JPH022381A - リン脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリン脂質の製造方法に関し、更に詳しくは、微
生物乾燥菌体により塩基構造が変換されたリン脂質を製
造する方法に関する。

リン脂質は、単に乳化剤に用い得るのみならずリポソー
ムの基材として薬剤運搬体、人工血液、人工細胞、ある
いは免疫診断等への応用が近年注目されており、また、
それ自体生理活性・薬理活性を持つものとして、医学・
薬学・工学分野等において様々な用途が考えられている
。このような多用な要求に対応するために、種々の用途
に応じた構造を有するリン脂質を効率良く製造する方法
を開発することは、産業上非常に意義のあることである
。

〔従来の技術と発明が解決しようとする問題点〕従来、
このようなリン脂質を製造する方法としては、キャベツ
由来あるいは微生物由来の種々の精製ホスホリパーゼＤ
酵素を直接あるいは固定化等を行って反応させる方法が
提案されている（特開開６３−３６７９０、同６３−３
６７９２、同６３−９１０８７）、Ｌかしながら、この
ような抽出酵素あるいは精製酵素は酵素の製造プロセス
のコストが高く、経済的に大きな課題となっている。更
に、酵素をセライト等の担体に固定化する方法は反応物
質が担体上の酵素まで拡散しにくく、特に担体の細孔内
に吸着された酵素は反応には実質的に関与せず、有効に
働く酵素が減少する等の問題があり、企業化を企てる上
で大きな障害となっている。また、ゲル化剤等による包
括固定化法は固定化の操作が？！雑で、しかも拡散律速
による反応速度の低下等の不都合な点が多く、改善が望
まれている。

本発明は、ホスホリパーゼＤを有する乾燥菌体を直接反
応に供することにより、これらの欠点を改遷し、高収率
で目的物が得られるリン脂質の塩基交換反応法を提供す
ることを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

即ら、本発明は塩基構造が変換されたリン脂質を製造す
るにあたり、原料リン脂質と水酸基を有する受容体とを
、ホスホリパーゼゴを有する乾燥菌体に接触させて反応
を行うことを特徴とするリン脂質の製造方法を内容とす
るものである。

本発明において用いられる原料リン脂質としては、ホス
ホリパーゼＤの基質となり得るものであれば、天然から
抽出したもの、または抽出後精製したもの、あるいは合
成したものの如何を問わず使用できる。また、市販のも
の、あるいは公知の方法で調製したものを使用してもよ
い。例えば、脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等、
またはそれらの混合物等が挙げられる。本発明の効果を
最大に発揮するためには、原料リン脂質として精製した
もの、ないしは組成の単純なものを用いた方が純粋な反
応生成物が得られる面で都合が良い。また、原料コスト
と人手の容易さ及びコケ素に対する反応性の面から、特
にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールア
ミンまたはホスファチジルセリンが工業的に効果が高く
好適である。

本発明における受容体としては、コリン、エタノールア
ミン、セリン、Ｎ−メチルエタノールアミン、Ｎ、Ｎ−
ジメチルエタノールアミンなどの含窒素アルコール類や
グリセロール、グルコース、フラクトース等のポリオー
ル、単糖類などを挙げることができる。

反応は、原料リン脂質を溶解または懸濁させる有機溶媒
の存在下で行うことが好ましり、微生物酵素を失活させ
ることの少ない溶媒系であればいずれも使用できる。例
えば石油エーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエ
ーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホルム、ジク
ロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ−へキサ
ン、シクロヘキサン、ｎ−オクタン、イソオクタン、酢
酸エチル、ジオキサン、ベンゼン等の溶媒、またはこれ
らの混合溶媒系、またはこれらにアセトン、アセトニト
リル等の極性溶媒を混合した混合溶媒系が挙げられる。

ただし、アルコール類は目的反応の基質となるため、基
質として添加する以外に用いることはあまり好ましくな
い。

本発明において用いられる微生物としては、ホスホリパ
ーゼＤを生成するものであれば全て用いることができる
が、特にストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属やスＩ・レプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｉ　）属、ミクロモノスボラ（
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属、ノカルディア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉ−ａ）属、ノカルディオプシス（Ｎｏｃａ
ｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、アクチノマヂューラ（Ａｃｔｉ
ｎｏｍａｄｕｒａ）属等に属する微生物を挙げることが
できる。より具体的には、ストレプトマイセス・クロモ
ファスカス（ＳＬ、ｃｈｒ−ｏｍｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦ
Ｏ１２８５１）　、ストレプトマイセス・メディオシデ
カス（ＳＬ、ｍｅｄｉｏｃｉｄｉｃｕｓ　ｌＦｏ、１３
２０２　）、ストレプトマイセス・ラベンジュラエ（Ｓ
Ｌ、　Ｉａｖｅｎ−ｄｕｌａｅ　５ｕｂｓｐ、　Ｉａｖ
ｅｎｄｕｌａｅ　ＩＦＯ１２７８９）　、ストレプトバ
ーチシリウム・グリゼオカルネラム（Ｓｔ、ｇｒｉ−ｓ
ｅｏｃａｒｎｅｕｍ　ＩＦＯ１２７７６）　、ストレプ
トバーチシリウム・シンナモメラム（Ｓｔ、ｃｉｎｎａ
ｍｏｍｅｕｍ　５ｕｂｓｐ。

ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ　ＩＦＯ１２８５２）　％スト
レプトバーチシリウムー）ｚチジョーエンセ（Ｓｔ、　
ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｅ　ＩＦＯＩ２７８２）　、ミク
ロモノスボラ・チャルセア（Ｍ、　ｃｈａ−Ｉｃｅａ　
ＡＴＣＣ１２４５２）、ノカルディア・メディテラーネ
イ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　Ｉ
ＦＯ１３１４２）、ノカルディオプシス・ダソンビレイ
　（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　ｄ−ａｓｓｏｎｖｉｌ
ｌｅｉ　ＩＦｏ　１３９０Ｂ）、アクチノマヂューラ・
リバノチ力（Ａｃｔｉｎｏｉａｄｕｒａ　ｌ１ｂａｎｏ
ｔｉｃａ　ＩＦＯ１４０９５）等が挙げられ、これらの
他にも公知の微生物が適用される。

上記微生物を反応の触媒として効率良く働かせるには、
微生物内にホスホリパーゼＤを多量に含有させる培養方
法、および菌体内ホスホリパーゼＤを受容体と接触し易
く、しかも活性をできるだ１す低下させない乾燥条件が
重要となる。

培養に用いる培地としては、微生物の培養に通常用いら
れるものが広く使用され得る。炭素源としては同化可能
な炭素化合物、例えばブドウ糖、シ＝！糖、乳糖、麦芽
糖、でんぷん、デキストリン、糖蜜、グリセリン等や炭
化水素類が使用される。

窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、特
にコーンスチープリカー、大豆粉、小麦グルテン、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、カゼイン加
水分解物等の有機化合物が好ましい。その他、リン酸塩
、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン
、亜鉛等の塩類が必要に応じて使用される。

培養温度は菌が発育し、ホスホリパーゼＤを生産する範
囲内で適宜採用し得るが、通常１５〜４０℃で培養され
る。培養時間は条件によって異なり、菌体内ホスホリパ
ーゼＤ活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、
通常は１〜６日程度である。

また、本発明においては、多孔質体からなる微生物保持
体と共に培養を行い、該保持体に微生物を付着・増殖さ
せ、得られた菌体を使用することができる。このような
方法においては、保持体の表層付近に生物膜状菌体が形
成され、これによってホスホリパーゼＤがより安定で、
しかも連続生産や繰返し回分生産などの有効な反応シス
テムに応用できるので、生産性が大幅に向上し極めて好
都合である。上記微生物保持体としては、微生物の持つ
粘着力、吸着力により微生物の吸着増殖を可能ならしめ
る任意の材料が適用できる。例えば、高分子多孔質材料
としては、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオ
レフィン系；ブタジェンまたはイソプレンなどのジエン
系；ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、アクリル
アミドまたはポリスチレンなどのビニル系重合体：ポリ
エーテル、ポリエステル、ポリカーボネートまたはポリ
アミド等の縮合系；ポリウレタン、シリコンおよびフン
素糸樹脂などの材料、また無機材料としては、セラミッ
クス、ガラス、活性炭、および多孔質金属や金属加工材
料などが適用できる。いずれの材料においても該保持体
に微生物を良好に固定化させるため、空隙率が６０〜９
０％、孔の径が２〜２０００μｍの範囲にある多孔質材
料や、空隙率が６０〜９９％である金属加工材料等を使
用するのが好ましい。

このような種々の保持体は、微生物の種類および培養条
件等によって適宜選択でき、形状については例えば球状
、ブロック状あるいはシート状等に加工して使用するこ
とができる。寸法については、微生物の種類、培養条件
、反応器の種類等によって適宜決定されるが、球状であ
れば直径が概ね１〜１００龍、ブロック状のものであれ
ば一辺が概ね１〜１００１のものが使用される。また、
微生物を上記保持体に固定化させるには、通常公知の回
分、半回分、連続培養等を用いて容易に達成される。

上記の如く得られた菌体から水分を除去する方法として
は、原則的には酵素が失活しない温度（４０〜６０℃）
で乾燥すればよいが、単に水分を蒸発させる方法では細
胞Ｍｉ織の収縮が起こり非常に堅くなり、組織内のホス
ホリパーゼＤと外界との接触が断たれ活性を発現するこ
とが困難となる。従って、菌体を乾燥させるには細胞組
織の収縮を伴わない方法を採用しなければならない。こ
のため、水溶性溶媒、例えばアセトンまたはメタノール
、エタノール、イソプロパツール等の低級アルコール類
中に菌体を浸して組織内を溶媒に置換した後、溶媒を蒸
発させる方法により、細胞組織の収縮を抑えて乾燥菌体
を得ることができる。

この場合、乾燥方法としては真空乾燥、凍結乾燥、低／
晶乾燥等の公知の乾燥法が使用できる。更に、菌体を溶
媒に浸す前に５重量％以下のゲルタールアルデヒド水溶
液に浸して細胞組織を固定化することにより、細胞Ｍｉ
織の収縮をより効果的に抑えることができる。このよう
な方法にて得られた菌体の水分は、通常１〜２０重景％
の水分含量に調製される。

このようにして調製された乾燥菌体を反応物質、即ら原
料リン脂質と受容体の混合物中に１懸濁させ反応させる
が、水と有機溶媒の比は水：有機溶媒を重量比でｔ：Ｏ
，５〜ｏ、ｔ：１ｏの範囲で用いることができるが、副
反応によって生しるホスファチジン酸の生成を極力防ぐ
ためには水分を４０重量％以下に制ｔｌした方が好まし
い。

反応温度は用いる菌体内酵素の適切温度であれば良（、
通常２０〜６０℃の範囲である。ただし、用いる溶媒が
低沸点のものである場合等は、この限りではない。

反応時間については、回分の場合は概ね０，５〜４０時
間、半回分法や連続法においても、この反応条件に見合
った反応時間を設定することにより、目的とする反応を
行わせることができる。また反応様式としては、容器に
入れた溶媒中に微生物菌体を分散、懸濁し接触反応させ
ればよく、回転攪拌や超音波による撹拌方法、カラムな
どに充填する方法、気泡塔型反応器等によって流動させ
る方法等のあらゆる形式の反応様式が適用できる。

〔作用・効果〕

叙上の如く、乾燥菌体の調製法および条件によって、初
めて乾燥菌体をリン脂質の塩基交換反応に使用すること
ができ、このような菌体内酵素によってリン脂質の塩基
交換反応を成功させたのは本発明が最初である。

本発明によれば、培養された微生物菌体の抽出や精製工
程を省略し、直接リン脂質の製造反応に使用できるため
、反応に使用する酵素のコストが大幅に低減でき、高収
率で所望のリン脂質を得ることができる。

更に、多孔質の微生物保持体に固定化された乾燥菌体を
使用すれば、菌体内のホスホリパーゼＤ酵素がより効果
的に安定化され、しかも連続あるいは繰返し回分反応方
法が適用できるので、生産性が著しく向上する。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

なお、実施例１〜６においてはリン脂質の組成分析、純
度検定は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて行った
。展開溶媒としては、クロロホルム−アセトン−メタノ
ール−酢酸−水（５０：２０：１０：１５：５）を用い
、デイノドマー試薬を用いて発色させ、デンシトメトリ
ーにより生成物の組成比を測定した。

また、実施例７〜１０においては、リン脂質の組成分析
はイアトロスキャンにより求めた。即ち、クロマロッド
Ｓｌ＋（ヤトロン社製シリカゲルロンド）にクロロホル
ム−メタノール（２：１）により抽出したリン脂質溶液
をスポットし、クロロホルム−アセトン−メタノール−
酢酸−水（６゜５：２：ｌ：１：０．３）を展開溶媒と
して約１０口展開し、イアトロスキャン（ヤトロン社製
イアトロスキャンＴＨ−１０）にかけ、ピーク面積比か
ら成分の重量比を求めた。

実施例１ ストレプトマイセス・クロモファスカスＩＦ０１２８５
１を、グルコース１％（重量％、以下同じ）肉エキス０
゜７５％、ペプトン０．７５％、ＮａＣ１０，３％：門
ｇｓｏ　　Ｏ，１％を含む培地（ｐ）１７．２　）で、
温度３０℃、約２日間通気培養した。得られた菌体を純
水で２回水洗し、ついで５０％アセトン水溶液中に１０
分間浸し、さらに１００％アセトンに５分間浸した後濾
過し、次いで３０℃にて真空乾燥した。かくして得られ
た乾燥菌体の水分含量は約５％であった。

第１図に示す攪拌式反応器に、精製ジパルミトイルホス
ファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ社製）２．０ｇ。

エタノールアミン５０ｍＭ、ジエチルエーテル５０Ｏｍ
Ｌｏ、５Ｍ酢酸バッフｙ　　（ｐＨ５）　］、Ｏｍｌ、
乾燥菌体２５ｇを加え３７℃にて２時間反応させた。

反応液中の水分濃度は公知の水分センサー（パナメトリ
ック社製、モデル：システム１）にて検知し、必要な場
合には酢酸バッファー液を添加す・る０Ｎ−ＯＦＦフィ
ードパ、り制御法にて約１００〜２００　ｐｐｍに制御
した。この場合の菌体中の水分濃度は５〜２０％であっ
た０反応終了後クロロホルムにてリン脂質を抽出し分析
した。

分析の結果、ホスファチジルエタノールアミン９５％、
ホスファチジン酸４％、ホスファチジルコリン１％であ
った。

実施例２ エタノールアミンの代わりにグリセロールを７０ｍＭ加
え、その他の反応条件、操作条件は実施例１と全く同様
に行った６ 分析の結果、ホスファチジルグリセロール９０％、ホス
ファチジン酸５％、ホスファチジルコリン５％であった
。

実施例３ エタノールアミンの代わりにグルコースを１５０ｍＭ加
え、その他の反応条件、操作条件は実施例１と全く同様
に行った。

分析の結果、ホスファチジルグルコース７５％、ホスフ
ァチジン酸１２％、ホスファチジルコリン１３％であっ
た。

実施例４ エタノールアミンの代わりにセリンを１００ｍＭ加え、
その他の反応条件、操作条件は実施例１と全く同様に行
った。

分析の結果、ホスファチジルセリン８５％、ホスファチ
ジン酸１０％、ホスファチジルコリン５％であった。

実施例５ 実施例１と同様の培地に、−辺４ｍｍのブロック状のポ
リウレタンフォームからなる微生物保持体（プリジスト
ン社製、エバーライトＨＲ−４０）を１００個／１（１
０ｍｌ培地となるように加えて培養し、微生物保持体に
菌体を固定化させた。固定化された菌体は実施例１と同
様に乾燥させ、乾燥菌体を調製した。微生物保持体中の
乾燥菌体量は１既ね５ｍｇ／個であった。

実施例１で用いた反応器に乾燥菌体が固定化された微生
物保持体１０００個を添加し、実施例１と同様の反応条
件にて反応させた。反応終了後、反応液を全て抜き出し
、再び新しい反応溶液を添加し、同様の反応を繰返した
。このような繰返し反応を３回行った。

それぞれの反応で得られた反応液からクロロホルムにて
抽出されたリン脂質を分析した。結果を第１表に示す。

第　　１　　表 第１表から、微生物保持体に固定化された乾燥菌体の酵
素活性は安定で、繰返し使用が可能であ実施例６ 実施例１で使用した微生物の代わりにストレプトバーチ
シリウム・シンナモメウスＴＰＯ１２８５２を使用した
以外は、実施例１と全く同様の条件で反応させた。

分析の結果、ホスファチジルエタノールアミン８６％、
ホスファチジン酸１２％、ホスファチジルコリン２％で
あった。

実施例７ ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンセＩＦ０１
２７８２を、グルコース１％、肉エキス０．７５％、ペ
プトン０．７５％、ＮａＣ１０，３％、Ｍｇ５Ｏａ　ｏ
、　１％を含む培地（ｐＨ７，２＞で、温度３０℃、約
２日間通気培養した。得られた菌体を純粋で２回水洗し
、ついで５０％アセトン水溶ｔｌ中に１０分間浸し、さ
らに１００％アセトン５分間浸した後濾過し、ついで３
０℃にて真空乾燥した。かくして得られた乾燥菌体の水
分含量は約５％であった。

容１１０ｏ、ｎ１の分液ロートにグリセロール４ｇ、ジ
パルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）るこ
とかわかる。

２００ｍｇ、ジエチルエーテル１０ｍｊ、０．２Ｍ酢酸
バッフｙ　−６ｍｌ　（ｐＨ５，６，０，０４Ｍ−Ｃａ
イオン含む）に乾燥菌体０．２ｇを加え３０℃にて７時
間振盪器にて反応させた。反応終了後、クロロホルムメ
タノール（２：１）にてリン脂質を抽出し分析した。

分析の結果、ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル（ＤＰＰＧ）　　８１％、ホスファチジン酸（ＰＡ）
１０％、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰ
Ｃ）　　９％であった。

実施例８ ストレプトバーチシリウム・ハンジョウエンセＴＦＯ１
２７８２の代わりにストレプトマイセス・クロモファス
カスＩＰ０１２８５＋、ミクロモノスボラ・チャルセア
ＡＴＣＣ１２４５２、ノカルディア・メディテラーネイ
　ＩＦＯ１３１４２、ノカルディオプシス・ダソンビレ
イ　ＩＦＯ１３９０８、アクチノマヂューラ・リバノチ
カＩＦＯ１４０９５を使用した以外は実施例７と全く同
様の操作を行った。

分析結果は、第２表の通りである。

第 表 実施例９ グリセロールの代わりに（Ａ）エタノールアミン６０■
、（Ｂ）グルコース５００■、および（Ｃ）Ｌ−セリン
２００■を使用した以外は反応条件、操作条件は実施例
７と全く同様に行い、それぞれジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＰＥＡ）　、ジパルミトイ
ルホスファチジルグルコース（ＤＰＧＬ）　、ジパルミ
トイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）を生産させた
。

分析結果は第３表の通りである。

第　　　　３　　　　表 を３回行った。

それぞれの反応で得られた反応液は第４表の通りであっ
た。

第　　　　４　　　　表 （単位は％） 実施例１０ ５００嬬振盪フラスコを用い、実施例１と同様の培地１
００　ｍｌに一辺４１量のブロック状のポリウレタンフ
ォームからなる微生物保持粒子（プリジストン社製、エ
バーライトＨＲ−４０）を１００個加えて培養し、微生
物保持粒子に菌体を固定化させた。固定化された菌体は
実施例７と同様に乾燥させ、乾燥菌体を調製した。微生
物保持粒子中の乾燥菌体量は概ね５■／個であった。

次いで、第２図に示した反応器に上記固定化された微生
物保持粒子５０個を入れ、実施例７と同様の反応条件で
反応させた。反応終了後、反応液を全て抜出し、再び新
しい反応？８液を添加させ同様の反応を操り返した。こ
のような繰り返し反応第４表の結果から、微生物保持粒
子に固定化された乾燥菌体の酵素活性は安定で繰り返し
使用が充分可能であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ実施例１及び実施例１０で
用いた装置を示す概要図である。 １・・・撹拌式反応器、　　２・・・水分センサー３・
・・水分分析計 ４・・・パーソナル・コンピューター ５・・・バッファーン夜貯蔵ボトＪし ６・・・バッファー液送液ポンプ ７・・・ジャケット温水、　８・・・乾燥菌体９・・・
反応器、　　　　　ｌＯ・・・ウォーターバス１１・・
・マグ不チソクスクーラー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、塩基構造が変換されたリン脂質を製造するにあたり
   、原料リン脂質と水酸基を有する受容体とを、ホスホリ
   パーゼＤを有する乾燥菌体に接触させて反応を行うこと
   を特徴とするリン脂質の製造方法。 ２、多孔質の微生物保持体に微生物が固定化された乾燥
   菌体を用いる請求項１記載の製造方法。 ３、微生物がストレプトマイセス属、ストレプトバーチ
   シリウム属、ミクロモノスボラ属、ノカルディア属、ノ
   カルディオプシス属及びアクチノマヂューラ属から選択
   される少なくとも１種である請求項２記載の製造方法。 ４、乾燥菌体が、菌体を水溶性溶媒に浸して該菌体組織
   内を溶媒置換した後、該溶媒を蒸発させて得られたもの
   である請求項１又は２記載の製造方法。