JPS632998A - ポリヌクレオチドプロ−ブおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の概要］ ポリヌクレオチドプローブおよびその製造方法につき開
示する。この方法は、シトシン塩基の４−アミノ基をヒ
ドラジド化合物で置換すると共に、報告成分をこのヒド
ラジド化合物へ結合させることを特徴とする。シトシン
塩基はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ドもしくはポリヌクレオチドを含有しなくてもよい。

［発明の属する技術分野］ 本発明は、ポリヌクレオチドプローブおよびその製造方
法に関するものである。ポリヌクレオチドプローブは、
ポリヌクレオチド成分とヒドラジド化合物と報告成分（
ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ　ｍｏｉｅｔｙ）とで構成される。

報告成分はヒドラジド化合物に結合され、このヒドラジ
ド化合物は脱アミン化されたシトシン塩基の４位置に結
合される。

［従来技術とその問題点］ 病原体もしくは感染物質を検出するには多くの診断法を
用いることができる。従来の方法は、たとえば形態学お
よび／または着色によって同定しうるまで病原体を培養
することからなっている。

この方法は、必ずしも全ての病原体を培養することがで
きず、さらに時間がかかり、面倒であり、比較的非特異
性でありかつ比較的鈍感であるという欠点を有する。

次いで免疫分析法が出現し、ここでは病原体は抗体と病
原体特異性抗原とからなる複合体の形成によって同定さ
れる。初期には、この方法は放射性リポータ分子を使用
することからなっていた。

したがってこの方法は、特殊の施設および高度に熟練し
た操作員を必要とするような放射能が要求され、古い試
料が不安定であり、抗原間における交差反応性の問題を
伴い、抗体が温度、ｐＨおよびイオン強度を含む反応条
件に対し敏感でありかつ標的組織を支持体に固定させえ
ないという欠点を有する。

たとえばＥＬＩＳＡのような改良された免疫分析法は、
蛍光性もしくは酵素型の報告成分を用いることを可能に
した。放射能はもはや問題とならないが、他の欠点が残
る。

病原体を同定するための最も有望な技術は核酸ハイブリ
ッド化技術である。特異性であり、鋭敏であり、迅速で
あり、簡単かつ有能であるという他に、この方法は古い
試料或いは高度に汚染した試料にて病原体を同定するこ
とができる。さらにこの方法は、病原体の検出のみに限
定されない。

これは標的ポリヌクレオチド、たとえばオンコゲンの存
在をも検出するために使用できる。

初期のハイブリッド化分析は、ハイブリッド化を証明す
るためにポリヌクレオチドプローブ中に放射性同位元素
を使用した。これらの分析は、放射能の使用に伴う欠点
を有した。これらの欠点は、ポリヌクレオチドプローブ
中に報告成分として蛍光性物質、色素原もしくは酵素を
組込むことにより軽減された。

これらポリヌクレオチドプローブの製造は、−般に報告
成分からなるヌクレオチドを特定の塩基配列中へ組込む
ための酵素反応を必要とした。これらの工程は一般に時
間がかかり、面倒でありかつ高価であった。さらに、こ
れらは種々異なる長さのポリヌクレオチドプローブを生
成する。

したがって、ポリヌクレオチドプローブの化学的製造方
法は多くの利点を有する。ポリヌクレオチドを化学的に
標識するための初期の試みは、標識をポリヌクレオチド
の末端糖部分に導入することを含む。たとえば、蛍光性
標識がＲＮＡの３′末端に結合され［ラインズおよびカ
ンドール（１９７４）　、ヌクレイツク・アシッド・リ
サーチ、第１巻、第７６７〜７８６頁およびワンギー等
（１９８０）サイエンチア・シニカ、第２３巻、第１２
９６〜１３０８頁］またＤＮＡの５′末端に結合され［
スミス等（１９８５）　、ヌクレイツク・アシッド・リ
サーチ、第１３巻、第２６９〜２７７頁］、ざらにビオ
チン標識がオリゴデオキシヌクレオチドの５′末端に結
合された［マラスギおよびワレス（１９８４）　、ＤＮ
Ａ、第３巻、第２６９〜２７７頁、コレットおよびカワ
シマ（１９８５）　、ヌクレイツク・アシッド・リサー
チ、第１３巻、第１５２９〜１５４１頁、並びにケンプ
等（１９８５）ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第
１３巻、第４５〜４７頁コ。これらの方法は、核酸１分
子当り１個の標識しか導入されず、したがってその検出
感度が低下するという欠点を有した。

シトシンの４位置における置換基の効果につき研究が行
なわれている。これらの研究が常に示したところでは、
置換基は改変されたシトシンとグアニンとの間の結合エ
ネルギを低下させる。４−アミノ基のモノメチル化は、
ポリ４−メチルシトシン＋ポリ■の１：１複合体のＴＭ
を顕著に低下させる［Ｒ，Ｌ、Ｃ，ブリマコムおよびＣ
，Ｂ。

リーセ、「成る種のメチル化ポリシチジル酸の製造およ
び性質」、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（１
９６６）　、第１８巻、第５２９〜５４０頁］。

Ｇ：Ｃ塩基対の生成に対する平衡常数は、Ｇ：４−メチ
ル−Ｃ塩基対の生成に対するよりも約８倍大である。塩
基対のポリヌクレオチドにおける４−メチルＣによるＣ
の置換は、ワトソンークリック二重螺旋構造をメチル置
換基１個当り約１．０〜１．８キロ力ロリー１モルだけ
不安定にさせることを計算は示している［Ｊ、Ｄ、エン
ゲルおよびＰ。

１七フオン・ヒラペル、「核酸配列の安定性に対するメ
チル化の作用：モノマーレベルにおける研究」、バイオ
ケミストリー（１９７４）　、第１３巻、第２０頁およ
び第４１４３〜４１５８頁］。シトシンのアミノ基に対
する置換基の不安定化作用を示すこれらの刊行物は、シ
トシンの４位置に報告成分を含むポリヌクレオチドプロ
ーブを使用することは好ましくないことを教示している
。

しかしながら、蛍光性もしくは酵素成分をシトシンの４
位置に結合させることにより、内部位置にＤＮＡもしく
はＲＮＡを標識する幾つかの論文が出版されている。１
つの論文は、プロピレンジアミンによる４−アミノ基の
アミノ転位と、それに続く末端アミン基に対するニトロ
ベンゾフラン（ＮＢＦ＞の結合とを報告している。この
論文が示すところでは、ポリ（Ｃ，ＮＢＦ−Ｃ）の重合
体はリポソームと相互作用し、これによりＮＢＦの蛍光
性が向上した。さらに、重合体はボリエ（イノシン）に
結合しうろことも示された。しかしながらこれらの結果
は、Ｃ，ＮＢＦ−Ｃ重合体１モル当り僅か０．８モルの
Ｉしか結合されないことを示しており、ポリＣに対する
その結合に比較して安定性が低い。さらに、ランダム重
合対におけるＧに対しＮＢＦ−Ｃが対となることを示す
データは見られない。ざらに、アミン転位を行なうため
ビサルファイトが使用されている。特に重要なことに、
特定のポリヌクレオチドにつきプローブとしてボリヌク
レが使用されていない［Ｄ、Ｅ。

トレーパーおよびり、ゴールド、「ポリヌクレオチドに
対する蛍光性標識の結合方法：す゛ボソームーリボ核酸
相互作用の研究に対する応用」、バイオケミストリー（
１９８０）　、第１９巻、第１７７４〜１７８１頁］。

極く最近、これらの刊行物はざらにエチレンジアミンと
じサルファイドとによるアミノ転位を報告している［Ｄ
、Ｅ、トレーパー、「ビサルファイト触媒によるアミノ
転位反応を用いたＲＮＡにおける特異性の選択シチジン
残基に対するリポータ基の結合」、ヌクレイツク・アシ
ッド・リサーチ（１９８４）　、第１２巻、第９８９〜
１００２頁］。

伯の論文は、ｔＲＮＡに対する蛍光性成分の結合を記載
している。その目的は、ｔＲＮＡのアミノ酸受容体活性
に対する塩基改変の作用を検討すると共に、存在するど
のシトシン塩基が合成酵素による識別に関与するかを決
定することであった。

この方法は、カルボニルヒドラジドによるシトシンの４
−アミノ基の置換と、それに続くヒドラジドに対するフ
ルオレシンの結合とを含んだ。この報告は、グアニンに
対するシトシンの塩基対形成能力に対する結合蛍光性成
分の作用、或いはプローブとしてのこの種のポリヌクレ
オチドの使用につき検討していない。さらに、たとえば
ビオチンのような診断上重要な架橋成分も添加されなか
った。さらに、変異誘発物質であるじサルファイドも、
アミノ転位を行なうために使用されなかった［８．Ａ、
ラインスおよびり、Ｈ，シュルマン、ｒｔＲＮＡに対す
る蛍光性プローブの新規な結合方法］、メソッズ・イン
・エンチモロジー、第ＬＩＸ巻、第１４６〜１５６頁］
。

ポリアミン結合アームを介するポリヌクレオチドに対す
る、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカ
リホスファターゼのような酵素成分の結合も記載されて
いない。この方法は、アミン転位または置換工程を含ん
でいない。寧ろ、ポリヌクレオチドをグルタルアルデヒ
ドと反応させてイミン結合を形成させた。この方法の欠
点は、イミン結合の形成が相補的塩基に結合するのに要
するアミン水素を喪失させることである［レンツおよび
クルツ、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（１９８４
）　、第１２巻、第２４３５〜３４４４頁］。

塩基のアミン基に対する反応を介し、ビオチン誘導体を
ＲＮＡもしく（、ＤＮＡに光化学付加させる方法も報告
されている。比較的少量のビオチンをこの方法により核
酸中へ導入しうるが、種々の塩基間に高レベルのビオチ
ンを導入すれば標的ＤＮＡに対するプローブのハイブリ
ッド化を阻害すると思われる。何故なら、ビオチンと反
応するアミノ基は、塩基対の間で水素結合するのに要す
るものと全く同じものであるからである［フォスター等
、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（１９８５）　、
第１３巻、第６１〜７２頁］。他の方法は、グアニンの
８−位置に対するＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルア
ミノフルオレンの結合を開示している。Ｎ−アセトキシ
−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレンは発癌性であるた
め、この化合物を含むプローブはその製造および使用が
危険であり、さらに安全性問題および処理問題を伴う［
ランデゲント等、エキスペリメンタル・セル・リサーチ
（１９８１）　、第１５３巻、第６１〜７２頁およびチ
ェノ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・
サイエンス・ＵＳＡ　（１９８４）　、第８１巻、第３
４６６〜３４７０頁］。

酵母ｔＲＮＡのシトシン塩基から４−デアミノ−４−ア
セトヒドラジドピリジニウムシトシン塩基への変換が報
告されている。その目的は、チロシン、アラニンおよび
バリンにおけるｔＲＮＡのアミノアシル化に対するこの
種の変換の効果を検討することであった［Ｋ、キクガワ
等、「ヌクレオシドおよびヌクレオチドＶ１の改変；キ
ラードーＰ試薬とトランスファＲＮＡとの反応」、バイ
オロジーク・バイオロジーク・アクタ（１９６７）、第
１３４巻、第２３２〜２４２頁］。

ＤＮＡとハロアルキルヒドラジドとの架橋も行なわれて
いる。この架橋はシトシンとグアノシンとの間で行なわ
れた。その目的は、特定の遺伝子配列を封鎖する一般的
方法を開発して複製、転写および修復のメカニズムをイ
ンビトロで研究することであった。いかなるリポータ分
子もヒドラジドには結合されなかった［Ｊ、サマートン
およびＰ、Ａ、バートレット、［核酸に対する配列特異
性の架橋剤、シチジンをグアノシンに架橋させかつＲＮ
Ａを相補的ＤＮＡ配列に架橋させるための６−ブロモ−
５，５−ジメトキシヘキサノヒドラジドの使用１、ジャ
ーナル・モレキュラ・バイオロジー（１９７８）　、第
１２２、第１４５〜１６２頁］。

グリシンヒドラジドとＤＮＡとの反応も記載されている
。比較的弱い蛍光性基（ダンシル）がこのヒドラジド結
合アームに導入された。しかしながら、このヒドラジド
はデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキ
シグアノシンと反応したので、比較非特異性であること
が観察された。

さらに、この反応はｐＨ４かつ３７°Ｃにて４７時間行
なわれ、その反応期間中にＤＮＡは部分的に脱プリン化
されてプローブの特異性を喪失する。さらに、蛍光性基
の目的はＤＮＡと蛋白およびその他の分子やイオンとの
相互作用を検討することを可能にすることであって、プ
ローブとして使用することではなかった［サイおよびマ
ーフエイ（１９７４）フイジオロジカル・ケミカルφフ
ィジイークス、第６巻、第１９１〜２０４頁］。

最近の１つの報告は、ポリヌクレオチド成分とナトリウ
ムビサルファイトおよびエチレンジアミンを含有する溶
液との反応を開示している。ビザルファイトはシトシン
塩基の６位置に可逆的に付加して、エチレンジアミンが
４アミノ基をアミン転位により置換することを可能にし
た。この方法の欠点は、ナトリウムビサルファイトを使
用することである。この化合物は公知の変異誘発性物質
である。さらに、これはシトシンの４−アミン基を成る
種の条件下でオキソ基まで変換させて、ポリヌクレオチ
ドからその塩基特異性の幾分かを喪失させる［Ｒ，Ｐ、
ビスシジ、Ｃ，Ｊ、コネリーおよびＲ，ｌ−１，ヨルケ
ン、「非同−ハイブリッド化のための核酸の新規な化学
的製造方法」、ジャーナル・クリニカル・マイクロバイ
オロジー（１９８６）　、第２３巻、第３１１〜３１７
頁］。

シトシンの４位置に結合した報告成分を含むプローブの
製造方法は、１９８４年１月４日付は公開のディージ・
エンゲルハルト等によるヨーロッパ特許公開箱０．０９
７．３７３号公報に簡単に要約されている。しかしなが
ら、シトシンの４−アミン基が報告成分によってアルキ
ル化されうるという以外は詳細が示されていない。

ヌクレオチドの、化学的標識につき相当な先行技術が存
在するが、これらの研究は産業上有意義なりＮＡプロー
ブの製造を与えていない。

本発明は、ヒドラジド化合物を含むポリヌクレオチドの
製造につき開示する。ヒドラジドは、先駆体シトシン成
分の４位置に結合されて４−アミノ基を置換することに
よりシトシン同族体を生成する。この方法は、ポリヌク
レオチドプローブの合成（好ましくはポリデオキシヌク
レオチドプローブの合成）を可能にし、その際ヒドラジ
ド化合物中に存在する第２官能性基によって報告成分を
ヒドラジド化合物に結合させ、この場合ヒドラジド化合
物は報告成分をポリヌクレオチドに結合させるための結
合アームとして作用する。

ヒドラジド化合物はポリヌクレオチドにおけるシトシン
塩基の４位置またはシチジン三燐酸の４位置に結合させ
ることができ、これを次いで発生期のポリヌクレオチド
に組込むことができる。さらに、報告成分もしくは架橋
成分をヒドラジド結合アームに結合させ、これをシチジ
ン三燐酸の４位置に結合させ、次いで改変したシチジン
三燐酸を発生期のポリヌクレオチド連鎖に組込むことが
できる。

ポリヌクレオチドプローブは、（ａ）ヒドラジド化合物
をポリヌクレオチドと反応させかつ報告成分をヒドラジ
ド化合物に結合させることにより、或いは（ｂ）報告成
分をヒドラジド化合物に結合させ（または報告成分にお
ける官能価をヒドラジド官能価にまで改変し）かつヒド
ラジド化合物をポリヌクレオチドと反応させることによ
り製造することかできる。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、ヒドラジド化合物をポリヌクレオチド
（好ましくはポリデオキシヌクレオチド）と反応させて
、少なくとも１個のシトシン塩基におけるアミノ基をポ
リヌクレオチドから除去しかつ報告成分を前記ヒドラジ
ド化合物へ結合させることによる、ポリヌクレオチドプ
ローブ（好ましくはポリデオキシヌクレオチドプローブ
）の製造方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、報告成分をヒドラジド化合物に
結合させかつ改変したヒドラジド化合物をポリヌクレオ
チド（好ましくはポリデオキシヌクレオチド）と反応さ
せることにより少なくとも１個のシトシン塩基における
アミノ基を置換する、ポリヌクレオチドプローブ（好ま
しくはポリデオキシヌクレオチドプローブ）の製造方法
を提供するにある。

さらに本発明の目的は、ヒドラジド化合物を約３．０〜
約８．０のＤＨにて約２〜１５時間の反応時間にわたり
ポリヌクレオチドと反応させて少なくとも１個のシトシ
ン塩基からアミン基を排除し、次いで報告成分を前記ヒ
ドラジド化合物に結合させることによる、ポリヌクレオ
チドプローブの製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ヒドラジド化合物を約３．０〜約
８．０のＤＨにてポリヌクレオチドと反応させることに
より２個以上のシトシン塩基からアミン基を排除しかつ
報告成分を前記ヒドラジド化合物へ結合させることによ
る、ポリヌクレオチドプローブの製造方法を提供するこ
とにある。

ざらに本発明の他の目的は、ジヒドラジド化合物をポリ
ヌクレオチドと反応させて少なくとも１個のシトシン塩
基のアミノ基を排除すると共に報告成分を前記ジヒドラ
ジド化合物に結合させることによる、ポリヌクレオチド
プローブの製造方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、ヒドラジド化合物を約３．０〜
約８．０のｐ］−１にてポリヌクレオチドと反応させる
ことにより少なくとも１個のシトシン塩基からアミン基
を除去すると共に架橋成分を前記ヒドラジド化合物へ結
合させることによる、ポリヌクレオチドプローブの製造
方法を提供するにある。

さらに本発明の目的は、架橋成分をヒドラジド化合物に
結合させかつ結合したヒドラジド化合物をポリヌクレオ
チド（好ましくはポリデオキシヌクレオチドと反応させ
て）少なくとも１個のシトシン塩基からアミン基を排除
することによる、ポリヌクレオチドプローブ（好ましく
はポリデオキシヌクレオチドプローブ）の製造方法を提
供するにある。

本発明の他の目的は、ヒドラジド化合物を約３．０〜約
８．０のｐＨにてポリヌクレオチドと反応させて２個以
上のシトシンからアミノ基を排除しかつ架橋成分を前記
ヒドラジド化合物に結合させることによる、ポリヌクレ
オチドプローブの製造方法を提供するにある。

さらに本発明の他の目的は、ヒドラジド化合物をポリヌ
クレオチド（好ましくはポリデオキシヌクレオチド）と
反応させて少なくとも１個のシトシン塩基のアミノ基を
前記ポリヌクレオチドから排除すると共に報告成分を前
記ヒドラジド化合物に結合させることにより、ポリヌク
レオチドプローブ（好ましくはデオキシポリヌクレオチ
ドプローブ）を製造することにある。

さらに本発明の他の目的は、シチジン−燐酸もしくは三
燐酸をヒドラジド化合物と反応させてシチジンの４−ア
ミノ基を排除し、この改変ヌクレオチド三燐酸を発生期
のポリヌクレオチド連鎖に組込みかつ報告成分を前記ヒ
ドラジド化合物に結合させることにより、ポリヌクレオ
チドプローブを製造することである。

Ｅ問題点を解決するための手段］ 本発明は、ポリヌクレオチドとヒドラジド化合物とから
なる物質の製造方法に関するものである。

この物質は、シトシン成分の４−アミノ基をビサルファ
イ１〜の不存在下でヒドラジド官能価により置換して製
造される。さらに本発明は、ポリヌクレオチドプローブ
の化学的製造方法に関するものである。−般に、ポリヌ
クレオチドプローブはポリヌクレオチド成分と、このポ
リヌクレオチド成分に結合された報告成分とからなって
いる。プローブのポリヌクレオチド成分は、塩基対を形
成する能力、すなわち興味ある標的ポリヌクレオチドの
相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリッド化する能力
を有する。プローブの報告成分は、標的ポリヌクレオチ
ドの存在を証明しうる手段を有し或いはこの手段を生成
する。この手段はたとえば蛍光、燐光、放射能、色素原
、電子密度または化学ルミネッセンスとすることができ
る。

ポリヌクレオチドプローブは幾つかの方法で製造するこ
とができる。好適な１方法は、ヒドラジド化合物をビサ
ルファイトの不存在下でポリヌクレオチドと反応させて
少なくとも１個のシトシン塩基の４−アミン基を排除す
ることである。次いで、報告成分をヒドラジド化合物中
に存在するヒドラジド以外の官能性基によってこのヒド
ラジド化合物へ直接に結合させる。或いは、先ず最初に
報告成分をヒドラジド化合物に結合させ、次いでこのヒ
ドラジド化合物をポリヌクレオチドと反応させて少なく
とも１個のシトシン塩基のアミノ基を排除する。他の変
法は、報告成分を架４Ｆ５成分によりじドラシト化合物
へ間接的に結合させる。このヒドラジド化合物は、ポリ
ヌクレオチドを報告成分に結合させるための結合アーム
として作用する。

Ａ、ポリヌクレオチドの説明 所望の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、酵素的ま
たは合成的に製造することができる。酵素的製造は適当
な雛型、ポリメラーゼ酵素および１つの塩基部分が改変
されているものを含む三燐酸先駆体の混合物を使用する
ことである。１つの適する方法はＭ１３ベクターを使用
する。この方法は当業者に周知されており、ここに説明
しない。

合成方法は、結合アームを所定の未改変ポリヌクレオヂ
ドに結合させる。この方法は、ＤＮＡプローブの大規模
生産に対する簡単かつ容易な方法を提供する。安価かつ
容易に入手しうる薬品を使用することができ、理論的に
はいかなる特殊な装置をも必要としない。ポリヌクレオ
チドに結合させる結合アームの個数は、各反応体の司お
よび反応条件を変化させて制御することができる。

ざらに合成方法は、ポリヌクレオチドの合成を装置によ
って自動化しうるという独特な利点を有する。この自動
化は、結合アームを有する化学合成されたヌクレオチド
先駆体を特定の塩基配列中へ直接に組込むことを可能に
すると思われる。しかしながら、ポリヌクレオチドは合
成的に製造する必要はない。これは当業者に周知された
方法によりポリメラーゼ酵素を用いて酵素的に製造する
こともできる。

ポリヌクレオチド合成装置の製造業者はアプライド・バ
イオシステムス社、リンカン・センター・ドライブ８５
０番、フォスター・シティ、カリホルニア州９４４０４
　；バイオサーチ・インコーポレーション社、ケルナー
・ビルディング２９８０番、サン・ラフアニル・カリホ
ルニア州９４’１）０１およびベックマン・インスツル
メンツ社・ページ・ミル・ロ一ド１０５０番、パロ・ア
ルド・カリホルニア州９４３０４を包含する。

最も広く使用されている化学合成は、固有の結合効率と
出発物質の安定性とにより、ホスホルアミダイト法を包
含する。出発物質は、３′−ヒドロキシル末端ヌクレオ
シドで誘導化された固体支持体である。ヌクレオシドを
シリカに対し３′−ＯＨで結合させる。５′−ヒドロキ
シルをジメトキシトリチル基で保護する。合成は固体支
持体に結合された増大するポリヌクレオチド連鎖によっ
て行なわれ、液相中に存在する過剰の試薬を濾過によっ
て除去し、その際塩基付加の間における精製工程を必要
としない。

合成サイクルの第１工程は、誘導化した固体支持体を酸
で処理してトリチル基を除去すると共に遊離５−ＯＨを
発生させ、所定のヌクレオシドをそのスルホルアミダイ
ト誘導体および弱酸（テトラゾール）を反応室に添加す
ることにより活性化させ、かつ遊離した５’　−ＯＨを
活性化ヌクレオシドと反応させることからなっている。

付加反応は−般に室温にて２分間以内に完結する。

次の工程は、付加を受けなかった全配列をキャッピング
しかつ全ホスファイト・ヌクレオチド間結合をより安定
なホスフェートに変換することからなっている。この反
応は３０秒以内に１００％完了する。酸化工程の後、ジ
メトキシトリチル基を除去しかつサイクルを連鎖延長が
完了するまで反復する。この時点でオリゴヌクレオチド
はまだ固体支持体に結合しており、かつホスフェート並
びに塩基Ａ、ＧおよびＣの環外アミノ基に保護基を有す
る。生物学上活性なりＮＡを製造するには、ホスフェー
トに存在するメチル基を除去しかつ連鎖を支持体から開
裂させる。ＤＮＡを含有する溶液を装置から除去した後
、塩基における環外アミンの保護基を切断する。

その後の必要とされる精製程度は用途に依存する。合成
装置で通常得られる９８〜１００％の段階的収率により
、しばしば約１５〜約２５塩基を含有するオリゴヌクレ
オチドプローブを精製する必要はない。より長いオリゴ
ヌクレオチドを使用する他の用途は、電気泳動または高
圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ＞による精製を必
要とする。

ホスホルアミダイト法を用いるポリヌクレオチド合成は
多数の利点を与える。第１に、ジイソプロピルホスホル
アミダイトは長時間にわたり安定であり、かつ非吸湿性
である。第２に、ホスホルアミダイトを用いる結合反応
は、ケト型が好適であるアセトニトリル（ピリジンでな
い）にて行なうことができ、したがって側鎖付加に対し
塩基を保護する。

一般に、ポリヌクレオチドは少なくとも約１２〜１５個
の塩基から構成すべきである。これは塩基配列に特異性
を付与すると共に、プローブとして選択性にする。しか
しながら、　’ＦＡ造業当業者プライド・バイオシステ
ムス社）によれば、約２００塩基までのポリヌクレオチ
ドを製造することができる。

Ｂ、ヒドラジド化合物の説明 ヒドラジド化合物は、シトシン成分における４−アミノ
基を排除することによりポリヌクレオチドに結合される
。

ヒドラジド化合物は、ポリヌクレオチド成分を結合させ
るための結合アームとして作用することができる。結合
アームとして作用するヒドラジド化合物は６個程度の少
ない原子を有し、或いは１０００個以上の原子を有する
こともでき、好ましくは約６〜約１００個の原子を有す
る。結合アームは、部分的に変性されている一本鎖ポリ
ヌクレオチドもしくは二重鎖ポリヌクレオチドのいずれ
かにおけるシトシン塩基に結合することができる。

結合アームは第１ヒドラジド官能価とヒドラジドのカル
ボニルに対しα位置の炭素に結合された第１アミン基以
外の第２官能価とから構成され、ただし第２官能価は同
一もしくは異なる分子における第１ヒドラジド官能価と
実質的に反応してはならない。この官能価は親核性、電
子親和性もしくは離脱基とすることができる。官能価の
例は、限定はしないが、カルボン酸エステル、カルボン
酸チオエステル、イミド、ケトン、アルデヒド、エポキ
シド、ハロゲン化物、ｎ−ヒドロキシスタシンイミドエ
ステル、イソシーアネート、イソチオシアネート、イミ
デート、無水物、じドラジン、アルコキシド、アルキル
アミン、メルカプタン、カルボキシレート、スルホネー
ト、ヒドラジド、ハロケトン、ジアゾニウム塩、アシル
アジド、ニトロフェニルエステル、スルホニルクロライ
ドおよびマレイン酸イミドを包含する。好適な第２官能
価はヒドラジン、アミン、アルキルアミン、メルカプタ
ン、カルボキシレートおよびカルボン酸エステルを包含
する。特に好適な第２官能価はヒドラジン、アミンおよ
びアルキルアミンを包含する。ヒドラジド化合物はたと
えば炭素−炭素二重結合、炭素−窒素単結合、炭素−窒
素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−酸素単結合、
炭素−硫黄単結合または炭素−珪素単結合を含むことが
できる。

好適なヒドラジド化合物は、水溶液中に可溶性のもので
ある。特に好適なヒドラジドはカルボニルヒドラジドで
ある。仙の好適なヒドラジドは、アミン基が存在しない
かまたはカルボニル基に結合しているアミノ酸ヒドラジ
ド、並びにジカルボン酸のモノヒドラジドである。反応
に必要とされる最適ｐＨにて水性媒体に対する溶解度が
低いためオキサリルヒドラジドは大して好適でなく、ま
た水溶液中で分解するためマロン酸および酒石酸ジヒド
ラジドも大して好適でないことに注目すべきである。

Ｃ，ポリヌクレオチドと結合アームとの反応報告成分を
ポリヌクレオチドに結合させる結合アームはヒドラジド
化合物である。シトシンの４−アミノ基を、置換反応に
おいてヒドラジド化合物により置換する。置換反応の条
件は特定のヒドラジドによって変化する。反応に影響す
る因子は水溶液に対するヒドラジドの溶解度、ヒドラジ
ドの反応性および反応条件下におけるヒドラジドの安定
性である。水溶性であるヒドラジドが好適である。何故
なら、置換反応を水溶液中で行ないうるからである。し
かしながら、反応は混合溶剤系で行なうこともできる。

反応に対するｐＨ範囲は約３．０〜約８．０の範囲で変
化しうるが、約３．５〜約６．０が好適である。温度は
約２０℃〜約９０℃で変化しうるが、約３５°Ｃ〜約５
０℃が好適である。−般に、任意の緩衝剤を存在させる
こともできる。しかしながら、ビザルファイトの存在は
必要でなく、事実これは変異誘発性物質であるため望ま
しくない。

低温度で行なわれる置換反応は、高温度で行なわれる反
応よりも長い反応時間を必要とすることが了解されよう
。同様に、酸性ｐＨにおける反応は、中性ＤＨにおける
よりも急速に進行する。しかしながら、ヒドラジドによ
るアミノ基の置換を可能にしかつグリコシドもしくはホ
スホジエステル結合の塩基開裂、並びにヒドラジド化合
物の分解を生じないような任意の条件が適している。

反応体の化学量論は変化することができる。−般に、シ
トシン塩基の個数に対比して過剰のヒドラジド化合物を
使用する。しかしながら、高価なヒドラジド化合物は化
学量論比の使用を支配し、成るいは過剰の塩基について
も支配する。

Ｄ、結合アームに対する報告成分の結合報告成分は、標
的ポリヌクレオチドの存在を検出する手段を与える。報
告成分は、結合アーム（ヒドラジド化合物）に対し直接
結合させ或いは１種もしくはそれ以上の架橋成分によっ
て間接的に結合させることができる。報告成分または架
橋成分は結合アームに対しまたは架橋成分に対し共有的
に又は非共有的に結合させることができる。

報告成分は結合アームに対し、この結合アームとポリヌ
クレオチドとの反応後に或いは結合アームとポリヌクレ
オチドとの反応前に結合させることができる。

報告成分は、この報告成分に存在する多数の官能価のい
ずれかによって結合アームへ直接にかつ共有的に結合さ
せることができる。この種の官能価は、限定はしないが
、イソチオシアネート、カルボジイミド、スルホニルク
ロライドおよびｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
を包含する。

官能価は結合アームの第２官能性基（すなわちヒドラジ
ド官能価以外のもの）と反応しうるちのとすべきである
。その例は、ポリヌクレオチドのシトシンに結合される
結合アームの第２官能価がアミノ基でありかつ報告成分
がイソチオシアネート官能価からなる場合である。アミ
ノ基はイソチオシアネートと反応して、結合アームを報
告成分に直接かつ共有的に結合させる。報告成分を結合
アームに結合させうる所要の官能基を既に有する多数の
報告成分が市販されている［たとえばエンシー・バイオ
ケム・インコーポレーション社による１９８４年カタロ
グ、ハドソン・ストリート３２５番、ニューヨーク、ニ
ューヨーク州１００１３］。

さらに、報告成分は結合アームへ間接的にかつ非共有的
結合させることもできる。これは、たとえばアルカリホ
スファターゼ（すなわち報告成分）がアビジン分子に共
有結合される場合である。ビオチン（すなわち架橋成分
）は結合アームに共有結合されてポリヌクレオチドのシ
トシンに結合する。ビオチンとアビジンとの間の複合体
の生成は報告成分をもたらし、これは結合アームに間接
的かつ非共有的に結合される。

酵素である報告成分の例は、限定はしないが、ハイドロ
ラーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ。

ペルオキシターゼ、カタラーゼ、グリコシダーゼ、オキ
シドレダクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼおよびヌク
レアーゼを包含する。特に好適なものはホスファターゼ
、ベルオキシターゼおよびオキシドレダクターゼである
。蛍光性成分の例は、限定しないが、ローダミンＢおよ
びフロオレシンを包含する。

ポリヌクレオチドに結合させうる報告成分の個数に関し
限定はない。報告成分の個数が多い程、ポリヌクレオチ
ドプローブの感度は大となる。しかしながら、立体障害
を最小化させるには、これらは４個の配列ヌクレオチド
につき１個より多い報告成分でないと思われる。

Ｅ、標的ポリヌクレオチドの検出方法 ポリヌクレオチドのハイブリッド化は相補的塩基対形成
に基づいている。−重鎖標的ポリヌクレオチドを溶液中
でまたは支持体上で一重鎖ボリヌクレオチトプローブと
混合すると、相補的塩基配列が対となって二本鎖ハイブ
リッド分子を形成する。ポリヌクレオチドプローブに対
するそのハイブリッド化による標的ポリヌクレオチドの
検出は、たとえば二本鎖ポリヌクレオチドを試料から単
離しかつこれを支持体くたとえばニトロセルローズ、ガ
ラススライド、プラスチック、紙もしくはその他の合成
重合体）に固定して行なうことができる。

固定したポリヌクレオチドをポリヌクレオチドプローブ
を含有する溶液と混合し、かつ支持体を約８０〜９０’
Ｃまで加熱してポリヌクレオチド二重鎖を変性させる（
二重鎖はアルカリによっても変性することができる）。

かくして、変性した標的ポリヌクレオチドとポリヌクレ
オチドプローブとを含有する系を適当に温度まで冷却し
て、ハイブリッド化を生ぜしめる。ハイブリッド化が完
結するのに充分な時間が経過した後（これは１０分〜数
時間とすることができる）、固定した標的ポリヌクレオ
チドを洗浄して全ての未結合ポリヌクレオチドプローブ
を除去する。ポリヌクレオチドプローブの報告成分が、
かくして直接的にたとえば放射能もしくは蛍光によって
、或いは間接的にたとえば酵素反応により生成された発
色原によって検出される［Ｍ、グルンスタインおよびＪ
、ワラス、メソッズ・イン・エンチモロジー、第６８巻
、Ｒ。

ウー（編）　　（１９７９）　、第３７９〜４６９頁：
Ａ、Ｒ。

シュンおよびＪ、サムプルツク、メソッズ・イン・エン
チモロジー、第６５巻、第１部、（１９８０）、第４６
８〜４７８頁：Ｄ、Ｃ，ワード、Ａ、Ａ、ワルドロップ
およびＰ、Ｒ，ランガーによる改変ヌクレオチド、並び
にその製造および使用方法、１９８２年１１月３日付は
公開のヨーロッパ特許公開公報第０．０６３，８７９号
：Ａ、Ｊ、べり−およびＪ、８．ピータ−１「感染病に
対するＤＮＡプローブ」、ダイアグノスティック・メジ
スン（１９８４年３月）、第１〜８頁；並びにウイーシ
ング・リーおよびジェムス・し、ベニントン、「組換Ｄ
ＮＡ技術：臨床微生物学における用途」、ラボラド１ノ
ー・マネージメント（１９８５年４月）第２１〜２６頁
参照。これらを参考のためここに引用する］。

第２の方法は、標的ポリヌクレオチドをその場で検出す
ることである。標的ポリヌクレオチドを含む組織試料を
ガラススライドに固定する。試料は、たとえばアセトン
中で或いはカルノイの８固定剤（１０％酢酸、３０％ク
ロロホルム、６０％メタノール）にて固定することがで
きる。この固定剤を、試料に対し約５分間接触させ続け
る。過剰の固定剤をスライドから洗浄除去し、かつスラ
イドを風乾する。

ポリヌクレオチドプローブをその報告成分としての蛍光
性分子と共に含有する溶液を、支持体上の試料に添加し
かつ試料をカバーガラスで覆う。

覆われたスライドを約９０〜９５℃まで約０．５〜２分
間加熱して、全ての二重鎖ポリヌクレオチドを変性させ
る。次いで、スライドを加熱ブロックから取出し、かつ
ハイブリッド化を室温にて約１０分間通行させる。先ず
最初に、試料を収斂性溶液で洗浄して全ての非ハイブリ
ッド化ポリヌクレオチドプローブを除去し、次いで緩衝
液で洗浄して収斂性溶液を除去する。最後に、スライド
を蛍光顕微鏡の下で検査する。試料（こおける蛍光の存
在は、−４０＝ 標的ポリヌクレオチドの存在を示す。

或いは、報告成分は酵素とすることもできる。

この酵素は加熱工程の際に存在させてはならない。

何故なら、熱によって変性するからである。しかしなが
ら、酵素は収斂洗浄剤の後に添加することができる。こ
の種の方法の例は、ビオチン（すなわち架橋成分）を結
合アームに結合させて、これをシトシンに結合させかつ
酵素報告成分をアビジンに結合させる場合である。ビオ
チンを含むポリヌクレオチドプローブを試料と混合して
、収斂剤清浄後の固定試料に添加する。標的ポリヌクレ
オチドの存在は、ポリヌクレオチドの一方がビオチンで
あるポリヌクレオチドハイブリッドを形成する。酵素が
結合しているアビジンを試料に添加すると、ビオチンに
複合化したアビジンが生成する。

酵素に対する基質の付加および色の出現は、標的ポリヌ
クレオチドの存在を証明する。

［実施例］ 以下、限定はしないが、本発明を実施例により説明する
。

一本鎖Ｍ１３ＤＮＡの化学的標識 延票 ｏ、３ｓｇのカルボヒドラジドを１．８５ｍの蒸溜水に
溶解しかつ０．１５ｄの濃塩酸を徐々に添加することに
より、カルボヒドラジド［アルドリッチ・ケミカル・コ
ーポレーション社から購入］溶液を新たに作成した。カ
ルボヒドラジドの最終濃度は２Ｍとし、かつこの溶液の
最終ＤＨを４．１５〜４．２５にした。

ＤＮＡとカルボヒドラジドとの反応 蒸溜水５０μｅにおける３００μ９の一本鎖Ｍ１３ＤＮ
Ａに、６００μρのカルボヒドラジド溶液を添加した。

この混合物を回動させ、次いで３７°Ｃにて６時間培養
した。生成物を３０μｅの１０Ｍ　　ＮａＯＨで中和し
、かつＤＮＡを１．４ｄの冷アルコールの添加によって
沈澱させた。ＤＮＡをｏ、　ｓ、４の１ＭＮＨ４ＡＣに
再溶解し、次いで１．０戒の冷アルコールの添加により
沈澱させた。この手順をさらに１回反復した。この方ル
ポヒドラジドー改変ＤＮＡをゲル電気泳動によって分析
した。甲−のＵｖ反応性バンドの出現は、ＤＮＡの大部
分が分解しなかったことを示した。

ビオチン標識された一本鎖Ｍ１３　　ＤＮＡの作成１０
ｎ＋ＭのＥＤＴＡを含有する１００μＮの９０ｍＨＩ７
ｊＩ酸塩緩衝液（ｐＨ８，５）と３０μｆｆ（７）　Ｄ
　Ｍ　Ｓ　Ｏとの混合物におけるカルボヒドラジド−改
変ＤＮＡ　＜ＣＨＤ　Ｎ　Ａ　）　７５ｕ（ｌへ、３０
μｆｆ（７）Ｌ’オチン溶液（ＤＭＳＯ中４ｏｍａ／＊
）を添加した。この混合物を室温に１晩保った。次いで
、改変したＤＮＡを３２０μでの冷アルコールを添加し
て沈澱させた。−２０°Ｃにて２０時間後、ＤＮＡを遠
心分離によって集め、次いで３００１Ｉｊの冷アルコー
ル（７０％）で１回洗浄した。

凍結乾燥した後、ビオチニル化したＤＮＡプロー７ヲ１
５０μｕ）　トＩＪ　スＥ　Ｄ　ＴＡＭ衝液［１０１１
１Ｈトリス、Ｈａ！（１）Ｈ７，５＞　、ｎ＋ＨＥＤＴ
Ａ］に貯蔵した。

フルオレシン標識された一本鎖Ｍ１３　　ＤＮＡの携 １２５μ９のカルボヒドラジド改変したＭ１３ＤＮＡを
２００μｐの硼酸塩緩衝液に溶解し、かつ１００μ９の
フルオレシンインチオシアネート（ＦＩＴＣ）溶液（１
０ｎ＋ｃ＋／ｍＤＭ　Ｆ　）を添加した。

この反応混合物を室温にて２０時間培養した。反応混合
物をＧ−５０カラム（１０ｃｍｘ　１ｃｍ　）に通して
精製し、その際５０ｍ）の重炭酸トリエチルアンモニウ
ム（ｐＨ７，５＞を溶出緩衝液として使用した。このフ
ルオレシン標識したＤＮＡを溶剤の凍結乾燥によって得
た。ＤＮＡにおけるフルオレシン分子の個数の測定方法
は、Ｓ、Ａ、ラインズおよびり。

Ｈ，シュルマンの測定法［メソッズ・エンチモロジ−（
１９５９）　、第５９巻、第１４６頁］とした。この測
定は、１個のフルオレシン分子がＤＮＡの塩基１０〜１
５個当りに組込まれたことを示した。

テキサスレッドで標識した一本鎖Ｍ１３　　ＤＮＡの作
成 標識方法はＪ、Ａ、チツス、Ｒ，ハングランド、Ｓ、０
．シャローおよびり、Ｍ、セカの方法［ジャーナル・イ
ミュノロジーカル・メソッズ（１９８２）第５０巻、第
１９３頁］とした。１２５μ９のカルボヒドラジド−改
変Ｍ１３　　ＤＮＡを、１０ｍＭのエチレンジアミンテ
トラ酸Ｍ（Ｎａ＋、１）ｌ−１７，５）を含有するｒａ
ｍ酸塩緩衝液（９０ｍ１４．　ｐＨ８，５）　　２５ｈ
ｆｆに溶解させた。１０ｍｇのテキサスレッド−セライ
ト混合物（Ｗ／Ｗ、１：９）をＤＮＡ溶液に懸濁させた
。

この反応混合物を暗所中にて４℃で１晩（約１６時間）
撹拌した。テキサスレッド標識したＤＮＡを、Ｇ−５０
カラム（０，９ｘ　１０ｃｍ）に対し１０ｍ）ｌの重炭
酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ１７，５）で溶出させ
て精製した。溶出液を反復凍結乾燥によって除去した。

このようにして得られたＤＮＡを、５９０μｍ対２６０
ｎｍの吸光比の測定によって分析した。

この測定は、１個のフルオロフォールがＤＮＡの塩基１
０〜１５個当りに組込まれたことを示した。

この方法は、米国特許出願第４６１　、４６９号のＣＴ
Ｐ出願である米国特許出願第７３２，３７４号に開示さ
れた方法である。標的二重鎖ＲＦ　　Ｍ１３ＤＮＡを熱
変性させ（５分間煮沸しかつ氷水中で急冷する）、次い
で１Ｍ酢酸アンモニウム中にて微量測定板に固定させた
。酢酸アンモニウム緩衝液をデカント除去し、かつ測定
板を２ＸＳＳＣにて２回洗浄した（室温）。上記のよう
に作成したビオチニル化Ｍ１３プローブ（０，２５μｈ
／ｍ！りを添加し、かつハイブリッド化をハイブリッド
他用緩衝液［４ｘＳＳＰＥにおける３０％脱イオン化ボ
ルムアミド、５％硫酸デキストラン、１％トリトンＸ　
−１００Ｊ５　ヨＵ　１　ｍ（Ｊ／　ｍｅの音波処理さ
れがっ熱変性された鮭精子ＤＮＡ］において３７℃で１
６時間行なった。測定板を２ｘＳＳＣとｏ、１％トリト
ンＸ−１００とで６５℃にて２回洗浄した。この測定板
を封鎖用溶液［２０１１９／穴１個、ＰＢＳ　（燐酸緩
衝塩水）、２％牛血清アルブミン、０．１％トリトンＸ
−１００および５ｍＨＥＤＴＡ］と共に３７°Ｃにて３
０分間培養した。封鎖溶液を除去した後、測定板を西洋
ワサビ−ストレプトアビジン複合体［ＰＢＳ中で１：　
　５，０００の希釈、１％牛血清アルブミン、０．１％
トリト／Ｘ　　１００１ヨｆｆ５ｍＨＥ　Ｄ　ＴＡ　：
　５０１１９／穴１個］と共ニ３７℃テ３０分間培養し
た。西洋ワサビ−ペルオキシダーゼに対する基質として
使用した０−フェニレンジアミンの溶液は、４ｍｇの０
−フェニレンジアミンと２５μｅのｔ」２０２　　（１
０％）とを２０ｄの燐酸塩−クエン酸緩衝液（ρｌ−１
６）に溶解して作成した。測定板をこの０−フェニレン
ジアミン溶液と共に室温にて５〜１０分間培養し、そし
て反応を４Ｎ硫酸溶液の添加により停止させた。標的Ｄ
ＮＡの検出は、４９００…における可視光線の吸光度を
読んで測定した。

ビオチニル化されたＭ１３　　ＤＮＡプローブの感度を
、Ｐ、Ｒ，ランガー、Ａ、Ａ、ワルドロップおよびり、
Ｃ，ワード、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
−・サイエンス・ＵＳＡ（１９８１）　、第７８巻、第
６６３３頁の手順にしたがって作成されたビオチンニッ
ク翻訳Ｍ１３プローブの感度と比較した。化学的にビオ
チニル化したＭ１３　　ＤＮＡプローブ（上記のように
作成）は、その感度が標的Ｍ１３　　ＲＦ　　ＤＮＡの
検出においてニック翻訳Ｍ１３　　ＤＮＡプローブ（Ｂ
１０−１１−ｄＵＴＰで置換された２４％のチミジンヌ
クレオチドによる〉の少なくとも２倍であった。

感受性かつ特異性のプローブをこの標識法によって作成
しうるという事実は、相補的グアニン残基に対する改変
シトシン塩基の水素結合が生じていることを示している
。

二重鎖Ｍ１３　　ＲＦ　　ＤＮＡのカルボヒドラジド改
変 Ｍ１３　　ＲＦ　　ＤＮＡ［２４μ９／８０μｆｆ、　
トリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｌ）Ｈ７，５＞−ＥＤＴＡ
中（１１１１Ｍ＞］を、１００℃にて５分間煮沸しかつ
次いでこれを氷水中で０℃まで冷却することにより熱変
性させた。

次いで、このＤＮＡを４００μでの２Ｍカルボヒドラジ
ド溶液に溶解させた。混合物を３７°Ｃで６時間培養し
、かつ過剰の試薬を上記したような反復アルコール沈澱
によって除去した。２０μ９のカルボヒドラジド改変し
たＤＮＡが得られた（８３％）。

カルボじドラシト改変した二重鎖Ｍ１３−ＲＦ−ＤＮＡ
　（蒸溜水５０μρにおける２０μ９）を熱変性し、次
いで硼酸塩緩衝液とＤＭＳＯ（２：１）を含有する溶液
０．１５ｍ１に添加した。上記の溶液へ、５０μＣのビ
オチン−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（エンゾチン）溶液（ＤＭＳＯ中４０ｍＭｍ
Ｎ＞を添加した。この混合物を３７°Ｃにて１５時間培
養し、かつこのビオチニル化されたＭ１３　　ＲＦ　　
ＤＮＡを標準的なアルコール沈澱法によって単離した。

１０μ９のビオチニル化されたＤＮＡが得られた（収率
５０％）。

この方法はｐ、ｓ、　　トーマス、［メソツズ・エンチ
モロジー（１９８３）　、第１００巻、第２５５〜２６
６頁］の方法を改変したものである。ニトロセルロース
フィルタを水および次いで２０ｘＳＳＣ（ＳＳＣ：　　
１．１５Ｍ　　Ｎａｐ！：　　０．０１５Ｍクエン酸ナ
トリウム）で浸漬した。乾燥したフィルタに、０．１ｍ
ＨＥ　ＤＴＡ　（１μｆ！＞における変性Ｍ１３（ＲＦ
）　　ＤＮＡをスポットし［１０分間煮沸し、次いで氷
水中で急冷する］、乾燥させ、かつ減圧下に８０’Ｃに
て２時間焼成した。次いで、フィルタを６５°Ｃにて少
なくとも２時間にわたり予備ハイブリッド他用緩衝液（
５ＸＳＳＣ，（１，１％ＳＤＳ、それぞれ１．０ｍ（Ｊ
／ｄの牛血清アルブミン、フィコール４００およびポリ
ビニルピロリドン、ＭＷ４０、０００、および１ｍｇ／
ｒＩｆ！の音波処理かつ加熱変性された（１０分間煮沸
しかつ冷水中で急冷する）鮭精子ＤＮＡ］にて予備ハイ
ブリッド化した。ハイブリッド化は、５０％Ｍｄの熱変
性したビオチン標識Ｍ１３　　ＲＦプローブを含有する
予備ハイブリッド他用緩衝液において６５℃の振どう水
浴中で２０時間行なった。これらのフィルタを２ｘＳＳ
Ｃ。

０．１％ＳＤＳ　（３Ｘ１５分間、６５°Ｃ）および０
．２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ　（２ｘ１５分間、６５
℃）にて撹拌しながら洗浄し、次いで２ＸＳＳＣ溶液で
室温にて２回洗浄した。

比色検出法はＪ、Ｊ、リアリー、Ｄ、Ｊ、ブリガチおよ
びり、Ｃ，ワードの方法（プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ　（１９８３）　
、第８０巻、第４０４５頁］とした。フィルタを、燐酸
塩緩衝塩水［０，１３Ｍの塩化す１〜リウム、０．００
７Ｍの二塩基性燐酸ナトリウムおよび０．００３Ｍの一
塩基性燐酸ナトリウム、並びに１％の牛血清アルブミン
］を含有する緩衝液にて西洋ワサビペルオキシダーゼ−
ストレプトアビジン複合体と共に３７℃にて３０分間培
養した。フィルタを高塩緩衝液［０，５Ｍの塩化ナトリ
ウム、１０ｍＨの燐酸塩緩衝液（ｐＨ６，５＞、０．１
％の牛血清アルブミン、０．００５％のツイーン−２０
］で３回洗浄した後、フィルタを１０ｍＮトリス緩衝液
（ｐＨ７，５＞におけるジアミノベンチジンテトラヒド
ロクロライトで発色させた。フィルタを水通水で洗浄し
かつ吸取りにより乾燥させて反応を停止させた。標的二
重鎖Ｍ１３　　ＲＦ　　ＤＮＡの検出感度は４００１）
（ｌであった。同じ条件下にて、ビオチン・ニック翻訳
されたＭ１３プローブを用いる検出感度は８０ｐｑの標
的Ｍ１３　　ＲＦ　　ＤＮＡであった。

シヂジンー燐酸塩（ＣＭＰ）とカルボヒドラジドとの反
応 ９．０ｇのカルボヒドラジドを、５（７の水中に溶解し
かつｌ）Ｈを濃塩酸（約５．０ｍ１）で４．２に調整す
ることにより作成した。

シチジン−燐酸塩（１，５（＋　１４．１ミリモル）を
４０−の２Ｍカルボヒドラジド溶液に溶解し、そして混
合物を３７°Ｃで２０時間培養した。ペーパークロマト
グラフ分析［３Ｍワットマンセルロース紙、０．１Ｎ　
　ＮａＡｃ　（ｐｌ−１６，０＞／ＣＨａ　ＣＮ、４ｏ
：６０による溶出］は、仝ＣＭＰ　（ＲＦ＝　０．３２
　）　力消費されかつ新たな化合物がＲＦｏ、２５で発
生したことを示した。この反応混合物を水で４００７ま
で希釈し、次いで１０７の０．５Ｎ硝酸ランタンで処理
した。混合物を冷室温中に３時間保ち、白色沈澱物を遠
心分離によって集めた。上澄液をデカント除去し、かつ
白色沈澱物を２５（７の水に懸濁させかつ２５０のダウ
エックス５Ｏ−Ｘ−８（Ｎａ＋）を加えた。この混合物
を、透明溶液が得られるまで連続撹拌した。上記と同様
なペーパークロマトグラフィーにより、この溶液はヒド
ラジド試験［０，１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液１ｄ中にｌ
ｌｌ１ｇのピクリルスルホン酸を含有する試薬を噴霧す
ると橙赤色を発生する］に対し陽性である単一化合物を
含有することが示された。得られた生成物の■は１５．
６００　０Ｄ　２７ｏ単位（１，５６ｎモル）であり、
これはｐｌ−１７，５にて推定Ｅ　２７０＝１０，００
０に基づき３８％であった。カルボヒドラジド改変され
たＣＭＰが、凍結乾燥後に白色粉末として得られた。

試料をさらに陰イオン交換ラカム［［）Ｅ５２カラム、
Ｏ１１Ｍ−０，３Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ｐ
Ｈ７，５＞の直線濃度勾配で溶出させる］に通して精製
した。所望の生成物が約０．０８Ｍの重炭酸１〜リエチ
ルアンモニウムにてカラムから溶出され、これを凍結乾
燥して白色粉末を得た。

ＨＰＬＣ分析［ＳＡＸカラム、０．０５Ｍ燐酸カリウム
における５％メタノール、ｐＨ３，５］は単一ピーク、
滞留時間＝１３．５ｍ１ｎ、を示した［出発物質の滞留
時間＝　９．１ｍ１ｎ、］。セルロース紙におけるＴＬ
Ｃ［０，１Ｎ　　ＮＨ４ＡＣ，ｐＨ５／アセトニトリル
、４０：６０］はＲＦ＝　　０．２９であることを示し
た［出発物質のＲＦ＝　０．３２　］。生成物中のビオ
チンの存在は、セルロース紙に対し６％濃硫酸を含有す
るエタノール中のｐ−ジメヂルアミノシンナムアルデヒ
ドの溶液（０，２％）を噴霧して検出した。ビオチン含
有の化合物はこの試薬によって桃色スポットを示した。

ＮＭＲ（Ｄ２０中）：δ８．７（ＮＨ，Ｓ）：δ８．０
（Ｃｅ　Ｈ，ｄ）：δ　７．８（ＮＨ，Ｓ）；δ５．９
５　　（Ｃ５Ｈ，ｄ）　：δ５．９０　　（ＣＩ　’　
ｌ−１゜ｍ）；δ３．８−４．０　（Ｃ２’　Ｈ，Ｃ３
’　Ｈ。

Ｃ５’Ｈ，ｍ＞。

１０ＭモルのＣＨ−ＣＭＰを０．４ｄの０．１ＮＩＩ酸
ナトリウム（１）Ｈ９，０）に溶解し、かつ４…Ｑのビ
オチン−ε−アミノカプロン酸ＮＨＳエステル（エンシ
チン、エンシー・バイオケム社）を３０μｌのＤＭＳＯ
中の溶液として添加した。この混合物を４°Ｃにて１晩
撹拌し、かつざらに６…Ｑのビオチン−ε−アミノカプ
ロンＩＮＨＳエステルを５０１１ｅのＤＭＳＯ中の溶液
として添加した。反応混合物をＤＥ５２陰イオン交換セ
ルロースカラムクロマトグラフィーによって精製し、そ
の際重炭酸トリエデルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７，５
）の直線濃度勾配０．０１−０．１５　Ｍを用いた。０
．０６　Ｍ緩衝液濃度で溶出したフラクションを合し、
かつ蒸発乾固させて生成物を白色フオームとして得た。

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１個のシトシン塩基を有するヌクレオ
   チド、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを
   改変するに際し、前記ヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
   ドもしくはポリヌクレオチドをヒドラジドである第１官
   能価と任意の第２官能価とを含むヒドラジド化合物に対
   し、前記少なくとも１個のシトシン塩基における４−ア
   ミノ基を前記ヒドラジド官能価で置換してヒドラジド改
   変されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドもしくはポ
   リヌクレオチドを生成する条件下で接触させ、前記接触
   工程をビサルファイトの不存在下で行ない、さらに前記
   第２官能価が第１アミノ基でありかつ前記ヒドラジド化
   合物がヒドラジド官能価に対しα位置である炭素を含む
   際は前記第１アミノ基が前記α炭素に結合されないこと
   を特徴とするヌクレオチド、オリゴヌクレオチドもしく
   はポリヌクレオチドの改変方法。
2. （２）ヒドラジド改変されたヌクレオチド、オリゴヌク
   レオチドもしくはポリヌクレオチドをヌクレオチド配列
   中に組込むことをさらに特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
3. （３）オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが
   ２個以上のシトシン塩基を有する特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
4. （４）第１架橋成分を、接触工程に先立ちヒドラジド化
   合物に結合させる特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）第１架橋成分がビオチンである特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。
6. （６）第２架橋成分を第１架橋成分に結合させる特許請
   求の範囲第４項記載の方法。
7. （７）第２架橋成分を非共有結合させる特許請求の範囲
   第６項記載の方法。
8. （８）第１架橋成分がビオチンであり、かつ第２架橋成
   分がアビジンもしくはストレプトアビジンである特許請
   求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）ヒドラジド改変されたヌクレオチド、オリゴヌク
   レオチドもしくはポリヌクレオチドをヌクレオチド配列
   中に組込むことをさらに特徴とする特許請求の範囲第４
   項記載の方法。
10. （１０）報告成分を接触工程に先立ちヒドラジド化合物
    に結合させる特許請求の範囲第１項記載の方法。
11. （１１）オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド
    が２個以上のシトシン塩基を有する特許請求の範囲第１
    ０項記載の方法。
12. （１２）報告成分をヒドラジド改変されたヌクレオチド
    、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに結合
    させることをさらに特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
13. （１３）ヒドラジド改変されたヌクレオチド、オリゴヌ
    クレオチドもしくはポリヌクレオチドをポリヌクレオチ
    ド配列中に組込むことをさらに特徴とする特許請求の範
    囲第１２項記載の方法。
14. （１４）オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド
    が２個以上のシトシン塩基を有する特許請求の範囲第１
    ２項記載の方法。
15. （１５）報告成分を架橋成分に結合させる工程をさらに
    含む特許請求の範囲第４項記載の方法。
16. （１６）ポリヌクレオチドを相補的ポリヌクレオチドに
    ハイブリッド化させる特許請求の範囲第１項記載の方法
    。
17. （１７）ヒドラジド化合物が約６〜約１０００個の原子
    を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
18. （１８）ヒドラジド化合物が約６〜１００個の原子を含
    む特許請求の範囲第１７項記載の方法。
19. （１９）ヒドラジド化合物がカルボニルヒドラジドであ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
20. （２０）ヒドラジド化合物が水溶性である特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
21. （２１）第２官能価がカルボン酸エステル、カルボン酸
    チオエステル、イミド、ケトン、アルデヒド、エポキシ
    ド、ハロゲン化物、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
    テル、イソシアネート、イソチオシアネート、イミデー
    ト、無水物、ヒドラジン、アルコキシド、アミン、アル
    キルアミン、メルカプタン、カルボキシレート、スルホ
    ネート、ヒドラジド、ハロケトン、ジアゾニウム塩、ア
    シルアジド、ニトロフェニルエステル、スルホニルクロ
    ライドおよびマレイン酸イミドよりなる群から選択され
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
22. （２２）第２官能価がヒドラジン、アミン、アルキルア
    ミン、メルカプタン、カルボキシレートおよびカルボン
    酸エステルよりなる群から選択される特許請求の範囲第
    ２１項記載の方法。
23. （２３）第２官能価がヒドラジン、アミンおよびアルキ
    ルアミンよりなる群から選択される特許請求の範囲第２
    ２項記載の方法。
24. （２４）第２官能価がヒドラジンである特許請求の範囲
    第２３項記載の方法。
25. （２５）ヒドラジド化合物が炭素−炭素二重結合、炭素
    −窒素単結合、炭素−窒素二重結合、炭素−炭素三重結
    合、炭素−酸素単結合、炭素−硫黄単結合および炭素−
    珪素単結合よりなる群から選択される少なくとも１種の
    結合を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
26. （２６）約３．０〜約８．０のｐＨを有する溶液中で行
    なう特許請求の範囲第１項記載の方法。
27. （２７）ｐＨが約３．５〜約６．０である特許請求の範
    囲第２６項記載の方法。
28. （２８）約２０℃〜約９０℃の温度を有する溶液中で行
    なう特許請求の範囲第１項記載の方法。
29. （２９）温度が約３５〜約５０℃である特許請求の範囲
    第２８項記載の方法。
30. （３０）少なくとも１個のシトシン塩基を有し、報告成
    分が脱アミノ化されたシトシンの４位置にカルボニルヒ
    ドラジドによって結合されていることを特徴とするヌク
    レオチド、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチ
    ド。