JPH0423751B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、各種の蛋白質、ウイルスなどの精製
に有用なアフイニテイクロマトグラフイ用ゲル、
さらに詳しくは、固体粒状非架橋セルロースの硫
酸エステルゲルからなる群特異性を有するアフイ
ニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製造法
に関する。 従来技術 特定の蛋白質、ウイルスなどを精製取得するに
は、従来、遠心分離法、イオン交換法、ゲル過
法などが採用されており、これらの方法を適宜組
合せたり、また反覆して用いられる。ところで、
これらの方法を組合せあるいは反覆して実施する
場合、各工程ごとに複雑な操作を必要とし、また
長時間を要するうえ、それらの工程を経るにした
がつて目的物の損失減量が生じる不利益がある。 別の精製法として、生物学的親和性を有する物
質を用いてクロマトグラフイにより生体物質を分
離精製する、いわゆるアフイニテイクロマトグラ
フイ法も知られている。そのような生物学的親和
性を有する物質として強酸性のムコ多糖類である
ヘパリンがあり、これは生体内で種々の重要な生
理活性を有する蛋白質と結合する特性を有し、例
えばアンチトロンビンと結合して血液凝固阻止
作用を促進したり、リポ蛋白リパーゼと結合して
脈血清澄作用を示すなど重要な生理作用、薬理作
用を示す。 かかるヘパリンの生理活性を利用して、これを
セフアロースCL−4B（フアルマシア社製）など
のクロマトグラフイ用ゲル担体にCNBrなどを用
いて結合させてアフイニテイロマトグラフイ用ゲ
ルを調製し、それを用いてアンチトロンビン、
凝固因子、リポ蛋白リパーゼなどの重要な生理活
性を有する蛋白質を精製することが提案されてい
る。しかしながら、ヘパリンは動物の肺臓、腎
臓、肝臓などから抽出精製されるものであるた
め、その操作が煩雑であり、しかも原料が違えば
ヘパリンの性状も異なるため、同一性状のヘパリ
ンを大量に入手することが困難でかつきわめて高
価である。したがつて、ヘパリンを結合させたア
フイニテイクロマトグラフイ用ゲルを用いる方法
は現段階では工業的規模で採用することはきわめ
て難かしい。 1935年ジヨンペスら（Jorpes et al）によりヘ
パリンの血液凝固阻止作用は分子中の硫酸基の存
在に基づくことが明らかにされて以来、ヘパリン
に代る高分子硫酸エステルを合成してアフイニテ
イクロマトグラフイ用ゲルを調製する試みがされ
ている。そのような物質として、例えば、セルロ
ース硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチンポ
リ硫酸などがあり、これらはヘパリンと同様に血
液凝固阻止作用、脂血清澄作用などを有し、また
塩基性有機物と結合して複合体を形成する性質を
示す。これら高分子硫酸エステル類はヘパリンの
有する主要な性質をすべて具備しているのでそれ
らを総称して「ヘパリノイド」と呼んでいる。こ
のヘパリノイドをCNBr等でクロマトグラフイ用
ゲルに結合させてアフイニテイクロマトグラフイ
用ゲルを調製し、これを用いて凝固因子などを精
製する方法が報告されている（例えば、米国特許
第4138287号、特開昭52−114018号）。 しかしながら、このような方法でも、ヘパリノ
イド自体が高価であり、しかもヘパリノイドをゲ
ル担体に結合させる方法が煩雑で、かつその結合
が比較的弱く、しばしば結合されたヘパリノイド
が脱離するという難点がある。 発明の目的 本発明者らは、アフイニテイクロマトグラフイ
用としてすぐれた特性を有する改良されたゲルを
見出すべく種々研究を重ねた結果、非架橋セルロ
ースの固体粒状粒子をその固体粒状状態を保持し
ながら硫酸エステル化したのちアルカリで中和し
て得られるゲルがヘパリン様の親和性を有しアフ
イニテイクロマトグラフイ用ゲルとしてきわめて
すぐれた特性を示すことを知り、本発明を完成す
るに至つた。すなわち、本発明は群特異性を有
し、各種蛋白質、ウイルスなどの精製に有用な新
規なアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよび
その製造法を提供するものである。 発明の構成および効果 本発明のアフイニテイクロマトグラフイ用ゲル
は、非架橋セルロースを硫酸エステル化して得ら
れるものであつて、好ましくは結晶セルロースあ
るいは結晶領域および非結晶領域からなるセルロ
ースを硫酸エステル化したものである。この場
合、得られたセルロース硫酸エステルは原料の形
状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理的安
定性にすぐれ、クロマトグラフイ用ゲルとして好
適である。これらの原料セルロース類はすでに市
販されており、例えばセルロフアインGC−15、
同GH−25、同GC−100、同GC−200（チツソ社
製）、アビセル（旭化成工業社製）などがある。 本発明のアフイニテイクロマトグラフイ用ゲル
を製造するには、硫酸エステル化剤をアミンまた
はアミドに溶解し、これに非架橋セルロースの粒
状物を反応させ、ついでアルカリで中和すること
により行なわれる。 硫酸エステル化剤としては無水硫酸またはクロ
ルスルホン酸が好ましいが、その他、硫酸、濃硫
酸、発煙硫酸、ピロ硫酸、スルフアミン酸なども
用いられる。しかし、条件によつては、セルロー
スの加水分解を進行させるため、少なくとも原料
セルロースの粒状状態を保持する限度内で硫酸エ
ステル化を行なう必要がある。そのため、硫酸エ
ステル化剤を過剰に加えず、通常原料セルロース
100部（重量部、以下同じ）に対して１〜150部程
度で用い、反応温度は−10〜100℃程度で、反応
時間は30分〜６時間程度とする。 溶媒として用いるアミンまたはアミドとしては
ピリジン、トリエチルアミン、ジメチルホルムア
ミドなどが挙げられる。これに添加反応させる原
料セルロースはカラムクロマトグラフイ用として
市販の粒径約15〜150μｍの粒状物を含水率１％
程度まで乾燥して用いる。 アルカリによる中和は、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化マグネシウムなどの適当な
濃度の水溶液またはメタノール性水溶液を用いて
行なわれる。この中和反応は通常発熱を伴なうた
め、氷水やドライアイスエタノール冷媒などで充
分に冷却し、反応温度を50℃以上に上昇させない
ように留意する。 本発明によるセルロースの硫酸エステル化は、
例えば下記式 で示されるようにセロビオース基の６位の水酸基
が最も反応性が高いため、この水酸基が硫酸化さ
れるものと考えられる。しかし、実際に硫酸化さ
れる割合はきわめて僅かで、後記実施例における
元素分析値からも明らかなようにＳまたはNaと
して理論量の約１％程度が硫酸化される。したが
つて、本発明のセルロース硫酸エステルは、セル
ロースモノ硫酸エステル（それは水溶性）となつ
ているのではなく、セルロースの非結晶領域部分
のみが、しかもその大部分はきわめて表面の薄い
層のみが、モノエステル化されたものと考えら
れ、このような硫酸エステル化された非結晶領域
セルロースと結晶領域セルロースとの分子間相互
作用により水不溶性を保つものと思われる。な
お、蛋白質などとの親和性に関与するのは粒状セ
ルロースのきわめて薄い表面層のみで充分であ
る。 上位の方法で得られる本発明のアフイニテイク
ロマトグラフイ用ゲルは、粒径約15〜150μｍの
非架橋セルロース硫酸エステルの水不溶性固体粒
状粒子からなる。 本発明の群特異性アフイニテイクロマトグラフ
イ用ゲルは、各種蛋白質、ウイルス類の精製にき
わめて有用である。効果的に適用される蛋白質、
ウイルス類としては、例えば、下記のような特異
性をする群がある。 百日せき菌などの産生する蛋白質Ｆ−HA
（Filamentous Hemagglutinin）および／または
LPF−HA（Leucocytosis promoting factor
hemagglutinin） Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）およびその抗原
（HBcAg、HBsAg）、またはこれらの形質転換動
物細胞由来または形質転換微生物由来の発現抗原
または蛋白質 単純ヘルペスウイルス蛋白質（HSVgB）、ま
たはその形質転換動物細胞由来または形質転換微
生物由来の発現抗原または蛋白質 インフルエンザウイルス（ヒト、ウマ、ブタ、
トリ）、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、イ
バラキウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ブタパル
ボウイルス、イヌパルボウイルス、オーエスキー
ウイルス、ニユーカツスルウイルス、ガンボロ病
ウイルスなど、および／またはこれらの形質転換
動物細胞または形質転換微生物に由来する産生物
質 アンチトロンビン、血液凝固因子、血小板第
４因子、リポ蛋白リパーゼ、または補体成分など
の生理活性を有する蛋白質 ウロキナーゼ、インベルターゼなどの動物、植
物、微生物などの生物体由来の酵素 本発明のアフイニテイクロマトグラフイ用ゲル
を用いて上記各種蛋白質、ウイルスなどの吸着、
溶出を行なうには通常のカラムクロマトグラフイ
で採用される操作が適用されるが、その条件は吸
着または溶出すべき蛋白質またはウイルスの種類
によつて異なる。しかし、一般的な操作条件とし
ては、該ゲルをカラムに充填し、PH5.0〜9.0、比
電導度0.5〜25.0ｍｓ／cmの緩衝液であらかじめ
平衡化し、これにPH5.0〜9.0、温度０〜60℃、比
電導度0.5〜25.0ｍｓ／cmの条件下で処理すべき
蛋白質またはウイルスを吸着せしめ、ついで前記
平衡化に用いたものと同じ緩衝液またはそれより
比電導度の大きい緩衝液で洗浄し、最後に、イオ
ン強度が上記平衡化および洗浄に用いた緩衝液よ
りも大きい、PH5.0〜10.0、比電導度5.0〜130ｍ
ｓ／cmの緩衝液を用いて溶出することにより、高
度に精製された蛋白質またはウイルスを得ること
ができる。なお、該精製操作はバツチ法、カラム
法のいずれでも行なうことができる。 上記精製操作について、百日せき菌の産生する
蛋白質であるＦ−HAおよびLPF−HAの単離精
製の場合を例にとつてさらに具体的に説明すれば
下記のとおりである。 (1) Ｆ−HAの単離精製 後記実施例１で得られるセルロース硫酸エス
テルゲルは、あらかじめ例えば0.2M塩化ナト
リウム添加0.01Mリン酸緩衝液等の、中性付近
のPH値（PH６〜９）であり、比電導度５〜25ｍ
ｓ／cm程度の適当な緩衝液を用いて平衡化を行
なつた後に、Ｆ−HAの吸着操作に供する。 セルロース硫酸エステルゲルへのＦ−HAの
吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−HAの溶出等一連の精
製操作は、バツチ法およびカラム法等の工業的
に通常よく用いられる操作方法で行なう。バツ
チ法で行なう場合は、百日せき菌培養物中にセ
ルロース硫酸エステルゲルを投入し、PH6.0〜
9.0程度の範囲において０〜30℃程度の温度に
て10〜60分程度緩く撹拌してＦ−HAを吸着さ
せる。この際、百日せき菌培養物の比電導度が
5.0〜25.0ｍｓ／cm程度となるように、適宜濃
縮または希釈して吸着操作に付す。 吸着終了後、培養物−ゲル混合液を過器上
に充填し、吸引過してゲルと液を分離す
る。分離したゲルを、比電導度５〜25ｍｓ／cm
程度で、PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝
液例えば、0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマ
ツキルベン（McIlvaine′s）緩衝液、0.3M塩化
ナトリウム添加0.01Mリン酸緩衝液あるいは
0.3M塩化ナトリウム添加0.01Mトリス塩酸緩
衝液等を注ぎ吸引して洗浄する。 この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が
25〜130ｍｓ／cm程度である（上記洗浄用緩衝
液の比電導度より大）適当な緩衝液、例えば
1.5M塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、
1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注
ぎ、吸着しているＦ−HAを溶出する。 カラム法にて実施する場合は、原材料液、洗
浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツチ法の
場合と同様でよく、これらの通液速度は10ml／
cm²／Hr〜500ml／cm²／Hr程度に調整して行な
うとよい。 上記方法によれば、セルロース硫酸エステル
ゲルの百日せき菌培養物中のＦ−HAの特異的
吸着能にすぐれ、Ｆ−HAの精製度は従来法に
比し数十倍に達し、しかもＦ−HAの回収率は
90％以上100％近くに達する。得られる精製Ｆ
−HAの比活性は４〜８×10⁴HAユニツト／mg
蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミドデ
イスク電気泳動（PH4.5）分析において単一の
バンドを形成し、百日せき菌内毒素がほぼ完全
に除去される。 (2) LPF−HAの単離精製 原材料液であるLPF−HA含有液は、百日せ
き菌培養物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液
で比電導度が0.5〜5.0ｍｓ／cmとなるように希
釈した後、吸着操作に付すこともできるが、こ
の上清中にはセルロース硫酸エステルゲルに対
して同じく親和性を有するＦ−HAが含まれて
いるため、あらかじめ、LPF−HAは吸着せず
Ｆ−HAを吸着する条件にて、セルロース硫酸
エステルゲルによるクロマトグラフイを行な
い、その素通り画分であるところのＦ−HAを
含まずLPF−HAを大量に含んだ画分を吸着操
作に付す。 セルロース硫酸エステルゲルへのLPF−HA
の吸着、ゲルの洗浄、LPF−HAの溶出等一連
の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の工
業的に通常よく用いられる操作方法で行なうこ
とができるが、カラム法の方が操作が簡単であ
り好都合である。カラム法の場合、セルロース
硫酸エステルゲルをカラムに充填し、あらかじ
め例えば0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）
等の比電導度0.5〜5.0ｍｓ／cmでPHが5.0〜9.0
程度である適当な緩衝液を通液して平衡化を行
つた後に、LPF−HAの吸着操作に移る。 吸着に際しては、LPF−HAの含有液をPHが
5.0〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適
宜調整して、セルロース硫酸エステルゲル充填
カラムに通液し、LPF−HAを吸着させる。こ
の後、前述の平衡化に用いたのと同様の緩衝液
を通液し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。 LPF−HAの溶出に際しては、PHが5.0〜9.0、
比電導度が5.0ｍｓ／cm以上である適当な緩衝
液を通液し溶出を行なうが、好ましくは段階溶
出または塩濃度勾配溶出を行なう。すなわち、
原材料液として百日せき菌培養液の遠心上清の
希釈したものをそのまま用いる場合は、前述の
吸着条件下において、LPF−HAと同時にＦ−
HAも吸着されてくるので、LPF−HAが溶出
され、かつＦ−HAが溶出されない条件下で溶
出する必要がある。この条件としてはPH５〜９
において比電導度５〜100ｍｓ／cm、好ましく
は50〜60ｍｓ／cmである適当な緩衝液（例えば
0.7M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベン
緩衝液）を最初に通液し、LPF−HAを含む画
分を回収する。この後に上述の溶出用緩衝液よ
り比電導度の大なる（100〜300ｍｓ／cm）緩衝
液を通液し、Ｆ−HAその他の不純成分を溶出
させ、セルロース硫酸エステルゲルを平衡化再
使用に供する。 最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施す
る。原材料液として、あらかじめＦ−HAを分
離したLPF−HA含有液を用いる場合において
も、比電導度が0.5→300ｍs1cmとなるような塩
濃度勾配緩衝液（例えば塩化ナトリウム０→
4.0M塩濃度勾配・0.02Mマツキルベン緩衝液
（PH5.2）を用いて溶出を行ない、LPF−HA含
有画分を分取すれば、きわめて高純度のLPF
−HAを得ることができる。 上記の精製法によれば、LPF−HAの精製度
は従来法に比し数十倍に達し、しかもLPF−
HAの回収率は90％以上100％近くに達する。
得られる精製LPF−HAの比活性は９×
10⁴LPEU／mg蛋白質ときわめて高く、ポリア
クリルアミドデイスク電気泳動（PH4.5）分析
において単一のバンドを形成し、百日せき菌内
毒素がほぼ完全に除去される。 つぎに、本発明のアフイニテイクロマトグラフ
イ用ゲルの製造に関する実施例およびそのゲルを
用いた各種蛋白質またはウイルスの精製に関する
実験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されない。 実施例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlに無水硫酸
20ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を30
℃に保つ。この中に含水率１％以下に乾燥したセ
ルロフアインGC−15（チツソ社製）80ｇを加え、
撹拌下30℃にて３時間反応させる。反応終了後、
冷却し、５％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中
和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食
塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲ
ルを得る。 元素分析値（測定値）：Ｃ、40.4％、Ｏ、45.8％、
Ｈ、6.3％、Ｓ、0.15％ またナトリウム含量は1400mg／Kgである。 実施例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中に結
晶セルロースであるクロマトグラフイ用アビセル
（旭化成工業社製）80ｇを加え、撹拌下65〜70℃
にて４時間保護する。反応終了後、冷却し、10％
水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲル
を過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に
洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。 実験例 １ （HBs抗原の精製） 前記実施例１で得られたセルロース硫酸エステ
ルゲルを充填したカラム（26.4mmφ×105mm）に、
0.05M塩化ナトリウムを含む0.027Mマツキルベ
ン緩衝液（PH7.20）を通し平衡化する。このカラ
ムにHBs抗原陽性人血清20mlを上記緩衝液で３
倍量に希釈したものを通液する。その後、上記緩
衝液で充分に洗浄する。ついで、0.6M塩化ナト
リウムを含む0.027Mマツキルベン緩衝液（PH
7.20）で溶出する。この結果を第１表に示す。第
１表に示すように、HBs抗原は溶出画分にほぼ
回収され、精製度は約16倍に達した。

【表】 実験例 ２ （Ｆ−HAの精製） 前記実施例１と同様にして調製したセルロース
硫酸エステルゲルをカラム（16mmφ×100mm）に
充填し、これに0.2M塩化ナトリウム添加0.01M
リン酸緩衝液（PH8.0、比電導度約17.5ｍｓ／cm）
を通液して平衡化する。このカラムに百日せき
相菌東浜株フアーメンター培養上清800mlを希釈
して、比電導度約17.5ｍｓ／cm、PH8.0に合わせ
た液を通液する。通液後、上記緩衝液にて洗浄
し、夾雑物質を洗い出す。ついで、1.5M塩化ナ
トリウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶出し、
Ｆ−HAを含む画分30mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第２表に記す。 Ｆ−HAの回収率は93.8％で、精製度（精製Ｆ
−HA画分の比活性／培養上清の比活性）は34倍
に達した。精製Ｆ−HA画分のLPF−HA活性は、
ハプトELISA法「佐藤ら、第28回毒素シンポジ
ウム予稿集141（1981）］による分析で10ELISAユ
ニツト／ml以下であつた。

【表】 実験例 ３ （LPF−HAの精製） 前記実施例１と同様にして調製したセルロース
硫酸エステルゲルをカラム（40mmφ×200mm）に
充填し、これに蒸留水1.0を通液する。このカ
ラムに百日せき相菌東浜株静置培養液の遠心上
清500mlを蒸留水で10倍希釈した液（比電導度約
1.5ｍｓ／cm）を通液する。約500mlの0.02Mマツ
キルベン緩衝液（PH5.2）をカラムに通液し、ゲ
ルを洗浄した後、0.02M塩化ナトリウム添加マツ
キルベン緩衝液（比電導度約2.0ｍｓ／cm、PH
5.2）2000mlを用い、塩化ナトリウム０→4.0Mの
塩濃度勾配にて溶出を行ない、約20mlずつ分画し
て分取した後、LPF−HAを含有する画分約130
mlをプールする。 原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第３表に示す。

【表】 実験例 ４ （インフルエンザウイルスの精製） 前記実施例１で得られたセルロース硫酸エステ
ルゲルをカラム（５cmφ×17cm）に充填し、これ
に0.14M塩化ナトリウムを含む0.010Mリン酸緩
衝液（PH7.4）を通液し平衡化する。このカラム
に11日令のふ化鶏卵に接種培養（34℃、48時間）
したＡ／フイリピン（H₃N₂）タイプインフルエ
ンザウイルス感染尿膜腔液［ウイルス量77CCA、
蛋白質窒素量377μｇ／ml（ローリー法）、比活性
（CCA／TCA−Ｎ）0.20］4200mlを通液する。そ
の後に0.19M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液2500mlを通して洗浄する。ついで、1.49M
塩化ナトリウムを含む0.010Mリン酸緩衝液で溶
出し、溶出画分170mlを得る。その後、4.99M塩
化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液でゲルを
溶出洗浄する。 この結果を第４表に示す。

【表】 第４表に示すように、インフルエンザウイルス
は溶出画分にほヾ回収され、精製度は約20倍に達
した。 実験例 ５ （日本脳炎ウイルスの精製） 前記実施例１と同様にして調製したセルロース
硫酸エステルゲル37.5mlをカラム（25mmφ×400
mm）に充填し、これに蒸留水375mlを通液する。
次に、0.14MNaCl添加0.01Mリン酸緩衝液375ml
にてゲルを平衡化したのちこのカラムにプロタミ
ン一炭末処理して得られる不活化日本脳炎ウイル
ス浮遊液50mlを通液する。0.14MNaCl添加0.01M
リン酸緩衝液にて、ゲルを充分洗浄した後、
1.5MNaCl添加100Mリン酸緩衝液（比電導度約
120ｍｓ／cm、PH7.2）100mlを用いて溶出を行な
い、約５mlずつ分画して分取した後、日本脳炎ウ
イルスを含有する画分約10mlをプールする。 原材料液および精製日本脳炎ウイルス画分の分
析結果および実験成績を第５表に示す。

【表】 実験例 ６ （狂犬病ウイルスの精製） 前記実施例１と同様にして調製したセルロース
硫酸エステルゲル0.14をカラム（2.5mmφ×400
mm）に充填し、これに蒸留水1400mlを通液する。
次に、0.14MNaCl添加0.01Mリン酸緩衝液1400ml
にてゲルを平衡化したのち、このカラムにニワト
リ胚初代培養細胞に接種増殖して得られる付活性
狂犬病ウイルス浮遊液2.9を流速500ml／時間で
通液する。0.14MNaCl添加0.01Mリン酸緩衝液に
て、ゲルを充分洗浄した後、1MNaCl添加0.01M
リン酸緩衝液（比電導度87.6ｍｓ／cm、PH7.26）
500mlを用いて流速１ml／分で溶出を行ない、約
10mlづつ分画して分取した後、狂犬病ウイルスを
含有する画分約30mlをプールする。 原材料液および精製狂犬病ウイルス画分の分析
結果および実験成績を第６表に示す。

【表】 実験例 ７ （アンチトロンビンの精製） 処理原料として新鮮凍結血漿を用い、これを解
凍し、8000rpmで30分間遠心分離し、その上清に
分子量4000のポリエチレングリコール10％を加え
て１時間撹拌し、8000rpmで60分間遠心する。つ
いでこの上清を、0.02Mリン酸緩衝液
（Na₂HPO₄・12H₂O（0.2M、76％）と
NaH₂PO₄・2H₂O（0.2M、24％）の混合液）にて
透析する。 前記実施例１と同様にして調製したセルロース
硫酸エステルゲル0.52を充填したカラム（1.5
cmφ×30cm）に、上記と同じ0.02Mリン酸緩衝液
を通してゲルを平衡化したのち、これに上記透析
した血漿上清20ml（PH5.0）を通液する。ついで、
流出液の吸光度が充分に下るまで上記と同じ緩衝
液を流してカラムを洗浄したのち、溶出緩衝液
（0.02Mリン酸緩衝液＋2.0M塩化ナトリウム）に
て溶出する。約10mlづつ分画し、吸光度280nｍ
（OD₂₈₀）での吸収ピークを示す２つのフラクシ
ヨンを得る。このフラクシヨンについて分析した
結果を第７表に示す。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 非架橋セルロースの固体粒状物を固体粒状状
   態を保持しながら硫酸エステル化したのちアルカ
   リで中和して得られる群特異性を有するアフイニ
   テイクロマトグラフイ用ゲル。 ２ 該非架橋セルロースが結晶セルロースまたま
   結晶領域および非結晶領域からなるセルロースで
   ある前記第１項記載のゲル。 ３ 硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶
   解させ、これに非架橋セルロースの固体粒状物を
   反応させ、ついでアルカリで中和することを特徴
   とする群特異性を有するアフイニテイクロマトグ
   ラフイ用ゲルの製造法。 ４ 硫酸エステル化剤が無水硫酸またはクロルス
   ルホン酸である前記第３項記載の方法。