JPS63307364A - 血液サンプル中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡ１ｃを分離しその百分率を測定する方法およびその実施に使用する装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液サンプル中のグルコシルへモグロビンＨ
ｂ　Ａ−ｆｃを分離しその百分率を測定する方法および
その実施に使用する装置に関する。

今世紀中ば以降、ヒトのヘモグロビンにハイ＜つかの異
なるフラクシヨンが存在し、物理化学的手段によシそれ
らのフラクシヨンを分離するととができることはよく知
られている。しかしながら、称で知られているこれらの
７２クシ璽ンのあるものが異種の糖類とヘモグロビンと
の結果の結果生成し、糖尿病患者にはいろいろな割合で
存在することを発見し、この発見が糖尿病を診断しモニ
ターする新しい０手段を与える道を開いた〔二ニー　・
イングランド・ジャーナル・オブ・メゾシン（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ）第２８４巻（７号）、第３５３〜３５７ページ、
１９７１年〕。

血液や蛋白質は、就中ヘモグロビンは血液中の酵素の助
けを借りることなくゆっくりと不可逆反応を起し、定量
的グリコジル誘導体を生成する。

その量はこの期間中に存在したグルコースの平均量に応
じて変化する。ヘモグロビンの場合は、との期間が赤血
球の平均寿命と同一、すなわち４ないし６週間であシ、
その反応は、主として次の２段階で起る。

ヘモグロビン（ＨｂＡ）＋グルコース （ｐｒｅ　−ＨｂＡ＋ｃ　） 第一の段階は可逆的であシ、不安定なアルジミン−タイ
プの中間体を急速に生成する。

この中間体は、第二の段階でグルコシルヘモグ０ビンＨ
ｂＡ＋ｃに徐々に変化する。

る。

糖尿病患者においては、グルコースが大量に存在するこ
とはこの反応が大規模に起ることを意味し、また従って
ＨｂＡ♀Ｃの割合が′高くなって、通常は７％を超える
ことを意味する。

１９７０年代の初期以来、グルコシルヘモグロビンの測
定が糖尿病患者をモニターするのに極めて重要であるこ
とが認められてきている。この測定は、分析に先立つ数
週間の間、患者に関する情報を医者に与えるので、その
結果によシある定まった時刻におけるグルコース・レベ
ルのモニターすることが望ましい。１９７０年代の初期
から今日にいたるまで、おびただしい刊行物がこの事実
を明らかにしてきている。この主題に関して参考となる
２つのすぐれた著作は、ニス・ラバール（Ｒａ　−ｂｈ
ａｒ、　８　）によるもの〔テキサス・レポート・オン
・ビオロジイ・アンド・メゾシン（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｐ
ｏｒｔｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）第４０巻、第３７３〜３８５ページ、１９８０〜８
１年〕およびビー・ビー・ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ、　
Ｂ、　Ｂ、　）他によるもの〔アメリカン・ジャーナル
・オン・エビデミオロジイ（Ａｍｅ−ｒｉｃａｎ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　）第１
２０巻（第２号）、第１６９〜１８９ページ、１９８４
年〕である。

グルコシルヘモグロビンの異なる７ラクシ冒ンの分離は
、ニー・ジー・シュネック（８ｃｈｎｅｋ　、　Ａ。

Ｇ、　）およびダブリニー・ニー・シェレーダー（Ｓｃ
ｈｒｏｅｄｅｒ、　Ｗ、　Ａ、　）が１９６１年に開示
しておシ〔ジャーナル・オン・ジ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエテ４　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌ　８ｏｃｉｅｔ
ｙ　）第８３巻、第１４７２〜１４７８ページ、１９６
１年〕、溶血物質を含浸させたセルピーズ・タイプまた
はメタアクリル・タイプのイオン交換樹脂を用い、その
樹脂中を、ナトリウム・イオンがおよそ（ＬＯ４９Ｍで
ｐＨ４７のリン酸ナトリウム緩衝液を通すカラムクロマ
トグラフィーによって実施された。

それ以来、多数の研究者と二・三の営利会社がこのマイ
クロコラムに適応して、極めて少量のサンプルヲ用いて
グルコシルヘモグロビンｔ−簡単力つ迅速に測定するこ
とを可能にした。とれらの方法は、すべてケー・エッチ
・ギヤビイ（Ｇａｂｂｙ　、Ｋ。

Ｈｏ）他が開示した基本的技術〔ジャーナル・オン・ク
リニカル・エンドクライノロジイ・アンド・メタボリズ
ム（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
）第４４巻（第５巻）、第８５９〜８６４ページ、１９
７７年〕を用いているの−で似たルよりたシである。こ
の基本的技術においては、ビオレックス７０　（Ｂｉｏ
Ｒｅｘ　７０、商品名）樹脂（弱カチオン樹脂、α０４
５〜α０７５■の粒子サイズを持ったメタアクリル酸と
ジビニルベンゼンの共重合体）を充填したマイクロカラ
ｌに溶血物質を適用し、ｐＨ＆７でナトリウムイオンが
約（ＬＯ４９Ｍのリン酸ナトリウム緩衝溶液を用いてグ
ルコシルヘモグロビンを溶出する。

種々の営利会社が使用している操作方法や公にされてい
る大多数の著作物において利用されている操作法は、下
記の諸点において同じである。

１）血液を水性洗浄溶液で処理し、それから５〜１０分
待って溶血現象を完了させることによって溶血物質を得
る。

２）樹脂の上部にこの溶血物質を含浸させる。

３）必要に応じて、ギヤベイ（Ｇａｂｂａｙ　）が推奨
したのと同じリン酸ナトリウム緩衝溶液を樹脂中に通し
てグルコシルヘモグロビンをすべて溶出する。

４）必要に応じて、イオン強度が更に強い第二の食塩水
を樹脂中に通して残留しているヘモグロビン類を溶出す
る。

５）二つの溶出７ラクシ冒ンの４１５ｎｍにおける示度
または第一のフラクシ冒ンと溶血物質の希釈液の示度に
よシナンプル中のグルコシルヘモグロビン類の百分率を
測定する。

６）溶出工程中は、温度を、通常は２０〜２５℃の一定
値に保持する。

これらの方法は、すべて広く臨床診断に用いられている
けれども、下記の二つの重大な不都合な点がある。

ａ）これらの方法は、試験遂行中の諸条件、就中温度の
変化に極めて影響を受けやすい。

ｂ）こレラの方法は、グルコシルヘモグロビンず、グル
コース以外の他の糖類とヘモグロビンの釈に問題を生ず
る。

温度に左右されるという問題は、アフィニティー・クロ
マトグラフィ、比色定量、電気泳動および等電点電気泳
動のような、他にとるべき技術を用いることによシ幾分
かは解決されてきている・温度に関する点は解決したけ
れども、これらの技術にはすべているいろな種類の不都
合な点があり、このことはこれらの技術を通常の分析に
利用することがイオン交換クロマトグラフィーはど広く
行℃わたっていないことの理由となっている。

共存するグルコシルヘモグロビン類がすべて一緒に溶出
するという問題は、いろいろ表研究者に他の諸方法を開
発させる結果となった。その方法の一つが、ビオ・ラッ
ド・ラボ・ラドリーズ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏ　ｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　）　　という会社によってＨｂＡ＋ｃ
についての特異な測定方法として実用化されている。こ
れらの他の方法は、すべてグルコシ溶出よシはイオン強
度が小さい第一の溶出剤と、イオン強度が大きい第二の
溶出剤を使用すること能であシ、第二の溶出剤は、グル
コシル化されていないヘモグロビン類を樹脂中に残存さ
せてＨｂ菫 Ａｒｃを溶出する。

イオン強度の相違を利用するのが分離をなしとげる方法
としては有用であるけれども、一方ではピークの下降を
遅らせるスムーズな条件の下で操作して、その工程を長
びかせることが必要である。

そして他方では、この方法は、それらが樹脂中を通過す
るとき、バンドのかなりの拡散をひきおこす。その結果
、ピークのエントレインメント・テ４　ル（ｅｎｔｒａ
ｉｎｍｅｎｔ　ｔａｉｌｓ）はかなシのものとなυ、従
ってｐＨ，イオン強度、温度または樹脂の長さなどが小
さく変化しただけでも非常に強い影響を受ける。

７−ｋ・ニスーＶｙ７リーｙ　（５ｃｈｉｆｒｅｅｎ、
　Ｒ，Ｓ、　）他は、高性能液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）にビオ・レックス７０樹脂を用いて、すなわち
諸サンプル間に再平衡が保−たれているシングル・コラ
ムを用いて研究し、アルコールが樹脂のイオン化され得
る基のｐＫａ値を低下させるので、移動相に用いられる
緩衝溶液へのエチルアルコールの添加が樹脂の迅速な再
平衡化にいかに役立つかを開示した〔クリ二カに一ケミ
ストリ４　（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ
）第２６巻（第３号）、第４６６〜４７２ページ、１９
８０年〕。デー・ペトン（Ｂｅｔｔｏｎ、　Ｄ、　）他
は、市販のキットに用いられている緩衝溶液にエチルア
ルコールを添加すると起るｐＫａ値の低下現象を利用し
てこの分離技術の改善的解決をなし菫 とげ、その結果、Ｈｂ　Ａ＋　ｃの分離を可能にした〔
アンナレス、ド・ビオロジイ・クリニック（Ａｎｎａｌ
ｅｓｄｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅ　Ｃ１１ｎｉｑｕｅ　）第
３８巻、第５７５〜３７７ページ、１９８０年〕。

しかしながら、通常の分析にこれらの条件を直接適用し
て果して役に立つかどうかは疑わしい。

すなわち、第一に研究者自身が指摘しているようもので
あシ、グルコシル化されていないヘモグロ■ ビン類の７ラクシ１ンからＨｂ　Ａ＋　ｃを完全に分離
することを困難にする。最後に、その溶媒は極めて毒性
の高いシアン化カリウムを含んでいるからである。

本発明は、こ五ら従来技術に内在する種々の不■ 都合表意に鑑み、血液サンプル中のＨｂＡ＋ｃの百分率
を通常の測定をするのに正確で信頼性があシ反覆可能な
方法を提供するものであシ、糖尿病患者の治療とモニタ
ーリングに極めてよく適している。

本発は、要約すると、次の工程からなる、血液讐 サンプル中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡ＋ｃヲ分離
し、その百分率を測定する方法である。

ａ）血液サンプルから溶血物質を得る。

ｂ）前記溶血物質を用いて弱カチオン交換樹脂に含浸さ
せる。

Ｃ）第一の緩衝溶液をその樹脂中に通してグルｅ）必要
に応じて、集めた溶出液のＨｂＡ＋ｃの含有量を分析し
、溶血物質中に存在する全ヘモグロビン量と比較する。

ここにおいて、前記グルコシルヘモグロビンＨｂＡ＋ｃ
の選別溶出に用いる溶液が、１０２〜αｏ５モル濃度の
アルカリ金属イオンを含有する緩衝溶液でチシ、他のグ
ルコシルヘモグロビン類ＨｄＡ士ａ冒 およびＨｂ　Ａ＋ｂの先行溶出に用いる溶液が、２〜１
０用緩衝溶液に類似する緩衝溶液であることを特徴とす
る。

また、本発明は、本質的に、 カチオン交換樹脂を充填したコラム１ 、α０２〜１０５モル濃度のアルカリ金属イオンおよび
２〜１０容量チの濃度の、水溶液に可溶の有機極性溶媒
を含有する緩衝溶液、 α０２〜α０５モル濃度のアルカリ金属イオンを含有す
る緩衝溶液 からなることを特徴とする前記方法の実施に使用する装
置である。

るがクロマトグラフィのバンドの分離が不十分である現
在存在する方法と異女シ、本発明の方法は、可能である
。このため、本発明の方法は現存するクロマトグラフィ
の諸方法よシははるかに正確で、信頼性があシ、反覆性
がある。

本発明の方法は、樹脂の酸性度と溶出剤である緩衝溶液
の酸性度、溶出剤である緩衝溶液中のアルカリ・イオン
濃度およびこれらの溶液への有機極性溶媒の添加という
三つの基本的パラメーターを正しく結合させることを要
する。

操作ｐＨは樹脂とへそグロビン類のイオン化し得る基の
解離度に直接影響するから、クロマトグラフィによる分
離に対しては根本的なものである。

ｐＨの変化にはなはだ鋭敏であるこの技術において、こ
のことは非常に重要なことである。

そのｐＨは、反覆可能な状態を維持するためには最低限
小数点以下第２位まで正確でなければならない。十分に
高いｐＨ値で操作し、樹脂のイオン化し得る基を解離さ
せ、その結果カチオンを保有させることが通常は好まし
い。しかしながら、グルコシルヘモグロビンが正の電荷
を帯びてコラムに吸着されるためには、ｐＨ値はグルコ
シルヘモグロビンのイオン化し得る基のｐＫａ値より著
しく高くあるべきではない。

これまでに述べた大多数の方法は、工業的方法も含んで
いるが、溶解剤としてｐＨ６，７０の緩衝溶液を用いる
。このｐＨ値は、前記のシエネック（５ｃｈｎｅｋ　）
およびシｘＶ−ダー（５ｃｈｒｏｅｄｅｒ　）の、べそ
かなシ吸着される。この程度の吸着は研究のためノ特殊
な操作やモニターリングには十分であるけれども、通常
の臨床分析に利用するためにはいささか不十分である。

というのは、その工程を大巾に長びかせ、臨床的診断に
おいて実際にはほとんど利用できなくする過度の吸着を
防止するために、アルカリ・イオン、基本的にはナトリ
ウム・イオンをα０６Ｍ以上の濃度で含有する緩衝溶液
を用い！ てＨｂＡΦＣを溶出するととが必要であるからである。

これらのイオン強度値は、樹脂とヘモグロビン類（グル
コシル化されていないヘモグロビン類を含む）との余）
特殊とは言えない分離を起し、それ故バンドを拡大させ
、グルコシル化されていないヘモグロビンのバンドを降
下させ始める。

本発明の方法は、通常用いられているｐＨ値よりは高い
、７．０を超える操作ｐＨ値を用いる。グルコシル化さ
れていないヘモグロビン類の樹脂への吸着を極めてよく
シ、グルコシルヘモグロビンのピークの集中をよくする
このｐＨ値は、低いイオン強度（アルカリ・イオンが１
０４Ｍ以下）の条件下においても、すべてのグルコシル
へモグロビらかじめ溶出することは、ある緩衝溶液を樹
脂中に通すことによってなしとげられる。この緩衝溶液
は前述したようにして得られ、この緩衝溶液に対しては
有機極性溶媒（たとえば、エチルアルコール）が十分な
量（通常は２〜１０容量チ）加えられていて、このよう
に樹脂のイオン化し得る基のｐＫａに対してシッフリー
ン（５ｃｈｉｆｒｅｅｎ　）が述べた上記の効果をこの
ようにして利用する。原則として、本発明の方法に対し
ては、水性緩衝溶液に溶解するのに十分な数の極性基と
、樹脂のイオン化し得る基のｐＫａを変更するのに十分
な数の非極性基を有するものならばどんな有機極性溶媒
でも、たとえば、短鎖の脂肪族アルコールのようなもの
でも使用することができる。

本方法の吸着段階、すなわちサンプルの調製、グルコシ
ル化されていないヘモグロビン類の選別溶出、結果の読
取シと計算は、前述の処理にひき続いて下記のように実
施する。

１）サンプルの調製 樹脂への適用に先立ってサンプルを調製するには三つの
基本的条件が必要である。

ａ）その内容物、特にヘモグロビン類の遊離を伴う赤血
球の膜の破壊 （アルジミン）の除去　　□ Ｃ）操作ｐＨに対する喀血物質の適合性ドライドｙ　（
Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００（商品名）を約α５チの
濃度で含有し、ｐＨが約５．０で、リン酸ナトリウムが
５５ｍＭの緩衝溶液を用いると、この三つの条件がみた
される。第一に、界面活性剤の存在は、膜の溶解とヘモ
グロビンの遊離をひきおこす；　第二に、媒質の適度の
酸性度は、アルミジンの解離をおこし、これが遊離のヘ
モグロビンとグルコースにもどす；　第三に、緩衝溶液
を媒質に用いると、サンプルのｐＨ値を次のクロマトグ
ラフィに適したものとする。

２）グルコシル化されていないヘモグロビン類の選別溶
出 ＨｂＡ＋ｃのフラクシヨンを溶出した後、コラム中に吸
着したグルコシル化されていないヘモグロビン類も、必
要に応じてイオン強度の高い溶液、たとえば１Ｍの塩化
ナトリウムを通すととＫよりて溶出することができる。

このようにして集めたたその代シに、コラムに適用され
る溶血物質中に存在するヘモグロビンの全量と直接比較
することによシ、このフラクシヨンを溶出することなく
その百分率を計算することも可能である。

３）結果の読取シと計算 異なる溶出路フラクション中の、または溶血物質中のヘ
モグロビンの量の測定は、（場合によっでは溶出サンプ
ルの希釈液かまたは溶血物質の希釈液を用いて）異なる
諸フックシ冒ンの光学的濃度を４１５ナノメートルにお
いて測光法によシ直接読取ることによシ行なう。

（全ヘモグロビンに対する百分率として表示される）　
ＨｂＡ＋ｃの濃度の計算は、（容量と希釈度に応じて補
正された）溶血物質の０．Ｄ、値でこのフラクシヨンに
対応する０、　Ｄ、値を除することによって、または場
合によりては全溶出フラクションの（補正された）　Ｏ
，Ｄ、値を加えることによって行なう。

本発明の方法をよシよく理解してもらうために、以下詳
細に説明する。

ａ）溶血物質の調製および不安定カフラクシ冒ンの除去 溶血剤と血液を混合し、その混合物を３７℃で２０分間
インキエベートする。

ｂ）コラムへの適用 このようにして得た溶血物質を樹脂の上部に含浸し、次
いで次の段階でも使用する緩衝溶液を少量用いてコラム
の壁面を洗浄する。

ｃ）　　ＨｂＡ干Ｃの溶出 第一の緩衝溶液を樹脂中に通すと、不要とされる他。グ
ヤヨッヤへ、グ。ビン類ＨｂＡｆａおよびＨｂＡ＋ｂを
含むフラクションを溶出する。この溶液が樹脂中を完全
に通過したら、第二の緩衝溶液を加える。これが集める
べきＨｂＡ±Ｃフラクシ冒ンを溶出する。

ｄ）全ヘモグロビンのサンプルの調製 ａ）段階で得た溶血物質１部を緩衝溶液と蒸留水で約１
　：　２４０の割合で希釈する。

サンプル中の）（ｂＡ＋ｃの百分率を次のようにして求
める。

すなわち、　ＨｂＡ＋ｃのフラクションと全ヘモグロビ
ンのサンプルの４１５ナノメートルにおける測光法によ
る読取シを行ない、（その希釈度に対応して補正した）
後者の０．Ｄ、値で前者の０．Ｄ、値を除することによ
ってサンプル中のＨｂＡ＋ｃの百分率を求める。

本明細書の不可欠の部分として二つの実施例を下にして
、本発明の方法を詳細に説明する。これらの実施例は、
本発明の方法の実施に当っての実際的の可能性について
説明するだけのものであって、この実施例に本発明を限
定するものではない。

実施例　１ 本実施例は、本発明の方法の完全な実施並びに正常な人
から採取したサンプルおよび糖尿病患者から採取したサ
ンプル中のＨｂＡ＋ｃの百分率の計算への適用を詳細に
説明し、本発明の方法がこれらの個体群を識別し得ると
とを明示する。

１）　コラムの調製 弱カチオン交換樹脂であシ、メタアクリル酸とジビニル
ベンゼンの共重合体であって、粒子のザイズが２００〜
４００メツシエであるアンバーライト　ＣＧ−５０（商
品名）タイプの樹脂を、その樹脂を充填したマイクロコ
ラムの溶出液の電導率とｐＨが緩衝溶液の電導率とｐＨ
と同一になるまで、はぼ００４Ｍに等しい濃度のナトリ
ウム・イオンを含む、ｐＨ７，０のリン酸塩の緩衝溶液
で平衡にする。

長さが約６５．で直径が約８閣のプラスチック・コラム
群にこの樹脂のサスペンシロンを充填する。

この樹脂の充填は、沈殿したら樹脂のベッドが約４０■
の高さになるように（乾燥重量で）約１５ノの樹脂を各
コラムに導入することによシ行なう。

厚さが１■の多孔性ポリエチレン盤をそのコラムの上端
と下端に置く。下端の盤は樹脂を支持し、上端の盤はサ
ンプルを完全に均一に適用することを可能にする。

２）サンプルの調製 界面活性剤トライトンＸ−１ｏ　ｏを約（１５％含有し
、ｐＨ５，ｏて、ＣＬＯ３５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝
溶液に（ｚＯ５−の血液を混合する。この混合物を（う
ず巻状に）攪拌し、次いで３７℃で２０分間インキエペ
ートする。インキエペート時間が経過したら、適用する
までには溶血物質を常温にもどすようにする。

３）サンプルのコラムへの適用 まずコラムの両端を開いてコラムが含んでいる液体をす
っかシ流し出す。次にこの液体を捨てる。

それから棒を用いてあらかじめ樹脂ベッドのレベルに調
節した上部フィルターの上に、α０５−の溶血物質を注
意深くのせる。溶血物質が樹脂に完全に浸透して樹脂に
しみこんだら、ナトリウム・イオンを約α０！５９　Ｍ
含有し、ｐＨ７，０で、１０１５Ｍのリン酸ナトリウム
の溶液であ）、あらかじめ５％のエチルアルコールを加
えである緩衝溶液をコラムに加え、コラム壁から適用物
の吸着物を洗い流して溶出を開始する。その溶出液は捨
てる。この段階と次の段階の双方においては、コラムの
温度と溶媒の温度を２３±１２℃と一定に保つ。必要に
応じて、コラムと溶媒を温度自動調節浴にいれることも
できる。

４）クルコシルヘモグロビンｓｏｄ出 コラムの滴下が止まったら、ｐＨがｚＯで、ナトリウム
・イオンを１０３９Ｍ含み、エチルアルコールを５％加
えた［ＬＤ　１５　Ｍのリン酸塩緩衝溶液２−は本実施
例の目的のためにのみ集める。しかしながら、常用の分
析ではそれを集める必要はない。）次に、コラムの滴下
が止んだら、ｐＨがＺＯで、ナトリウム・イオンをα０
３９Ｍ含むα０１５Ｍのリン酸塩の緩衝溶液４．０−を
コラムに加える。ＨｂＡｆｃを含有するこの溶出液を集
める。

５）全ヘモグロビンのサンプルの調製 段階２で集めた溶血物質α０５ｍを、１Ｍの塩化ナトリ
ウム緩衝溶液４．０−と蒸留水ａＯ−と混合する。均一
な混合液が得られるまで、それを激しくうず巻状に攪拌
する。

６）結果の読取シと計算 分光光度計、または場合によっては適当なフィルターを
取付けた光度計を用いて、段階４で集めで調製したサン
プルの０．　Ｄ、　（全Ｈｂの０．Ｄ、）を４１５ｎｍ
で読取る。

２つの７ラクシ讐ンの百分率は次のようにして計算する
。

ＨｂＡｆ−ａ　＋　ｂ　（Ｑ百分率＝ ＨｂＡ橿Ｃの百分率冨 ２つのグループ、すなわち通常の患者から採取した第一
のグループおよび糖尿病に分類される患者から採取した
第二のグループの、それぞれ２０個のサンプルについて
操作し、本発明の技術を実施した。この場合、病気の程
度については何等特別の制限を付さなかった。得られた
数値を次表に示す。

その得られた平均値は下記の如くである。

通常の患者のサンプル： ＨｂＡ＋ａ＋ｂの百分率＝２．２１±０．２０％ＨｂＡ
！ｃの百分率　＝５．１４±ｒ：Ｌ６６ｑｂＨｂＡ＋ｃ
の百分率＝ＩＱ、１４±２．１５％一方、Ｈｂ　Ａ＋　
ｃの百分率に関しては、変動の差が比較的少なく、糖尿
病患者のグループの平均値の方が通常の患者のグループ
の平均値よシ９７％高いから、この２つの集団のグルー
プを完全に区に顕著であることを認めることができる。

このこが特に有用であることを立証するものである。

実施例　２ 本実施例は、クロマトグラフの溶出グラフを調べ、それ
を現在使用されている他の２つの方法により得られたも
のと比較して、グルコシルヘモグロビン類のピークの分
離について詳細に記述する。

溶出グラフを調べるだけでなく、中央高におけす るピークの巾、ＨｂＡｆｃのピークの谷間の深さと比較
した谷間の深さ、ＨｂＡ＋ｃ溶出の終期におけるグルコ
シル化されていないもののバンドの先端がコラムを下降
する距離、溶出工程の終期におけるコラムの先端と末端
の距離についても計算を行ない、クロマトグラフを解明
するための手掛りとなるパラメーターを提供した。

実施例１で述べた操作方法を用い、４１５　ｎｍにおけ
るＯ、　Ｄ、値を読取って、Ｑ、５−ずつの分離フラク
ションの中から２つのグルコシル化されたフラクション
を集めた。

他の２つの方法は、溶出液の収集を除いて諸指示に従っ
て厳密に実施した。これらの方法を識別するために、ま
た本実施例の諸口的を達成するために、樹脂長が長く、
サンプルの量が多く、容量が大きい、最も古い方法を以
後マクロ法と称する。

また、最近開発されたもう一つの類似の方法は、もっと
少量の樹脂とサンプルと緩衝溶液を用いるものであシ、
以後ミクロ法と称する。

三つの場合の各々において、通常の患者のサンプルと糖
尿病患者のサンプルを用いた。

溶出グラフはミリリットル（−）で表わされる、対応溶
出容量に対する４１５ｎｍにおける各フラクションの０
．Ｄ、値をプロットすることによって作成した。

本実施例を更に詳しく説明するために、これらの分析結
果から作成したグラフを第１〜６図に示すＯ 第１図は、本発明の方法を用いた通常の患者のサンプル
の分析結果を示す。

第２図は、ミクロ法を用いた通常の患者のサンプルの分
析結果を示す。

第３図は、マクロ法を用いた通常の患者のサンプルの分
析結果を示す。

第４図は、本発明の方法を用いた糖尿病患者のサンプル
の分析結果を示す。

第５図は、ミクロ法を用いた糖尿病患者のサンプルの分
析結果を示す。

第６図は、マクロ法を用いた糖尿病患者のサンプルの分
析結果を示す。

それぞれの場合において、陰影をつけた領域は、！ ＨｂＡ＋ｃのピークとして集めたフラクションを示す。

下表は、このクロマトグラフの下記の特徴ある百分率の
最大値として表示された、ＨｂＡ？ｃのピークにおいて
集めた最初のフラクションの０．Ｄ。

−りにおいて集めた最後のフラクションの０．Ｄ。

ＨＬ＋ＡＯの先端が樹脂中を下がって行く距離　［Ｆ］
■で表示された、ＨｂＡ＋ｃの溶出が完了した時の、Ｈ
ｂＡＯの先端とコラムの末端との間の距離　（Ｌ）（こ
の三方法において、通常の患者のサンプルに対する場合
と糖尿病のサンプルに対する場合とでは、パラメーター
はよく似ていて、平均値として表示する。） クロマトグラフのグラフという観点からすると、通常の
患者のサンプルおよび糖尿病患者のサンプルに対する各
々の場合において気゛付き得ることではあるが、同じよ
うな結果が得られるということから次の諸点が明らかと
なる。

１）治療的観点からすると極めて重要な意義をそれぞれ
全部で６−と５．５−でよいという点で）よく似ておシ
、同じことをやるのに１４１１ｔ１！！を要するいわゆ
るマクロ法に比してはるかにすぐれている。

２）　　ＨｂＡΦＣのピークの分離に関しては、最高値
に関する最初の点と最後の点の高さを代表的なパラメー
ターとして選んでいる。

本発明の方法は、（これらの点が最高値の約１５％であ
るという点で）マクロ法とよく似ていることおよび特に
この場合最高値の４６チを示す最後の点に関しては、両
法がミクロ法よシはるかにすぐれていることは、グラフ
および表の双方において認めることができる。

３）クロマトグラフィにおいては通常のことであるが、
中央高において表示される溶出ピークの巾に関しては、
本発明の方法が、２つのピークにおいて他の２つの方法
に比してはるかにすぐれていることを認めることができ
る。このことは、表中のデータ（ＤｌおよびＤＪからと
、バンドの巾においてかなシの差があることが容易に認
められるグラフから、演鐸することができる。

４）クルコシル化されていないヘモグロビン類出し始め
る危険に関しては、本発明の方法が、それ自身他の２つ
の方法に比して極めてすぐれていることを示している。

一方、本発明の方法のバンドの保持は、（先端が１０■
移動する）ミクロ法のそれとよく似ているが、（先端が
１５．移動する）マクロ法のそれよりはるかにすぐれて
いて、（コラムの長さが、８ｍと１０■でおることに比
してその長さが５０ｍであることによシ）、ＨｂＡ＋ｃ
バンドの末端からの離れ方が極めてよい。就中、工程を
早めるため、極めて短いコラムを使用するミクロ法に比
べるとよい。短いコラムの使用カットするように思われ
る。

かくて本発明は、従来の方法よシはるかに速く、もう一
方の最近開発された方法と同程度に速い上に、その二つ
の方法よシ問題解決にはるかに役立ち、信頼できる方法
を提供するものであると結論することができる。

それ故、本発明の方法は現在使用している多くの方法に
比して、迅速性、問題点の解明および正確さにおいて全
体として明らかにすぐれていることが判る。

以上をもって本発明の説明を終るが、ここに示した思想
を実施するにあたっては細部にわたって変更を加えるこ
とができることを強調しなければならない。すなわち、
この思想とは、本質的には上記の説明の中で述べたとこ
ろのものであるが、常にこの思想の基本的諸原則に基づ
く小さな変更は加えることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法を用いた通常の患者のサンプル
の分析結果を示す◎ 第２図は、ミクロ法を用いた通常の患者のサンプルの分
析結果を示す。 第３図は、マクロ法を用いた通常の患者のサンプルの分
析ｉ果を示す。 第４図は、本発明の方法を用いた糖尿病患者のサンプル
の分析結果を示す。 第５図は、ミクロ法を用いた糖尿病患者のサンプルの分
析結果を示す。 第６図は、マクロ法を用いた糖尿病患者のサンプルの分
析結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １） ａ）血液サンプルから溶血物質を得る。 ｂ）前記溶血物質を用いて弱カチオン交換樹脂に含浸さ
   せる。 ｃ）第一の緩衝溶液をその樹脂中に通してグルコシルヘ
   モグロビン類ＨｂＡｌａおよびＨｂＡｌｂの選別溶出を
   行なう。 ｄ）第二の緩衝溶液をその樹脂中に通して ＨｂＡｌｃの選別溶出を行なう。 ｅ）必要に応じて、集めた溶出液のＨｂＡｌｃの含有量
   を分析し、溶血物質中に存在する全ヘ モグロビン量と比較する。 の工程からなり、前記グルコシルヘモグロビンＨｂＡｌ
   ｃの選別溶出に用いる溶液が、０．０２〜０．０５モル
   濃度のアルカリ金属イオンを含有する緩衝溶液であり、
   他のグルコシルヘモグロビン類ＨｂＡｌａおよびＨｂＡ
   ｌｂの先行溶出に用いる溶液が、２〜１０容量％の濃度
   で水溶液に可溶の有機極性溶媒を含有する前記グルコシ
   ルヘモグロビンＨｂＡｌｃ溶出用緩衝溶液に類似する緩
   衝溶液であることを特徴とする血液サンプル中のグルコ
   シルヘモグロビンＨｂＡｌｃを分離しその百分率を測定
   する方法。 ２）前記有機極性溶媒が短鎖の脂肪族アルコールである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の血液サ
   ンプル中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡｌｃを分離し
   その百分率を測定する方法。 ３）前記使用されるアルコールがエチルアルコールであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の血液
   サンプル中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡｌｃを分離
   しその百分率を測定する方法。 ４）前記溶出に使用される緩衝溶液がｐＨ値６．７〜７
   ．２のリン酸ナトリウムからなることを特徴とする特許
   請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の血液サンプル
   中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡｌｃを分離しその百
   分率を測定する方法。 ５）前記二種の緩衝溶液においてナトリウム・イオンの
   濃度が同一で、かつ約０．０４モルであることを特徴と
   する特許請求の範囲第４項に記載の血液サンプル中のグ
   ルコシルヘモグロビンＨｂＡｌｃを分離しその百分率を
   測定する方法。 ６）前記エチルアルコールの濃度が３〜７％であること
   を特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の血液サンプ
   ル中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡｌｃを分離しその
   百分率を測定する方法。 ７）溶血剤が０．５％の界面活性剤を含有する、ｐＨ５
   のリン酸ナトリウム３５ｍＭからなる緩衝溶液であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに
   記載の血液サンプル中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡ
   ｌｃを分離しその百分率を測定する方法。 ８）前記使用される界面活性剤がトライトンＸ−１００
   （Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、商品名）であることを特
   徴とする特許請求の範囲第７項に記載の血液サンプル中
   のグルコシルヘモグロビンＨｂＡｌｃを分離しその百分
   率を測定する方法。 ９）コラム中の樹脂の高さが３５〜４５ｍｍであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記
   載の血液サンプル中のグルコシルヘモグロビンＨｂＡｌ
   ｃを分離しその百分率を測定する方法。 １０）本質的に、 カチオン交換樹脂を充填したコラム、 ０．０２〜０．０５モル濃度のアルカリ金属イオンおよ
   び２〜１０容量％の濃度の、水溶液に可溶の有機極性溶
   媒を含有する緩衝溶液、 ０．０２〜０．０５モル濃度のアルカリ金属イオンを含
   有する緩衝溶液 からなることを特徴とする前記方法の実施に使用する装
   置。 １１）本質的に、溶血剤として用いる界面活性剤の水溶
   液を含有することを特徴とする前記方法の実施に使用す
   る装置。