JPS632936B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発熱物質の除去方法、さらに詳しく
は、発熱物質含有溶液を、セルロースまたは架橋
ポリサツカライドを硫酸エステル化して得られる
セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサツカラ
イド硫酸エステルを用いて、アフイニテイクロマ
トグラフイに付すことにより発熱物質を除去する
方法に関する。

発明の技術的背景と産業上の利用分野 一般に注射用薬剤などでは、その原料中または
製造工程中に、発熱物質が混入し、その除去に多
大の労力を要することがある。

このような発熱物質とは、微量でも恒温動物に
対して体温の異常上昇を起す物質の総称であり、
内因性のものと外因性のものに分類される。しか
し発熱物質と通称されているものはそのほとんど
が外因性の微生物由来とくに細菌性発熱物質で、
ことにグラム陰性杆菌の夾膜構成成分である燐脂
質多糖体（リポポリサツカライド）が元凶とさ
れ、注射用薬剤中におけるその存在はきわめて望
ましくない。すなわち、リポポリサツカライドと
呼ばれる物質は、主としてグラム陰性杆菌の菌体
成分または代謝産物であつて、分子量は約6000か
ら数百万に達する。このようなリポポリサツカラ
イドは通常の液状医薬品またはその基材もしくは
緩衝溶液やそれらの製造用器材に応用されている
滅菌方法では分解されず、しかも、例えば分子量
6000以上の高分子物質を含む溶液からかかるリポ
ポリサツカライドを除去するのは極めて困難であ
る。

従来技術 従来、分子量約6000以上の高分子物質を含む注
射用薬剤の製造には、蒸留法、逆浸透法または限
外過法などによつて発熱物質を除去した精製水
を用いたり、乾熱滅菌、酸またはアルカリ処理な
どによつて発熱物質を分解した機器を用いて発熱
物質の混入を防ぐ技術が汎用されているが、薬剤
から積極的に発熱物質を除去することは通常知ら
れていない。なお、ペプチド性抗生物質であるポ
リミキシンＢの微量添加によつて発熱物質を不活
化する方法が知られているが、この場合ポリミキ
シンＢが最後まで残留するという好ましくない事
態は避けられない。発熱物質の混入を避けるため
には工程管理上細心の注意を要し、そのための気
づかいや苦労は大きく、しかも製造コストの増大
ともなる。しかも、万一、何らかの理由で、注射
用薬剤などにリポポリサツカライドのごとき発熱
物質が混入した場合には、その薬剤は廃棄処分す
るしかなく、きわめて不経済であつた。

発明の目的 本発明は、このような不利益を克服し、注射用
薬剤などから可及的に発熱物質を除去し、医療の
安全性を高めるとともに、きわめて経済的に薬剤
を製造する方法を提供するものである。なお、発
熱物質としては外部から混入したもののみなら
ず、製剤の素材となる微生物菌体や培養物に含ま
れる原因物質の除去が可能となつた。

すなわち、本発明者らは、上記のような好まし
くない発熱物質を含有する溶液より、簡単にかつ
効率よく発熱物質を除去する方法を見い出すべく
種々研究を重ねた結果、セルロースまたは架橋ポ
リサツカライドを硫酸エステル化して得られるセ
ルロース硫酸エステルゲルまたは架橋ポリサツカ
ライド硫酸エステルゲルをアフイニテイクロマト
グラフイ用ゲルとして用い、発熱物質含有溶液を
処理することにより発熱物質を特異的に分離除去
し得ることを知り、本発明を完成するに至つた。

発明の構成および効果 本発明は、例えば各種血液製剤、ワクチン類な
どの、とくに分子量約6000以上の物質を有効成分
として含有する製剤の製造において、発熱物質を
含有する溶液からアフイニテイクロマトグラフイ
により発熱物質のみを特異的に除去するに際し、
アフイニテイクロマトグラフイ用ゲルとして一度
重合度を有するセルロースまたは架橋ポリサツカ
ライドを硫酸エステル化して得られるセルロース
硫酸エステルゲルまたは架橋ポリサツカライド硫
酸エステルゲルを用いることを特徴とし、該ゲル
が特定の血漿蛋白質、凝固系蛋白質、補体、酵
素、あるいは各種ウイルス抗原、細菌抗原などの
有用な活性成分を特異的に吸着するが、リポポリ
サツカライドなどの発熱物質は吸着しない特性を
有するとの新しい知見にもとづいて、発熱物質の
みを特異的に除去するものである。

本発明方法の対象となる発熱物質含有溶液とし
ては、アンチトロンビン、血液凝固因子、血小
板第４因子リポ蛋白リパーゼ、補体成分などの血
液由来製剤、Ｂ型肝炎ワクチン、日本脳炎ワクチ
ン、インフルエンザワクチン、狂犬病ワクチンな
どの各種ウイルス由来製剤、形質転換動物細胞由
来または形質転換微生物に由来する抗原活性、生
理活性産生物、百日せき菌等の培養物に由来する
コンポーネントワクチンや抗原活牲、生理活性画
分その他酵素製剤など、各種注射用薬剤、とくに
分子量約6000以上の高分子物質を有効成分とする
薬剤が含まれるが、これらに限定されず、リポポ
リサツカライドなどの発熱物質を含む多くの薬剤
が適用される。

本発明で用いられるセルロース硫酸エステルと
は、セルロースを硫酸エステル化して得られるの
であるが、好ましくは結晶セルロースあるいは、
結晶領域および非結晶領域からなるセルロースを
硫酸エステル化したものが良い。この場合、得ら
れたセルロース硫酸エステルは原料の形状を保持
し、物理的安定性にすぐれ、アフイニテイクロマ
トグラフイ用ゲルとして好適である。これらの原
料セルロース類はすでに市販されており、例えば
セルロフアインGC―15、同GH―25、同GC―
100、同GC―200（チツソ社製）、アビセル（旭化
成工業社製）などがある。これらのゲルを例えば
ピリジンなどの有機溶媒の存在下クロルスルホン
酸、無水硫酸などを作用させ水酸化ナトリウム等
のアルカリ溶液で中和することにより所望のセル
ロース硫酸エステルが得られる。

架橋ポリサツカライド硫酸エステルとは、デキ
ストラン、セルロース類、アガロースなどのポリ
サツカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ジ
クロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレング
リコールビスエポキシプロピルエーテル等の架橋
剤で架橋して得られる架橋ポリサツカライドを硫
酸エステル化して得られるものである。架橋ポリ
サツカライドはすでに市販されており、例えば架
橋デキストランとしてセフアデツクスＧ―10、Ｇ
―25、Ｇ―50、Ｇ―100（フアルマシア社製）など
があり、架橋アガロースとしてセフアローズCL
―2B、CL―4B、CL―6B（フアルマシア社製）な
どがあり、架橋セルロースとしてセルロフアイン
GCL―25、GCL―90（チツソ社製）などがある。
これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の
存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用さ
せることにより所望の架橋ポリサツカライド硫酸
エステルが得られる。

これらのセルロース硫酸エステルまたは架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルを用いてカラムクロ
マトグラフイによつて発熱物質を除去するには通
常のカラムクロマトグラフイで採用される操作が
適用される。例えばカラムに該セルロース硫酸エ
ステルまたは架橋ポリサツカライド硫酸エステル
（好ましくは球状粒子に成形したゲル）を充填し、
これをPH５〜８、イオン強度が0.001〜1.0程度で
ある適当な緩衝液、例えば0.1M食塩添加0.01M
リン酸緩衝液（PH7.2）などで平衡化したのち、
カラムに発熱物質含有液を通し、上記平衡化に用
いた緩衝液を通液試料の５〜10培量通してカラム
を洗浄する。このあと、イオン強度が平衡化に用
いた緩衝液のイオン強度よりも大である発熱物質
を含まない適当な緩衝液、例えば0.6M食塩を含
む0.01Mリン酸緩衝液（PH６〜９）などにて溶出
することにより、発熱物質を含まない目的物質の
溶液が得られる。

なお、上記の操作において、緩衝液に
Tween80、NP―40、Triton Ｘ―100などの適当
な界面活性剤を添加してクロマトグラフイーを行
なうこともできる。

本発明の方法はカラムクロマトグラフイのみな
らずバツチ法にも同様に適用でき、工業的規模に
おいても簡単な操作で行ないうるうえ、特別の高
価な試薬も必要とせず、きわめて安価に発熱物質
を分離除去することができる。

実施例 つぎに調製例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。

調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中に結
晶セルロースであるクロマト用アビセル（旭化成
社製）80ｇを加え、撹拌下65〜70℃にて４時間保
持する。反応終了後、冷却し、10％水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離
し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセ
ルロース硫酸エステルゲルを得る。

調製例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGH―25（チツソ社製）80ｇを加え、
撹拌下65〜70℃にて３時間保持する。反応終了
後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加え
て中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩
衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステ
ルゲルを得る。

調製例 ３ ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ―50（フアルマシア社製）7.5ｇを加
え、撹拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エ
ステルを得る。

調製例 ４ 前記調製例３と同様にして調製したピリジン―
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋セルロース
ゲルであるセルロフアインGCL―25（チツソ社
製）の乾燥物7.5ｇを加え、65〜70℃にて４時間
反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離
し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架
橋セルロース硫酸エステル7.2ｇを得る。

調製例 ５ 前記調製例３と同様にして調製したピリジン―
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋アガロース
ゲルであるセフアロースCL―6B（フアルマシア
社製）のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃
にて４時間反応させる。反応終了後、冷却し、水
酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを
過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗
浄して架橋アガロース硫酸エステル23mlを得る。

実施例 １ 前記調製例５と同様にして得られた架橋アガロ
ース硫酸エステルゲルをカラム（26.4mmφ×182
mm）に充填し、0.1％ホルマリンを通液して滅菌
後、0.1M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）
を通液して平衡する。このカラムに、精製した
HBs抗原の0.01Mリン酸緩衝食塩液［HBs抗原
1.0μｇ／ml、ウサギ発熱試験２羽合計1.8℃、プ
レゲルエンドトキシンテスト（帝国臓器社製）
10⁴］60mlを通液する。ついで、カラム体積の10
倍量の0.01Mリン酸緩衝食塩液（プレゲルエンド
トキシンテスト：マイナス）で洗浄したのち、発
熱物質を含まない0.6M食塩添加0.01Mリン酸緩
衝液（プレゲルエンドトキシンテスト：マイナ
ス）で溶出して溶出画分18.0mlを得る。

この溶出画分には、HBs抗原が3.27μｇ／ml含
まれ、回収率は98.1％であつた。この画分を発熱
物質を含まない0.01Mリン酸緩衝食塩液でHBs抗
原量1.0μｇ／mlに調整したところ、ウサギ発熱試
験では２羽合計0.7℃で、プレゲルエンドトキシ
ンテストではマイナスとなり、発熱物質はほとん
ど完全に除去されていた。

実施例 ２ 前記調製例２と同様にして調製したセルロース
硫酸エステルゲルを高圧滅菌したのち、ガラスフ
イルター上にて発熱物質を含まない1/75Ｍリン酸
緩衝食塩液（PH7.2）で充分に洗浄、平衡化する。
これに、百日ぜき菌培養上清（HA価512、ウサ
ギ発熱試験２羽合計3.0℃、プレゲルエンドトキ
シンテスト：10¹⁵以上）1000mlを加え、十分撹拌
したのち、溶液を吸引する。次に発熱物質を含ま
ない1/75Ｍリン酸緩衝食塩液で充分に撹拌したの
ち吸引する。この洗浄操作を４回繰返する。最後
に発熱物質を含まない1.5M食塩を添加したのち
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）を加え、充分撹拌
懸濁させたのち、溶液を吸引して溶出液120mlを
得る。

これより百日せき菌HA（hemagglutinin）はほ
ぼ100％回収され、またこの溶出液はHA価5120、
プレゲルエンドトキシンテスト：10²、ウサギ発
熱試験２羽合計0.6℃であつて、発熱物質はほと
んど除去されていた。上記ウサギ発熱試験および
プレゲルエンドトキシンテストは溶出液を上記緩
衝液にて12.5μｇ蛋白質／mlに調整して行なつた。

なお、実施例１および２における発熱試験はい
ずれも生物学的製剤基準の発熱基準の項目にした
がつて行なつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 発熱物質含有溶液をアフイニテイクロマトグ
   ラフイにかけて発熱物質を除去する方法におい
   て、クロマトグラフイ用ゲルとしてセルロース硫
   酸エステルまたは架橋ポリサツカライド硫酸エス
   テルを用いることを特徴とする発熱物質の除去方
   法。 ２ 発熱物質含有溶液が注射用薬剤である前記第
   １項記載の方法。 ３ 発熱物質含有溶液をアフイニテイクロマトグ
   ラフイ用ゲルに通液して発熱物質を吸着させるこ
   となく洗浄除去する前記第１項記載の方法。 ４ セルロース硫酸エステルが、結晶セルロース
   または結晶領域および非結晶領域からなるセルロ
   ースの硫酸エステル体である前記第１項記載の方
   法。 ５ 架橋ポリサツカライド硫酸エステルが架橋セ
   ルロース硫酸エステルおよび架橋アガロース硫酸
   エステルおよび架橋デキストラン硫酸エステルか
   ら選ばれる１種である前記第１項記載の方法。 ６ 架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒ
   ドリン架橋セルロース硫酸エステルである前記第
   ５項記載の方法。 ７ 架橋アガロース硫酸エステルがエピクロルヒ
   ドリン架橋アガロース硫酸エステルである前記第
   ５項記載の方法。 ８ 架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロル
   ヒドリン架橋デキストラン硫酸エステルである前
   記第５項記載の方法。 ９ アフイニテイクロマトグラフイ法がカラムク
   ロマトグラフイまたはバツチ法である前記第１項
   記載の方法。