５ｙｓｔ、ｅｍ）　Ｊ　、アメ
リカン・ジャーナル・オブ・オブステトリックス・アン
ド・ジャイネコロジー（八ｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、
　Ｇｙｎｅｃｏｌ、）、１４０巻、７９９・−８０６頁
　　　　　　、ヨールズら（Ｙｏｌｌｅｓ）、［タイム
ド・リリーズ・デボ−・フォア・アンタイ・カンザー・
エージエンツｌｌ　（Ｔｉ＋ｎｅｔ１１°ｅｌｅａｓｃ
　　ｄｅｐｏｔ　　ｆｏｒ　　ａｒ＋Ｌｉ−ｃａｎｃｅ
ｒ　　ａｇｅｎＬ！＜　訂　）Ｊ１アクタ・ファーマシ
クチイカ・スベク（ＡｃｔａＰｈａｒｍ。 ５ｖｅｃ、）、１５巻、３８２〜３８８頁（＋９７８）
、米国特許第３７７３９１９号および米国特許出願第６
９９７１５号ｒ］ｃ＋ｓ５＋ｒ−２月８１１）参照］、
ポリ（ラクチド・コ・グリコリド）システノ、からのペ
プチドの徐放性送達がケントら＜Ｋｃ・ｎＬ）　［ｌイ
ン・ビボ・コ〉′トロールド・リリース・オブ・アン・
ＬＨ＋’＋　Ｉ＋・アナログ・フロム・インジエクテッ
ド、ポリメリック・マイク１７カプセルズ（ＩＩＩ　ｖ
ｉｖ。 ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｒＣｌｅ：、＋ｓｅ　ｏｒ　ａ
ｎ　Ｌ曲Ｈａｎａｌｏｇ　ｆｒｏｍｉｎｊｅｃｔｅｄ　
ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｍ１ｃｒｏｃａｐｓｕ’１ｃｓ）
」、：７ントラセプテイブ・デリバリ−・システムズ（
ＣｏｎＬｒａ−ｃｅｐｔ、　ｌ１ｅｌｉｖ、　５ｙｓＬ
、）、３巻、５８　頁（１９８４年）１゜す〉ダーズら
（Ｓａｎｄｅｒｓ）　ｌ　Ｉ　’Ｊ　’／　ｌ・Ｄ　−
ルド・リリース・オブ・ア・ルテイナイジング・ホルモ
ン・リリージング・ホルモン・アナログ・フ１７ム・ポ
リ（ｃｌ、Ｉ−ラクチド・コ・グリコリド）　・マイク
１フスフエアズ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｒｅｌｅａｓ
ｅ　ｏｆ　ａ　ＩｕＬｅｉ＋＋−１ｚｉ盲１ｇｈｏｒｍ
ｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｔｎｇｈｏｒｍｏｎｅａｎａｌｏ
ｇｕｅｆｒｏｍｐｏｔ　ｙ　（ｄ　、　Ｉ　−ｆａｃｔ
　ｉｄｅ−ｃｎ−ｇｌ　ｙｃｎｌ　ｉ　ｄｅ）−ｍ　ｉ
　ｃｒｏｓｐｂｅｒｅｓ　）、ジャーナル・オプ・ファ
ーマシウティカル・サイエンス（Ｊ、　Ｐｌ＋ａｒｍａ
ｃｅｕｔ、　Ｓｃｉ　、　）、７３巻、　１２　（Ｊ　
／１〜１２９７１″ｉ、＜１０８４年）、（ヨーロッパ
’Ｊ：ｊ　Ｒ′ｒ第００５２５１０り参照）１、および
チャンク（Ｔ。 Ｃｈａｎｔ）　ｌ”バイオデグレーダブル・セミパーミ
アブル・マイクロカプセルズ・コ〉′デイニング・工〉
ザイムズ　ホルモ〉ズ・バクジーンズ・アンド・アザ−
バイオロジカルズ（ｌｌｉｏｄｃｇｒ；）ｃｂ＋１）ｌ
ｃ　ｓｅｍｉ−ｔ＋ｅ＋−ｍｐａｂｌｅ　ｎ＋１ｃｒｏ
ｃ；＋ｐｓｕｌｃｓ　ｃｏｎｔａｊｎｉｎｇ　Ｃ＋＋ｚ
ｙｍＣｓ。 ｈｏｒｍｏｎｐｓ、ｖａｃｃｉ＋＋ｃｓ　ａｎｔｌ　ｏ
ｔｈｅｒ　ｌ＋ｉｏｌｎｇｉｃａｌｓ）　Ｊ　。 ジャーナル・オブ・バイオエンジニアリング（Ｊ。 Ｂｉｏｅｎｌｉｎｃｃｒｉｎｇ）、　１巻、２５〜３２
頁（１９７６年）、およびヨーロッパ特許出願第８２３
００　／１１６．３号（１９８２年１月２７日出願）（
現在、ヨーロッパ持ｒ「第００５８４８１号）コによっ
て報告された３　しかしながら以下にその理由を詳述す
るように、ポリラクチドマトリックスから巨大ポリペプ
チドを送達することは困ｇ１ｔである。上記の引用文献
中、２５００またはそれ以−１の分子址を右するポリへ
プチドを含有した剤形は最後に埜げた２つのＩｆＦ＋示
だζフである。 ポリラクチドお、Ｌびポリ（ラクチド・＝トグリ＝　７
− コリド）ポリマーおよびコポリマー（以−ト、それぞれ
ポリラクチドまたはＰ　Ｌ、　Ｇ　Ａポリマーと総称す
る）は水に溶解しない、これに反しほとんどのポリペプ
チド類は水に溶解するが、有１９１媒には溶解しない、
この理由から、現在までポリペプチド粒子を分散させた
ポリラクチド剤形の製造は、−・最に二つの基本的な手
法のうちの一つによって行われている。 その手法の・一つは、ｆｌｌｌｌｌｌ全成分状態でポリ
ラクチドと混合し、ついでこれを加熱押出、加熱圧縮ま
たはキャスティング（注型）する方法である。 もう一つの手法は、有機溶媒中でポリマーおよびポリペ
プチドの溶液または懸＋Ｔｉ液を作り、ついでこれを注
型してフィルム珪たはスラブ（厚板）とし、溶媒を蒸発
する方法である６通常この方法では、固化の際、ポリペ
プチド粒子の均−竹およびポリペプチド／ボリラクヂド
マトリックスの均質性を許容し得る程度達成するため、
溶液／懸濁液を広範囲にもしくは急激に撹拌することが
必要である。フィルムまたはスラブを減圧下に乾蜂しな
いと溶媒を蒸発するのに数時間ないし数日間を要し、ま
たこれを減圧下に実施すると、固体の乾燥の際つねに気
泡を生じる。そのうえこの方法で作成したポリラクチド
製剤は多くの泊Ｖ！適用目的に対し均一性が充分である
とは言えない、水溶性粒子層のコアレッセンスのため、
ポリペプチドは巨大な粒子集合体としてポリラクチド内
に不均一に分布する。したがってこの方法で作成した製
剤はさらにもう一度粉砕し、その粉末を加熱再成形する
か、あるいは加熱下に製剤を圧縮または押し出しするよ
っな均質化の方法を錨になければならない、これらの操
作に要する温度は通常少なくとも７０“Ｃである。 またポリラクチドに薬物を組み入れて注Ｑ（可能なマイ
クロカプセルを作成することが知られている。そのよう
なマイクロカプセルは、米国特許第３７７３９１９号お
よび米ｒＴＪ特許ＪｊＪＭ第６９９７１５月ならびにヨ
ーロッパ特許第（１０５２５１０号に提供されているよ
うな基本的手法によって作成することができる。後者の
方法は、ポリマーをハロゲン化炭化水素溶媒に溶解し、
急激な撹拌によってポリペプチドを含有している水溶液
をこのポリマー／溶媒溶液中に分散させ、分散したポリ
ペプチドを含有している微小水滴上にハロゲン化炭化水
素溶媒から高分子１す゛膨剤の沈殿を生じさＱ゛る非溶
媒コアセルベーション剤をこれに添加することによって
、ポリペプチドをカプセル１ヒすることから成る。つい
で得られたマイクロカプセルを有機溶媒で繰り返し洗浄
することによりこれを乾燥す゛る。 しかしながら、巨大ポリペプチドは物理的および化学的
な変性をとくに受けやすく、したがって過度の熱、溶媒
、およびぜん断力を加えることによって生物学的効力の
失活を生じる。この理由から、現在までポリラクチド重
α体中ｌ＼巨大ポリペプチドを組み入れるには、ある程
度ポリペプチド／ポリマー懸濁液の均一性を犠牲にする
必要があり、さもなければポリペプチドの４Ｖ物学的効
力の実質的な損失を招く結果を生じ、あるいはその双方
と成る。得られた製剤は、−般に効力が低下したポリペ
プチドの不規則な大きさの巨大粒子を含んでいる不均一
な分散となる。巨大で不規則なポリペプチド粒子が組み
入れられると、薬物送達速度は不規則となり、１Ｙ通ポ
リラクチド医薬製剤で見られる多段附放出作に悪影響を
与えるようになる。 Ｊ：ｉ：縮および押出のように溶融した成分を混和・練
合し、加熱均質化する手法のような既知手法による一層
均質でモノリシックな製剤のｆ１製法は、実質士、しば
しばポリペプチドの生物活性のほとんど完全な失活をも
たらす０例えばｊ２和な条ｆ’ｌＸ下に加熱混合し、押
出しをすることによって作成したＰ　１．、　Ｇ　Ａ　
／インターフェロン製剤は、もとのインターフェロンの
生物活性の１％を保有しているに留とまる（実施例７、
参照）、この形式の製造過程中に生じる生物活性の損失
を補充するには、大過剰のポリペプチドを製剤中に加え
なければならない。 変性したポリペプチドを含有した製剤のもう−・７　］
、］、−一 つめ内凹は、それらによって生じる免疫原性の増大であ
る。変性したポリペプチドへの応答によって起こる抗体
の産生は、所望の治療効果を部分的もしくは完全に損な
うこととなる。 したがって調節された巨大ポリペプチドの規則正しい送
達を提供し、生物活性を著しく失活することなく製造し
得る均質なポリラクチド剤形の必要性がある。 ［発明の記載］ この発明は水溶性の巨大分子ポリペブチ１；を１１１１
乳動物に調節役ＪＪ、する新規活性物質送達システムを
提供する。このシステムは、巨大分子ポリペブチ１：お
よび所望によりそれ以外の水溶性成分から成る匂子を約
３０重量％を越えることなくポリラクチドに分散させて
含有して成る高分子７トリツクスを含むシステムであっ
て、ここで該ポリペブチ１；および水溶性のそれ以外の
成分を含有している粒子の直径は実質的にすべて１０μ
またはそれより小さく、それらを均等にかつ独立して７
１、リックス全体に完全に分散させ、しかも７１〜リッ
クス製造前に保有していたポリペプチドの生物活性の少
なくとも約５０％をなお保有している高分子７トリツク
スを含んでいる。 考案されたこの剤形は、細胞外液または細胞内液を利用
してこれを該剤形内へと移行させることが可能な生体部
位へ、生物活性を有する巨大分子ポリペプチドの調節さ
れた一定量を送達し得る経済的でしかも確実な方法を提
供するにのシステムは、１日より少ない期間から数ケ月
にわたる長期にわたって活性物質を好適な速度で送達し
得るように設計することができる。−般に活性物質の放
出期間は、約１週間ないし３ケ月間が期待される。この
放出調節剤形の重要な利点は、事実上ポリペプチド活性
物質の生物活性をほんのｆ！＾か失活するだけで製造で
きるという点にある。高い生物活性を保持することがで
きるから、ポリペブチ１（は比較的低い初期含有量でこ
の剤形をｇｌ造することが可能である。 ｉｑ造中、ペプチドの高い生物活性が保持されることか
らさらに幾つかの利点が得られる。第一に製造者にとっ
て、各投与形態すなわち送達システムに組み入れられる
活性物質のコスト面で経済的に著しく有利である。第２
にポリペプチドおよびそれ以外の水溶性成分の該剤形中
に占める％が比較的少ないため、それらの成分の生体内
における該システムの水和作用に対する関与を最低に留
どめることによって、剤形が作動し得る全期間を通じ、
従来公知の何れの生物分解システム類で到達し得たより
もさらに一定したポリペプチド放出速度が提供される。 第３に変性したポリペプチドの量が問題とならない程度
であることは、ポリベブヂド送達部位における好ましく
ない免疫応答の生じる可能性を減少させる。 この剤形のもう一つの利点は、活性成分をほとんど失活
することなく製造できる点である。言うまでもなくこの
ことは活性成分の消費を節約するのに役立つ、製造によ
って、当初活性成分出発物質の８０％が剤形に組み入れ
られ、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは実
質上１００％を組み入れることができる。 この発明による放出調節剤形のも・）−・つ重要な利点
は、ポリマー／ボリベプヂドマトす・ソクスの新規な物
理的構造にある。この７トリツクスは、ポリラクチドポ
リマー中に水溶性成分の極めて微細な分散、すなわちマ
イクロサスペンションを含んでおり、ここで活性成分お
よび所望によりそれｕノ外に添加された任意の水溶性成
分のずべてのＴ１′１径は１０）ｔまたはそれ以下であ
る。それらの粒子はポリマー全体にわたって均等にかつ
独立して分１１にシており、木質的に均質でモノシリツ
クな剤形を提（Ｊ（する、　ｆｆｅ来公知のシステムの
場合、その剤が水０１され浸食を受けるに−）れて、拡
散と溶解との組み合わさった機序を介して生物活性を存
するポリペプチドが放出される。しかしながら、巨大分
子を送達する既知の高分子マトリックスシステムとは異
なり、この発明のシステムでは、巨大分子をシステムか
ら放出するのに通水チャネルすなわちマクロ細孔を７ト
リツクス内に形成することに依存してはいない、薬物の
放出を生じるのにマクロ細孔の生成を必要とする場合、
その間、薬物＝１５− をほとんどまたは全く放出しない中間静止相によって特
徴付けられる３段階放出像を生じることが知られている
。また薬物放出の始まる初期相の前に静止期もしくは不
動期があることがある。これに反して、この発明におい
ては、ポリペプチドおよびそれ以外の水溶性成分が極め
て微細な独立した粒子としてポリラクチドマトリックス
内に存在しているから１通水チャネルは、多少あるとし
ても放出のかなり末期に至るまで形成されない、その結
果、初期にごく短時間のラグタイムを置き、システムの
全期間を通じ極めて規則正しい放出像を達成することが
できる。 さらにこの発明は、上述の好適な大きさと形態を具備し
た剤形を埋め込むことによって、細胞内液および／また
は細胞外液により吸収し得る生体部位へ適用することか
ら成る、巨大分子ポリペプチド活性物質の投与方法を提
供する。またこの発明は、上記記載に係る剤形の新規製
造方法を提供する。 −１，６−− （定義） ［生物活性を有する巨大分子ポリペプチド」の語は、哺
乳動物に投与すると有用な生物活性を示し、約１０００
ダルトンより小さくなく、好ましくは約２５００ダルト
ンより小さくない分子量を有する任意のポリペプチドを
表す。 「ポリペプチドは少なくともその生物活性の約５０％を
保有する」の語は、製造完了時の測定において、実施例
５に記載したような特定ポリペプチドの生物学的検定精
度の範囲内で、少なくともポリペプチド生物学的力価の
約５０％をなお保有していることを表す、−般に検定は
、濃度既知の放射能標識ポリペプチドを含有する標準貯
蔵品を添加し、緩和な条件下で製造システノ、からポリ
ペプチドを抽出し、標準貯蔵品および抽出したポリペプ
チドの相対放射能（カウント７分／ｍｌ）および該ポリ
ペプチドの標準的な生物学的検定による相対生物活性（
単位／ｍＬ）を測定することからなる。測定すべきポリ
ペプチド試料は検定板ウェルに系列−ｎ、釈し、標準試
料を対象として生物学的検定を実施する。検定板ウェル
を判定するため任意の終末点を設け、これと同じ終末点
を使用して標憎試料の判定を行う、インターフェロン検
体の活性は、各抽出検体とそれぞれ当量な標準貯蔵品の
生物活性［単位（ｌｏｇ＋。）／ｌｎＬ］に基づいて計
算する。この発明の範囲に包含されるシステムにおいて
は、対応するポリペプチド標準貯蔵品の単位（（ｌｏｇ
　ｔｏ）　／　ｍ　’　］の１７２　　またはそれより
も大きいポリペプチド比活性値（１０ｇ　ｔｏ）となる
、この発明の好ましい態様では、製造後、ポリペプチド
の生物学的力価は少なくとも約７０％、さらに好ましく
は少なくとも約９０％、とくに好ましくは実質的にもと
の生物学的力価をそのまま保有する。 「実質的にすべてのポリペプチドおよびそれ以外の水溶
性成分の粒子」の話は、成分粒子の是の少なくとも約７
５％、さらに好適には少なくとも約９０％においてそう
認められることを言う。 「水溶性」の話は、少なくとも米国局方第１Ｉ版１１２
１頁に定められた定義による「極めて偏かに溶Ｍ」　（
すなわち水に対する溶解度が少なくとも０．１〜１．（
Ｉ　ｍ　ｇ／ｍｌ　）である巨大分子ポリペプチドおよ
びその外の所望により製薬上許容し得る成分を表すのに
用いられる。 Ｅマイクロサスペンション」の話は、実質的にすべて１
０ノ１またはそれ以下の粒径を有し、実質上ポリマー全
体に均等にかつ独立して分散しているポリペプチドおよ
びそれ以外の水溶性固体成分の粒子を記載するのに用い
る。「均等にかつ独立して分ｉｉｋ　している」の語は
、粒子が互いに接触せず、むしろ個々に高分子に囲まれ
てほぼ等間隔に配置されている状態を表すのに用いられ
る。ポリペプチドおよびそれ以外の水溶性成分の粒子の
大きさおよび分布の測定は、実施例４に記載のようなｔ
ｗｎａ的な顕微鏡的測定によって実施できる。実質的に
すべての粒子は、好ましくは５μまたはそれＵ丁、さら
に好ましくは１μまたはそれ以下の粒径を有する。 「ポリラクチド」の話は、α−ヒドロキシカルボン酸卸
から誘導されたホモポリマー類およびコポリマー沖、と
くにα　ヒドロキシ酢酸乳酸およびα−ヒドロキシ７０
ピオン酸−グリコール酸がら誘導されたコポリマー類を
総称的な意味で記載するのに用いる。これらは通常乳酸
類の環状エステルから製造される。 この発明σ】目的は、生物活性を有する巨大分子ポリペ
プチドの実質上均一なマイクロサスベ〉ジョンをその中
に組み入れた均質・なボリラクヂドマトす・γクスを０
り製することにある。この７１〜リツクスは細胞外液お
よび／または細１１２＋内液を利用してこれを該剤形へ
と移行させることが可能な生体部位へ適用することによ
って、生物活性を有するポリへプ千ドを放出する。７ト
す・ソクスは水和されると、拡散および浸食の機序によ
りポリペプチドを放出する。ポリペプチド類は水溶性な
ので、その放出速度は該剤形の水和およびポリマーの浸
食速度に支配される。 ポリラクチドの共重合体を使用するので、使用する共重
合体の型およびその相対量を好適に選択することによっ
て、高分子７トリツクスの水和および浸食の速度を変え
ることができる。好適なコモノマーの例として、グリコ
リド、β−プロピオラクト〉、テトラメチルグリコリド
、β−ブチロラクトン、４　ブチロラクトン、ビバＬｌ
ラクトン笠、およびα−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキ
シイソ醋酸、α−ヒドロキシ吉草酸、α−ヒドロキシ・
イソ吉草酸、α−ヒドロキシカプロン酸、α−ヒドロキ
シ−α−エチル醋酸、α−ヒドロキシイソカフ０ン酸、
α　ヒト

【７キシー３−メチル吉草酸、α　ヒドロキシ
へブタン酸、α−ヒトｌ：？キシオクタン・酸、α−ヒ
ドロキシデカン酸、α−ヒトｔ７キシミリスチ〉酎、ａ
−ヒドロキシステアリン酸、およびα−ヒドロキシリグ
ノセリン酸等の分子内環状エステルが挙げられる。 これらの１壬意の化合１勿はコモノマーとして、許容し
得るポリマーのｗＡ造に使用できる。β−ブチロラクト
ン゛は、Ｗ−モノマーとして、または好適なコモノマー
とともに基本上ツマ−として使用できる６しかし乳酸を
単一モノマーとし、またはこれとグリコール酸をコモノ
マーとする共重合体として使用することが最も好ましい
、ポリラクチドσ）話は、乳酸モノマーから単独に作成
されたポリマー、および上に列挙した型のそれ以外のコ
モノマーと一緒に共重合体として作成されたコポリマー
との双方を示すのに用いられる。ポリ（ラクチド−コ−
グリコリド）およびＰＬＧＡの話は、乳酸およびグリコ
ール酸のコポリマーとして作成された共重合体に対し互
換性をもって使用される。 好ましいポリマーを作成することができるα−ヒドロキ
シカルボン酸は、光学的に活性な（Ｄ−およびＬ−）形
または光学的に不活性な（ＤＬ−、ラセミ）形をとるこ
とができる０例えば乳酸の場合、それが革−モノマーの
場合であってもあるいはコモノマー成分の場合であって
も、ｒ）−乳酸、し−乳酸、ＤＬ−乳酸、またはＤ−お
よびし＝乳酸の任意の割合の混合物であることができる
。 作成可能な好ましいモノマーおよびコモノマーの組合わ
せは無数にあるが、最も有用な組合わせは乳酸単独また
は乳酸およびグリコール酸から作成した重合体であり、
この場合、グリコール酸ははコモノマーとして、グリコ
リドｌｉｔ位に月するラクチド即位のモル比１００：Ｏ
〜３０：７０、好ましくは］　０　（１：　Ｏ〜４０　
：　６０．１列えば７５゜２５・〜４０・６０ｆ）割合
で存在する。グリコリドに対するラクチドのモル比が、
約７５＋２５および５　（１：　５０であるポリ（ラク
チド−コ−グリコリド）コポリマーを使用するのが最も
好ましい、平均値で示したポリ（ラクチ、ドーコーグリ
コリド）ポリマーの分子量は好ましくは約２　（１００
０〜１　（］　ＯＯＯＯダルトンである。特定の共重合
体の分子量はそのモノマー構成とは無関係である１例え
ば好ましい５０　：　５０の割合のコポリマーは、上記
の分子Ｖの範囲内に含まれる任意の値をとることができ
る。 この発明は、上述した好ましい構成および範囲１プ外の
ものを含め、モノマーの構成およびその分子量を双方と
も変えたポリマーであっても、そのポリマーが固体物質
を形成し得るものである限りそれらの利用を包倉する。 この発明の目的のため、特定のポリマーの分子１：１：
を、クロロホルムまたはヘキサフルオロインプロパツー
ルを使用し３　（ｌ　Ｔ″Ｃ：′測定した毛管粘度計に
よる固壱粘度の関数として測定した。この発明の使用に
好適なポリラクチドの固有粘度の範囲は約０．２　ｄｌ
　／′ｇ〜約１．５　ｃｌ　Ｌ　７ｇであり、好ましく
は約０．３３〜１．０　ｄｌ　、７ｇの範囲である（Ｌ
、’Ｊ下、すべての粘度はへキサフルオロイソプロパツ
ール中で測定した）８ ポリラクチドの製造方法は和学文献および特許文献に評
紺に提供されている。以下に列挙した特許は、１Ｈ８１
なポリラクチド類、その物理的性質およびその製造方法
に関して詳細な記載があり、その−部を引用して参照し
た。それらは米１３；１特許第３７７３（１１９号、米
国特許第４２９３　”；　３９号、米国特許第３４３５
００８号、米１ｎ特許第３４４２８７１号、米国特許第
３４６８）１５３号、米国特許第３５９７４５０号、米
国特許第３７８１３４１９号米国特許第３７３６６４６
号および米田特許出願第６９９７１４号（１９８５年２
月８日出願）、およびヨーロッパ特許第００５２５１０
号である、 この発明の７ｆｌｌ形に組み入れることが可能な巨大分
イボリベブチドは、分子ｆＩ−が約１０００よりも大き
く、都合よくは約２５００よりも大きく、好ましくは約
（＋　ＯＯＯ・−５０００００、ざらに好ましくは約１
００００よりも大きく、最も好ましくは約１５０００よ
りも大きい、生物活性を有する分子である。この発明の
実施に゛より送達可能なポリペプチドとして一つだけ挙
げられるべき選択条件は、血漿、組織間液、および皮下
間隙および粘膜組織の細胞外液および細胞内液のような
生理的水性媒質に、少なくともごく備かに溶解し得ると
いうことである。［ごく僅かに溶解する」というのは、
１Ｔｉｉ述のように水に少なくとも約（１，１〜１０ｍ
　ｇ／　＋ｎ　ｌ溶解するということである。 ポリペプチドを例示的に類別して示せば、とりわ（Ｊ蛋
白ｌｔ１、酵素、ｔｔＡ蛋白質、糖蛋白τ１．リボ蛋白
質、ホルモン様活性ポリペプチド、およびこれらの分子
のアゴニストおよび拮抗物質笠を２む合成類０１１体等
が埜げられる。。 この発明の使用に々ｆ適な蛋白ａの種類は多く、免疫ン
１８１　ｆ’ｉｌｉ物質、リンポカイ〉卸、モノカイ〉
類、ザイトカイン類、酵素類、抗体、成長ｆＪｔ進物質
、成長抑制因子、血液蛋白質、ホルモン】イ１．ワクチ
ン（ウィルス、ａｌ菌、寄生虫類、リケ・ソチア類の抗
ＪｒＩ：を含む）、血液凝固因子等、および種々グ）前
駆蛋白質体、突然蛮族蛋白質、その他の類似体対゛が挙
げられる。また抗体も含まｉする。 とくにこの発明の送ずシステムに紺み入れるのに々ｊ′
油なポリペプチドの例は、以Ｆに２トげた生物活性を存
する巨大分子および突ｊグ′、変５＾蛋白質およυそれ
らのガＩ似体、すなわちインターフェロン−Ｈｉ（α−
１β−１）−５お、Ｌびβ１．．７の、Ｌうなそれらの
突然変異体）、コロニー刺激因子（１，２，３、ＧＭ、
α−１β−１γ−等）、インターロイキン類（Ｔ　Ｌ−
１、Ｔ　Ｌ−］　、、］ＩＩ−、−１１ＴＬ、−２、］
　］Ｌ−３．ｌＬ−４、ＩＬ−５等）、マクロファーシ
ン古性化因子、マクロファージペプチド類、Ｂ＃ｌ胞因
ｔ（８！胞増殖因子等）、′ｒ細胞因子汀（、プロティ
ンＡ、アレルギー抑制性因子、号プレフ号−因子、細胞
１；り害竹糖蛋白質、免疫細胞障害物質、免疫前１７、
ｔ　Ｉｎ、免疫療法剤ポリペプチド、リンホｌ−キシン
Ｈ１、■ΦＩＩＩ；壊死因子（α−５β−等）、カケク
チン、オンコスタチン類、　ｌｌＴｌ瘍抑制因子、形質
転換増殖因子（７１’Ｇｌ’−α、′１”ＣＦ−β等）
、アルブミン、α−１−抗ｌ・す１シン、アポリボ蛋白
質−ε、赤芽球活性１ヒ因子、エリスロボイエチン、第
■囚子。 第ＶＩｌ（Ｃ）因子、第■因子、フィブリ〉溶解性￥＠
質、ヘモボイエヂ＞’ｉ、！’？プラスミノーゲン活性
化因イ活性化ブイスミノーゲン活性化因子、ウロキナー
ゼ、フ゛ｔ７ウロキ→゛−ゼ、ストレアＩＩナーゼ、リ
ボ＝Ｉルチン、リボモジュリン、マクロコルチン、肺表
面活性化蛋白質、プロティンＣ、プロティン５、Ｃ反応
性蛋白質、レニン阻官物質、コラ−ゲナーゼ阻害物資、
スーパーオキシド・ジスムターゼ〈超酸化物不均化酵素
）、表皮成長因子、成長ポルモン、血小板由来成長因子
、骨形成魚成長因子、心房性ナトリウム利尿因子、 アラリフリン、アトリオベプチン、骨形１ｇ形成蛋白質
、カルシトニン、カルシトニン前駆物質、カルントニン
逍伝イ関連ペプチド、軟骨ｉＡ尋因子。 結合組織活性化蛋白質、表性ホルモン（卵胞刺激ホルモ
ン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）
、成長ホルモン放出因子、骨形成蛋白質、イ〉シ又リン
、プロインシュリン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン
、副甲状１１にホルモン抑制ｑ勿質、レラキシン、セク
レチン、ソマトメジン（゛、インシュリン様成長因子、
インヒビン、副腎皮質刺澹ポルモン、グルカゴン、パン
アクティブ・インテステイナル・ポリペプチド、ガスト
す・ツク・インヒビトリー・ペプチド、モチリン、コレ
シストキニ〉、肝臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプ
チド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺部ホル
モン、ワクチン抗原としてＨ’Ｉ’　Ｌ　Ｖ−Ｉ、−１
１、エイズ・ライス群（ＨＴＬＶ−Ｉｎ／ＬＡＶ、／’
ＨＩＶおよびＨＩＶ−２等）、サイトメガロウィルス、
肝炎Ａ型、Ｂ型、ノンーＡ／ノンーＥ＋型ウィルス、弔
純ヘルペスー■型ウィルス、単純ヘルペス−ｎをウィル
ス、マラリア、仮性狂犬病、レトロウィルス、ネコ白血
病ウィルス、ウシ白血病ウィルス、伝染性胃賜炎ウィル
ス、ウシ感染性Ｑ気管支炎、バラインフルエンザ、イン
フルエンザ、ロタウィルス群、Ｒ８（レスビレ−トリー
・シンシシアル）ウィルス、水痘・帯状ヘルペスウィル
ス、ＥＰ（エプスタイン・バール）ウィルス、百日咳等
の抗原、およびダラム陰性細菌、シュードモナス、内毒
素、破傷風毒素、およびそσ）他の細菌、ウィルスまた
はその他の感染性微生物に対するモノクロナールおよび
ポリクロナール抗体、蛋白質分解酵素阻害物質等が挙げ
られる。 ここに列挙した巨大分子ポリペプチドの例は、単にこの
発明の実施に当って使用するのに好適な活性物質の種類
を説明するために提示したものであって、これによって
この発明の範囲を制限するものではない。 とくに好ましいポリペプチド群は、天然産または人工の
インターフェロン類である。インターフェロンは約１５
０００〜約２８０００の範囲のモノマー分子量を有する
ポリペプチド類である。それらは、吐乳動物細胞がウィ
ルス感染、免疫刺激またはその池の因子に反応すること
によって合成された蛋白質である。現在、インターフェ
ロンは次の３つの大綱目の何れかに分類される。それら
はα型すなわち白血球インターフェロン（ＩＦＮ、−α
）、β望すなわち繊維芽細胞インターフェロン（］　Ｆ
　Ｎ−β）、およびγ型すなわち免疫インターフェロン
（ＴＦＮ−γ）である、インターフェロン・沖の生物学
的特性は抗ウィルス作用、細胞分裂阻止作用および免疫
調節作用であって、それらの作用により５治療薬として
臨床的にウィルス感染症および悪性ｌ！瘍の処置に使用
される。 インターフェロンは白血球、リンパ芽球細胞の連続浮遊
液または培養、および繊維芽細胞培養のような天然供給
源から入手できる。Ｔリンパ球はγ−インターフェロン
の産生を刺激する。β−インターフェロンは繊維芽Ｉｌ
Ｉ胞のような哺乳動物細胞から誘導される。ここで言う
「β−インターフェロン」またはｒｌＦＮ−β」とは、
ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ブタおよびウマ等の天然供給
源、および組換えＤＮＡ技術によって誘導されたβ−イ
ンターフェロンの両者な包含する。また例えばグリコジ
ル化、メチル化、および１キ定数のアミノ酸の置換えお
よび／または欠失によるβ−インターフェロンの修飾形
態もこれに包含される。ここで使用するＨ　ｕ　Ｉ　Ｆ
　Ｎ−βとはヒトβ−インターフェロンのことであり、
ｒ　Ｉ−Ｉ　ｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ・・βとは組換え技術によ
ってイＰ成したＨｕＴＦＮ−βの二とである。］　Ｆ　
Ｎ　　／Ｉｍａｒ−１７とは、１７番目のアミノ酸をセ
リンと置を例えたβ−インターフェロンのことを指す。 インターフェロンの濃度は、広く国際的に承認を受は立
証された標準「部位Ｊによって表され、標準状態でウィ
ルスの複製を阻止する一定足のインターフェロン力価で
示される。 既知（ヒ合物であるＩＦＮ−β＊ｅ’ｒ−１’７は、Ｉ
ＦＮ−βを暗号化したＤＮＡの修飾配列によって最も良
好に生産され、微生物操作により、修飾されたＤ　Ｎ　
Ａを蛋白質として発現する。成熟ＴＦＮ−βを１ｈ号化
したＤ　Ｎ　Ａ配列のセンス鎖のコドン１７（チミン）
の第一塩基をアデニンで置換すると、ＩＦＮ−βアミノ
酸配列の１７位のシスティン残基がセリンで置換される
。Ｔを他の塩基に変え、他の塩基をコドン１７に入れる
ことによってシスティンを他のアミノ酸に置換えること
ができる。 ＩＦＮ−βのセンス鎖のコドン１７領域において、１７
ヌクレオチド配列のコドン１７の最初の塩基がただ一つ
異なっている以外は全く同一である配列ＧＣＡＡＴＴＴ
ＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧを有する合成１７−ヌクレオチド
・プライマーを使用することにより特定部位組換え突然
変異を誘発することができる（ここにおいて、Ｃはデオ
キシシチジン、１′はデオキシチミジン、Ａはデオキシ
アデノシン、Ｇはデオキシグアノシンを表す）、プライ
マーにおける誤対合はヌクレオチドの１２の位置である
。１７量体をＩＦＮ−β遺伝子のアンチセ〉゛ス鎖を有
する一本鎖Ｍ１３ファージＬ）　Ｎ　Ａにハイブリッド
化する。ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片（５°−エ
キソヌクレアーゼ・サブユニットを欠いているＤＮＡポ
リメラーゼＩ断片）を使用してこのオリゴヌクレオチド
・プライマーをＤＮＡに継ぎ足して得られた２本ｇＤＮ
Ａ（ｄｓＤＮＡ）を、Ｔ−ａリガーゼで閉管状ＤＮＡに
転換する。 ｔｐｒられな突然変異性へテロ２本鎖を複製することに
よって誤対合を含んだＤＮＡ鎖からクローンを得る。特
定制限部位の出現又は消失、抗生物質耐性または感受性
、またはその他当該技術において周知の方法により突然
変異クローンを同定しスクリーニングする。システィン
をセリンで置き換えると、′［をＡによって置換するこ
とによって格造道伝子内に新しいＨｉｎｆ　１の制限部
位が生じる（制限部位とは、特定の制限酵素によって認
識され開裂されるＤＮＡ配列の部位を言う、　１（ｉｎ
ｆ　Ｉ制限部位とは、１ｌｉｎｆｌエンドヌクレアーゼ
によって認識された制限部位である）、オリゴヌクレオ
チドプライマーをプローブとして使用する突然変異体フ
ァージ・ブレークのハイブリダイゼーション・スクリー
ニングによって突然変′ｊ４体クローンを同定すること
ができる。プライマーは母株にハイブリッド形成すると
唯１つの誤対合を有するが、突然変異体ファージＤＮＡ
にハイブリッド形成すると完全に対合する。したがって
オリゴヌクレオチド・ブライマーが、突然変異体ＤＮＡ
に優先的にハイブリッド形成するが母株ＤＮＡにはハイ
ブリッド形成をしない、ハイブリダイゼーション条ｆ↑
を考案することが可能である。また新たに生成した旧ｎ
ｆ　ｌの部位はＩＦＮ−β遺伝子内の唯１つの塩基変異
を確認する手段として使用できる。 突然変異遺伝子を含むＭ１３ファージＤＮＡをＪｉｔ　
ｍし、これをプラスミドｐＴｒｐ３のような好適な発現
ベクターにスプライスし、このベクターをエシェリキア
・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｍ　Ｍ　２９４株のような
宿主に形質転換する。形質転換株およびその子孫株の培
養に好適な発育培地に関しては、当業者周知のことであ
る０発現したＩＦＮ−βの突然変異蛋白質（突然変異遺
伝子から誘導された蛋白質）を単離して精製し、形質決
定する。 このＪＰＮ−βの合成方法のさらに詳細に関しては、米
国特許第４５１８８１４号に示されておりその教示を引
用する０　　　　　　　　また米国特許第４５１８５８
４号には、β−ＩＦＮのおよびインターロイキン−２の
突然変異蛋白質を開示し、その製造方法を教示している
。 α型および７・型のインターフェロンをｖＪ造する絹替
えＤＮＡ技術およびインターフェロンがの突然変異蛋白
質も既知である。ナガタら（Ｎａｇａｔａ）はα−イン
ターフェロンを発現する細菌の調製方法を開示している
［ネイチ’ｒ　　（Ｎａｔｕｒｅ）、２８４巻、３１６
〜３２０頁（１９８０年）］、］γ−インターフェロは
、ＥＰＯ出願第０１３８０８７Ａ号およびこれに対応す
る米１１特許出願第５３４０４号（１９８３年９月２０
日出願）に開示された方法によって製造することができ
、その教示を引用する。 この発明の放出コ４節剤形は、１またはそれ以上の生物
活性を宥する巨大分子ポリペプチド以外にもさらに水溶
性の製薬上許容し得る成分を含有することができる。所
望によりポリラクチドマトリックスに組み入れることが
可能な水溶性成分は、約ｌＯμまたはそれり下の粒径を
有する粒子として加える０、：れを加える場合は、それ
らを巨大分子ポリペプチドと緊密に混和し、高分子全体
に均等にかつ独立して完全に分散させる。 多くの巨大分子ポリペプチドは少量の安定剤、バッファ
ー、塩等の添加によって好結果が得られる。この発明に
有用な水溶性成分はその他の活性成分蛋白質またはポリ
ペプチド、安定剤、炭水化物、バッファー、界面活性剤
および可塑剤等であるが、これに限定されるものではな
い、好適な安定剤の例はヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）
、ゼラチン、ブドウ糖、その他の炭水化物等である。こ
の発明に組入れて好適なその他の炭水化物は、スクロー
ス、マルトース、マンノース、グルコース、フルクトー
ス、ラクト−ス、ソルビットおよびグリセリン等である
。好適な界面活性剤は、ツイーン（商標、例えばツイー
ン−２０、ツイーン−８０等）、プルロニック（商標）
ＬＩＯＩ、Ｌ１２１およびＦ’１２７のようなプルロニ
ック・ポリオール類等である（これら周知の界面活性剤
の詳細については、メルク・インデックス第１０版のよ
うな標準的出版物を参照されたい）、好適な可塑剤とし
てはポリエチレングリコール、グリセリドおよびエチル
セル１フースが挙げられる。 ７トリツクス内のポリラクチドおよび水に不溶性成分に
対する巨大分子ポリペプチドおよび水溶性成分の相対比
は、投与すべきポリペプチドと所望の放出速度およびそ
の時間によって変化させることができる。巨大分子の活
性物質およびそれ以外の水溶性成分は、このシステムの
約３０重量％まで加えることができる。正確な足は、特
定活性物質の力価、その物理化学的および薬力学的な挙
動、その安定性、および所望の放出時間によって界なる
。 ポリラクチドマトリックスの好ましい組成は、（ａ＞ポ
リラクチド８０〜９９．９９９９重景％重量ｂ）生物活
性を有する巨大分子ポリペプチドおよびそれ以外の所望
により水溶性の成分０．０００１〜２０重量％である。 極めて活性なポリペプチドの場合、ポリペプチドおよび
それｐノ外の水溶性成分の重量合計がマトリックス全体
の重量の１０％、５″）ｆ、、２％またはそれ以下であ
ることができる。 この発明はインターフェロン類のゴ節された送達によく
適している。ポリペブチトマトソックスに組み入れるイ
ンターフェロンの量は、個々のインターフェロンおよび
先に列挙したそれ以外の因子ｃ乏より、好ましくは２０
％またはそれ以下とする。好ましい組成は、 （ａ＞ポリラクチド　９０へ、　９９．９９９　　重量
％、（１）’）　ＩＩ　ｕ　ＩＦＮ−β　０．００１〜
２重重量から成り、さらにそれ以外の水溶性成分を約１
０％まで含有することができる。 一層好ましい組成は、 （ａ）ポリペプチド　９５〜９９．９重量２Ｋ、（ｂ）
ＨｕＴＦＮ−β　０．０１〜０．１重景％重量成り、さ
らにそれＵ外の水溶性成分を約５％まで含有することが
できる。 とくに好ましい組成は、 （ａ）ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）［モル比５０
・５０、固有粘度的０．６４ｄＬ／ｇ３９７４７重量％
、 （ｂ）ＨｕＩＦＮ−β　０．０３重景−％、（Ｃ）ヒト
血清アルブミン　１．２５重量％、（ｄ）デキストロー
ス　　　　１，２５重量％から成る。これらのシステム
に組み入れる好ましいインターフェロンはｒ　ｌ−１ｕ
　Ｔ　Ｆ　Ｎ−βｗｃｒ１７でＪ）る。 （製造方法） この発明の送達システムは、所望のマイクロサスペンシ
ョンのコンホーメーションが達成され、巨大分子ポリペ
プチドの生物活性が実質的に保持され得る任意の方法に
よって製造することが可能である。好ましい方法は、ポ
リラクチド溶液中に調製したポリペプチドのマイクロサ
スベンジジンを噴霧キャスティングする方法である。熟
練した化学者はマイクロサスペンションをｆヤ成し得る
多くの方法を熟知しているであろう、以下に２つの新規
でかつ有用な方法を記載するく熟練者であれば、アセト
ンおよび２塩化メチレン以外でも、蛋白１丁がその溶媒
に適合し不溶性であるならばその溶媒を使用することを
考えつくことができる）。 （アセトン法） 巨大分子ポリペプチドおよびそれ以外の所望により水溶
性の成分バッファーから成るＮｖＲ水溶液を、選ばれた
ポリラクチドのアセトン溶液に室温で添加する。得られ
た混合液を標準的な回転撹拌機に掛け、約５〜１２０秒
間、好ましくは約１０秒間高速回転で撹拌する。生成し
たポリマー、ポリペプチドおよびその他の成分の沈殿を
約０５〜３０分間、好ましくは１０分間、５００〜１１
００ＯＸ、好ましくは７００Ｘｇの回転で遠心分離する
。 生じたアセトンおよび水の上滑を除去し、もう−度アセ
トンを加えてペレット中のポリマー（例えばＰＬＧＡ）
が溶解し、ポリマーアセトン溶液中のポリペプチドおよ
びそれ以外の水溶性成分にマイクロサスペンションが分
離してくるまで高速で回転する。 （２塩化メヂレン法） ポリペプチドおよびそれ以外の所望により水溶性の成分
から成るＭ９Ｂ水溶液を、運ばれたポリラクチドの２塩
化メチレン溶液に添加する。得られた混合液を、約１０
〜１８０秒間、好ましくは約−Ａ　　Ｏ−一 ６０秒間、白色のエマルションが生成するまで、高速で
回転する。このエマルションは直ちにエアブラッシまた
はその他の好適な噴霧装置に移し、以下に記載する噴霧
キャスティングを実施する。 （活性物質送達システムの作成） この発明の活性物質送達システムでは、目的とする固体
ポリペプチド／ポリラクチドマトリックス生成物におい
て、ポリペプチドおよびそれ以外の水溶性成分のすべて
の粒子の粒径が１０μまたはそれ以下であり、それらが
マトリックス全体に均等にかつ独立して分散しているマ
イクロサスペンションの形態を示すように作成される。 剤形を固化する際に、水溶性成分の液体マイクロサスペ
ンションが集合して巨大粒子とならないことを保証する
ため、好適な条件を使用してエアブラッシまたはその他
の好適な装置で、このマイクロサスペンションを粘着性
のない表面へ速やかに噴霧キャス）・することが好まし
い、平坦なフィルムを得るため、エアブラッシは噴霧す
べきシートまたはフィルムの表面から約４〜６インチ離
し、−定のイ↑動のもとて噴霧することが好ましい、好
適な非粘着性の面としてはポリプロピレン、テフロン、
ナイロン、ポリエチレンまたはその誘導体、およびその
他類似の非粘着性の材料が挙げられる。ポリプロピレン
、テフロンおよびポリエチレンが好ましい。噴霧キャス
ト皮膜の厚みは、約５μ位の薄さから約１０００μ位の
厚さにまですることができる。約１００μより厚い皮膜
の場合は、層を重ねて噴霧キャスティングする間に、乾
燥のためしばらく放置することが好ましい、ポリペプチ
ドの有機溶媒との接触をできるたり短くすることが望ま
しい場合は、皮膜は薄い方（約１０〜５０μ）が好まし
い。 −ａに得られたフィルムは、目的の放出調節剤形または
システムへ成形する前に完全に乾燥すべきである。皮膜
の厚みによって、完全な乾燥を達成し得る乾燥時間は１
時間以下から約３日間までを要し、所望によりマトリッ
クスが固化し気泡の発生が生じなくなったときから、減
圧下に乾燥することにより乾燥時間を短縮することがで
きる。 多くのポリペプチドにおいて、非経口的注射は好ましい
投与経路である。この発明のポリペプチド／ポリラクチ
ドマトリックス製剤は、液体マイクロサスペンジョンを
微粒子化し、得られた微粒子を空気または不活性気体の
向流または渦巻き流で乾燥することによって注射可能な
形態を作成することができる。このようにして得られた
微粒子はそのまま直接注射することができ、また適合性
のよい製薬上許容し得る注射可能な溶液または懸濁液に
配合することもできる。 この発明の調節送達システムは、細かな綱網、テフロン
網、または手術用の不活性付着のような不活性な製薬上
許容し得る物質で構造的に補強することができる。こと
に放出調節剤形をその活性送達部位から回収する必要性
が予想される場合、これを補強材料に配合することは有
用である。補強剤形は、好ましくは非粘着性の表面に広
げた補強材ｆ４の」二（、こポリペプチド／ポリラクチ
ドマイクロサスベンジジンを噴霧することによって作成
デきる。皮膜を暫時乾燥し、ついでこれを裏返して他方
の面を噴霧する。皮膜が所望の厚みに達するまでこの操
作を反復する。ポリマーの滑らがな層によって補強材料
の生地が完全に被覆されることが好ましい。 上記のような噴霧キャスティングによって得られた高分
子フィルムは、目的とする使用部位に合った任意の固体
剤形に成形することができる０例えばフィルムを一定の
寸法に裁断し、これを−枚づつの切片として皮下に埋め
込むことができる。 別法として、フィルムを巻き付け、所望の寸法の円筒形
の剤形とすることができる。多層フィルムを積層し、打
ち抜き裁断して事実上任意の大きさと形を有する剤形を
作ることができる０層の整合性は、貼り合わせた層の間
を、そのポリマーに合った溶媒または溶媒蒸気で軽く噴
霧またはブラッシすることに、１って確実にすることが
できる。 この発明の放出調節剤形は、１日より短い期間から数ケ
月間の長期にわたり、調節された速度で生物活性をイｆ
する巨大分子ポリペプチドおよびそれに付随した任意の
活性物質を送達すべく設計す−４４＝ ることができる、治療有効量のβ−インターフェロンを
、６０日〜１００日間皮下に送達した例を実施例１およ
び２および第１図に示す、実際の放出速度および持続時
間は、ポリラクチドポリマー１１えば、モノマーまたは
コモノマー、そのモル比およびその固有粘度の選択等）
またはコポリマーの選択、製剤の形および輪郭（例えば
、平らであるか、巻いであるか、単層が、多層か）、ま
た影響は比較的少ないが組み入れた活性物質の景によっ
て、この発明の実施の範囲内で変化させることができる
。 剤形に組み入れる活性物質の量は、高分子システム重量
の０．０００１〜３０％の範囲で変えることができる。 任意のシステムの最適量は活性物質の力価、所望の生理
的効果、処置期間の長さ、および活性物質の放出速度に
よってきまる。この発明の剤形は、好ましくは巨大分子
ポリペプチドの約０．０００１〜２０重量％を含有する
。 剤形の大きさも同様に活性物質の含有量、その放出速度
、処置期間によってきまる０例えば、あるポリペプチド
／ポリラクチド製剤が１０６単位／ＥＩの平均速度でポ
リペプチドを放出し、所望の処置期間が６０日である場
合、この製剤はポリペプチドを少なくとも６Ｘ１０’単
位含有する必要がある。システムに含有すべきポリペプ
チドの重量％に基づいて、剤形の必要な大きさが計算で
きる。 ［製造例］ 以下の製造例および実施例はこの発明をさらに詳細に説
明するためのものであって、発明の範囲を限定する目的
をもつものではない。 製造例１ ＴＦＮ−β遺伝子のＭ１３ベクターへのクローニング １本ＷＤＮＡ鋳型の供給源としてＭ１３ファージベクタ
ーを使用することは、テンプル（Ｔ、　Ｔｅｍｐｌｅ）
らによって示されているしネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、２９６巻、５３７〜５４０頁（１９８２年）］。 ＴＰＮ−β遺伝子を含んでいるプラスミド　ρβｔｒｐ
を、エシェリキア・コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１　）のしＩ−
ｐプロモーターの支配下に制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ賄およ
びＸ　ｈ　ｏ　１１で消化する。Ｍ１３ｍｐ８　［メッ
シング（，１，Ｍｅｓｓｉｎｇ）、「サード・クリーブ
ランド・シンポジウム・オン・マクロモレキュールズ・
レコンビナンｌ−Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｔｈｉｒｄ　Ｃ１ｅｖ
ｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏ−ｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：　Ｉｌｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄ
ＮＡ）　Ｊ、ワルトン（Ａ、　ＷａｌＬｏｎ）＃Ｔ４、
エルセビル・プレス社１４３〜１５３頁（１９８１年）
コの複製型（ＲＦ　）ＤＮＡを制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　
ＩｔおよびＢ　ａ　ｒｎ　１４１で消化し、これを先に
Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩおよびＸｈｏｌ＋で消化したｐβ１
．　　ｔｒｐ　　ＤＮＡと混合する。この混合物をＴ４
ＤＮＡリガーゼでライゲートし、連結されたＤＮＡをイ
ー・コリ、Ｊ　Ｍ　１０３株のコンビテンｉ・細胞へ導
入し、これらをＸｇａｌインジケーター・プレート」−
へ加える［メッシングらヌクレイツク・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ）、９巻、３
０９〜３２１頁（１−９８１年）］。 組換え体ファージを含んでいるブレーク（白色ブレーク
）を拾い、これをＪ　Ｍ　１．０３および感染細胞から
１ＩＩＩ製したＲＦ分子ミニブレプがら成る調製し立で
の培養へ接種する［バーンボイム（Ｈ，Ｄ、　Ｂｉ　ｒ
ｎ−ｂｏｉｍ）およびドリー（Ｊ、　Ｄｏｌｙ）、ヌク
レイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄ　Ｒｅ５）　、　７巻、１５１３〜１５２３頁（１
９７９年）］９種々の制限酵素でＲＦ分子を消化し、Ｉ
ＦＮ−β挿入体が含まれているクローンを同定する。ク
ローンＭ１３−β１から一本鎖（ｓｓ）ファージＤＮＡ
を作成し、これを、合成オリゴヌクレオチドを使用して
誘発する特定部位突然変異の鋳型として使用する。 製造例２ 特定部位突然変異誘発 アデノシン・１−リホスフェート（ＡＴＰ）０．１ｍＭ
の存在下に４０ピコモルの合成オリゴヌクレオヂドＧＣ
ＡへＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧ　（ブライマー）をＴ
４キナーゼで処理する［５０μＬ中、５０ｍＭ　塩酸ヒ
ドロキシメチルアミノメタン（トリス−ＨＣＬ　）（ｐ
＋−１８，０）、ｉｏｍＭＭ　ｇ　ＣＬ４．５ｍＭ　ジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｔ４キナーゼ（９単位）
含有、３７℃で１時間１゜−４８＝ 酵素処理を行ったプライマー（１２ｐＭ）を５５Ｍ１Ｂ
−βＩ　　ＤＮＡ　　５μｇ、！：、反応混合液５゜μ
Ｌ［５０ｍＭＮａＣ！、、１０　ｍ　Ｍ　ｌ−リス−Ｈ
ＣＬ（ｐ　Ｈ８，０＞、　　１．　０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２　、　１　０ｒｎＭ　　β−メルカプトエタノール］
中で６７℃で５分間、ついで４２℃で２５分間加熱して
ハイブリッドを形成する。このアニーリングした混合物
を氷上で冷却し、これを反応混合液５０μし［０、５ｍ
　Ｍづつ各デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）
、８０　ｍ　Ｍ　Ｉ□リス−ＨＣＬ（Ｔ）Ｈ７，４）、
８１１１Ｍ　ＭｇＣ１，２、］、　ＯＯｍ　Ｍ　Ｎ　ａ
　Ｃｌ５、ＤＮＡポリメラーゼ１クレノウ断片（９単位
）、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位
）含有］へ添加し、３７℃で３時間、ついで２５℃で２
時間インキュベー１・する、フェノール抽出およびエタ
ノール沈殿を行って反応を停止させる。１０ｍＭ１−リ
ス−１−Ｉ　ＣＩ、（１：）　Ｉ−１’８’、　０　）
　、　１．　Ｏｒｎ　Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）、５０％スクロースおよび０．０５％ブロモフェ
ニルブルーにＤＮＡを溶解し、臭化エチジウム２μｇ／
ｍＬの存在下で０．８％アガロースゲル上で電気泳動す
る。ＲＦＭ１３−β１に対応するＤＮＡバンドを切り取
り、これを過塩素酸法によって溶出する［デービスら（
Ｒ，ＷＤａｖｉｓ）、［アドバンスト・バクチリアル・
ジエネティックス（＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、コールド・スプリングバ
ーバー−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｉｒｙ）、ニューヨーク、１
７８〜１７９頁（１９８０年）コ。溶出したＤＮＡをコ
ンビテンｌ−Ｊ　Ｍ　１０３細胞の形質転換に使用し、
これを−夜発育させた後、その培養の」〕清から１本鎖
（ｓｓ）ＤＮＡをｊｌｌ−離する。この５ｓＤＮＡを使
用してもう１度プライマーの伸長を繰り返し、ゲル精製
したＲＦＤＮＡをコンビテンｌ−Ｊ　Ｍ　ｉ　Ｏ３細胞
へ導入し、寒天プレートに接托して一夜インキユベート
し、ファージ・ブレークを得る。 製造例３ 突然変異原化したブレークのスクリーニングおよび同定 突然変異を起こしたＭ２Ｓ−β】ブレークを含んだブレ
ー■・と２枚の突然変異を起こしていないＭ２Ｓ−β１
ファージ・ブレークを含んだプレートを４℃に冷却し、
各プレート毎に２枚づつの乾いたニトロセルロース・フ
ィルターを用意して第１のフィルターは５分間、第２の
フィルターは１５分間、寒天プレー１〜上に重層してフ
ァージ、ブレークをプレートからフィルターへ移す、５
分間０．２ＮＮａＯＨ１１，５ＭＮａＣＬ、０．２％ト
リトン フィルターを置き、さらに５分間、０．５Ｍｌ〜リスＩ
ｉＣＩ、（　ｐ　）■７　、　５　）および１．５Ｍ　
ＮａＣＬに浸した２戸紙」二に置いて中和する。これら
のフィルターを同様なやり方で．２ＸＳＳＣ　（標準食
塩水・クエン酸塩）に浸した濾紙で２回洗浄し、乾燥後
、真空炉で２時間８０℃で加熱する．重複フィルターを
、フィルター当り１．　０　＋ｎ　ＬのＤＮＡハイブリ
ダイゼーション・バッファー（５ＸＳＳＣ）（ｐｌ＋７
．０）ｒ４Ｘデンハート溶液（ポリビニルピロリジン、
フィコール、ウシ血清アルブミンそれぞれ］Ｘ＝０．０
２％＞、ｏ．ｉ％ドデシル碗−５　　１．　− 酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭリン酸すトリウム・
バッファー（ｐＨ７．０）、変性したザケの精液ＤＮＡ
　（１，ＯＯμｇ／ｍｌ、）］と５５℃で４時間プレハ
イブリダイズする．酵素反応によってオリゴヌクレオチ
ド・ブライマーを３２ｐ−標識ＡＴＰで標識し、ｌ１２
ｐ−標識１０ーブを作成する。 フィルターをＤＮＡハイブリダイゼーション・バッファ
ー（フィルレター当り５ｍ１．）中で５５℃て′２４時
間ハイブリッド形成し、Ｓ２ｐ−標識プライマー（３．
５Ｘ１０うｃｐｍ／ｍＬ）を作成する。 フィルターを０．１％ＳＤＳを含有し，ｓｓｃＢ。 を暫減させた洗浄用バッファーで５５℃：Ｃ−３０分間
洗浄する．Ｒ初フィルターを２ｘｓｓｃを含有するバッ
ファーで洗浄し突然変異を起こしていないＭ２Ｓ−β１
ブレークを含んだ対照フィルターの放射能の存在につい
て検査する．洗浄バッファーのＳＳＣ濃度を段階的に低
下させ、突然変異を起こしていないＭ２Ｓ−β１ブレー
クを含んだ対照フィルターに検出し得る放射能が認めら
れなくなるまでフィルターを洗浄する．フィルターを空
気乾燥し、−７０℃で２〜３日間オートラジオグライー
に掛ける。 製造例４ イー・コリにお（プる突然変異体ＩＦＮ−βの発現 Ｍ２Ｓ−ＳＹ２５０］から得たＲＦ　　ＤＮＡを制限酵
素Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩおよびＸｈｏｌ＋で消化し、そ
の５　２　０　１：ｌ　ｐ挿入断片を１％アガロースゲ
ル上で精製する．イー・コリ　ｔｒｐプロモーターを含
有している１ラスミドｐ　Ｔ　ｒ　ｌ）３を酵素Ｈ　ｉ
　ｎ　ｄ　ＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、これを精製
したＭ２Ｓ−ＳＹ２５０１　　ＤＮＡＩｉｌｉ片と混合
し、１’ａＤＮＡリガーゼの存在でライゲートする．ラ
イグー１−　したＤＮＡをイー・コリＭＭ２９４株へ導
入する。 アンピシリン耐性の形質転換株をテトラサイクリン薬物
感受性についてスクリーニングする．５個のアンピシリ
ン耐性、デトラサイクリン感受性クローンから得られた
プラスミドＤＮＡをＨ　ｉ　ｎ　ｆＩで消化し、Ｍ２Ｓ
−ＳＹ２５０１挿入体の存在をスクリーニングする。 クローンｐｓＹ２５０１と命名されたプラスミドは、ジ
・アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレク
ション（ｔｈｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ａｇｒｉ
−ｃｕｌｔｕｒａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ）。 ファーメンテーショ〉・・ラボラトリ−（Ｆｔ！ｒｍｅ
ｎ−ｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ノーザン
・レジオナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）
、サイエンス・アンド・エデュケーション・アトミニス
トレージョン（Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｃｌ　Ｅｄｕ−ｃ
ａｔｉｏｎ　Ａ街ｎ１ｎｉｓ叶ａｔｉｏｎ）、υ、Ｓ、
デパートメント・オブ・アグリカルチャー（Ｕ、Ｓ、　
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）
、１８１５ノース・ユニバーシティ・ストリート（Ｎｏ
ｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ）、ベオ
リア（Ｐｅｏｒｉａ）、イリノイズ（ｌ１１ｉｎｏｉｓ
）、６０６０４から入手可能であり、ＣＭＣＣＮｏ、　
１５３３　およびＮＲＲＬ　　Ｎｏ、ＩＥＩ−１５３５
６の番号のもとに受は入れられている。 ｐ　Ｓ　Ｙ　２５０１およびｐβＩ　ｔｒｐ　の培養は
１．０の光学密度（ＯＤ６ｏｏ）まで増殖する。＃ｓ胞
を含んでいない抽出物を調製し、微量滴定法によりＩＦ
Ｎ−β　抗ウイルス活性値をＧ　Ｍ　２７６７　（Ｉｌ
ｆ乳動物）細胞で検定する。 製造例５ Ｉ　Ｆ　Ｎ　−ｔ３　ｓｅｒ＋７　ノｔ＃’ＡＩＦＮ−
β１゜１１□を生産するよう形質転換したイー・コリ菌
からＩＦＮ−βｗｅｒ１７を回収する。こσ〕イー　コ
リ菌は下記に示した組成の増殖培地に６８０　ｎ　ｍで
、ｏＤ１０〜１１まで増殖する（屹Ｎ　　Ｈ４Ｃ，Ｌ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　
０　　＋口　ＭＫ２ＳＯ４１６，１ｍＭ Ｋ　ＨｚＰＯ＜　　　　　　　　　７．８　ｍ　ＭＮ　
ａ　２１−ｌ　Ｐ　Ｏａ　　　　　　　　１．２　、２
　ｍ　ＭＭｇＳＯ４・７８．０　　　　３ｍＭ クエン酸Ｎａ２・２Ｈ２０１，，５ｍＭＭ　ｎ　Ｓ　Ｏ
４・４　Ｈ２０３０ｕ　ＭＺｎＳＯａ・７１１□０３０
）１Ｍ （：１４ＳＯａ・５＋−＋２ｏ３）ｔｈり１−−トリプ
トファン Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ　ａ　・７　Ｈ　ｘｏ　　　　　　　　
７　２　ｔｔ　Ｍ塩酸チアミン　　　　　　　　２０ｍ
ｇ／Ｌグルコース　　　　　　　　　４０ｇ／ＬＮＨ．
○ＨでｐＨを調節する。 形質転換したイー・コリ　からの回収物９．９Ｌ（９．
９ｋｇ）を２０℃に冷却し、回収物を十字流フィルター
に通し、平均圧力降下１１０ｋＰａ、定常濾過流速２６
０ｍＬ／分の速度で枦液重量が８、８ｋｇとなるまで通
過させる．濃縮！ＩＩＪ（約Ｉし）を容器に移し、１５
℃まで冷却する．ついで濃縮物をメイソン・ゴーリン（
Ｍａｓｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ）ホモジナイザーに掛け（５
℃、６９０００ｋＰａ）、濃縮物中の細胞を破砕する．
ホモジナイザーをリン酸緩衝食塩水ＩＬ　　（ＰＢＳ．
ｐＨ７．４）で洗浄し、洗浄液を破砕物に加えて、最終
審Ｊｉ２Ｌとする．この容量を連続遠心に掛ける（１２
０００Ｘｇ．流速５　０　ｍ１７分）、固体を上清から
分離し、これをＰＢＳ　（２重量％ＳＤＳ含有）４［に
再浮遊する．この浮遊液を室温で、浮遊物が見えなくな
るまで１５分間撹拌する．ついでこの溶液を２−ブタノ
ールで抽出する（２−ブタノール：溶液の容積比＝１：
１）、抽出液を液液相分離機に掛ける（流速：２００ｍ
ｌ／分）、有機相を分取し、これを蒸発乾固して蛋白質
２１．３ｇを得る．この蛋白質を蒸留水に１；１０の容
積比で再浮遊させる。 これらの製造に使用したイー・コリ株は、商業的に入手
可能な材料であって、例えばＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ。 の、Ｌうなカルチャー・コレクションズ等の供給源から
入手できる．またＴＦＮ−β＊ｔｒ１７も商業的に入手
可能な既知物質である．また米国特許第４５１８５８４
号を参照にされたい。 ［実施１＠ｌ］ 実施例１ インターフェロンを含有する放出調節剤形の製造方法（
アセトン法） Ａ．ＩＦＮ，／ＰＬＧＡマイクロサスペンションの作成 り、Ｌ−Ｐ　ＬＧＡ　１　ｇ　（モル比１：１、固有粘
度０　　０４　ｄＬ／ｇ）１　ｇを室温でアセトン５ｍ
ｌ　に溶解した０組換え体Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−βＱ、３ｍ
ｇをバッファー１ｍｌに浮遊した浮遊液（Ｈ３八　１２
゜５ｍｇ、デキストロース１２．５ｍｇ含有）をＰＬＧ
Ａアセトン溶液に加え、得られた混合液を約３０秒間高
速回転した。生成したＰＬＧＡ、）ＩＳＡ、ＩＦＮおよ
び（おそらく）デキストロースの沈殿を、１０分間７０
０Ｘｇで遠心した。アセトンおよび水から成る上滑をピ
ペットで分取し、残渣の液体部分を綿布で除去した。ア
セトン１０ｍ１を加え、ベレット状のＰＬＧＡが溶解し
、ＨｕｌＦＮ−β、Ｈ３ＡおよびデキストロースがＰＬ
ＣＡのアセトン溶液中でマイクロサスペンションと成る
までこの混合物を高速で回転した。 Ｂ、ＩＦＮ／Ｆ’ＬＧＡマイクロサスペンションの噴霧
キャスティング Ａ項に記載したＩＦＮ／ＰＬＧＡマイクロサスペンショ
ンを、エアブラッシで１５ＰＳＩの圧搾空気を使用して
清潔なポリエチレンシートへｎｔｉした。ＰＬＧＡの膜
の厚みがほぼ５０μの一定な厚さのフィルムが得られる
ように、エアブラツシはシート表面から４〜６インチ雛
し、−定した状態で１ヤ動して噴霧を行った。 Ｃ，フィルムの補強 Ａ項に記載のＩＦＮ、／ＰＬＧＡマイクロサスベンジタ
ンを使用し、絹で補強して噴霧キャスト・グフイルムを
作成した。 細かく編織した　　綱網を枠に張り、その張られている
部分に１００ｍｇ／ｍｌｃ度のＰＬＧＡ（モル比５０　
：　５０．固有粘度０．６４）のアセトン溶液を塗布し
た。濡れた網をそのまま乾かし綱網の網目が完全に塞が
るまでＰＬＧＡ溶液を繰りｊグし塗布して適用した。乾
燥した網をポリエチレンシート上に置き、ＴＦＮ／ＰＬ
ＧＡマイクロサスペンションをこれに噴霧キャスティン
グした。 １時間乾燥後、被覆した面を裏返し、裏面を被覆し、再
度ＩＦＮ／ＰＬＧＡマイクロサスペンションを噴霧して
、ポリマー層が約１００μの厚さとなるまで続けた。さ
らに１時間乾燥後、先に噴霧した側をもう一度噴霧し、
乾燥放置し、もう−度裏返してあとから噴霧した側を再
度噴霧した。得ちれたフィルムのＢＩＡ＊は３００μで
あった。 Ｄ、ＢおよびＣで得られたフィルムを、室温で１８時間
貯蔵した。ついでそれらをポリエチレンシートからはが
し、室温で３日間乾燥しな。 Ｅ、製剤の成形（Ｄ　ｅｖｉｃｅ） Ａ−Ｄ項の記載で得られた噴霧キャストフィルムを使用
して、下記の放出調節剤形を作成した。 ａ、補強しなかったフィルムを裁断した、平らなフィル
ム断片（ＩＸ２ｃｍ）。 ｂ、補強をしたフィルムを裁断した、平らなフィルム断
片（ＩＸ２ｃｍ）。 Ｃ１袖強しなかったフィルムを平らフィルム断片（３Ｘ
　５　ｃ　ｍ　）に裁断し、これを１８番ゲージの針金
に巻き付け、末端５ｍｍの長さの部分に綿布でごく軽く
アセトンを適用するかまたはアセトン蒸気にさらすこと
によって、フィルムを針金にしつかりとり付けた。針金
を抜き取り、環を５〜１０ｍｍの長さに細断した。 ｄ、補強をしたフィルムを平らなフィルム断片（３Ｘ５
ｃｍ）に裁断し、これを１８番ゲージの針金に巻き付け
、末端５　ｍ　ｍの長さの部分に綿布でごく軽くアセト
ンを適用するかまたはアセトン蒸気にさらすことによっ
てフィルムを針金にしつかりとり付けた。４金を抜き取
り、環を５〜１０Ｉｌｌ　ｍの長さに細断した。 これらの剤形を、マウスの皮下に１００日間埋め込んだ
ときの放出像を第１図に示した。第１図において、剤形
１．２および３はそれぞれａ、ｂおよび０項の記載によ
って゛成形した剤形である。 実施例２ インターフェロンを含有した放出調節剤形の作成（二塩
化メチレン法） Ｄ、Ｌ−ＰＬＧＡ（モル比５０　：　５０、固有粘度ｏ
、６４ｄｌｙｇ＞　１　ｇを二塩化メチレン４ｍｌ　に
溶解した。ヒト血清アルブミン（）ＩｓＡ）１２．５ｍ
しおよびデキストロース１２．５ｒｎＬを含有するバッ
ファー１ｍｌ　に浮遊させた組換え体ＨｕＴＦＮ−β０
．３ｍｇをＰ　Ｉ−Ｇ　Ａ溶液に添加した。得られた混
合物を白色のエマルションが生成するまで約６０秒間高
速で回転させた。エマルションは直ちにエアブラッシに
移し、実施ＰＡｌのＤ項記載のようにこれをポリエチレ
ンフィルム上に噴霧し乾燥した。 放出調節剤形は１８番ゲージの針金に、３　ｃ　ＩｎＸ
５ｃｍのフィルム断片を巻きイづけることによって成形
し、巻き付けた環の末端をアセトンで処理することによ
ってしっかりと固定し、針金を抜いて、環を５または１
０ｍｍの長さに細断した。 この剤形を、６０〜１００日間マウスの皮下に埋め込ん
だときの放出像を、第■の剤形４に示した。 火砲例３ マウスの皮下に埋め込んだときのイン・ビボにおける放
出像の測定 Ａ、β−インターフェロンの放出像 実施例１および２に記載のように、剤形１〜４をそれぞ
れ６０個づつ作成した。ただしＨｕ　Ｉ　ＦＮ−βは、
放射能を標識したβ−インターフェロン（”’Ｉ−ｒＨ
ｕ　Ｉ　ＦＮ−βｓ　＊　ｒ　ｌ　？　）を使用した。 これらの剤形を１．２５’ｍラドのγ線照射によって滅
菌し、ＩＣＲ系虻性マウス（体重１８〜２０ｇ）の背面
皮下に埋め込んだ、各マウスにそれぞれ１個づつを坪め
込んだ、埋め込み期間を変えて（１〜１００　Ｅ１間）
剤形をマウスからとり出し、残存する宜”Ｌ−ｒＨｕｌ
ＦＮ−βａｃｒ１７の放射能を測定した。第１図に、剤
形１〜４の１００口までのイン・ビボにおける放出像を
示した。 実施例４ 粒子の大きさおよびその分布の測定 リコ施１４ｉ１１１および２の記載により作成しなＰＬ
ＧＡ／ＩＦＮフィルムについて、各製剤中のインターフ
ェロンおよびそれ以外の巨大分子（ヒト血清アルブミン
およびデキストロース）の粒子の大きさを下記の方法で
測定した。 Ａ、実施例１の記載により作成したＰＬＧＡ／ＩＦＮフ
ィルム Ｄ、Ｌ−ＰＬＧＡ　（モル比５０　：　５０、固有粘度
０．６４ｄｌ／’ｇ）を室温でアセトン５ｔｎＬに溶解
した。組換え休ＨｕｌＦＮ−β０　、３　ｒｎ　ｇをバ
ッファー１ｍＬに浮遊した浮遊ｔｉ　（Ｈ３Ａ　　１２
．５ｒｎｇデキストロース１２．５ｍｇ含有）をＰＬＧ
Ａアセトン溶液に加え、得られた混合液を約１０秒間高
速回転した。生成したＰＬＧＡ、Ｈ３Ａ、Ｉ　ＦＮおよ
び（おそらく）デキストロースの沈殿を、１０分間７０
０Ｋｇで遠心した。アセトンおよび水から成る上清をピ
ペットで分取し、残渣の液体部分を綿布で除去した。ア
セトン１０ｍ１を加え、ベレット状のＰＬＧＡが溶解し
、ＩＦＮ、Ｈ３Ａおよびデキストロース沈殿がアセトン
溶液に溶解しているＰＬＧＡに懸濁するようになるまで
この混合物を高速で回転した。懸濁液の１滴をガラスス
ライドに載せてカバーガラスをかぶせ、偏光顕微鏡で、
１００×の倍率で１０μｍ目盛りの接眼網目を使用して
検鏡した。 ＰＬＧＡ／アセトン溶液に懸濁している固体巨大分子（
ＩＦＮ、Ｈ３Ａ、デキストロース）の粒子の大きさは検
出限界に等しいかもしくはそれ以下（約１００〜５００
ナノメーター）から１００μまでの範囲であった。１０
μより大きい粒径を有する粒子は、粒子数合計の１０％
以下であってはとんどの粒子の直径は１μより小さかっ
た。すくなくとも他の１個の粒子と接触しているのが観
察されたのは、可視粒子の１０％以下であった。 Ｂ、実施例２の記載のように作成したＰＬＧＡ／Ｔ　Ｆ
Ｎフィルム 実施例２に記載した方法で作成したＰＬＧＡ／ＴＦＮマ
イクロサスペンションの１滴をガラススライドに載せて
カバーガラスをかぶせ、光学顕微鏡で、１００×の倍率
で１０μｍ目盛りの接眼網目を使用して検鏡した。１０
０Ｘの倍率では何らの粒子も認められず、すべてのＩＦ
ＮおよびＨ３Ａの粒子の大きさは検出限界（１００〜５
００ナノメーター）またはそれ以下であることが判明し
た。 実施例５ インターフェロンの生物学的抗ウィルス活性の検定 インターフェロンの生物学的抗ウィルス活性の検定は、
ヒト・ウイッシュ細胞（ＷＩＳＨｃｅ口）における水痘
性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）の細胞傷害性効果の阻止作
用を追求することにより、細胞に対するインターフェロ
ンの効果を測定することができる。細胞傷害を起こした
ウィルスは光学顕微鏡で視ることができる。活性インタ
ーフェロンとともにインキュベートした細胞では、ウィ
ルスの増殖が減少する。活性インターフェロンの単位は
、インターフェロン製剤の希釈終末点の逆数として表さ
れ、その終末点はウィルス増殖を約５０％阻止する希釈
濃度として定義付けられる。 既知濃度の［”’Ｉ　］　ｒＨｕ　］　ＦＮ−βｓ＠ｒ
＋７を添加し、実施例１および２に記載した放出調節シ
ステムに含有されたインターフェロンを、実施例６の記
載のように、このシステムから抽出した。 以下Ａ〜Ｄに記載のように抽出したインターフェロン検
体を測定し、製造したシステム中のインターフェロンの
生物活性を標準貯蔵品インターフェロンの生物活性と比
較して決定した。 Ａ、方法 イーグルの最小必須培地（’ＥＭＥＭ）５０μ［を加え
た滅菌した９６穴のミクロ滴定板のウェル（穴）の列に
、検定すべき各インターフェロン検体および標準物質２
５μｍ　（／ウェル）づつをピペットで添加する。標準
物質はナショナル・インキュベ−ト・オブ・ヘルスから
入手した国際標砧品）（ｕｌＦＮ−β（ｔ１’：型番号
Ｇ−０２３−９０２−５２７）を使用した。各検体はそ
れぞれ２回づつ重複して試験し、各滴定板の１列目はＥ
ＭＥＭをさらに２５μＬ追加して対照とする。ついでブ
レートを紫外線で６分間照射し細菌の発育を防止する。 ついでミクロ滴定板の残りのウェルにそれぞれＥＭＥＭ
で希釈した５０μＬの希釈検体の３倍系列希釈（標１４
に、１／２　ｌｏｇ　Ｉｌ＋希釈）をｍｔｒる。 ウジ胎児血清（Ｆｅ２）の２％ＥＭＥＭ溶液５０μｍ４
を添加し、ついでヒトのウイッシュ細胞を５％ＦＣＡ加
ＥＭＥＭによく混合した浮遊液１００μＬを、ウェル当
りの細胞数２．５Ｘ１０’となるように加える。ついで
滴定板を５％ＣＯ２気流中３７℃で２４時間インキュベ
ー１・する。 ウイッシュ細胞浮遊液を添加して約２４時間後に、少な
くとも細胞１個当り１個のブレーク形成単位のｖＳＶを
添加して調製したｖＳＶのＥＭＥＭ希釈液５０　Ｂ　Ｉ
　を、対照とした４個のウェルを除いて、各ウェル毎に
添加する。 ウィルス処理をした滴定板を５％ＣＯ２気流中３７℃で
インキュベートシ、ＶＳＶ添加後約１８時間に判定する
。 Ｂ８判定 滴定板を光学顕微鏡下に読み、ウィルス対照が完全に細
胞傷害効果（ＣＰＥ）を表し、予期したタイターで対照
の終末点に達する評価点を記録する。各試験ウェルの評
価点は下記の通りとする。 ＳＰ：ＣＰＥの疑い ｌ：２５％の細胞がＣＰＥ ２：５０％の細胞がＣＰＥ ３ニア５％の細胞がＣＰＥ ４：１００％の細胞がＣＰＥ Ｃ：ＩｔａＩ菌汚染 ＣＴ：細胞毒性 検体滴定の終末点は、最初に５０％ＣＰＥと判定された
ウェルで決める。ＴＦＮのｌｏｇ　＋ｏ単位／口ＩＩ　
で示されるタイターはウェルの希釈度に対応しており、
標準対照の読みによって補正する。 ０、インターフェロンの比生物活性の計算希釈していな
い各インターフェロン検体の１〜５０　Ｂ　Ｌの３個の
アリコートの放射能を、パラカード（Ｐａｃｋａｒｄ）
・ガンマ・カウンターで測定する。 カウント７分（ＣＰＭ）の結果から単位容積当りのカウ
ント（ＣＰ　Ｍ　／　ｍ　ｌ　　＞を決定する。Ａ項お
よびＢ項記載の方法で測定した各検体のＴＦＮ活性（Ｉ
ＦＮ単位／ｍｌ）を各検体のＣＰＭ／ｍｌで割るとＴＦ
Ｎの活性が単位／ＣＰＭで出る。 製造されたポリラクチド製剤から抽出して得られた各検
体の単位／ＣＰ　Ｍの値を、対応するポリラクチド／イ
ンターフェロン・システムの製造に使用した出発インタ
ーフェロン物質（標準貯蔵品］　ＦＮ）の単位／Ｃ１）
Ｍの値で割ると標準貯蔵ＩＦＮの比活性に対する抽出し
たインターフェロンの比活性の割合が出る。このように
してして得た割合に標準貯蔵品ＩＦＮに対するＴＦＮの
単位／ｍ［値を掛けた値が、抽出ＩＦＮ検体の標準貯蔵
品ＴＦＮ単位／　ｒｎ　Ｌ当量である。 各抽出検体の標準貯蔵品ＩＦＮ単位／ｎ１［当量のｌｏ
ｇｌｏを相対ｌｏｇ　ＩＱ　Ｉ　Ｆ　Ｎ活性（ＲＬＩＡ
）と叶ぶ、試験した各検体群のＲＬＩＡ値を平均し、こ
れを好適な標準貯蔵品のｌｏｇ　、。ＩＦＮ単位ＺｍＬ
値と比較する。また試験動物（例えばマウス）に埋め込
み、試験期間中、数回の間隔（例えば１り月）をおいて
段階的に回収する一連の剤形から得られたＲＬＩＡ値の
線形回帰分析によって、さらに粘度を高めることができ
る。埋め込んだ日数（Ｘ軸）に対するＲＬＴＡ値（Ｙ軸
）のグラフから描かれた線のＹ軸との交点は、埋め込み
前の製剤中に含有されているインターフェロンの活性を
示している。 Ｄ、成績 この発明の新規放出調節剤形において、製造後生体に適
用する前のＲＬ　Ｉ　Ａ値は、対応するポリペプチド標
準貯蔵品のｌｏｇ　Ｉｌｌ　Ｉ　Ｆ　Ｎ単位／ｍＬの１
７２またはそれ以上であることが判明した。 実施例１および２の記載のようにして作成したインター
フェロン、・′ポリラクチド製剤をこの実施例の記載に
より測定すると、組み入れたインターフェロンの生物活
性を本質的に全く失わない６すなわち製剤後、埋め込み
前の平均ｒｊ　Ｌ　］　Ａ値は、その製剤に使用したＴ
ＦＮ標準ｊ？蔵品のＩｏＢ　、。 ＩＦＮＪＩＩ位／　ｍ　Ｌと本質的に差がない。 実施例６ ポリペプチドマ）・リックスからのポリペプチドの抽出 Ａ、実施例１および２により作成したポリラクチドマト
リックス剤形からのインターフェロンの抽出 実施例１および２に記載の方法により標準インターフェ
ロンから作成し、濃度既知の［＋２５７］ｒ　ｌ−１ｕ
　］　Ｆ　Ｎ−β、、、、７を添加したインターフェロ
ン含有製剤をそれぞれアセトンに溶解しくアセトン］Ｏ
ｍ１に対してポリラクチド３００　ｔｏ　ｇまで）、ポ
リラクチドが完全に溶解するまで高速回転してインター
フェロンを沈降懸渇させた。各懸濁液を７００Ｘｇで１
０分間遠心し、アセ）・ン／ポリラクチド上清を除去し
た。残渣ベレ・ソトを減圧下に室温で２４時間乾燥し、
ひきつづきｌ５Ａ１２．５ｍｇ／’ｍｌおよびデキスト
ロース１２．５ｍ　ｇ　、／　ｍ　ｌ　からなる混合ｆ
ａ　Ｏ、５ｍ　Ｌで室温で１時間、定期的に桜やかにか
き混ぜて抽出した。各試験管を７００Ｘｇで１０分間遠
心し、インターフェロンを含弔している上滑を取り、４
℃で貯蔵した。１０．５０および１００μｌの上清検体
を使用して噴位容是当りの放射能を測定した。さらにイ
ンターフェロン活性を測定して、抽出したインターフェ
ロンの比活性＜ＩＦＮ単位／放射能力ウンつ−／分）を
貯蔵インターフェロン出発原料の比活性と比較した。抽
出したインターフェロンの単位容量当りの放射能および
生物活性の測定は、実施例５に記載した。 実施例７ 既知の加熱成形法によるポリラクチド送ｊ室剤形中のＨ
ｕｌＦＮ−βの生物活性 Ａ、加熱成形ポリラクチド剤形の作成 この発明の範囲外である既知の加熱押出法によりＨｕｌ
ＦＮ−βを活性成分として含有するポリラクチドマトリ
ックス薬物送達剤形を作成した。 この方法は加熱押出装置にポリペプチドおよびポリラク
チドを加えて混合する方法である。Ｄ、Ｌ−ｒｌ　Ｌ　
Ｇ　Ａ　（モル比５０１５０　、固有粘度０．６４）Ｊ
ｏｇを凍結乾燥した組替えヒト・インターフェロン［１
バイアル中、ＩＦＮ・β　０．３ｍｇ（インターフェロ
ン４．２Ｘ１０’単位）、ヒと血清アルブミン１２．５
ｍｇ、デキストロース１２．５＋ｎ　ｇ含有］２５バイ
アルの内容物と混合した。混合物を加熱押出装置の挿入
ロートに加え、約７５℃の温度で３　ｍ　ｍの環状押出
しダイから押出し、＠副空冷によって直ちに室温珪で冷
却した。得られたインターフェロン／ポリラクチド部材
の棒を７ｍｍの長さに細断した。 Ｂ、インターフェロンの抽出 Ａ項で記載した方法によって作成したインターフェロン
／ポリラクチド部材をそれぞれ秤量し、緩衝液１ｍＬ　
　［７４，９％リン酸バッファー（ｐＨ７，４）、２５
％エタノール、０．１％ＳＤＳ］を含有している２ｍＬ
づつの２個のガラス製バイアルに加えた。バイアルを４
℃に保ち、２４時間ゆるやかにかき混ぜた。抽出終了後
、部材をバイアルから除き、抽出液を測定するまで４℃
で貯蔵した。 Ｃ，インターフェロンの生物活性測定 抽出物の生物活性（単位／ｍＬ）を実施例５の測定方法
で測定した。各部材に含有されていた総インターフェロ
ン量を乾燥部材の生成物およびその組成の乾燥重量当り
インターフェロン（単位／ｇ）から計算した。 Ｄ、成績 加熱成形剤形から抽出したインターフェロンのＲＬＩＡ
（相対１０８＋ａインターフエロン活性）は対応するイ
ンターフェロン標準貯蔵品のＩＯｇ＋ａ単位／　ｍ　ｌ
の１％よりも少なかった。 実施例８ 微粒子化した注射または埋め込み可能な放出調節製剤の
作成 実施例１および２の記載によりポリラクチド溶液に！ざ
濁したインターフェロンのマイクロサスペンションを調
製した。この液を噴霧装置で微粒子化し、得られた微粒
子を乾煙し、清浄空気、窒素またはその他の不活性気体
の向流または渦巻き流中に加えて小球化した。得られた
ポリペプチド／ポリラクチドマトリックスの微粒子を減
圧下に３日間貯蔵し、ついで使用または貯蔵するため、
分級した この方法で作成した放出調節剤形は注射用懸濁剤として
、あるいは皮下または筋肉内に埋め込み投与することが
できる。 実施例９ 以下にこの発明に開示した方法によって作成した微粒子
化したポリペプチド／ポリラクチド粒子の非経口注射用
製剤を記載する。 実施例８の記載に従って作成したポリラクチドを含有し
た微粒子化インターフェロンを下記の溶液に懸濁しな。 カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５％ ＮａＣＬ　　　　　　　　　　　　　　　　０．６％ベ
ンジルアルコール　　　　　　　（１，９％ツイ＞８０
　　　　　　　　　　　　　　（１，１％精製水を加え
て全量１００％とする。 例えばインターフェロン／ポリラクチドの微粒子３３０
　ｍ　ｇを上記の溶液５．５ｍｌに懸濁させて注射可能
な懸濁液０．５　ｍｌ　当りインターフェロン９　ｊｊ
　ｇを含有する注射剤が提供される。 以上のｌ！ｖ説および特殊態様はこの発明の範囲および
実施態様を例示的に説明しようとするものであって、こ
れによって発明の範囲が制約されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３に記載した試験の成績を示したグラフ
であって、マウスの皮下に埋め込んだ活性物質送達シス
テムから放出されたβ−インターフェロンの放出像を示
している。 埋め込み期間は６０−１００日であり、システムは実施
例１および２にしたがって製造したちのである。 ４＋Ｍ＋　１３２７７人　シンテックス（ニー・ニス・
エイ）インコーホレイテッド

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）巨大分子ポリペプチドおよび所望によりそれ以外
   の水溶性成分から成る粒子を約３０重量％を越えること
   なくポリラクチドに分散させて含有して成る高分子マト
   リックスを含むシステムであって、ここで該ポリペプチ
   ドおよびそれ以外の水溶性成分を含有している粒子の直
   径は実質的にすべて１０μまたはそれより小さく、それ
   らを均等にかつ独立してマトリックス全体に完全に分散
   させ、しかもマトリックス製造前に保有していたポリペ
   プチドの生物活性の少なくとも約５０％をなお保有して
   いる高分子マトリックスを含んで成る巨大分子ポリペプ
   チドを哺乳動物に調節投与するための活性物質送達シス
   テム。
2. （２）ポリペプチドが約１００００より大きい分子量を
   有する、特許請求の範囲第１項記載のシステム。
3. （３）ポリペプチドがサイトカイン類、リンホカイン類
   、モノカイン類およびインターフェロン類の何れかの部
   類から選ばれたものである、特許請求の範囲第１または
   ２項記載のシステム。
4. （４）ポリペプチドがインターロイキン−１、インター
   ロイキン−２またはそれらの類似体である、特許請求の
   範囲第３項記載のシステム。
5. （５）一層または多層の噴霧キャスト・フィルム層から
   形成されている、特許請求の範囲第１〜４項の何れ１項
   記載のシステム。
6. （６）生物学的な適合性を有する不活性補強物質を含ん
   で成る、特許請求の範囲第５項記載のシステム。
7. （７）ポリペプチドがカルシトニンまたはその類似体、
   または副甲状腺ホルモンまたはその類似体である、特許
   請求の範囲第１〜６項の何れか１項記載のシステム。
8. （８）ポリペプチドが表皮成長因子、形質転換増殖因子
   −α、形質転換増殖因子−βまたはその類似体である、
   特許請求の範囲第１〜７項の何れか１項記載のシステム
   。
9. （９）ポリペプチドがβ−インターフェロンである、特
   許請求の範囲第１〜６項の何れか１項記載のシステム。
10. （１０）ポリペプチドが免疫刺激物質もしくは免疫抑制
    物質である、特許請求の範囲第１〜６項の何れか１項記
    載のシステム。
11. （１１）酵素がスーパーオキシド・ジスムターゼもしく
    はプラスミノーゲン活性化因子である、特許請求の範囲
    第１〜６項の何れか１項記載のシステム。
12. （１２）ポリペプチドが成長ホルモンまたは成長ホルモ
    ン放出因子である、特許請求の範囲第１〜６項の何れか
    １項記載のシステム。
13. （１３）ポリペプチドがウシ成長ホルモンである、特許
    請求の範囲第１２項記載のシステム。
14. （１４）ポリラクチドがポリ（ラクチド−コ−グリコリ
    ド）共重合体であり、その共重合体のラクチド単位とグ
    リコリド単位とのモル比が約１００：０〜３０：７０で
    あることから成る、前記各項の何れか１項記載のシステ
    ム。
15. （１５）ポリペプチドおよび所望によりそれ以外の水溶
    性成分から成るマイクロサスペンションをポリラクチド
    溶液中に作成する段階を含んで成る、特許請求の範囲第
    １項記載のシステムの作成方法。
16. （１６）疾患の処置に使用する、特許請求の範囲第１項
    記載のシステムの用途。