JPS60213863A - ヘモグロビン分離用架橋共重合体 - Google Patents

ヘモグロビン分離用架橋共重合体

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JPS60213863A
JPS60213863A JP59070631A JP7063184A JPS60213863A JP S60213863 A JPS60213863 A JP S60213863A JP 59070631 A JP59070631 A JP 59070631A JP 7063184 A JP7063184 A JP 7063184A JP S60213863 A JPS60213863 A JP S60213863A
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JP
Japan
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crosslinked copolymer
hemoglobin
stable
copolymer
blood
Prior art date
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Pending
Application number
JP59070631A
Other languages
English (en)
Inventor
Tadao Hoshino
忠夫 星野
Yuzo Yanagihara
柳原 裕三
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Corp
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Asahi Kasei Kogyo KK
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Publication date
Application filed by Asahi Chemical Industry Co Ltd, Asahi Kasei Kogyo KK filed Critical Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority to JP59070631A priority Critical patent/JPS60213863A/ja
Publication of JPS60213863A publication Critical patent/JPS60213863A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26Synthetic macromolecular compounds

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はへモグレビン分離用架橋共重合体に関する。
ヘモグロビン(以下ゐと記す)は血液に含まれる色素蛋
白質で、血中の酸素運搬体として重要な役割を果してい
る。人のヘモグロビンは数多くの分画からなり、電気泳
動法やイオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィ
ーによって分離することができる。イオン交換樹脂によ
って得られる画分HbA、はさらにHbA4a%HbA
41) 、 HbAtcに細分画される。HbA16は
HbAtの多くの部分を占めており、通常グリコヘモグ
ロビンとしてHbAsまたはHbAleが測定される。
グリコへモグ四ビyli測定時よりさかのぼって前l〜
3カ月間の血糖値とよく相関するので、糖尿病の治療指
標として有用であり、主として液体り四マドグラフィー
(以下LCと記す)によって分離定量されている。しか
しながらHbAlc は安定型のほかに不安定屋のグリ
コヘモグロビンを含み、前記目的に対しては安定型のみ
を定量する必要がある。
これtでにグリコヘモグロビンを分離定量するためのい
くつかの方法が知られている。例えば、架橋アクリル酸
また社メタクリル酸を基本骨格とする弱酸性イオン交換
樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーによる分析法が
、操作性や測定データの安定性等に問題があるとして改
良が試みられている(特開昭!に一1010!0号、特
開昭56−qprtrtr号、特開昭3g−7−osr
号等)。また近年イオン交換基を持た壜い特定の粒状合
成高分子やカルボキシル基を有するシリカゲルを固定相
とする高速液体り瞠マドグラフィー(以下HPLCと記
す)を用いた方法も報告されている(特開昭36−?ざ
657号、特開昭37−コ6り4<6号、特開昭5ク一
ノJ!?J!fA号)。しかしながら、これらの方法で
社いずれもHbAlc の安定盤と不安定型とがまった
く分離されていないか、分離が不十分であった。
本発明a HbAsaの安定型と不安定型とを分離する
と共に、安定型を定量する方法に用い得る架橋共重合体
の提供を目的とするものである。
すなわち、本発明はビニルアルコール単位に由来する水
酸基l〜i o mq/lと、カルボキシル基aコ〜J
 Ormq/lとを有す石ヘモグロビン分離用架橋共重
合体に関する。
本発明の架橋共重合体はビニルアルコール単位に由来す
る水酸基を共重合体乾燥重量あたりl〜/ Omq/l
の範囲で含む。
水酸基の量は、水酸基を無水酢酸と反応させて消費した
無水酢酸の量、または架橋共重合体の重量変化を測定す
ることによりめることができる。
乾燥架橋共重合体/lが/ mmolの無水酢酸と反応
したときの水酸基の量を/ meq/fとする。水酸基
の量は実用上は/ = g meq/fの範囲にあるの
が好ましい。
さらに本発明の架橋共重合体はカルボキシル基ヲ0.2
〜3.0meq/fの範囲で含む。カルボキシル基の結
合様式は特に限定されないが、例えば、下記(りまたは
(2)の基が主鎖に結合したもので表わされる。なかで
も(1)が好ましい。
OCR2C0OH(1) OC0CHz CH2C0OH(2) カルボキシル基の量は通常のカルボン酸型のイオン交換
樹脂の交換容量の測定方法でめ得る。カルボキシル基の
量は実用上は0.5〜2.0meq/lの範囲にあるの
が好捷しい。
本発明の架橋共重合体の架橋構造は特に限定されないが
、例えば、トリアリルインシアヌレート、ジアリルイン
7アヌレートやトリアリルシアヌレート等のトリシアヌ
レート環やトリアジン環を有する架橋性単量体単位によ
って架橋された構造等を挙げることができる。なかでも
トリアリルイソシアヌレートによって架橋された構造が
好ましい。
架橋共重合体としては全多孔性の構造を有するものを挙
げることができる。重量は保水量で表わされ、水中で十
分膨潤させた架橋共重合体をフィルター付の遠沈管に入
れ、該架橋共重合体表面の付着水を遠心分離したのち架
橋共重合体を乾燥して、乾燥前後の重量変化から乾燥架
橋共重合体単位重量あたりの値としてめることができる
◎分離能と強度をバランスさせるためには保水量がas
 NIAov/ltv範囲にあるのが好ましく 、HP
LC用充填剤として用いる場合は0.!r−3.097
fの範囲にあるのがよい。
本発明の架橋共重合体がLC用固定相として用いられる
場合、平均粒径は/NN1000pの範囲にあり、HP
LC用の場合は2〜75μmの範囲にあるのが好ましい
本発明の架橋共重合体の製法の一例は特願昭!it−1
0kg11コ号公報に示されており、水酸基やカルボキ
シル基の量等を本発明の範囲になるように選べばよい。
本発明の架橋共重合体を用いたヘモグロビンの分離は、
例えば前記架橋共重合体を固定相とするLCによって行
表い得る。固定相は通常はステンレスやガラスのカラム
に充填されて用いられる。
また移動相としてはグリコヘモグロビンをLCによって
分析するときに使用される公知の移動相、例えば酢酸ナ
トリウム系やリン酸ナトリウム系のような緩衝液、ある
いは塩化ナトリウムや硫酸ナトリウム等の塩を含む液が
用いられる。また移動相に尿素や塩酸グアニジンの添加
あるいはアセトニトリル、メタノール、エタノール、メ
ルカプトエタノール等の有機溶媒を混合してもよい。移
動相の虜はλ〜/2の範囲で変えることができ、好まし
くはダ〜/θの間で設定するのがよい。移動相の組成、
例えば緩衝剤、塩、尿素、有機溶媒等の濃度や声は必ず
しも一定である必要はなく、連続的あるいは段階的勾配
方式によって変化させることができる。溶離液中のへ七
グpビンは例えば波長亭/ j nmの可視光の吸光度
を測定することにより検出でき、分離、分析を容易に行
なうことができる。
本発明の架橋共重合体を固定相として用いたLC等によ
ってHb、特にHbAl、の安定型と不安定型を容易に
分離できる理由は明らかではないが、架橋共重合体がビ
ニルアルコール単位に由来する水酸基とカルボキシル基
を有するためHbAlcの安定型と不安定型に対する親
和性に微妙な差が生じたことによると思われる。また本
発明の架橋共重合体は、アルカリ水溶液に対する耐性が
大きいので移動相や洗浄液の−゛を広い範囲で選択でき
る。さらにイオン交換基のほかに非イオン性親水基を多
く有するため、架橋共重合体に対して蛋白質等の非特異
的吸着が少なく、安定したクロマトグラムを繰り返し得
ることができる。このように本発明の架橋共重合体を用
いることによりグリコヘモグロビン、特にI(bAlc
の安定型の分析を迅速で容易にかつ安定して行なうこと
が可能になり、糖尿病における血糖コン)1−−ルの指
標を得るために有効に用いることができ、利用価値は極
めて大きい。
次に本発明の詳細な説明するが、本発明は以下の実施例
に限定されるもので社ない。
実施例1 コ4セパラブルフラスコに少量のポリビニルアルコール
とリン酸ナトリウムを含む水溶液g00mlト、酢酸ビ
ニル1001.)リアリルイソシアヌレ−)J7.&f
、オクチルアセテート 96を及びコ、2′−アゾビス
イソブチロニトリル3fよりなる混合液を入れ十分攪拌
したのち60℃で/7時間、さらに71’CでS時間加
熱して懸濁重合を行ない粒状共重合体を得た。次にこの
共重合体を乾燥したのちカセイソーダ s2tを溶解し
た水JJと共に13℃で20時間攪拌しケン化反応を行
なった。
さらにケン化反応後の粒子iotをクロロ酢酸i、lI
t及びカセイソーダ 1.コfと共に水/θ0−の中に
入れ30℃で76時間反応した。粒子をp別、水洗した
のち分級して平均粒径9.0μmの粒状架橋共重合体を
得た。この粒状架橋共重合体の一部をピリジン中で過剰
の無水酢酸と共にデ5℃で16時間加熱し、反応前後の
共重合体の重量変化からめた共重合体の水酸基の量はダ
、t rryeq/lであった。
また共重合体を浸漬した塩化ナトリウム水溶液にカセイ
ソーダ水溶液を滴下して測定した一炭化、いわゆる滴定
曲線からめたカルボキシル基の量はQデmeq/fであ
った。共重合体の保水量は/、1.f/fであった。
この粒状共重合体を内径7jvm 、長さ10cm の
ステンレスカラムに充填して液体クロマトグラフィー用
固定相とし、以下の分離操作を行なった。
エチレンジアミン四酢酸ナトリウム0.3■を入れた試
験管に健常人血液0.2−を加え、5分間遠心沈降を行
ない、得られた上澄液を廃棄し、沈降した血球部分に生
理的食塩水/、j−を加えて十分攪拌し、再び遠心沈降
を行ない血球を洗浄した。
血球洗浄状さらに一回繰り返し行なった。得られた洗浄
血球容量の約5倍量の脱塩水を血球に加え十分攪拌し血
球を溶血させた。次いで溶血液に約等量のトルエンを加
え、遠心器によりS分間遠心沈降を行ない水層部分のl
pンをHb試料とした。
30rrN1のリン酸二水素−ナトリウムを含み、−ふ
!に調整した水溶液をA液とし、A液に03Mの塩化ナ
トリウムを共存させた水溶液をB液としそれぞれ移動相
として用いた。
送液ポンプの吸入側にA液とB液を勾配形成装置を介し
て接続し、A/B比がqs/、2s;(体積比)になる
ように設定してl一層で通液しつつインジェクターから
Hb試料を注入したのち3コ一通液後、A/B比が3 
!;/l、 ! になるようにした。この間カラムをコ
ダ℃に保った。
カラムから流出する液はフローセルを有する分光光度針
に連結し4</、tnm の吸光度を測定し、第1図の
クロマトグラムを得た。
ビーク/とコがHbAl、画分を構成するものであるこ
と社次のようにしてわかった。後述の従来法によって分
取して得られたHbAlc 画分を水沫で再画分すると
、ビークlとコがその主たる構成分であった。さらに洗
浄血球をグルコース共存下でインキュベートしたのちH
b試料を調整し測定したところビークlが顕著に増大し
たこと、また生理食塩水中で同様にインキュベート後測
定したところビークlが著しく減少したことから、ビー
クlが不安定展のHbAlaであると推定した。
また移動相の通液速度を2−にした以外、前述のクロマ
トグラフイーの操作を同様に行たったところ、約半分の
時間でHbAl(+の安定型と不安定型が良好に分離さ
れた(第2図)0 このように水沫ti HbAlcの安定型と不安定型と
を迅速に、かつ良好に分離できることがわかった。
比較例1(従来法) 実施例1で調整したHb試料コ00μlを、弱酸性陽イ
オン交換樹脂Blo−Rex 70 (バイオ・ラド社
製)を充填した直径ざ簡、長さ739M11のカラムの
上端に吸着させた。次いで30mMのリン酸−ナトリウ
ム及び10−シアン化カリウムを含み、pH4,7の水
溶液をQ 7 w4/1xisで7−分間前記カラムに
通液し、さらに/10− のリン酸−ナトリウムを含み
、pH6,4Iコの液を同様の流速で通液した。得られ
た溶出液のII / !r nnlの吸光度を分光光度
計で測定して第3図の結果を得た。第3図中ビークAは
HbAl、とHbAlbの混合物に、ピークBはHb4
e1またピークCはHbA5 に相当するものである。
【図面の簡単な説明】
第1図及び第4図は実施例1で得られたクロマトグラム
である。図中ピークl及びコはヘモグミビンの分画を示
す。また第3図は比較例1で得られたクロマトグラムで
ある。第3図中のピークA。 B、Cはヘモグロビンの分画を示す。 特許出願人 旭化成工業株式会社 代理人弁理士 星 野 透 4M fl−at間 (チjン 第1図 イ月に椅II+閾 (#) 第2図 イj(持重1 間 (分) 第3図

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)、ビニルアルコール単位に由来する水酸基/=1
    0maq/lと、カルボキシル基0.2〜3.0 mq
    /lとを有するヘモグロビン分離用架橋共重合体。
JP59070631A 1984-04-09 1984-04-09 ヘモグロビン分離用架橋共重合体 Pending JPS60213863A (ja)

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JP (1) JPS60213863A (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02309253A (ja) * 1989-05-23 1990-12-25 Sekisui Chem Co Ltd 糖化ヘモグロビンの定量法
JPH03118466A (ja) * 1989-09-29 1991-05-21 Sekisui Chem Co Ltd 糖化ヘモグロビンの定量法
JPH0384362U (ja) * 1989-12-18 1991-08-27
JPH055730A (ja) * 1990-11-30 1993-01-14 Hitachi Ltd 液体クロマトグラフ装置
US5294336A (en) * 1989-09-18 1994-03-15 Hitachi, Ltd. Apparatus for liquid chromatography for separating AIC components from hemoglobin in blood

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