JPS6332482A - Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法Info
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- JPS6332482A JPS6332482A JP61172832A JP17283286A JPS6332482A JP S6332482 A JPS6332482 A JP S6332482A JP 61172832 A JP61172832 A JP 61172832A JP 17283286 A JP17283286 A JP 17283286A JP S6332482 A JPS6332482 A JP S6332482A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその
製造方法に関する。
製造方法に関する。
本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素に類似する作
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するし一α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭５９−１９８９７２に記載されている。しか
しながらこの公開された明細書に記載されているＬ−フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌により生産さ
れたものであり、この明細書には、バシルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属細菌が同情の酵素を生産することは全く示
唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニンデヒド
ロゲナーゼはＬ３０．ＯＯ’０±１０，０００の分子量
を有し、分子！ ６．６００±５，０００のサブユニッ
トから成る点、及びフェニルピルビン酸のみならずｐ−
ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドールピルビン酸
等広範囲の基質に対して高い特異性を有する点等におい
て、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く
異なる。
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するし一α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭５９−１９８９７２に記載されている。しか
しながらこの公開された明細書に記載されているＬ−フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌により生産さ
れたものであり、この明細書には、バシルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属細菌が同情の酵素を生産することは全く示
唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニンデヒド
ロゲナーゼはＬ３０．ＯＯ’０±１０，０００の分子量
を有し、分子！ ６．６００±５，０００のサブユニッ
トから成る点、及びフェニルピルビン酸のみならずｐ−
ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドールピルビン酸
等広範囲の基質に対して高い特異性を有する点等におい
て、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く
異なる。
特開昭６１−１４６１８３にはロドコッカス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の生産するＬ−フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼ及びこの酵素を利用するし一α−７
ミノカルボン酸の製造方法が記載されている。この明細
書には、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細閑が同様の
酵素を生産することは全く示唆されていない。ロドコッ
カス属細菌の生産する酵素はＬ−フェニルアラニンに対
して著しく高い基質特異性を有することが記載されてい
るが、酵素の分子量については全く記載されていない。
ｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の生産するＬ−フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼ及びこの酵素を利用するし一α−７
ミノカルボン酸の製造方法が記載されている。この明細
書には、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細閑が同様の
酵素を生産することは全く示唆されていない。ロドコッ
カス属細菌の生産する酵素はＬ−フェニルアラニンに対
して著しく高い基質特異性を有することが記載されてい
るが、酵素の分子量については全く記載されていない。
本発明者等の発明に係る特願昭６０−０８０２９３号及
び特願昭６０−１２７１１８号明細書にはバシルス属微
生物又はスポロサルシナμ江犯１と猛劇１り一属微生物
が生産するし一フヱニルアラニン脱水素酵素及びその製
造方法、並びに該酵素を使用するＬ−フェニルアラニン
の製造方法が記載されている。しかし、これらの微生物
に由来するフェニルアラニン脱水素酵素はいずれも高速
液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ ３０００ Ｓりによ
り測定される約２９０．０００の分子量を有する点など
において、３６０．０００〜３７０，０００の分子量を
有する本発明のフェニルアラニン脱水素酵素と異る。
び特願昭６０−１２７１１８号明細書にはバシルス属微
生物又はスポロサルシナμ江犯１と猛劇１り一属微生物
が生産するし一フヱニルアラニン脱水素酵素及びその製
造方法、並びに該酵素を使用するＬ−フェニルアラニン
の製造方法が記載されている。しかし、これらの微生物
に由来するフェニルアラニン脱水素酵素はいずれも高速
液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ ３０００ Ｓりによ
り測定される約２９０．０００の分子量を有する点など
において、３６０．０００〜３７０，０００の分子量を
有する本発明のフェニルアラニン脱水素酵素と異る。
従って本発明は、今まで知られているＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とは異る新規なＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素、及びその製造方法を提供しようとするもので
ある。
ニン脱水素酵素とは異る新規なＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素、及びその製造方法を提供しようとするもので
ある。
本発明者等は、該酵素を生産する新規な微生物及び該酵
素の新規な製造方法を開発するために、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素活性を有する菌株を広範囲にスクリー
ニングしたところ、バシルス属微生物が高活性で新規な
し一フヱニルアラニン脱水素酵素を生産することを見い
出した。
素の新規な製造方法を開発するために、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素活性を有する菌株を広範囲にスクリー
ニングしたところ、バシルス属微生物が高活性で新規な
し一フヱニルアラニン脱水素酵素を生産することを見い
出した。
前記の目的は、次の性質：（１）１モルのＬ−フェニル
アラニン、１モルのＮＡＤ’及び１モルの水から１モル
のフェニルピルビン酸、１モルのアンモニウムイオン及
び１モルのＮＡＤＨを生成する反応、並びにこの逆反応
を触媒する；（２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾
過法において約３６０，０００〜３７０、０００の分子
量を示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドディスク電気泳
動法において約３８．０００〜３９．０００の分子量を
有するサブユニットを示す；及び（３）Ｌ−フェニルア
ラニンに特異的に作用し、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプト
ファン及びＬ−メチオニンに対する特異性が非常に低い
；を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素；並びにバシルス属微生物を培養し、この培養物
から前記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製
造方法を提供することにより解決される。
アラニン、１モルのＮＡＤ’及び１モルの水から１モル
のフェニルピルビン酸、１モルのアンモニウムイオン及
び１モルのＮＡＤＨを生成する反応、並びにこの逆反応
を触媒する；（２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾
過法において約３６０，０００〜３７０、０００の分子
量を示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドディスク電気泳
動法において約３８．０００〜３９．０００の分子量を
有するサブユニットを示す；及び（３）Ｌ−フェニルア
ラニンに特異的に作用し、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプト
ファン及びＬ−メチオニンに対する特異性が非常に低い
；を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素；並びにバシルス属微生物を培養し、この培養物
から前記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製
造方法を提供することにより解決される。
（１）微生立
本発明において使用する微生物として、例えばバシルス
・バディウスＩＡＭ １１０５９（ＡＴＣＣ１４５７４
）微工研菌寄第８５２９号（ＦＥＲＭ Ｐ−８５２９）
を挙げることができる。本菌はＡＴＣＣカタログやＪＦ
ＣＣカタログに記載されており、容易に入手することが
できる。
・バディウスＩＡＭ １１０５９（ＡＴＣＣ１４５７４
）微工研菌寄第８５２９号（ＦＥＲＭ Ｐ−８５２９）
を挙げることができる。本菌はＡＴＣＣカタログやＪＦ
ＣＣカタログに記載されており、容易に入手することが
できる。
なお、本菌に変異を生じさせて一層生産性の高い菌株を
得ることもできる。さらに、これらの菌株の細胞中に存
在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生産に関与す
る遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラ
スミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例
えばエソシエリノヒア・コリ （Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）や酵母のごとき異種宿主を形質転換す
ることにより、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素生産株
を人為的に創成することもできる。
得ることもできる。さらに、これらの菌株の細胞中に存
在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生産に関与す
る遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラ
スミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例
えばエソシエリノヒア・コリ （Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）や酵母のごとき異種宿主を形質転換す
ることにより、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素生産株
を人為的に創成することもできる。
（２） ＭｌぶりもＬ１汰
前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが
好ましい。
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが
好ましい。
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当っては前記
基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラニ
ンを添加するのが好ましい。このＬ−フヱニルアラニン
の添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等に
より異なるがおよそ０．０１〜１ ｗ ／ ｖ％である
。
基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラニ
ンを添加するのが好ましい。このＬ−フヱニルアラニン
の添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等に
より異なるがおよそ０．０１〜１ ｗ ／ ｖ％である
。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよいが
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内であれ
ばいずれの温度でも良いが、好ましくは２５〜４５℃で
ある。ｐＨは６〜１１、好ましくは７〜ＩＯの範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは６〜４８時間である。
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内であれ
ばいずれの温度でも良いが、好ましくは２５〜４５℃で
ある。ｐＨは６〜１１、好ましくは７〜ＩＯの範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは６〜４８時間である。
次に得られた培養物から本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって、粗酵
素を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプ
トマイシンを加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行ない、さらに
硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の
添加による結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵
素標品を単離することが出来る。なお、本発明の酵素の
製造方法の具体的な一例を実施例に記載する。
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって、粗酵
素を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプ
トマイシンを加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行ない、さらに
硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の
添加による結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵
素標品を単離することが出来る。なお、本発明の酵素の
製造方法の具体的な一例を実施例に記載する。
（３）力ｌ■亙定抹
本発明においては次の方法により力価を測定した。酸化
的脱アミノ化反応ニゲリシン−Ｋｃｔ−Ｋｏ［ｌ衝液（
ｐＨ１０，５） １００ ｐ ｍｏｌ 、 ＮＡＤ”
２．５ 、ｃｚｍｏｌ 、Ｌ−フェニルアラニン１０μ
ｍｏｌ−、及び適当量のサンプルを１ｍｌになるように
混合して反応せしめ、２５℃におけるＮＡＤＨの増加を
３４０ｎｍの吸光度の増加として計測し、１分間当り１
μｍｏｌ のＮＡ叶を増加せしめる酵素量を１単位とす
る。
的脱アミノ化反応ニゲリシン−Ｋｃｔ−Ｋｏ［ｌ衝液（
ｐＨ１０，５） １００ ｐ ｍｏｌ 、 ＮＡＤ”
２．５ 、ｃｚｍｏｌ 、Ｌ−フェニルアラニン１０μ
ｍｏｌ−、及び適当量のサンプルを１ｍｌになるように
混合して反応せしめ、２５℃におけるＮＡＤＨの増加を
３４０ｎｍの吸光度の増加として計測し、１分間当り１
μｍｏｌ のＮＡ叶を増加せしめる酵素量を１単位とす
る。
還元的アミノ化反応ニゲリシン−ＫＣ１ｌｆｉ衝液（ｐ
Ｈ９、５）１００ ＃ ｍｏｌＸＮＡＤＨＯ，１ｐ ｍ
ｏｌ、ＮＨ４Ｃｌ １２００１！ ｍｏｌ−フェニルピ
ルビン酸ナトリウム１０μｆｆ１ｏ１及ヒ適当量のサン
プルを１ｍｌになるように混合して反応せしめ、２５℃
におけるＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度の減少と
して計測し、１分間当り１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少せ
しめる酵素量を１単位とする。なお本文中の酵素活性の
単位は酸化的脱アミノ化反応における活性の値を用いて
いる。
Ｈ９、５）１００ ＃ ｍｏｌＸＮＡＤＨＯ，１ｐ ｍ
ｏｌ、ＮＨ４Ｃｌ １２００１！ ｍｏｌ−フェニルピ
ルビン酸ナトリウム１０μｆｆ１ｏ１及ヒ適当量のサン
プルを１ｍｌになるように混合して反応せしめ、２５℃
におけるＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度の減少と
して計測し、１分間当り１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少せ
しめる酵素量を１単位とする。なお本文中の酵素活性の
単位は酸化的脱アミノ化反応における活性の値を用いて
いる。
（４）詐素立咀１
本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素は次の性質を
有する。
有する。
（１）作用：次式に示す反応を触媒する。
Ｌ−フェニルアラニン＋ＮＡＤ” ＋１１□０−フェニ
ルピルビン成子ＮＡＤＨ＋ＮＨ，” （２）基質特異性二本酵素は酸化的脱アミノ化反応では
、Ｌ−フェニルアラニン以外のし一アミノ酸には掻めて
わずかにしか反応しないか又は全く反応しない。
ルピルビン成子ＮＡＤＨ＋ＮＨ，” （２）基質特異性二本酵素は酸化的脱アミノ化反応では
、Ｌ−フェニルアラニン以外のし一アミノ酸には掻めて
わずかにしか反応しないか又は全く反応しない。
補酵素としては、ＮＡＤ”が必要であり、ＮＡＤＰ”は
ＮＡＤ”に対して約１．８％の活性を示すにすぎない。
ＮＡＤ”に対して約１．８％の活性を示すにすぎない。
（３）至適ｐＨ：酸化的脱アミノ化反応では、ｐＨ１０
，５付近が至適であり、還元的アミノ化反応では、ｐＨ
９，４付近が至適である。
，５付近が至適であり、還元的アミノ化反応では、ｐＨ
９，４付近が至適である。
（４）ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，０５Ｍ）中３
０℃にて１時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ
化反応について測定した場合、ｐＨ８，０付近が安定で
ある。
０℃にて１時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ
化反応について測定した場合、ｐＨ８，０付近が安定で
ある。
（５）至適温度２６５℃付近における活性が最大である
。
。
（６）温度安定性：０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
”）中、各温度において１０分間処理した後の残存活性
を酸化的脱アミノ化反応について測定する場合、５５℃
で活性が半減する。
”）中、各温度において１０分間処理した後の残存活性
を酸化的脱アミノ化反応について測定する場合、５５℃
で活性が半減する。
（７）吸収スペクトル：２７８ｎｍに極大吸収を有する
。
。
（８）金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イ
オン及びＰＣＭＢによって活性が阻害される。
オン及びＰＣＭＢによって活性が阻害される。
（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合３．５である。
り測定した場合３．５である。
（１０）分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ
３０００ Ｓ誓）により約３６０．０００〜３７０ 、
０００と算出される。
３０００ Ｓ誓）により約３６０．０００〜３７０ 、
０００と算出される。
（１１）サブユニットの分子量： ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により約３８．０００〜３９ 、
０００と算出される。
ルアミドゲル電気泳動により約３８．０００〜３９ 、
０００と算出される。
（１２）均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７
，５％、ｐ）１Ｂ、４）により第１図式に示す如（単一
のバンドを与える。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（１０，０％、 ｐＨ７，２） ニヨリ第
１図Ｂに示す如く単一のバンドを与える。
，５％、ｐ）１Ｂ、４）により第１図式に示す如（単一
のバンドを与える。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（１０，０％、 ｐＨ７，２） ニヨリ第
１図Ｂに示す如く単一のバンドを与える。
次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
Ｌ−フェニルアラニン０．２％、酵母エキス０．５％、
ペプトン１．０％、ＫＪＰＯａ Ｏ，２％ＮａＣｌ０．
１％及びＭｇ５Ｏａ・７ｔｌｚＱ Ｏ，０２％を含有
し、ｐＨ７，０に調製した培地３０リツターを１２０℃
、１５分間加熱殺菌した後、バシルス・バディウスＩＡ
Ｍ １１０５９（ｌｋ工研菌寄第８５２９号）を接種し
湿重發約２８０ ｇの菌体を得た。菌体を生理的食塩水
で洗浄した後、（Ｌ １ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ及び５ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０） １リツターに懸濁し、９ ＫＨｚにおける超
音波処理を約１０時間行ない菌体を破砕した。破砕菌体
は１４．０００Ｘ ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た
。この無細胞抽出液を５０℃、１０分間の熱処理の後、
固形硫酸アンモニウムを加え３０％硫酸アンモニウム飽
和とした。３０分撹拌の後、生成した沈澱を１４．００
０Ｘ ｇで２０分間遠心分離することにより除去した。
ペプトン１．０％、ＫＪＰＯａ Ｏ，２％ＮａＣｌ０．
１％及びＭｇ５Ｏａ・７ｔｌｚＱ Ｏ，０２％を含有
し、ｐＨ７，０に調製した培地３０リツターを１２０℃
、１５分間加熱殺菌した後、バシルス・バディウスＩＡ
Ｍ １１０５９（ｌｋ工研菌寄第８５２９号）を接種し
湿重發約２８０ ｇの菌体を得た。菌体を生理的食塩水
で洗浄した後、（Ｌ １ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ及び５ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０） １リツターに懸濁し、９ ＫＨｚにおける超
音波処理を約１０時間行ない菌体を破砕した。破砕菌体
は１４．０００Ｘ ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た
。この無細胞抽出液を５０℃、１０分間の熱処理の後、
固形硫酸アンモニウムを加え３０％硫酸アンモニウム飽
和とした。３０分撹拌の後、生成した沈澱を１４．００
０Ｘ ｇで２０分間遠心分離することにより除去した。
この上清に固形硫酸アンモニウムを加え６０％硫酸アン
モニウム飽和とした。遠心分離にり得られる、酵素活性
を有する沈澱を少量の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解し、さらに０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含むＱ、０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この酵素液をあらか
じめＱ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍのカラム
に通過させ、さらに０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの
２−メルカプトエタノールおよび０．１ＭのＮａＣ１を
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。
モニウム飽和とした。遠心分離にり得られる、酵素活性
を有する沈澱を少量の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解し、さらに０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含むＱ、０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この酵素液をあらか
じめＱ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍのカラム
に通過させ、さらに０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの
２−メルカプトエタノールおよび０．１ＭのＮａＣ１を
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。
活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む０．ＯＩＭリンｅＪ１１
衝液（ｐＨ７，０）で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ” トヨパール６５０ Ｍのカラム
に通過させ、前工程と同様にして酵素を溶出させた。
−メルカプトエタノールを含む０．ＯＩＭリンｅＪ１１
衝液（ｐＨ７，０）で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ” トヨパール６５０ Ｍのカラム
に通過させ、前工程と同様にして酵素を溶出させた。
この活性区分を集め、固体硫酸了ンモニうムの添加によ
り４０％の硫酸アンモニウム飽和とした。
り４０％の硫酸アンモニウム飽和とした。
生成する沈澱を遠心分離により除去し、上清をさらに５
０％硫酸アンモニウム飽和とした。酵素活性を有する沈
澱を遠心分離により得、少量の０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に溶解し、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５
ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この酵素液を再び
３０％硫酸アンモニウム飽和とし、あらかじめ０．１
ｍ Ｍ ＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含むＯ，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ（７，０）の３
０％硫酸アンモニウム飽和液で平衡化したオクチル−セ
ファロースのカラムに通過させ３０％から０％の硫酸ア
ンモニウム飽和の同リン酸緩衝液の直線的な濃度勾配で
酵素を溶出させた。
０％硫酸アンモニウム飽和とした。酵素活性を有する沈
澱を遠心分離により得、少量の０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に溶解し、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５
ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この酵素液を再び
３０％硫酸アンモニウム飽和とし、あらかじめ０．１
ｍ Ｍ ＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含むＯ，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ（７，０）の３
０％硫酸アンモニウム飽和液で平衡化したオクチル−セ
ファロースのカラムに通過させ３０％から０％の硫酸ア
ンモニウム飽和の同リン酸緩衝液の直線的な濃度勾配で
酵素を溶出させた。
この活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭ
の２−メルカプトエタノール及び０．１ ＭＮａＣｌを
含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
たセファデックスＧ−２００によるゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行なった。こうして、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を約７．２％の収率で約１９０倍に精製した
。この精製過程における比活性及び回収率を第１表に示
す。この酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動（７，
５％ゲル、ｐＨ８，４）及びＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（１０，０％ゲル、ｐＨ７，２）におい
て均一であることが証明された。
の２−メルカプトエタノール及び０．１ ＭＮａＣｌを
含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
たセファデックスＧ−２００によるゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行なった。こうして、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を約７．２％の収率で約１９０倍に精製した
。この精製過程における比活性及び回収率を第１表に示
す。この酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動（７，
５％ゲル、ｐＨ８，４）及びＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（１０，０％ゲル、ｐＨ７，２）におい
て均一であることが証明された。
第１表
１互性上 Ｌ−フェニルアラニン ７、索９−フェニ
ルビルビン酸ナトリウム２０．４■（１００μｍｏｌ）
、蟻酸アンモニウム５０ Ｎ （８００ｐ ｍｏｌ）、
ＮＡＤ”３．６Ｎ （５μｍｏｌ）、トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，５）２５０、ｃｒｍｏｌ ｓバシルス・バ
ディウスＩＡＭ １１０５９のＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素０．５単位（均一精製酵素）、および粗蟻酸脱
水素酸素０．５単位（（ｐＨ８，５）、カンジダ・ボイ
ディニ１１ｈ２２０１より部分精製）を含む５＋ｗｌの
反応液を３０℃において２４時間保温した。微生物定量
法により定量したところ１６．２ｍｇ （９８、ｃｒｍ
ｏｌ； ９８％の転換率）のし−フェニルアラニンが生
成していた。
ルビルビン酸ナトリウム２０．４■（１００μｍｏｌ）
、蟻酸アンモニウム５０ Ｎ （８００ｐ ｍｏｌ）、
ＮＡＤ”３．６Ｎ （５μｍｏｌ）、トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，５）２５０、ｃｒｍｏｌ ｓバシルス・バ
ディウスＩＡＭ １１０５９のＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素０．５単位（均一精製酵素）、および粗蟻酸脱
水素酸素０．５単位（（ｐＨ８，５）、カンジダ・ボイ
ディニ１１ｈ２２０１より部分精製）を含む５＋ｗｌの
反応液を３０℃において２４時間保温した。微生物定量
法により定量したところ１６．２ｍｇ （９８、ｃｒｍ
ｏｌ； ９８％の転換率）のし−フェニルアラニンが生
成していた。
バシルス・バディウスＩＡＭ １１０５９により生産さ
れるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の基質特異性を酸
化的脱７ミノ化について測定した場合、Ｌ−フェニルア
ラニン以外のし一アミノ酸にはきわめてわずかしか反応
しないが、還元的アミノ化反応においては相当に広い基
質特異性を有する。この知見に基き、バシルス・バディ
ウスＩＡＭ １１０５９の菌体あるいはＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を用いて第２表に記載する各種のα−
ケト酸からそれぞれ対応するし一アミノ酸の合成を行な
った。
れるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の基質特異性を酸
化的脱７ミノ化について測定した場合、Ｌ−フェニルア
ラニン以外のし一アミノ酸にはきわめてわずかしか反応
しないが、還元的アミノ化反応においては相当に広い基
質特異性を有する。この知見に基き、バシルス・バディ
ウスＩＡＭ １１０５９の菌体あるいはＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を用いて第２表に記載する各種のα−
ケト酸からそれぞれ対応するし一アミノ酸の合成を行な
った。
なお、表中でＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の状態で
「粗酵素」とは無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味
し、「部分精製酵素」とは、さらにＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラムを通過させた酵素を意味する。ＮＡＤゝ又はＮ
ＡＤＨの濃度は１ないし２０ｍＭの濃度となるようにし
た。アンモニウムイオンは塩化アンモニウム、蟻酸アン
モニウム又はＮＨ，０Ｒ−ＮＨ４Ｃ１緩衝液（ｐＨ９，
０）として供給し、その４度は０．０５ないし０．５Ｍ
の濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム又は蟻
酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケトカルボ
ン酸の１〜３０当量とした。反応液のｐＨは８．５ない
し９であり、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５）又は
ＮＨ，０）ｌ−Ｎｌ（４Ｃ１緩衝液（ｐＨ９，０）を０
．０５ないし０．５ Ｍの？農産となるようにして用い
た。反応は３０℃で行なった。反応液中に生成したＬ−
アミノ酸の定量はロイコノストック１メセンテロイデス
（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅ−ｒｏｉｄ
ｅｓ）ＡＴＣＣ８０４２を用いるバイオアッセイにより
行なった。
「粗酵素」とは無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味
し、「部分精製酵素」とは、さらにＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラムを通過させた酵素を意味する。ＮＡＤゝ又はＮ
ＡＤＨの濃度は１ないし２０ｍＭの濃度となるようにし
た。アンモニウムイオンは塩化アンモニウム、蟻酸アン
モニウム又はＮＨ，０Ｒ−ＮＨ４Ｃ１緩衝液（ｐＨ９，
０）として供給し、その４度は０．０５ないし０．５Ｍ
の濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム又は蟻
酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケトカルボ
ン酸の１〜３０当量とした。反応液のｐＨは８．５ない
し９であり、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５）又は
ＮＨ，０）ｌ−Ｎｌ（４Ｃ１緩衝液（ｐＨ９，０）を０
．０５ないし０．５ Ｍの？農産となるようにして用い
た。反応は３０℃で行なった。反応液中に生成したＬ−
アミノ酸の定量はロイコノストック１メセンテロイデス
（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅ−ｒｏｉｄ
ｅｓ）ＡＴＣＣ８０４２を用いるバイオアッセイにより
行なった。
なお、具体的には次の様にして反応を行ない、後記の結
果を得た。
果を得た。
反応１号上
フェニルピルビン酸ナトリウム７４．３■（３６４μｍ
ｏ＋）、グリセロール２８■（３００μｍｏｌ）、バシ
ルス・バディウスＴＡ？’ｌ １１０５９の菌体（５１
の培養液から菌体を遠心分離で集菌し、生理的食塩水で
１回洗浄した菌体）を含む５ｍｌの反応液を３０℃で２
４時間静置した。反応液中のＬ−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ２５■（１５３μ
ｍｏｌ：４２％の転換率）のし−フェニルアラニンが生
成していた。
ｏ＋）、グリセロール２８■（３００μｍｏｌ）、バシ
ルス・バディウスＴＡ？’ｌ １１０５９の菌体（５１
の培養液から菌体を遠心分離で集菌し、生理的食塩水で
１回洗浄した菌体）を含む５ｍｌの反応液を３０℃で２
４時間静置した。反応液中のＬ−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ２５■（１５３μ
ｍｏｌ：４２％の転換率）のし−フェニルアラニンが生
成していた。
反応番号２はこの例と同様に実験を行なった。
反息脣号主
フェニルピルビン酸ナトリウム２０．４■（１００μｍ
ｏｌ）、ＮＡＤＨ７６，３ｍｇ （１００ｕ ｍｏ＋）
、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５）２５０ μｍｏｌ
、塩化アンモニウム１０７ｍｇ（２ｍｍｏｌ）、バシ
ルス・バディウスＩＡＭ １１０５９のＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素０．５単位（硫安分画における３０〜
６０％飽和画分）を含む５ｍｌの反応液を３０℃におい
て２４時間保温した。
ｏｌ）、ＮＡＤＨ７６，３ｍｇ （１００ｕ ｍｏ＋）
、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５）２５０ μｍｏｌ
、塩化アンモニウム１０７ｍｇ（２ｍｍｏｌ）、バシ
ルス・バディウスＩＡＭ １１０５９のＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素０．５単位（硫安分画における３０〜
６０％飽和画分）を含む５ｍｌの反応液を３０℃におい
て２４時間保温した。
反応液中のＬ−フェニルアラニン量を微生物定量法によ
り測定したところ、１５．７■（９５μｍｏｌ；９５％
の転換率）のし−フェニルアラニンが生成していた。反
応番号５はこの例と同様に実験を行なった。
り測定したところ、１５．７■（９５μｍｏｌ；９５％
の転換率）のし−フェニルアラニンが生成していた。反
応番号５はこの例と同様に実験を行なった。
及近１１艷土
フェニルピルビン酸ナトリウム２０．４■（１００μｍ
ｏｌ）、蟻酸アンモニウム５０ ｍｇ（８００，ｃｒｍ
ｏり、ＮＡＤ”３．６ｒｒｗ （５μｍｏｌ）、トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）２５０、ｃｒｍｏｌ ％バ
シルス・バディウスＩＡＭ １１０５９のＬ−フヱニル
アラニン脱水素酵素０．５単位（硫安分画における３０
〜６０％飽和画分）、および粗蟻酸脱水素酵素０．５単
位（ｐ）１８．５、カンジダ・ポイディニｍ２２０１よ
り部分精製）を含む５ｍｌの反応液を３０℃において２
４時間保温した。微生物定量法により定量したところ１
５．７ｑ （９５μｍｏｌ； ９８％の転換率）のし−
フェニルアラニンが生成していた。
ｏｌ）、蟻酸アンモニウム５０ ｍｇ（８００，ｃｒｍ
ｏり、ＮＡＤ”３．６ｒｒｗ （５μｍｏｌ）、トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）２５０、ｃｒｍｏｌ ％バ
シルス・バディウスＩＡＭ １１０５９のＬ−フヱニル
アラニン脱水素酵素０．５単位（硫安分画における３０
〜６０％飽和画分）、および粗蟻酸脱水素酵素０．５単
位（ｐ）１８．５、カンジダ・ポイディニｍ２２０１よ
り部分精製）を含む５ｍｌの反応液を３０℃において２
４時間保温した。微生物定量法により定量したところ１
５．７ｑ （９５μｍｏｌ； ９８％の転換率）のし−
フェニルアラニンが生成していた。
反応番号６，７．８は、この例と同様に実験を行なった
。
。
これらの結果を次の第２表に要約する。
以下余白
第１図は、本発明のフェニルアラニン脱水素酵素のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Ａ）及びＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｂ）の泳動図のスケッチで
ある。
アクリルアミドゲル電気泳動（Ａ）及びＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｂ）の泳動図のスケッチで
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
１モルのアンモニウムイオン及び１モルのＮＡＤＨを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約３６０，０００〜３７０，０００の分子量を示し、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドディスク電気泳動法において
約３８，０００〜３９，０００の分子量を有するサブユ
ニットを示す； （３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、そして
Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニン
に対する特異性が非常に低い；を有することを特徴とす
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素。 ２、バシルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄ
ｉｕｓ）（ＦＥＲＭ Ｐ−８５２９）により生産される
特許請求の範囲第１項記載の酵素。 ３、次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのＮＡＤ
＾＋及び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、
１モルのアンモニウムイオン及び１モルのＮＡＤＨを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約３６０，０００〜３７０，０００の分子量を示し、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドディスク電気泳動法において
約３８，０００〜３９，０００の分子量を有するサブユ
ニットを示す； （３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い； を有するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法に
おいて、該酵素を生産することができるバシルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属微生物を培養し、この培養物から該酵
素を採取することを特徴とする方法。 ４、前記バシルス属微生物がバシルス・バディウス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）（ＦＥＲＭ Ｐ−８５
２９）である特許請求の範囲第３項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61172832A JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61172832A JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6332482A true JPS6332482A (ja) | 1988-02-12 |
| JPH0655137B2 JPH0655137B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=15949177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61172832A Expired - Lifetime JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0655137B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
| WO2021070943A1 (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-15 | 味の素株式会社 | 改変フェニルアラニン脱水素酵素 |
-
1986
- 1986-07-24 JP JP61172832A patent/JPH0655137B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法 |
| US9267116B2 (en) | 2008-12-09 | 2016-02-23 | Kaneka Corporation | Amino acid dehydrogenase, and process for producing L-amino acid, 2-oxo acid or D-amino acid |
| WO2021070943A1 (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-15 | 味の素株式会社 | 改変フェニルアラニン脱水素酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0655137B2 (ja) | 1994-07-27 |
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