JPS6338199B2 - - Google Patents
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- JPS6338199B2 JPS6338199B2 JP58039813A JP3981383A JPS6338199B2 JP S6338199 B2 JPS6338199 B2 JP S6338199B2 JP 58039813 A JP58039813 A JP 58039813A JP 3981383 A JP3981383 A JP 3981383A JP S6338199 B2 JPS6338199 B2 JP S6338199B2
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- hydroxybutyric acid
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- acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
(a) 産業上の利用分野
本発明は、新規なβ−ヒドロキシ酪酸の濃度を
簡易・迅速に定量できる固相一体化組成物に関す
るものである。 (b) 従来の技術及びその問題点 β−ヒドロキシ酪酸（β−オキシ酪酸）は、脂
肪酸代謝の中間産物でケトン体の一種であり、糖
尿病患者や糖尿病動物の体液（血液や尿等）に他
のケトン体とともに多く存在する。以下、本発明
を、体液中のβ−ヒドロキシ酪酸を測定する場合
を例にとり詳細に説明する。 膵内分泌障害によるインスリン不足など炭水化
物代謝障害があるときには、肝臓での脂肪酸の酸
化が盛んになる。その結果、アセトン・アセト酢
酸・β−ヒドロキシ酪酸等のケトン体が異常増加
し、組織、血液、尿中にケトン体が過剰に蓄積さ
れる（ケト−ジスの状態）。従つて、高度の膵内
分泌障害特に重症糖尿病の場合、或いは糖質制限
投与の際には体液中ケトン体の消長に注意するこ
とが必要である。 ところで、重症糖尿病におけるケト−ジス状態
の際には、これらのケトン体のうち特に血中β−
ヒドロキシ酪酸の上昇が著しくなり、β−ヒドロ
キシ酪酸／（アセトン＋アセト酢酸）の比が増大
し、β−ヒドロキシ酪酸が糖質代謝異常を最も鋭
敏に反映するとされている。 血液中のβ−ヒドロキシ酪酸の定量法としては
ウイリアムソン等のβ−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素を用いる方法が知られている〔バイオケミカル
ジヤーナル（Biochemical Journal）82巻90頁、
1962年〕。この方法はβ−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素とジホスホピリジルヌクレオチド（DPN）
を反応させ、生成した還元型ジホスホピリジルヌ
クレオチド（DPNH）の340nｍにおける特異吸
収の吸光度を測定し、その分子吸光係数からβ−
ヒドロキシ酪酸量を求めるものである。従つて、
分析には高度の熟練と長時間を要し、且つ高級な
紫外部分光光度計を必要とする点で問題があつ
た。 この欠点を是正するために、紫外部分光光度計
を必要としない血中ケトン体の高感度簡易比色法
が開発された（特開昭55−35232）。この方法は、
まずβ−ヒドロキシ酪酸にβ−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（NAD）を作用させて酵素的に酸化してアセ
ト酢酸となし、血中に元から含まれていたアセト
酢酸と共にｐ−ニトロフエニルジアゾニウムフル
オロボレートと反応させてアゾ化合物となす。こ
れを次亜燐酸で還元して安定なヒドラゾ化合物に
転じ、390nｍの波長を用い比色法により全アセ
ト酢酸量を求める。別途、β−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素を作用させないで同様に比色して血中の
元のアセト酢酸量のみを求め、上記全アセト酢酸
量から差演算をなし、β−ヒドロキシ酪酸量を求
めるものである。しかしこの方法も、血液試料の
前処理（除蛋白）や複雑な定量操作のため測定に
熟練と長時間を要し、且つ特別の器具や高級な分
光光度計も必要であり、日常の臨床検査法として
は未だ多くの問題を有している。 一方、β−ヒドロキシ酪酸をニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（NAD）の存在下でβ−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により酸化（脱水素）
して生成した還元型NAD（NADH）に、電子伝
達体を介してテトラゾリウム塩を還元せしめ、生
成する有色のホルマザンの呈色度を測定してβ−
ヒドロキシ酪酸を迅速、簡易に定量でき、優れた
結果を得ることができる方法が見いだされた。 更に、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、
（NAD）、及びテトラゾリウム塩を吸収性担体に
含浸させ、次いで乾燥させた試験具がオーエン
（Owen）によつて開発された。〔米国特許第
4351899号、発明の名称：代謝酸の半定量測定
（Semi−Quantitative Assay of Metabolic
Acid）〕 オーエンの組成物における測定原理は、下式に
示す如くまずβ−ヒドロキシ酪酸を電子受容体で
あるNADの存在下にβ−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素により酸化（脱水素）してアセト酢酸とな
す。このとき生じる還元型NAD（NADH）が電
子伝達体を介してテトラゾリウム塩を還元して有
色のホルマザンを生成させ、このホルマザンの呈
色状態を比色してβ−ヒドロキシ酪酸量を求める
ものである。 この試験具に検体の一滴を塗布すれば、数分の
後検体中のβ−ヒドロキシ酪酸の濃度に応じた色
を組成物上に呈する。これを予め作成した標準比
色表と肉眼比色するだけでβ−ヒドロキシ酪酸濃
度を測定することが可能である。 しかしながらこの試験具は、電子伝達体として
メルドラブルー、PMSが使用されていること及
び試薬を吸収性担体に含浸させているため、呈色
等の安定性が悪く、また、長時間の試験具の保存
にも耐えうるものではなかつた。 ところで、この試験具は保存安定性を高めるた
め、試薬の内、PH緩衝剤のみを他の試薬と別の吸
収性担体に保持させている。オーエンが開示して
いるように、アルカリ性緩衝剤と他の試薬を一緒
にすると保存安定性が得られないためである。 この点を確認するために、発明者らは以下に示
す検討を行つた。 検討１ (1) β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 60IU／ml (2) β−NAD 21ｍＭ (3) メルドラブルー 0.25ｍＭ (4) INT 8.9ｍＭ (5) グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
1M（PH8.8） (6) リン酸1K−リン酸2K緩衝液 1M（PH8.8） 上記(1)〜(4)の試薬を溶解したものと、(5)〜(6)の
試薬を溶解したものを別々に作製し、両者を合わ
せて含浸溶液を作製したところ、瞬時に赤紫色に
着色した。この混合含浸溶液に吸収性紙（東洋濾
紙製、濾紙＃500）に浸漬し、乾燥したところ、
赤紫色に着色し、試薬紙として全く使用できなか
つた。 検討２ 検討１で作製した(1)〜(4)の試薬を溶解した液と
(5)〜(6)の試薬を溶解して作製した液のそれぞれに
検討１で用いた濾紙を浸漬、含浸し、２種の試薬
残渣含有濾紙を作製した。(5)〜(6)の試薬乾燥残渣
含有濾紙は白色であつたが、(1)〜(4)の試薬乾燥残
渣含有濾紙はうす青色を呈していた。 検討１及び２より本発明に用いられている試薬
の場合、オーオンの主張する通り全ての試薬を一
緒にすると使用できない位の着色が見られるが、
アルカリ性緩衝液を別にすれば試験片の着色を抑
えられることが理解される。 しかしながら、アルカリ性緩衝剤を他の試薬と
別の吸収性担体に含浸させたオーエンの試験具は
使用において不便であるばかりか、精度の悪い結
果しかもたらさない。即ち、使用に際しては別々
の容器から取り出した２種類の試薬含有紙を重ね
た上から試料を滴下するという面倒さがあり、ま
た、２つに試薬含有紙を重ねた上から試料を滴下
するために、両方の試薬含有紙に試料を均一に供
給することができないため、精度に悪い結果しか
得られていなかつた。精度が悪いことは、オーエ
ン自身が、発明の名称に半定量測定という表現を
用いていることからも理解できる。 (c) 問題点を解決するための手段 以上のような現状に鑑み、本発明者等は鋭意研
究の結果、β−ヒドロキシ酪酸をニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（NAD）の存在下でβ
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により酸化（脱水
素）する工程に電子伝達体及びテトラゾリウム塩
を存在せしめ、生成するホルマザンの呈色度を測
定するためのものにおいて、PHを７〜９に維持す
るPH緩衝剤、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、
NAD、電子伝達体、テトラゾリウム塩が、親水
性の天然又は合成のフイルム形成重合体が疎水性
の天然又は合成のフイルム形成重合体に分散され
たものであるバインダーと共に、水不浸透性の支
持体上に構成させることによつて保存安定性の優
れたβ−ヒドロキシ酪酸の定量用組成物を見出し
た。 本発明の組成物の保存安定性が優れている理由
は、天然又は合成のフイルム形成重合体が不安定
な試薬を覆うことによつて空気中の酸素や湿度に
よる酸化から守つていることと、接触させると不
安定な試薬を覆うことによつて隔離していること
にある。特に疎水性のフイルム形成重合体中に親
水性のフイルム形成重合体を分散させ、油中水滴
エマルジヨンとしたものは試薬を覆う効果が高く
保存安定性を高めるのに絶大な効果を有してい
る。 本発明におけるβ−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
としては、β−ヒドロキシ酪酸を酸化してアセト
酢酸を生成させるものならば如何なるものでも用
いられる。これには、ロドシユードモナススフエ
ロイド（Rhodopseudomonas spheroi−des）や
シユードモナスレモイグネ（Pseudomonas
lemoignei）などの細菌を起源とするもの、牛の
心臓や豚の肝臓などの動物組織から抽出したもの
などが挙げられる。 NADは、酸化還元系反応で水素原子受容作用
を有する補酵素であり、肝臓・膵臓などの動物組
織や酵母などから抽出されたものが挙げられ、そ
のナトリウム塩やリチウム塩なども使用可能であ
る。 電子伝達体としては、生成したNADH水素供
与作用を活性化するものであれば、いずれも用い
られる。例えばフラピン酵素の一種であるジアホ
ラーゼやメルドラブルー、PMS、１−メトキシ
PMSなどの中間電子キヤリヤーが挙げられる。
このうち、安定な１−メトキシPMSとジアホラ
ーゼが特に好ましい。 テトラゾリウム塩は、還元性物質の存在下で有
色物質であるホルマザン類に還元されるもので、
多数のモノテトラゾリウム塩、ジテトラゾリウム
塩等がある。前者の代表的な例としては、塩化３
−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロフエ
ニル）−５−フエニルテトラゾリウム（略称
INT）が臭化３−（４，５−ジメチル−２−チア
ゾリル）−２，５ジフエニル−2Hテトラゾリウム
（略称MTT）、又後者の代表例として、３，3′−
（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニリレン）
−ビス〔２−（パラニトロフエニル）−５−フエニ
ル−2Hテトラゾリウム〕（略称ニトロ−TB）な
どが挙げられる。このうち、水によく溶け比較的
安定なニトロ−TBが最適である。 親水性の天然及び合成の有機フイルム形成重合
体としては、アラビアガム、アルギン酸、ゼラチ
ン、デキストラン、プルラン、カルボキシメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム
などがあり、疎水性のバインダーとしてはエチル
セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリル酸エ
チル、ポリビニルブチラール、ポリ酢酸ビニル、
ポリビニルカルバゾールなどがある。これらのう
ち、親水性バインダーとしては、ゼラチン、ポリ
ビニルアルコールが好適であり、疎水性のバイン
ダーとしてはエチルセルロース、ポリビニルブチ
ラールが好適である。 PH緩衝剤としては、酵素反応、呈色反応にして
至適なPH条件（７〜９）を与えるものであればど
のようなものでもよく、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩
衝剤、トリス緩衝剤、グツドの緩衝剤などPHを７
〜９に維持できるものであれば多くのものの使用
が可能である。さらに、その他の添加剤の使用も
可能である。 上記各試薬を（バインダー）分散し溶解させて
プラスチツクフイルム上に塗布し、乾燥させて組
成物とする。これを例えば５mm角程度に裁断して
試験片とし、細長いプラスチツクフイルムの先端
に貼着して用いると使用に便利である。 この試験片に血清、血漿又は尿などの体液を滴
下して数分間の反応時間を待つと試験片が呈色す
る。また、検体が全血の場合は、試験片表面がβ
−ヒドロキシ酪酸のような低分子物質は通過させ
るが血球などの巨大な物質は通過させない構造に
なつているので、呈色反応後、血球を水洗または
ふき取りによつて除去でき、試験片表面の呈色が
赤血球の赤い色に妨げられることなく観測でき
る。 呈した色調を予め作成した標準比色表と肉眼比
色することにより、体液中のβ−ヒドロキシ酪酸
の濃度が測定できる。より高い精度の測定を希望
する場合、呈色色相に対応する光源を有する簡単
な光反射率計を用いることは勿論可能である。 次に、本発明の理解を助けるため、研究の過程
において見い出された例を参考例として挙げる。 参考例 １ 0.1M−トリスヒドロキシアミノメタン−塩酸
緩衝液（PH8.5）100mlに、β−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素（起源：シユードモナスレモイグネ、比
活性：10U／mg）、10mg、NAD33mg、電子伝達体
（１−メトキシPMS）３mg、テトラゾリウム塩
（ニトロ−TB）17mgを溶解させた試液を調製し
た。 この試液3.0mlずつを試験管に採り、β−ヒド
ロキシ酪酸水溶液（標準液：０、２、４、６、
８、10mgmol／）の各々20μを加えて37℃に
保ち、比色計によつて520nｍの単色光で0.5、１、
２、３、４、５分間の反応時間における吸光度を
測定した。測定値を表−１にまとめて示す。 この反応タイムコースを見るため、縦軸に吸光
度、横軸に反応時間をとり、各測定値をプロツト
して第１図を作成した。第１図より０ｍmol／
の試料の吸光度変化より試薬自身の着色が殆どな
いこと、及び反応は約４分間で終点に達している
ことが分かつた。 さらに、反応が終点に達した４分目の各標準液
に対応する吸光度（ただし、0mol／における
吸光度0.263をブランク値として差し引いた値）
を縦軸に、標準液の濃度を横軸にとり、検量線
（第２図）を作成した。β−ヒドロキシ酪酸
10mol／までの原点を通じる直線が得られた。
簡易・迅速に定量できる固相一体化組成物に関す
るものである。 (b) 従来の技術及びその問題点 β−ヒドロキシ酪酸（β−オキシ酪酸）は、脂
肪酸代謝の中間産物でケトン体の一種であり、糖
尿病患者や糖尿病動物の体液（血液や尿等）に他
のケトン体とともに多く存在する。以下、本発明
を、体液中のβ−ヒドロキシ酪酸を測定する場合
を例にとり詳細に説明する。 膵内分泌障害によるインスリン不足など炭水化
物代謝障害があるときには、肝臓での脂肪酸の酸
化が盛んになる。その結果、アセトン・アセト酢
酸・β−ヒドロキシ酪酸等のケトン体が異常増加
し、組織、血液、尿中にケトン体が過剰に蓄積さ
れる（ケト−ジスの状態）。従つて、高度の膵内
分泌障害特に重症糖尿病の場合、或いは糖質制限
投与の際には体液中ケトン体の消長に注意するこ
とが必要である。 ところで、重症糖尿病におけるケト−ジス状態
の際には、これらのケトン体のうち特に血中β−
ヒドロキシ酪酸の上昇が著しくなり、β−ヒドロ
キシ酪酸／（アセトン＋アセト酢酸）の比が増大
し、β−ヒドロキシ酪酸が糖質代謝異常を最も鋭
敏に反映するとされている。 血液中のβ−ヒドロキシ酪酸の定量法としては
ウイリアムソン等のβ−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素を用いる方法が知られている〔バイオケミカル
ジヤーナル（Biochemical Journal）82巻90頁、
1962年〕。この方法はβ−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素とジホスホピリジルヌクレオチド（DPN）
を反応させ、生成した還元型ジホスホピリジルヌ
クレオチド（DPNH）の340nｍにおける特異吸
収の吸光度を測定し、その分子吸光係数からβ−
ヒドロキシ酪酸量を求めるものである。従つて、
分析には高度の熟練と長時間を要し、且つ高級な
紫外部分光光度計を必要とする点で問題があつ
た。 この欠点を是正するために、紫外部分光光度計
を必要としない血中ケトン体の高感度簡易比色法
が開発された（特開昭55−35232）。この方法は、
まずβ−ヒドロキシ酪酸にβ−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（NAD）を作用させて酵素的に酸化してアセ
ト酢酸となし、血中に元から含まれていたアセト
酢酸と共にｐ−ニトロフエニルジアゾニウムフル
オロボレートと反応させてアゾ化合物となす。こ
れを次亜燐酸で還元して安定なヒドラゾ化合物に
転じ、390nｍの波長を用い比色法により全アセ
ト酢酸量を求める。別途、β−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素を作用させないで同様に比色して血中の
元のアセト酢酸量のみを求め、上記全アセト酢酸
量から差演算をなし、β−ヒドロキシ酪酸量を求
めるものである。しかしこの方法も、血液試料の
前処理（除蛋白）や複雑な定量操作のため測定に
熟練と長時間を要し、且つ特別の器具や高級な分
光光度計も必要であり、日常の臨床検査法として
は未だ多くの問題を有している。 一方、β−ヒドロキシ酪酸をニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（NAD）の存在下でβ−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により酸化（脱水素）
して生成した還元型NAD（NADH）に、電子伝
達体を介してテトラゾリウム塩を還元せしめ、生
成する有色のホルマザンの呈色度を測定してβ−
ヒドロキシ酪酸を迅速、簡易に定量でき、優れた
結果を得ることができる方法が見いだされた。 更に、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、
（NAD）、及びテトラゾリウム塩を吸収性担体に
含浸させ、次いで乾燥させた試験具がオーエン
（Owen）によつて開発された。〔米国特許第
4351899号、発明の名称：代謝酸の半定量測定
（Semi−Quantitative Assay of Metabolic
Acid）〕 オーエンの組成物における測定原理は、下式に
示す如くまずβ−ヒドロキシ酪酸を電子受容体で
あるNADの存在下にβ−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素により酸化（脱水素）してアセト酢酸とな
す。このとき生じる還元型NAD（NADH）が電
子伝達体を介してテトラゾリウム塩を還元して有
色のホルマザンを生成させ、このホルマザンの呈
色状態を比色してβ−ヒドロキシ酪酸量を求める
ものである。 この試験具に検体の一滴を塗布すれば、数分の
後検体中のβ−ヒドロキシ酪酸の濃度に応じた色
を組成物上に呈する。これを予め作成した標準比
色表と肉眼比色するだけでβ−ヒドロキシ酪酸濃
度を測定することが可能である。 しかしながらこの試験具は、電子伝達体として
メルドラブルー、PMSが使用されていること及
び試薬を吸収性担体に含浸させているため、呈色
等の安定性が悪く、また、長時間の試験具の保存
にも耐えうるものではなかつた。 ところで、この試験具は保存安定性を高めるた
め、試薬の内、PH緩衝剤のみを他の試薬と別の吸
収性担体に保持させている。オーエンが開示して
いるように、アルカリ性緩衝剤と他の試薬を一緒
にすると保存安定性が得られないためである。 この点を確認するために、発明者らは以下に示
す検討を行つた。 検討１ (1) β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 60IU／ml (2) β−NAD 21ｍＭ (3) メルドラブルー 0.25ｍＭ (4) INT 8.9ｍＭ (5) グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
1M（PH8.8） (6) リン酸1K−リン酸2K緩衝液 1M（PH8.8） 上記(1)〜(4)の試薬を溶解したものと、(5)〜(6)の
試薬を溶解したものを別々に作製し、両者を合わ
せて含浸溶液を作製したところ、瞬時に赤紫色に
着色した。この混合含浸溶液に吸収性紙（東洋濾
紙製、濾紙＃500）に浸漬し、乾燥したところ、
赤紫色に着色し、試薬紙として全く使用できなか
つた。 検討２ 検討１で作製した(1)〜(4)の試薬を溶解した液と
(5)〜(6)の試薬を溶解して作製した液のそれぞれに
検討１で用いた濾紙を浸漬、含浸し、２種の試薬
残渣含有濾紙を作製した。(5)〜(6)の試薬乾燥残渣
含有濾紙は白色であつたが、(1)〜(4)の試薬乾燥残
渣含有濾紙はうす青色を呈していた。 検討１及び２より本発明に用いられている試薬
の場合、オーオンの主張する通り全ての試薬を一
緒にすると使用できない位の着色が見られるが、
アルカリ性緩衝液を別にすれば試験片の着色を抑
えられることが理解される。 しかしながら、アルカリ性緩衝剤を他の試薬と
別の吸収性担体に含浸させたオーエンの試験具は
使用において不便であるばかりか、精度の悪い結
果しかもたらさない。即ち、使用に際しては別々
の容器から取り出した２種類の試薬含有紙を重ね
た上から試料を滴下するという面倒さがあり、ま
た、２つに試薬含有紙を重ねた上から試料を滴下
するために、両方の試薬含有紙に試料を均一に供
給することができないため、精度に悪い結果しか
得られていなかつた。精度が悪いことは、オーエ
ン自身が、発明の名称に半定量測定という表現を
用いていることからも理解できる。 (c) 問題点を解決するための手段 以上のような現状に鑑み、本発明者等は鋭意研
究の結果、β−ヒドロキシ酪酸をニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（NAD）の存在下でβ
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により酸化（脱水
素）する工程に電子伝達体及びテトラゾリウム塩
を存在せしめ、生成するホルマザンの呈色度を測
定するためのものにおいて、PHを７〜９に維持す
るPH緩衝剤、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、
NAD、電子伝達体、テトラゾリウム塩が、親水
性の天然又は合成のフイルム形成重合体が疎水性
の天然又は合成のフイルム形成重合体に分散され
たものであるバインダーと共に、水不浸透性の支
持体上に構成させることによつて保存安定性の優
れたβ−ヒドロキシ酪酸の定量用組成物を見出し
た。 本発明の組成物の保存安定性が優れている理由
は、天然又は合成のフイルム形成重合体が不安定
な試薬を覆うことによつて空気中の酸素や湿度に
よる酸化から守つていることと、接触させると不
安定な試薬を覆うことによつて隔離していること
にある。特に疎水性のフイルム形成重合体中に親
水性のフイルム形成重合体を分散させ、油中水滴
エマルジヨンとしたものは試薬を覆う効果が高く
保存安定性を高めるのに絶大な効果を有してい
る。 本発明におけるβ−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
としては、β−ヒドロキシ酪酸を酸化してアセト
酢酸を生成させるものならば如何なるものでも用
いられる。これには、ロドシユードモナススフエ
ロイド（Rhodopseudomonas spheroi−des）や
シユードモナスレモイグネ（Pseudomonas
lemoignei）などの細菌を起源とするもの、牛の
心臓や豚の肝臓などの動物組織から抽出したもの
などが挙げられる。 NADは、酸化還元系反応で水素原子受容作用
を有する補酵素であり、肝臓・膵臓などの動物組
織や酵母などから抽出されたものが挙げられ、そ
のナトリウム塩やリチウム塩なども使用可能であ
る。 電子伝達体としては、生成したNADH水素供
与作用を活性化するものであれば、いずれも用い
られる。例えばフラピン酵素の一種であるジアホ
ラーゼやメルドラブルー、PMS、１−メトキシ
PMSなどの中間電子キヤリヤーが挙げられる。
このうち、安定な１−メトキシPMSとジアホラ
ーゼが特に好ましい。 テトラゾリウム塩は、還元性物質の存在下で有
色物質であるホルマザン類に還元されるもので、
多数のモノテトラゾリウム塩、ジテトラゾリウム
塩等がある。前者の代表的な例としては、塩化３
−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロフエ
ニル）−５−フエニルテトラゾリウム（略称
INT）が臭化３−（４，５−ジメチル−２−チア
ゾリル）−２，５ジフエニル−2Hテトラゾリウム
（略称MTT）、又後者の代表例として、３，3′−
（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニリレン）
−ビス〔２−（パラニトロフエニル）−５−フエニ
ル−2Hテトラゾリウム〕（略称ニトロ−TB）な
どが挙げられる。このうち、水によく溶け比較的
安定なニトロ−TBが最適である。 親水性の天然及び合成の有機フイルム形成重合
体としては、アラビアガム、アルギン酸、ゼラチ
ン、デキストラン、プルラン、カルボキシメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム
などがあり、疎水性のバインダーとしてはエチル
セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリル酸エ
チル、ポリビニルブチラール、ポリ酢酸ビニル、
ポリビニルカルバゾールなどがある。これらのう
ち、親水性バインダーとしては、ゼラチン、ポリ
ビニルアルコールが好適であり、疎水性のバイン
ダーとしてはエチルセルロース、ポリビニルブチ
ラールが好適である。 PH緩衝剤としては、酵素反応、呈色反応にして
至適なPH条件（７〜９）を与えるものであればど
のようなものでもよく、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩
衝剤、トリス緩衝剤、グツドの緩衝剤などPHを７
〜９に維持できるものであれば多くのものの使用
が可能である。さらに、その他の添加剤の使用も
可能である。 上記各試薬を（バインダー）分散し溶解させて
プラスチツクフイルム上に塗布し、乾燥させて組
成物とする。これを例えば５mm角程度に裁断して
試験片とし、細長いプラスチツクフイルムの先端
に貼着して用いると使用に便利である。 この試験片に血清、血漿又は尿などの体液を滴
下して数分間の反応時間を待つと試験片が呈色す
る。また、検体が全血の場合は、試験片表面がβ
−ヒドロキシ酪酸のような低分子物質は通過させ
るが血球などの巨大な物質は通過させない構造に
なつているので、呈色反応後、血球を水洗または
ふき取りによつて除去でき、試験片表面の呈色が
赤血球の赤い色に妨げられることなく観測でき
る。 呈した色調を予め作成した標準比色表と肉眼比
色することにより、体液中のβ−ヒドロキシ酪酸
の濃度が測定できる。より高い精度の測定を希望
する場合、呈色色相に対応する光源を有する簡単
な光反射率計を用いることは勿論可能である。 次に、本発明の理解を助けるため、研究の過程
において見い出された例を参考例として挙げる。 参考例 １ 0.1M−トリスヒドロキシアミノメタン−塩酸
緩衝液（PH8.5）100mlに、β−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素（起源：シユードモナスレモイグネ、比
活性：10U／mg）、10mg、NAD33mg、電子伝達体
（１−メトキシPMS）３mg、テトラゾリウム塩
（ニトロ−TB）17mgを溶解させた試液を調製し
た。 この試液3.0mlずつを試験管に採り、β−ヒド
ロキシ酪酸水溶液（標準液：０、２、４、６、
８、10mgmol／）の各々20μを加えて37℃に
保ち、比色計によつて520nｍの単色光で0.5、１、
２、３、４、５分間の反応時間における吸光度を
測定した。測定値を表−１にまとめて示す。 この反応タイムコースを見るため、縦軸に吸光
度、横軸に反応時間をとり、各測定値をプロツト
して第１図を作成した。第１図より０ｍmol／
の試料の吸光度変化より試薬自身の着色が殆どな
いこと、及び反応は約４分間で終点に達している
ことが分かつた。 さらに、反応が終点に達した４分目の各標準液
に対応する吸光度（ただし、0mol／における
吸光度0.263をブランク値として差し引いた値）
を縦軸に、標準液の濃度を横軸にとり、検量線
（第２図）を作成した。β−ヒドロキシ酪酸
10mol／までの原点を通じる直線が得られた。
【表】
【表】
上記処方の試液3.0mlに患者血清検体20μを添
加し、37℃で５分間反応させ520nｍの単色光を
用いて吸光度を測定したところ0.27であつた。第
２図の検量線より検体中のβ−ヒドロキシ酪酸の
濃度は3.10ｍmol／である。 本例から明らかなように、PH8.8においても電
子伝達体として１−メトキシPMS、ジアゾニウ
ム塩としてニトロ−TBを用いることによつて単
一の溶液試薬でもβ−ヒドロキシ酪酸を定量する
ことができる。 よつて、本方法によれば、上記の処方の試液
3.0mlに検体20μを添加し、一定温度で４〜５分
間反応させ520nｍ付近の単色光を用いて比色し、
同条件で予め作成した検査線より検体中のβ−ヒ
ドロキシ酪酸を定量することができる。 参考例 ２ 0.1Mホウ酸−ホウ砂緩衝剤（PH８）10ml、
NAD10mg、１−メトキシPMS1mg、安定化剤と
して牛血清アルブミン100mg、β−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素（起源：Pseudomonas
lemoigneis）50Uを溶解した後、ニトロTBを溶
解し、直ちに濾紙を浸漬して室温で風乾させる。 本品を５mm角の試験片に裁断し、５×70mmの細
長いポリ塩化ビニルフイルムの先端に両面テープ
を用いて貼り合わせる。この試験片部分を検体に
浸けるか、または検体の１滴を塗布して３分間反
応させると、青紫色の呈色が見られる。 この呈色色調を予め作成しておいた０、0.1、
0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ｍmol／のβ−ヒ
ドロキシ酪酸に相当する呈色色調を示す標準比色
表と対比することによつて、検体中のβ−ヒドロ
キシ酪酸の濃度を測定することができる。 しかしながら、実施例４に示すように本例で作
成した試験片は安定性が十分でないので、商品と
して使用者に提供することはできない。 実施例 １ 0.1Mトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩
衝液（PH８）10mlに、１−メトキシPMS1.5
加し、37℃で５分間反応させ520nｍの単色光を
用いて吸光度を測定したところ0.27であつた。第
２図の検量線より検体中のβ−ヒドロキシ酪酸の
濃度は3.10ｍmol／である。 本例から明らかなように、PH8.8においても電
子伝達体として１−メトキシPMS、ジアゾニウ
ム塩としてニトロ−TBを用いることによつて単
一の溶液試薬でもβ−ヒドロキシ酪酸を定量する
ことができる。 よつて、本方法によれば、上記の処方の試液
3.0mlに検体20μを添加し、一定温度で４〜５分
間反応させ520nｍ付近の単色光を用いて比色し、
同条件で予め作成した検査線より検体中のβ−ヒ
ドロキシ酪酸を定量することができる。 参考例 ２ 0.1Mホウ酸−ホウ砂緩衝剤（PH８）10ml、
NAD10mg、１−メトキシPMS1mg、安定化剤と
して牛血清アルブミン100mg、β−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素（起源：Pseudomonas
lemoigneis）50Uを溶解した後、ニトロTBを溶
解し、直ちに濾紙を浸漬して室温で風乾させる。 本品を５mm角の試験片に裁断し、５×70mmの細
長いポリ塩化ビニルフイルムの先端に両面テープ
を用いて貼り合わせる。この試験片部分を検体に
浸けるか、または検体の１滴を塗布して３分間反
応させると、青紫色の呈色が見られる。 この呈色色調を予め作成しておいた０、0.1、
0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ｍmol／のβ−ヒ
ドロキシ酪酸に相当する呈色色調を示す標準比色
表と対比することによつて、検体中のβ−ヒドロ
キシ酪酸の濃度を測定することができる。 しかしながら、実施例４に示すように本例で作
成した試験片は安定性が十分でないので、商品と
して使用者に提供することはできない。 実施例 １ 0.1Mトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩
衝液（PH８）10mlに、１−メトキシPMS1.5
【表】
mg、ゼラチン1.5ｇ、NAD8mg、β−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素（起源：Rhodopseudomonac
spheroides）100Uを溶解させ、次にニトロ−
TB100mgを溶解したのち、直ちにドクターブレ
ードを用いて0.4mmの厚さでポリエステルフイル
ムに均一に塗布した後、25℃で２時間乾燥する。 本品を５×７mmの試験片に切断し、更に５×90
mmのポリ塩化ビニルの先端に貼り合わして試験具
とする。この試験具の試験片部分に種々濃度のβ
−ヒドロキシ酪酸を含有する患者血清の１滴を塗
布して２分間反応させ、余りの血清を吸収性紙で
軽く吸い取り、更に３分間呈色が安定するのを待
つて、予め作成しておいた０、0.1、0.2、0.5、
1.0、2.0、5.0、10.0ｍmol／のβ−ヒドロキシ
酪酸に相当する呈色色調を示す標準比色表と肉眼
対比してβ−ヒドロキシ酪酸の濃度を求めた。 同じ血清試料のβ−ヒドロキシ酪酸濃度を、本
例の方法（測定値ｘ）と特開昭55−35232号公報
に記載の方法（測定値ｙ）で測定した結果を表−
２に示す。両者の相関係数は0.988、回帰直線式
はｙ＝1.06x−0.02となり、両者が良好な相関関
係にあることを示す。 実施例 ２ 実施例１の組成物に、更にエチルセルロース１
ｇをクロロホルム10mlに溶解させたものと、20％
ゼラチン水溶液1.5mlを添加し、強撹拌すること
によつて分散させ、油中水滴エマルジヨンを作製
する。これを0.15mmの厚さのドクターブレードを
用いてポリエステルフイルム上に均一塗布し、30
℃で45分間乾燥し、多孔性の半透性膜を形成させ
る。これを実施例１と同様な試験具に加工してこ
の試験片部分に全血試料中の１滴を塗布し、３分
間後に脱脂綿で余剰の試料をふき取ると、血球成
分が除去され、全血試料中のβ−ヒドロキシ酪酸
濃度に対応する青紫色の呈色が観察される。 実施例 ３ 0.2Mリン酸１カリウム−ホウ砂緩衝液（PH８）
10mlにNAD120mg、ジアホラーゼ4000U、ニトロ
ーTB60mg、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
2000U（起源、Pseudomonas lemoignei）、ゼラ
チン１ｇを溶解した溶液(1)を作製する。また、エ
チルセルロース１ｇをクロロホルム10mlに溶解さ
せた溶液(2)に上記の溶液(1)3.0mlを添加し、強撹
拌することにより分散させ、油中水滴エマルジヨ
ンを作製する。これを0.15mmの厚さのドクターブ
レードを用いてポリエステルフイルム上に均一に
塗布し、30℃で45分間乾燥し、多孔性の半透性膜
を形成させる。 これは、実施例２に示された方法で全血試料の
β−ヒドロキシ酪酸濃度を３分間で測定すること
ができる。 本実施例による組成物は、電子伝達体にジアホ
ラーゼを用いているため、25℃における保存安定
性が６ケ月間あり、さらに血球分離して血清（又
は血漿）にする必要がなく、全血を試料として血
中β−ヒドロキシ酪酸濃度を測定することができ
る。 また、試験面のβ−ヒドロキシ酪酸濃度に対応
する青紫色の呈色は、紙を担体とする試験具表面
のそれと比べて均一であり、精度の高い測定成積
が得られる。 実施例 ４ 参考例２及び実施例１〜３において作製した組
成物の保存安定性（試験面がもとのクリーム色か
ら暗い青紫色に着色し、β−ヒドロキシ酪酸濃度
判定が困難になるまでの期間）を調べたところ、
表３の通りとなつた。 参考例２と比較して、実施例１では濾紙のよう
な吸収性担体に試薬を含浸させていないので、安
定性が改善されていることが見い出された。また
実施例２、３では更に良好な保存安定性を有して
いる。この検討の結果より、親水性バインダーを
加えることによつて保存安定性が改善され、さら
に疎水性バインダー中に分散して油中水滴エマル
ジヨンを作製した後、塗布・乾燥することによつ
て商品として実用できる安定性を有するβ−ヒド
ロキシ酪酸定量用組成物を製造できる。
酪酸脱水素酵素（起源：Rhodopseudomonac
spheroides）100Uを溶解させ、次にニトロ−
TB100mgを溶解したのち、直ちにドクターブレ
ードを用いて0.4mmの厚さでポリエステルフイル
ムに均一に塗布した後、25℃で２時間乾燥する。 本品を５×７mmの試験片に切断し、更に５×90
mmのポリ塩化ビニルの先端に貼り合わして試験具
とする。この試験具の試験片部分に種々濃度のβ
−ヒドロキシ酪酸を含有する患者血清の１滴を塗
布して２分間反応させ、余りの血清を吸収性紙で
軽く吸い取り、更に３分間呈色が安定するのを待
つて、予め作成しておいた０、0.1、0.2、0.5、
1.0、2.0、5.0、10.0ｍmol／のβ−ヒドロキシ
酪酸に相当する呈色色調を示す標準比色表と肉眼
対比してβ−ヒドロキシ酪酸の濃度を求めた。 同じ血清試料のβ−ヒドロキシ酪酸濃度を、本
例の方法（測定値ｘ）と特開昭55−35232号公報
に記載の方法（測定値ｙ）で測定した結果を表−
２に示す。両者の相関係数は0.988、回帰直線式
はｙ＝1.06x−0.02となり、両者が良好な相関関
係にあることを示す。 実施例 ２ 実施例１の組成物に、更にエチルセルロース１
ｇをクロロホルム10mlに溶解させたものと、20％
ゼラチン水溶液1.5mlを添加し、強撹拌すること
によつて分散させ、油中水滴エマルジヨンを作製
する。これを0.15mmの厚さのドクターブレードを
用いてポリエステルフイルム上に均一塗布し、30
℃で45分間乾燥し、多孔性の半透性膜を形成させ
る。これを実施例１と同様な試験具に加工してこ
の試験片部分に全血試料中の１滴を塗布し、３分
間後に脱脂綿で余剰の試料をふき取ると、血球成
分が除去され、全血試料中のβ−ヒドロキシ酪酸
濃度に対応する青紫色の呈色が観察される。 実施例 ３ 0.2Mリン酸１カリウム−ホウ砂緩衝液（PH８）
10mlにNAD120mg、ジアホラーゼ4000U、ニトロ
ーTB60mg、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
2000U（起源、Pseudomonas lemoignei）、ゼラ
チン１ｇを溶解した溶液(1)を作製する。また、エ
チルセルロース１ｇをクロロホルム10mlに溶解さ
せた溶液(2)に上記の溶液(1)3.0mlを添加し、強撹
拌することにより分散させ、油中水滴エマルジヨ
ンを作製する。これを0.15mmの厚さのドクターブ
レードを用いてポリエステルフイルム上に均一に
塗布し、30℃で45分間乾燥し、多孔性の半透性膜
を形成させる。 これは、実施例２に示された方法で全血試料の
β−ヒドロキシ酪酸濃度を３分間で測定すること
ができる。 本実施例による組成物は、電子伝達体にジアホ
ラーゼを用いているため、25℃における保存安定
性が６ケ月間あり、さらに血球分離して血清（又
は血漿）にする必要がなく、全血を試料として血
中β−ヒドロキシ酪酸濃度を測定することができ
る。 また、試験面のβ−ヒドロキシ酪酸濃度に対応
する青紫色の呈色は、紙を担体とする試験具表面
のそれと比べて均一であり、精度の高い測定成積
が得られる。 実施例 ４ 参考例２及び実施例１〜３において作製した組
成物の保存安定性（試験面がもとのクリーム色か
ら暗い青紫色に着色し、β−ヒドロキシ酪酸濃度
判定が困難になるまでの期間）を調べたところ、
表３の通りとなつた。 参考例２と比較して、実施例１では濾紙のよう
な吸収性担体に試薬を含浸させていないので、安
定性が改善されていることが見い出された。また
実施例２、３では更に良好な保存安定性を有して
いる。この検討の結果より、親水性バインダーを
加えることによつて保存安定性が改善され、さら
に疎水性バインダー中に分散して油中水滴エマル
ジヨンを作製した後、塗布・乾燥することによつ
て商品として実用できる安定性を有するβ−ヒド
ロキシ酪酸定量用組成物を製造できる。
【表】
以上本発明における好適な実施例を挙げたが、
これらは本発明の技術思想に限定を加えるもので
はなく、その技術思想の範囲内において種々の変
更を加え得る。例えば、酵素や発色剤の安定剤と
して蛋白質や多糖類、反応促進剤としてヒドラジ
ン化合物やマグネシウム化合物が用いられ、また
各種粘稠剤、界面活性剤のような添加物を使用す
ることが可能である。また溶媒は氷だけでなく、
種々の有機溶媒も使用可能であり、各材料は必ず
しも溶解している必要はなく、サスペンシヨンや
エマルジヨン状態で溶媒中に分散していてもよ
い。 尚、本発明は上記した臨床検査分野以外に、食
品添加物その他の検体中のβ−ヒドロキシ酪酸の
定量分析にも勿論用いることができる。以上詳述
したように本発明は、PHを７〜９に維持できるPH
緩衝剤の存在下、β−ヒドロキシ酪酸をNADと
β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により脱水素して
生成したNADHに、電子伝達体を介してテトラ
ゾリウム塩を還元させ、β−ヒドロキシ酪酸量に
応じて有色のホルマザンに変化させ、ホルマザン
の呈色状態を比色してβ−ヒドロキシ酪酸の量を
求める試薬を固相一体化した組成物である。 本発明の組成物を用いれば従来行われていた方
法と異なり、検体（特に血液）の前処理を要せず
測定に際し特別の装置や複雑な操作及び熟練を必
要とせず極めて使用しやすく、且つ短時間に結果
が得られる。 本発明の組成物によれば、検体の一滴を組成物
に塗布するだけでよく検体が極めて微量ですみ、
呈色までの反応を数分で終了し、臨床分野におけ
る日常検査として不可欠な条件である迅速・簡易
化と検体の微量化が実現出来る。特に、既に市販
され入手可能な尿糖や血糖試験片と組み合わせて
同様の操作で尿・血液中の糖とβ−ヒドロキシ酪
酸両者の濃度が測定でき、医師、看護婦更に在宅
検査しなければならない糖尿病患者にとつて便利
であり、実用上極めて大きな価置を有するもので
ある。
これらは本発明の技術思想に限定を加えるもので
はなく、その技術思想の範囲内において種々の変
更を加え得る。例えば、酵素や発色剤の安定剤と
して蛋白質や多糖類、反応促進剤としてヒドラジ
ン化合物やマグネシウム化合物が用いられ、また
各種粘稠剤、界面活性剤のような添加物を使用す
ることが可能である。また溶媒は氷だけでなく、
種々の有機溶媒も使用可能であり、各材料は必ず
しも溶解している必要はなく、サスペンシヨンや
エマルジヨン状態で溶媒中に分散していてもよ
い。 尚、本発明は上記した臨床検査分野以外に、食
品添加物その他の検体中のβ−ヒドロキシ酪酸の
定量分析にも勿論用いることができる。以上詳述
したように本発明は、PHを７〜９に維持できるPH
緩衝剤の存在下、β−ヒドロキシ酪酸をNADと
β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素により脱水素して
生成したNADHに、電子伝達体を介してテトラ
ゾリウム塩を還元させ、β−ヒドロキシ酪酸量に
応じて有色のホルマザンに変化させ、ホルマザン
の呈色状態を比色してβ−ヒドロキシ酪酸の量を
求める試薬を固相一体化した組成物である。 本発明の組成物を用いれば従来行われていた方
法と異なり、検体（特に血液）の前処理を要せず
測定に際し特別の装置や複雑な操作及び熟練を必
要とせず極めて使用しやすく、且つ短時間に結果
が得られる。 本発明の組成物によれば、検体の一滴を組成物
に塗布するだけでよく検体が極めて微量ですみ、
呈色までの反応を数分で終了し、臨床分野におけ
る日常検査として不可欠な条件である迅速・簡易
化と検体の微量化が実現出来る。特に、既に市販
され入手可能な尿糖や血糖試験片と組み合わせて
同様の操作で尿・血液中の糖とβ−ヒドロキシ酪
酸両者の濃度が測定でき、医師、看護婦更に在宅
検査しなければならない糖尿病患者にとつて便利
であり、実用上極めて大きな価置を有するもので
ある。
第１図は、本発明の原理を使用した方法の参考
例１の処方における反応タイムコースを示し、第
２図は、本発明の原理を使用した方法の参考例１
の処方における検量線を示すグラフである。
例１の処方における反応タイムコースを示し、第
２図は、本発明の原理を使用した方法の参考例１
の処方における検量線を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ β−ヒドロキシ酪酸をニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NAD）の存在下でβ−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素により酸化（脱水素）する
工程に電子伝達体及びテトラゾリウム塩を存在せ
しめ、生成するホルマザンの呈色度を測定するた
めのものにおいて、PHを７〜９に維持するPH緩衝
剤、β−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、NAD、電
子伝達体、テトラゾリウム塩が、親水性の天然又
は合成のフイルム形成重合体が疎水性の天然又は
合成のフイルム形成重合体に分散されたものであ
るバインダーと共に、水不浸透性の支持体上に構
成されていることを特徴とするβ−ヒドロキシ酪
酸の定量用組成物。 ２ 電子伝達体が１−メトキシPMS又はジアホ
ラーゼであり、かつテトラゾリウム塩がニトロ
TBである特許請求の範囲第１項記載のβ−ヒド
ロキシ酪酸の定量用組成物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58039813A JPS59162899A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | β‐ヒドロキシ酪酸の定量用組成物 |
| DE19843408062 DE3408062A1 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-05 | Verfahren zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeure und eine zusammensetzung zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeure |
| US06/922,178 US4803158A (en) | 1983-03-08 | 1986-10-23 | Composition used for the determination of beta-hydroxybutyric acid and a method for preparing the said composition |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58039813A JPS59162899A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | β‐ヒドロキシ酪酸の定量用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162899A JPS59162899A (ja) | 1984-09-13 |
| JPS6338199B2 true JPS6338199B2 (ja) | 1988-07-28 |
Family
ID=12563404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58039813A Granted JPS59162899A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | β‐ヒドロキシ酪酸の定量用組成物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4803158A (ja) |
| JP (1) | JPS59162899A (ja) |
| DE (1) | DE3408062A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0698029B2 (ja) * | 1985-12-10 | 1994-12-07 | 株式会社三和化学研究所 | 獣乳の品質検査と乳獣の健康診断とを同時に行う方法 |
| FR2596865B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1989-09-01 | Elf Aquitaine | Nouveau procede et dispositif pour le dosage de la carnitine |
| US5036000A (en) * | 1986-12-16 | 1991-07-30 | Enzymatics, Inc. | Threshold color control system |
| JPS63212868A (ja) * | 1987-02-27 | 1988-09-05 | Shimadzu Corp | ３−ヒドロキシ酪酸分析装置 |
| JPH01117799A (ja) * | 1987-10-30 | 1989-05-10 | Sekisui Chem Co Ltd | 生体成分測定用試験紙 |
| JP2677154B2 (ja) * | 1993-03-08 | 1997-11-17 | 日東紡績株式会社 | 総ケトン体の測定方法および測定試薬 |
| US5902731A (en) * | 1998-09-28 | 1999-05-11 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US6656697B1 (en) * | 1998-09-28 | 2003-12-02 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US6541216B1 (en) | 1999-12-22 | 2003-04-01 | Roche Diagnostics Corporation | Amperometric biosensor test strip |
| US6583722B2 (en) | 2000-12-12 | 2003-06-24 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Wetness signaling device |
| US6603403B2 (en) | 2000-12-12 | 2003-08-05 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Remote, wetness signaling system |
| JP6222629B2 (ja) * | 2013-08-29 | 2017-11-01 | 花王株式会社 | 排尿障害のバイオマーカー |
| WO2025187833A1 (ja) * | 2024-03-08 | 2025-09-12 | 天野エンザイム株式会社 | 新規３－ヒドロキシ酪酸酸化酵素 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1598153C3 (de) * | 1966-11-22 | 1973-11-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Diagnostisches Mittel zum Nach weis der Inhaltsstoffe von Korperflus sigkeiten |
| FR2053897A5 (en) * | 1969-07-09 | 1971-04-16 | American Hospital Supply Corp | Dehydrogenase activity determination with - dyeing composition |
| US3867258A (en) * | 1973-11-08 | 1975-02-18 | American Cyanamid Co | Lactate dehydrogenase test material |
| US3867259A (en) * | 1973-11-08 | 1975-02-18 | American Cyanamid Co | Lactate dehydrogenase test material |
| JPS5510029A (en) * | 1978-07-07 | 1980-01-24 | Hiroshi Miyazawa | Water-hammer pumping machine |
| JPS5512239A (en) * | 1978-07-12 | 1980-01-28 | Nippon Denso Co Ltd | Wave-form switching apparatus |
| DE2831580C2 (de) * | 1978-07-18 | 1980-09-18 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin |
| US4254222A (en) * | 1978-07-19 | 1981-03-03 | Owen Oliver E | Semi-quantitative assay of lactic acid and β-hydroxy butyrate |
| US4351899A (en) * | 1978-07-19 | 1982-09-28 | Owen Oliver E | Semi-quantitative assay of metabolic acids |
| JPS568549A (en) * | 1979-07-02 | 1981-01-28 | Fuji Photo Film Co Ltd | Multilayer chemical analyzing material |
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