JPS6340771B2 - - Google Patents
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- JPS6340771B2 JPS6340771B2 JP53044093A JP4409378A JPS6340771B2 JP S6340771 B2 JPS6340771 B2 JP S6340771B2 JP 53044093 A JP53044093 A JP 53044093A JP 4409378 A JP4409378 A JP 4409378A JP S6340771 B2 JPS6340771 B2 JP S6340771B2
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- Japan
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- milk
- casein
- whey
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- weeks
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/04—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from milk
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/20—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey
- A23J1/205—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey from whey, e.g. lactalbumine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
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- Polymers & Plastics (AREA)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は乳起源の免疫学的因子、特に活性イム
ノグロブリン類（active immunoglobulins）を
含有する蛋白濃縮物の製造法に関する。 免疫学的因子を新生児および乳児の乳中に合体
させることによつて、乳起源の免疫学的因子を新
生児および乳児のための栄養生成物中に導入する
ことが既に提案されており、それら生成物の経口
注入はそれら因子が乳児の血液に移行するのを可
能とすることを意図しているが、そのために採用
される方法および該全身性受動免疫の結果の何ら
の指示もなされていない。 ワクチン接種雌牛の乳を凝固させ、ホエイ
（lactoserum）を回収し、そしてラクトグロブリ
ン類（lactoglobulins）を硫酸アンモニウムで選
択的に沈澱させ、ついで純水に対し透析し、過
しそして乾燥することによつて免疫ラクトグロブ
リン類を単離することがまた提案されている。そ
れらの作業と関連してマウスにおける血清保護試
験は、それら免疫本体の経皮注射がある種の腸病
源性の細菌およびビールスに対し、動物にそれら
微生物を同じ経路で注射したとき、全身性受動保
護を生じることを示した。 本発明者等は、イムノグロブリン類が操作工程
中に変性することなしに、イムノグロブリン類を
含有する蛋白濃縮物を商業的規模で製造する方法
を今や見出した。この生成物は、腸の段階で、再
吸収なしにそして消化管内における活性の有意の
損失なしに局所受動免疫を提供する。 本発明に従う方法は次の工程からなる： −高度免疫乳産生雌の乳を採取し、 −クリームおよび夾雑物を分離し、清澄化しそし
て脱脂した乳を凝固させ、カゼインを分離し、
過し、限外過し、そして過によりホエイの蛋
白質を無菌化し、イムノグロブリン類を変性せず
そして無菌性を維持する条件下に生成物を蒸発し
そして乾燥する。 添付の図面は本方法の各種工程の図解説明であ
る。 乳所有雌は牛科（bovidae）、特に雌牛である。 処理される乳は多かれ少なかれ抗体に豊んだ各
種の形のものでありうる。初乳（colostrnm）、
遷移乳（transition milk）（出産後８日目からの
乳）または授乳末期乳（end−of−lactation
milk）（授乳の最後の２ケ月）。 高い抗体水準を最長の可能期間中得るためにそ
れら乳の混合物を処理するのが好ましい。 雌牛を組合せワクチン接種、たとえば乳腺中へ
の槽内点滴（intracisternal instillation）、経皮
注射（皮下、静脉内）、乳腺後節系中への注射、
乱切法（scarification）、経口摂取、あるいはそ
れら様式のいくつかの組合せにより高度免疫化す
る。 使用する乳の各型において満足な抗体水準を得
るために注意深く作成した免疫計画でそれら様式
の組合せを使用するのが好ましい。従つて、初乳
および遷移乳の場合には、ワクチン接種は出産前
８−２週間に経皮または槽内経路により、そして
出産に引続く週は経口経路による。 授乳末期乳の場合には、経皮、局所および経口
ワクチン接種が授乳の予測される終了の前2.5ケ
月間交互に適用される。 使用するワクチンは選択された抗原および免疫
雌牛の同種血清に基づくアジユバントの混合物が
よく、かくしてワクチンの無毒化および免疫複合
体の形成が提供される。 雌牛が給源動物として使用されるので、蛋白濃
縮物中に含有されるイムノグロブリン類（Ig′s）
は主にGIg′s（特にG1Ig′s）であるが、AIg′sが主
たるIg′sである母乳は別である。 蛋白質が70ないし80重量％を示す蛋白濃縮物中
のIg−含量は25ないし35重量％である。ある種の
利点は、本方法の実際の適用において、Ig′Sがホ
エイの他の蛋白質から分離されず、従つてそれは
また得られる濃縮物中に存在するということであ
る。即ち、たとえば硫酸アンモニウムでの選択さ
れた沈澱および透析の操作はもはや必要ではな
い。 加えて、ホエイ中に存在するある種の静菌また
は抗ビールス因子、たとえばラクトフエリン、ま
たは酵素系たとえばラクトパーオキシダーゼおよ
びリボヌクレアーセがまた、蛋白濃縮物中に見出
される。 ビールスまたは細菌起源のすべての種類の抗原
を使用することができ、そして得られる抗体は雌
牛に注射する抗原の性質に依存する。たとえば、
経口投与に適当な任意の支持体中にIg′sを含有す
る蛋白濃縮物を合体させることにより、胃腸炎の
原因となり重篤な下痢および脱水を伴う腸病源性
の細菌およびビールスに対する保護を得ることが
できる。この支持体は任意の賦形剤により、ある
いは好ましくは、栄養生成物たとえば幼児のため
の乳または麦芽処理乳、“人間化（humanised）”
した、即ち乳児に適合させた乳、特定の群の新生
児に特に適合させた乳、たとえば早産児または低
い出生時体重を有する乳児のための乳等によつて
形成しうる。 たとえば、乳を支持体として抗−エツシエリヒ
ア・コリIg′Sを予防量において含有する濃縮物を
使用するのが望ましい場合には、0.8ないし３ｇ
の濃縮物を乾燥物100ｇ中に合体することができ、
６ｇの量までの濃縮物が治療量として充分であ
る。 本方法を遂行するためには、引続く過器およ
び限外過器の閉塞を避けるために、脱脂および
清澄化操作を極めて充分に行なうことが必要であ
る。 脱脂は好ましくは２段階で、先ず大部分の脂肪
および夾雑物（たとえば初乳中にしばしば存在す
る血液）を除去するために低温で、ついで脂肪お
よび夾雑物を完全に分離するために高温で行なわ
れる。凝固はカゼインの等電点PHで、レンネツト
の存在において、酸たとえばクエン酸の添加によ
り行ないうる。 凝固はPH値約4.6までの酸たとえば塩酸の添加
により、そして40度Ｃの温度に加熱することによ
り行なうのが好ましい。 カゼインの分離は微粒子（fines）の分離を可
能とするホエイの清澄化を伴なう。 他方、加熱処理を必要とする操作（蒸発および
乾燥）はIg′Sの不活性化を防止するように設定さ
れた条件下に行なうことが重要である。 その若干のものが脱脂操作中にクリームと共に
除去されまた他にカゼインの分離の間にカゼイン
と共に除去されるIg′Sの損失を低下させるため
に、クリームおよび凝乳（curd）を水で抽出し、
そしてそれらを回収するためにIg′Sを含有する洗
滌水を処理するのが推奨される。 本発明の方法を以下の実施例で説明するが、そ
の中で示す量および比率は特に指示しない限り、
重量によるものである。 例 １ 各種の種の雌牛を、以下の計画に従い、その製
法を以下に記載するワクチンを使用して高度免疫
化し、そして授乳の最後の２ケ月間および出産後
の最初の８日間の乳を採取した。 ワクチンの製造 以下の胃腸病源性エツシエリヒア・コリ血清型
を使用した： 018：K76（B20） 0111：K58（B4） 020：K17（Ｌ） 0112：K68（B11） 026：K60（B6） 0119：K69（B14） 044：K74（Ｌ） 0124：K72（B17） 055：K59（B5） 0125：K70（B15） 078：K80（−） 0126：K71（B16） 086：K61（B7） 0127：K63（B8） 0128：K68（B12） 各種菌株は入院幼児の胃腸炎患者から得た。血
清型決定は多価および１価の抗血清〔デフコ
（Difco）〕で行なつた。細菌はカゼインに由来す
るアミノ酸（デフコカザミノ酸）２％およびグル
コース２％を含有する最少量の液体媒質中で、び
んの振盪なしに＋37度Ｃで24時間培養した。微生
物を不活性化するために、培養物を遠心分離によ
り沈降細胞と上澄層とに分離した。細胞を再懸濁
し、そしてホルムアルデヒド0.5％の存在におい
て＋37度Ｃで24時間インキユベートし、他方上澄
液はホルムアルデヒド0.05％の存在において上記
の如く不活性化した。再遠心分離し、そして上澄
層を分離した後、細菌をもとの上澄層に再懸濁し
た。この方法は細菌性外毒素を含有する上澄層が
ワクチンとして維持されることを可能とする。１
−２×109細菌／mlを含有するワクチンが得られ、
ついでAl（OH）3の２％溶液および免疫化した雌
牛の同種の血液と混合することによつて希釈し
た。 免疫方法 Ａ 抗−エツシエリヒア・コリIg′Sを含有する初
乳および遷移乳を得るための免疫計画： 【表】 Ｂ 抗−エツシエリヒア・コリIg′Sを含有する授
乳末期乳（授乳の最後の２ケ月）を得るための
免疫計画 この免疫は初乳および遷移乳期間につき既に免
疫化した雌牛に対し専ら行なう。 【表】 【表】 例 ２ 例１に従いワクチン接種した雌牛から採取した
出産後最初の８日間の乳を次の如く処理した： −脱脂は２工程で行なう：低温における工程Ａ
および高温における工程Ｂ。 Ａ 冷却乳1100Kgを遠心脱脂機に入れ、そして
2500容バツフアータンクに導き、ついで血液
および夾雑物〔かす（dregs）〕を除去するため
に高速（約11000G）遠心清澄機中にポンプ注
入する。 Ｂ 冷却清澄化乳を2500容貯蔵器に貯え、そし
て40度Ｃのヒーターを経て先に使用した遠心脱
脂機にポンプ注入し、かくしてクリーム110Kg
を分離し、それを回収し、そしてかす５Kgを排
棄する。この方法の変法においては、低温およ
び高温脱脂操作のための自己清澄化脱脂機、お
よびそれら操作の間の清澄機の使用が可能であ
り、かくして脱脂時間が短縮する。 −温かい清澄化脱脂乳（985Kg）をついで、凝
固操作のための撹拌機を付した４個の方形750
容凝固タンクに分配する。 1N塩酸溶液を37度ＣにおいてPHが約4.6に安定
化するまで加え、その後撹拌しつつその温度を20
分間維持し、ついで約15度Ｃに冷却する。 −次の操作はカゼインの分離である。それは脱
脂し、凝乳に固めたどろどろした（slabbed）乳
の２度の連続遠心分離からなる。第１のものはカ
ゼイン150Kgを分離する自己清浄化清澄機により
凝乳化カゼインの大部分を分離し、ホエイはバツ
フアー貯蔵器に入る。第２の遠心分離操作は、た
とえば脱脂操作の工程Ａで使用した清澄機によ
り、引続く過および限外過を妨害しうる微量
の粒子を除去する。清澄化ホエイ854.7Kgが得ら
れ、そして2500容貯蔵器にポンプ注入する。 −ホエイはついで連続的に過および限外過
する。過は、カゼインの非常に微細な粒子を分
離することにより、限外過の困難性を避けるた
めに、極めて充分なものでなければならない。
過は20×20cmの板からなるザイツ・スプラ
（Seitz Supra）100過器で行なう。液は3000
容貯蔵器に貯え、ついで限外過器にポンプ注
入する。限外過は保持物（retentate）を貯蔵
器に再循環して２ないし３工程で行なう。直列に
配列した２個の遠心ポンプは、限外過器の供給
隔室（input compartment）の入口上の約７バ
ールの圧力に対し、圧力が約4.5バールに保たれ
ている取り出し端（output end）において放出
を行なう。ポンプに供給されるエネルギーにより
加熱されるのを防止するために、保持物は約10−
12度Ｃに冷却する。 第１の工程、即ち限外過プロパー（proper）
は、高分子量の溶質および保持物中に見出される
膜上に保持される蛋白質を分離し、他方乳糖、ビ
タミン類無機塩および水の部分は透過物
（permeate）中に除去される。800の膜を有する
DSSモジユール（module）（膜表面＝７m2）を使
用することにより、保持物／透過物比率は約１：
3.1であり、かくして透過物580Kgおよび保持物
274.7Kgが14.17Kg／m2ｈの透過物の平均取り出し
で得られる。 第２工程はダイア過（diafiltration）であ
り、その間に水825Kgが保持物に連続的に加えら
れ、そして溶液は第１工程におけると同じ条件下
に循環する。ダイア過は透過物の電導度が必要
な値に達したときに中止し、加えた水に対する保
持物の比率は約１：３である。かくして、透過物
825Kgおよび保持物274.7Kgが11.75Kg／m2ｈの
透過物の平均取り出しで分離する。第３工程は、
透過物82.5Kgの脱離により、保持物を乾燥物含
量約10％まで膜に再循環することによつて随意に
行なわれる濃縮工程である。かくして、192.2Kg
の予濃縮溶液（preconcentrated solution）が得
られる。変法においては、この第３工程は省か
れ、その代りに、無菌化過段階に直接進行す
る。 無菌化過工程は、加熱処理がIg′Sの変性を生
じて無菌化に適用できないので、全体として本方
法において重要な工程である。無菌化過は保持
物からなおそれに存在しうる微生物（それらの大
部分はクリーム、カゼインおよびかすの分離の間
に既に除去されている）、を取り除く。無菌化
過器が閉鎖されるようになるのを防止するため
に、保持物の遠心分離および三重過による清澄
化が必要である。清澄化の後、保持物は貯蔵器中
に貯え、そして直列に配列した３個の過器（ザ
イツ・スプラ100、EK，EKS）上の予過
（prefiltration）段階からなる過ラインに通し、
引続いて直列に配列した（過熱水で直前に滅菌し
た）ザイツ・スプラ20濾過器およびミリポア
（Millipore）HA（0.45μ）過器上で無菌化過
する。無菌化保持物は500容滅菌貯蔵器中に貯
える。 以下の操作のすべては無菌条件下に行なう。以
下の蒸発工程への移行はたとえば滅菌し、圧縮し
そして過した窒素下になしうる。 蒸発工程は薄層蒸発機（１m2の表面を有する落
下膜を有する）中、75度Ｃの加熱温度で乾燥物含
量少なくとも20％まで行なわれ、生成物の温度は
約30度Ｃである。感染を避けるために、移行は蠕
動ポンプにより保持物貯蔵器から蒸発機を包含す
る輪（loop）に連結された濃縮物貯蔵器へなさ
れ、濃縮操作は閉鎖回路中で行なう。この操作は
Ig′Sの活性に影響しない。 濃縮物（96ｇ）はついで任意の適当な手段、た
とえば凍結と引続く凍結乾燥により乾燥する。凍
結は板上−40度Ｃで行ないうる。Ig′Sは−30度Ｃ
で約45日間活性の何らの損失なしに貯蔵しうる。
−30度Ｃにおける生成物は−50度Ｃの冷却器温度
で、チエンバー中の板上0.5トールで凍結乾燥さ
れ、そして30ないし35度Ｃの温度に加温される。
乾燥に使用される方法はIg′Sの活性に影響しな
い。かくして25ないし35％のIg′Sを含有する乾燥
生成物19.1Kgが得られ、滅菌条件下に包装され
る。 例 ３ 出産後の最初の８日間の乳および授乳の最後の
４週間に採取した乳を処理するために例２に記載
した方法を採用することにより、次の平均組成を
有する蛋白濃縮物が得られる： 蛋白質 75±５％ イムノグロブリン類 30±５％ α−ラクトグロブリン類 15±５％ β−ラクトグロブリン類 35±５％ 血清アルブミン類 ５±２％ 他の微量蛋白質 ５±２％ 残留水分 ４±0.5％ 乳 糖 10±２％ 無機塩類 ５±２％ 非蛋白性窒素含有物質 ５±２％ 例 ４ 方法は、クリームとカゼインを水で抽出して若
干の損失Ig′Sを回収することを除いては例２にお
ける如くであり、水は製造ラインに再循環させ
る。 −冷却脱脂（工程Ａ）は、クリームに随伴する
（entrained）Ig′Sを含有する蛋白質の画分を抽出
するための平行水抽出ラインで行なう。第１の遠
心分離操作から生ずるクリーム（115Kg）を、撹
拌機を付した1000容貯蔵器中に貯え、そして40
度Ｃの微温水150Kgと混合し、全体を30分間撹拌
し、そして脱脂機中で遠心分離する。クリーム
115Kgおよび溶液150Kgがこのようにして分離し、
溶液は脱脂しそして清澄化した乳と再組合せす
る。かくして熱脱脂（工程Ｂ）および凝固のため
の液体1130Kgが得られる。 −カゼインの分離は、脱脂し、レンネツト添加
しそして酸性化した乳1145Kgから、ホエイ991Kg
およびカゼイン154Kgを与える。凝乳から水で
Ig′Sを含有する蛋白質画分を抽出するために、平
行ラインを使用する。自己清浄化清澄機から出し
て、凝乳を撹拌機を付した貯蔵器中に貯え、そし
て40度Ｃの微温水300Kgと30分間撹拌し、そして
コロイドミルに移す。魔砕凝乳の懸濁液をついで
自己清浄清澄機中で分離する。洗滌したカゼイン
154Kgおよび洗滌液体300Kgを回収し、洗滌液体は
引続く操作のためにホエイと再組合せする。ホエ
イ1291Kgを過および限外過して透過物（，
および）2010Kgおよび予濃縮物216Kgを得る。
蒸発は濃縮物108Kgを与え、それはついで乾燥に
より乾燥生成物21.6Kgを与える。これは例２に記
載した方法に比し約14％のIg″Sの増加を示す。 例 ５ 例２または４に従い製造した粉末１Kg、あるい
は例３に従い製造した粉末２Kgを、乳粉末100Kg
と均質に混合し、それをついで無菌条件下に包装
して、例２または４に従い製造したIg−濃縮物
250mg／Kg／日、あるいは例３に従い製造したIg
−濃縮物500mg／Kg／日に相当する140cal／Kg／
日の等熱量飼料のためのIg″Sの予防量を含有する
生成物を得る。 例 ６ −乳性Ig′Sが人間Ig″S中に通常見出される抗体
特異性を有すること、およびこの特異性が製造工
程中維持されること、 −特異性の乳性Ig′Sが腸病源性微生物の病源機
構の妨害による保護活性を示すこと、 を実証するために、各種のインビトロおよびイン
ビボ試験を、以後“Ig−濃縮物”として示す例２
または４に従う蛋白濃縮物で行なつた。 受動血球凝集 羊からの赤血球を特異エツシエルヒア・コリ血
清型の尿素抽出物で感作した。この抽出物はブロ
ードヘージ法〔ブロードヘージ（Brodhage H.，
（1961）、ジヤーナル、オブ、ザ、ハイジーン（J.
Hyg.）、1961、148、94〕によつて得られた。細
菌はルー（Roux）のびん中、栄養寒天（デフコ）
上、37度Ｃで30時間培養した。培養物をホスフエ
ートでPH7.2に緩衝化した塩溶液10ml（8.8ｇNaCl
＋1.86ｇNa2HPO4・2H2O＋0.43ｇKH2PO4／
1000mlH2O）で採取した。尿素（メルク）10ｇ
の添加に続いて、懸濁液を37度Ｃで90時間ゆつく
り撹拌した。遠心分離の後、上澄層をホスフエー
トでPH7.2に緩衝化した塩溶液に対し完全に透析
し、ホスフエートでPH7.2に緩衝化した塩溶液で
最終容量50mlに希釈し、そして小量ずつ−20度Ｃ
で凍結した。羊赤血球を、アブラミアス等の方法
〔アブラミアス（Avrameas S.）、タウドウ
（Taudou B.）、チユイロン（Chuilon S.）イム
ノケミストリー（Immunochemistry）、1969、
６、67〕およびオツトー等の方法〔オツトー
（Otto H.）、タカミヤ（Takamiya H.）、ボーグ
ト（Vogt A.）、ジヤーナル、オブ、ジ、イムノ
ロジカル、メソーズ（J.Immunol.Methods）、
1973、３、137〕の方法の組合せにより、この抗
原で感作した。羊の赤血球をグルタールアルデヒ
ドで予備処理し（最終濃度、羊の赤血球５％およ
びグルタールアルデヒド0.5％）、洗滌し、ホスフ
エートでPH7.2に緩衝化した塩溶液に懸濁して20
％懸濁液を形成させ、ついで同容量の尿素抽出物
と混合した。緩和に撹拌しつつ20度Ｃで16時間イ
ンキユベートした後、感作された羊赤血球を数回
洗滌し、そして直接使用のために１％の水準に懸
濁した。10％懸濁液の形で羊赤血球は４度Ｃで数
週間貯蔵しうる。 過の前に、試験すべき各検体は、グルタール
アルデヒドで予備処理した羊赤血球に吸収させな
ければならない（Ig−濃縮物１mlにつき沈降した
羊赤血球0.1ml、37度Ｃ、60分間）。 滴定はＶ−型凹みを形成したポリスチレン板を
使用し、マイクロタイター系下に行なつた〔セー
バー（Sever J.L.）、J.Immunol.，1962、88、
320、およびコンラース（Conrath T.B.）、ハン
ドブツク、オブ、マイクロタイター、プロセデユ
アズ（Handbook of Microtiter Procedures）、
1972）。１／200に希釈した正常家兎血清中の１系
列の50μ希釈を調製し、そして１％感作羊赤血
球の25μを各希釈に加えた。他の系列を非特異
凝集対照として非感作羊赤血球で調製した。結果
を２時間後に読み取り、血球疑集力価は明らかな
陽性反応を導く最終希釈により得た。 ５種のエツシエリヒア・コリ血清型につき得ら
れた結果を次表に示す：エツシエリヒア・コリ血清型 凝集力価 Ｏ 55 １／256 Ｏ 111 １／64 Ｏ 119 １／128 Ｏ 127 １／128 Ｏ 128 １／64 対 照 − インビトロにおける静菌活性 Ig−濃縮物を培地に加えることにより各種エツ
シエリヒア・コリ血清型の生育に対する静菌活性
を試験した。最少量の検体が試験に使用され、そ
して同時に最大数の検体が試験されることを可能
とするために、培養に適合したマイクロタイター
系を使用した。 各培養物はグルコース１％を含有する最小媒質
または富化培地のいずれか中の最終容量0.25mlを
有した。試験するインキユベーシヨン時間の各値
につき、容量の変化に帰因する誤差の危険を減少
させるために２検体を取つた。結果は栄養寒天の
板上10μ部分の二重計数により評価した。細菌
接種物は２×103細菌／mlを含有する最小媒質中
の16時間培養物の希釈物からなる。インキユベー
シヨンは湿つた雰囲気中37度Ｃの温度で行なつ
た。最終濃度1μg／ml、10μg／ml、100μg／mlお
よび１mg／mlにおけるIg−濃縮物を２×103エツ
シエリヒア・コリ／mlの接種に先立ち培地に加え
た。Ig−濃縮物の10μg／ml濃度で、エツシエリ
ヒア・コリO111：B4の明瞭な阻害がインキユベ
ーシヨンの最初の４時間に観察された。培地それ
自体により形成された対照との比較により、より
大きな生育が非免疫雌牛から得られた正常乳清１
mg／mlの存在において観察された。 マウスにおけるエツシエリヒア・コリの清掃率
（Clearance） マウス８匹（体重20ないし24ｇの雄スイス白マ
ウス）を各試験に使用し、２匹は対照とし、そし
て６匹は３つの試験を２回行なつた。すべてのマ
ウスはヘパリン（500UI／ml）0.1mlを皮下注射し
た。エツシエリヒア・コリO111：B4の16時間培
養物を滅菌塩溶液で１：10の比率に、ついで対照
については１：10の比率に希釈し、そしてIg−濃
縮物の３種の選択した濃度を含有する胎児性雌牛
血清（デフコ）の添加により１：100の比率に希
釈した。得られた溶液0.2mlを尾静脉に静脉内注
射し、各マウス（マウス２匹は対照、そして２×
３は試験用）は約２×106細菌を受け取り、そし
てもとの細菌懸濁液は109細菌／mlを含有した。
注射直後（to時間）、そして20，40および60分後
に、血液50μを、眼静脉叢から、検定したヘパ
リンがけ毛細管（calibrated heparin−lined
capillary tubes）の挿入によつて取り、そして
検体を直ちに滅菌塩溶液５mlに移し（血液希釈
10-2）、それをついで塩溶液中10-3および10-4に
希釈した。計数は、寒天板（デフコ）上、各希釈
１mlで行ない、そして食菌インデツクスＫは、ビ
オツチ等〔ビオツチ（Biozzi G.）、スチツフル
（Stiffel G.）、ハルペルン（Halpern B.M.）、ル
ミノール（Le Minorl.）モートン（Mauton
D.）、J.Immunol.，1961、87、296）に従つて決
定した： Ｋ＝logC1−logC2／T2−T1 C1およびC2はT1およびT2時間における計数に
相当する。 この様にして、胎児性雌牛血清の存在において
網膜内皮系中の脱離により細菌数の正常な減少が
観察され、他方注射溶液へのIg−濃縮物10μgの
添加は、20分間に血流からの細菌の99.6％の消失
を生じた。 結果を次表に示す： 【表】 オプソニン作用過程の特異性を決定するため
に、エツシエリヒア・コリのO111：B4血清型で
のIg−濃縮物の徹底的吸収により試験を行ない、
そしてこの吸収は食菌作用の増加における活性の
実際上全部をIg−濃縮物の１mgの量においてさえ
も破壊することを示した。 次表は20分後に得られた食菌作用インデツクス
Ｋを示す： 【表】 マウスにおける保護試験 109細菌／mlを含有する栄養培地（デフコ）中
のエツシエリヒア・コリO111：B4の培養物の対
数希釈（log10）調製して５％ムチン（細菌の発
病力を強化するための顆粒状ムチン、1701−Ｗ
型、ウイルソン・ラボラトリーズ（Wilson
Laboratories）、シカゴ市、イリノイ州の製品）
中の10-4，10-5，10-6および10-7希釈を得た。 各希釈物３mlをついで試験される溶液0.6ml、
即ち、それぞれ塩溶液、Ig−濃縮物および正常ホ
エイ蛋白質（非免疫雌牛）と混合した。各希釈に
つきマウス５匹を使用し、得られた混合物0.6ml
を各マウスに腹腔内注射した。処理されたマウス
５匹のうち48時間後の死亡マウスの数の評価の結
果を次表に示す。 【表】 μ
＊ 乳性Ig′S35ないし45％を含有する総蛋白
質として計算。
Ig−濃縮物100μgは試験したすべての細菌濃度
につき完全な保護を生じ、他方非免疫雌牛の乳か
ら単離したホエイ蛋白質100μgは保護を生じなか
つた。 例 ７ 第１の系列の臨床試験は乳性Ig′Sが腸管内に
おいて不活性断片への蛋白分解性破壊に抵抗す
ることを示した。 各種の理由によつて入院しているが胃腸炎にか
かつていない２週ないし１年の幼児11名（男９
名、女２名）を、例２または４に従い製造したIg
−濃縮物を含有する乳で、24時間に等しく分配さ
れる２ｇ／Kg体重に相当する等熱量用量において
養つた。Ig−濃縮物を合体させた最初および最後
の食餌はカーミン赤（Carmine red）0.2ｇで標
識した。少なくとも１回の糞便をＩ−濃縮物の投
与前に採取し、そして引続く糞便を72時間にわた
り組織的に採取し、糞便は−20度Ｃで貯蔵した。
ホスフエートでPH7.2に緩衝化した塩溶液１部に
対し、糞便２部を添加し、その後糞便を０度Ｃに
おいてガラス棒で分散させることによつて、糞便
の抽出物を調製した。懸濁物をついでミニ−スタ
ーラー（mini−stirrer）を使用して室温で20分
間撹拌（400rpm）した。懸濁物をついで０度Ｃ
に急速に冷却し、そしてその温度で15分間遠心分
離（3500G）した。ついで上澄層を注意深く取つ
た。 糞便抽出物中の活性Ig′Sの存在は二重免疫拡散
（オクタロニー試験）および免疫電気泳動により
確認した。この試験に使用した抗血清は、乳性抗
体１mgまたはG1Ig 0.1mgを家兎に繰返し皮下注射
および静脉内注射することによつて調製した。オ
クタロニー試験のためには、9.5mmの間隔でへだ
てた４mmの凹みをパンチ〔LKB−Producteur
AB〕により形成したガラス板（94×84mm）を、
ホスフエートでPH7.2に緩衝化した塩溶液中の１
％寒天ゲルの層で被覆し、牛の初乳乳清の抗蛋白
抗血清および牛乳の１価の特異性抗−G1Ig抗血
清を使用した。 免疫電気泳動のためには、ガラス板（100×85
mm）を、PH8.3に緩衝化した0.05Mバルビチユレ
ート（水１当り、バルビツール酸ナトリウム
10.3ｇ＋クエン酸0.5ｇ＋シユウ酸0.5ｇ）中の１
％寒天ゲル12mlで被覆し、そして電気泳動による
分離は、室温、４ボルト／cmで90分間行なつた。
抗血清の拡散（24時間）の後、板を塩溶液で洗滌
し、乾燥し、そしてアゾカルミンＢ（azocarmine
Ｂ）で発色させた。 乳性Ig′Sは、それらの出現の時期およびIg−分
泌の期間のかなりの変化にもかかわらず、糞便中
に存在することが認められた。また、カルミン赤
標識およびIg′Sの出現と消失の間には、よい対応
性があつた。 それら乳性Ig′Sの活性を確認するために、イン
ビボン血清保護試験を、マウスで（例６に記載し
た如く）、各系列につき６糞便抽出物を使用して
行ない、結果を次表に示す： 【表】 免疫電気泳動の陽性結果と糞便抽出物中に含ま
れる物質の保護能力の間に明らかな相関が認めら
れる。特に、抽出物（幼児M.D.）そしてお
よび（幼児S.G.）中の乳性Ig′Sの濃度はIg−濃
縮物少なくとも１mgに相当すると評価される。 第２の系列の臨床試験は、例２または４に従
つて製造したIg−濃縮物の治療および予防性質
を決定するために行なつた。 治療性質 この試験は、エツシエリヒア・コリによつて生
ずるベニン（benine）ないし急性の胃腸炎にかか
つている５ケ月令までの幼児で行なつた。各系列
の試験において、総数152名の患者にそれらの食
餌を経てIg−濃縮物２ｇ／Kg／日５日間または１
ｇ／Kg／日10日間を与えた。患者には、医薬たと
えばスルホンアミドまたは抗生物質は、経口的ま
たは経皮的のいずれでも、何も与えなかつた。糞
便培養物を各投与の翌日に調製し、最後はIg−濃
縮物の最終投与の36ないし48時間であつた。43名
の患者を、同様にであるがIg−濃縮物の代りに、
非免疫雌牛のホエイ蛋白質で処置した。 陰性の糞便培養物が、処置期間中90名の幼児
（57.7％）で得られた。対照の系列においては、
14名の幼児（27.7％）のみが、糞便培養物中にお
けるエツシエリヒア・コリの自然消失を示した。
非免疫雌牛からの乳清の天然蛋白質は、小量の抗
エツシエリヒア・コリIgを含有するという事実を
斟酌しなければならない。最高用量をより短期間
投与した場合においては、治療はよりしばしば不
成功であることがまた認められた。 糞便のかたさを各例において試験した。試験
は、多数の例において下痢の消失および著しい臨
床的改善を、糞便が陽性を保つている場合におい
てさえも示した。糞便培養物が陰性の場合には、
糞便のかたさは、Ig−濃縮物を低乳糖含量の乳調
合物中において投与するとき、より急速に改善さ
れた。 予防性質 早産児はエツシユリヒア・コリによる胃腸炎に
関する限り極端に感受性の高い群である。臨床的
予防試験に選択したのはこの群であつた。 各試験は、各室に８つのインキユベーターを有
する２室で６ケ月間行なつた。各室における試験
および対照は、すべての患者が同じ条件下にさら
されるように分配し、４つのインキユベーターを
試験にそして４つを対照目的に使用した。各患者
は平均41日間留まり、幼児はその群（試験または
対照）にかかわらず、回復後に移動し、そして他
の者と交代した。70例を追跡し、36例は対照と
し、そして34例を試験群とした。 試験群は、0.25ｇ／Kg／日の量で24時間に分配
する各食事においてIg−濃縮物を与えた。糞便培
養物を試験の開始から、調製し、そして各５日間
試験した。総数666の糞便培養物のうち、339は対
照群に属し、そして327は試験群に属した。後者
のうち33例（10.1％）はエツシエリヒア・コリの
存在を示し、他方339の対照培養物のうち96例
（28.3％）が陽性であつた。胃腸炎の急性形とし
ばしば関係する血清型エツシエリヒ・コリ
O119：B14をそれ自体試験したとき、陽性糞便
培養物の頻度は、対照群で23.3％であるのに対し
試験群で5.5％であつた。 早産児の乳への特異抗エツシエリヒア・コリ乳
性Ig′Sを含有する蛋白濃縮物の合体は、新生児の
この特に感受性の群におけるエツシエリヒア・コ
リによる感染の程度を著しく減少させると結論し
うる。
ノグロブリン類（active immunoglobulins）を
含有する蛋白濃縮物の製造法に関する。 免疫学的因子を新生児および乳児の乳中に合体
させることによつて、乳起源の免疫学的因子を新
生児および乳児のための栄養生成物中に導入する
ことが既に提案されており、それら生成物の経口
注入はそれら因子が乳児の血液に移行するのを可
能とすることを意図しているが、そのために採用
される方法および該全身性受動免疫の結果の何ら
の指示もなされていない。 ワクチン接種雌牛の乳を凝固させ、ホエイ
（lactoserum）を回収し、そしてラクトグロブリ
ン類（lactoglobulins）を硫酸アンモニウムで選
択的に沈澱させ、ついで純水に対し透析し、過
しそして乾燥することによつて免疫ラクトグロブ
リン類を単離することがまた提案されている。そ
れらの作業と関連してマウスにおける血清保護試
験は、それら免疫本体の経皮注射がある種の腸病
源性の細菌およびビールスに対し、動物にそれら
微生物を同じ経路で注射したとき、全身性受動保
護を生じることを示した。 本発明者等は、イムノグロブリン類が操作工程
中に変性することなしに、イムノグロブリン類を
含有する蛋白濃縮物を商業的規模で製造する方法
を今や見出した。この生成物は、腸の段階で、再
吸収なしにそして消化管内における活性の有意の
損失なしに局所受動免疫を提供する。 本発明に従う方法は次の工程からなる： −高度免疫乳産生雌の乳を採取し、 −クリームおよび夾雑物を分離し、清澄化しそし
て脱脂した乳を凝固させ、カゼインを分離し、
過し、限外過し、そして過によりホエイの蛋
白質を無菌化し、イムノグロブリン類を変性せず
そして無菌性を維持する条件下に生成物を蒸発し
そして乾燥する。 添付の図面は本方法の各種工程の図解説明であ
る。 乳所有雌は牛科（bovidae）、特に雌牛である。 処理される乳は多かれ少なかれ抗体に豊んだ各
種の形のものでありうる。初乳（colostrnm）、
遷移乳（transition milk）（出産後８日目からの
乳）または授乳末期乳（end−of−lactation
milk）（授乳の最後の２ケ月）。 高い抗体水準を最長の可能期間中得るためにそ
れら乳の混合物を処理するのが好ましい。 雌牛を組合せワクチン接種、たとえば乳腺中へ
の槽内点滴（intracisternal instillation）、経皮
注射（皮下、静脉内）、乳腺後節系中への注射、
乱切法（scarification）、経口摂取、あるいはそ
れら様式のいくつかの組合せにより高度免疫化す
る。 使用する乳の各型において満足な抗体水準を得
るために注意深く作成した免疫計画でそれら様式
の組合せを使用するのが好ましい。従つて、初乳
および遷移乳の場合には、ワクチン接種は出産前
８−２週間に経皮または槽内経路により、そして
出産に引続く週は経口経路による。 授乳末期乳の場合には、経皮、局所および経口
ワクチン接種が授乳の予測される終了の前2.5ケ
月間交互に適用される。 使用するワクチンは選択された抗原および免疫
雌牛の同種血清に基づくアジユバントの混合物が
よく、かくしてワクチンの無毒化および免疫複合
体の形成が提供される。 雌牛が給源動物として使用されるので、蛋白濃
縮物中に含有されるイムノグロブリン類（Ig′s）
は主にGIg′s（特にG1Ig′s）であるが、AIg′sが主
たるIg′sである母乳は別である。 蛋白質が70ないし80重量％を示す蛋白濃縮物中
のIg−含量は25ないし35重量％である。ある種の
利点は、本方法の実際の適用において、Ig′Sがホ
エイの他の蛋白質から分離されず、従つてそれは
また得られる濃縮物中に存在するということであ
る。即ち、たとえば硫酸アンモニウムでの選択さ
れた沈澱および透析の操作はもはや必要ではな
い。 加えて、ホエイ中に存在するある種の静菌また
は抗ビールス因子、たとえばラクトフエリン、ま
たは酵素系たとえばラクトパーオキシダーゼおよ
びリボヌクレアーセがまた、蛋白濃縮物中に見出
される。 ビールスまたは細菌起源のすべての種類の抗原
を使用することができ、そして得られる抗体は雌
牛に注射する抗原の性質に依存する。たとえば、
経口投与に適当な任意の支持体中にIg′sを含有す
る蛋白濃縮物を合体させることにより、胃腸炎の
原因となり重篤な下痢および脱水を伴う腸病源性
の細菌およびビールスに対する保護を得ることが
できる。この支持体は任意の賦形剤により、ある
いは好ましくは、栄養生成物たとえば幼児のため
の乳または麦芽処理乳、“人間化（humanised）”
した、即ち乳児に適合させた乳、特定の群の新生
児に特に適合させた乳、たとえば早産児または低
い出生時体重を有する乳児のための乳等によつて
形成しうる。 たとえば、乳を支持体として抗−エツシエリヒ
ア・コリIg′Sを予防量において含有する濃縮物を
使用するのが望ましい場合には、0.8ないし３ｇ
の濃縮物を乾燥物100ｇ中に合体することができ、
６ｇの量までの濃縮物が治療量として充分であ
る。 本方法を遂行するためには、引続く過器およ
び限外過器の閉塞を避けるために、脱脂および
清澄化操作を極めて充分に行なうことが必要であ
る。 脱脂は好ましくは２段階で、先ず大部分の脂肪
および夾雑物（たとえば初乳中にしばしば存在す
る血液）を除去するために低温で、ついで脂肪お
よび夾雑物を完全に分離するために高温で行なわ
れる。凝固はカゼインの等電点PHで、レンネツト
の存在において、酸たとえばクエン酸の添加によ
り行ないうる。 凝固はPH値約4.6までの酸たとえば塩酸の添加
により、そして40度Ｃの温度に加熱することによ
り行なうのが好ましい。 カゼインの分離は微粒子（fines）の分離を可
能とするホエイの清澄化を伴なう。 他方、加熱処理を必要とする操作（蒸発および
乾燥）はIg′Sの不活性化を防止するように設定さ
れた条件下に行なうことが重要である。 その若干のものが脱脂操作中にクリームと共に
除去されまた他にカゼインの分離の間にカゼイン
と共に除去されるIg′Sの損失を低下させるため
に、クリームおよび凝乳（curd）を水で抽出し、
そしてそれらを回収するためにIg′Sを含有する洗
滌水を処理するのが推奨される。 本発明の方法を以下の実施例で説明するが、そ
の中で示す量および比率は特に指示しない限り、
重量によるものである。 例 １ 各種の種の雌牛を、以下の計画に従い、その製
法を以下に記載するワクチンを使用して高度免疫
化し、そして授乳の最後の２ケ月間および出産後
の最初の８日間の乳を採取した。 ワクチンの製造 以下の胃腸病源性エツシエリヒア・コリ血清型
を使用した： 018：K76（B20） 0111：K58（B4） 020：K17（Ｌ） 0112：K68（B11） 026：K60（B6） 0119：K69（B14） 044：K74（Ｌ） 0124：K72（B17） 055：K59（B5） 0125：K70（B15） 078：K80（−） 0126：K71（B16） 086：K61（B7） 0127：K63（B8） 0128：K68（B12） 各種菌株は入院幼児の胃腸炎患者から得た。血
清型決定は多価および１価の抗血清〔デフコ
（Difco）〕で行なつた。細菌はカゼインに由来す
るアミノ酸（デフコカザミノ酸）２％およびグル
コース２％を含有する最少量の液体媒質中で、び
んの振盪なしに＋37度Ｃで24時間培養した。微生
物を不活性化するために、培養物を遠心分離によ
り沈降細胞と上澄層とに分離した。細胞を再懸濁
し、そしてホルムアルデヒド0.5％の存在におい
て＋37度Ｃで24時間インキユベートし、他方上澄
液はホルムアルデヒド0.05％の存在において上記
の如く不活性化した。再遠心分離し、そして上澄
層を分離した後、細菌をもとの上澄層に再懸濁し
た。この方法は細菌性外毒素を含有する上澄層が
ワクチンとして維持されることを可能とする。１
−２×109細菌／mlを含有するワクチンが得られ、
ついでAl（OH）3の２％溶液および免疫化した雌
牛の同種の血液と混合することによつて希釈し
た。 免疫方法 Ａ 抗−エツシエリヒア・コリIg′Sを含有する初
乳および遷移乳を得るための免疫計画： 【表】 Ｂ 抗−エツシエリヒア・コリIg′Sを含有する授
乳末期乳（授乳の最後の２ケ月）を得るための
免疫計画 この免疫は初乳および遷移乳期間につき既に免
疫化した雌牛に対し専ら行なう。 【表】 【表】 例 ２ 例１に従いワクチン接種した雌牛から採取した
出産後最初の８日間の乳を次の如く処理した： −脱脂は２工程で行なう：低温における工程Ａ
および高温における工程Ｂ。 Ａ 冷却乳1100Kgを遠心脱脂機に入れ、そして
2500容バツフアータンクに導き、ついで血液
および夾雑物〔かす（dregs）〕を除去するため
に高速（約11000G）遠心清澄機中にポンプ注
入する。 Ｂ 冷却清澄化乳を2500容貯蔵器に貯え、そし
て40度Ｃのヒーターを経て先に使用した遠心脱
脂機にポンプ注入し、かくしてクリーム110Kg
を分離し、それを回収し、そしてかす５Kgを排
棄する。この方法の変法においては、低温およ
び高温脱脂操作のための自己清澄化脱脂機、お
よびそれら操作の間の清澄機の使用が可能であ
り、かくして脱脂時間が短縮する。 −温かい清澄化脱脂乳（985Kg）をついで、凝
固操作のための撹拌機を付した４個の方形750
容凝固タンクに分配する。 1N塩酸溶液を37度ＣにおいてPHが約4.6に安定
化するまで加え、その後撹拌しつつその温度を20
分間維持し、ついで約15度Ｃに冷却する。 −次の操作はカゼインの分離である。それは脱
脂し、凝乳に固めたどろどろした（slabbed）乳
の２度の連続遠心分離からなる。第１のものはカ
ゼイン150Kgを分離する自己清浄化清澄機により
凝乳化カゼインの大部分を分離し、ホエイはバツ
フアー貯蔵器に入る。第２の遠心分離操作は、た
とえば脱脂操作の工程Ａで使用した清澄機によ
り、引続く過および限外過を妨害しうる微量
の粒子を除去する。清澄化ホエイ854.7Kgが得ら
れ、そして2500容貯蔵器にポンプ注入する。 −ホエイはついで連続的に過および限外過
する。過は、カゼインの非常に微細な粒子を分
離することにより、限外過の困難性を避けるた
めに、極めて充分なものでなければならない。
過は20×20cmの板からなるザイツ・スプラ
（Seitz Supra）100過器で行なう。液は3000
容貯蔵器に貯え、ついで限外過器にポンプ注
入する。限外過は保持物（retentate）を貯蔵
器に再循環して２ないし３工程で行なう。直列に
配列した２個の遠心ポンプは、限外過器の供給
隔室（input compartment）の入口上の約７バ
ールの圧力に対し、圧力が約4.5バールに保たれ
ている取り出し端（output end）において放出
を行なう。ポンプに供給されるエネルギーにより
加熱されるのを防止するために、保持物は約10−
12度Ｃに冷却する。 第１の工程、即ち限外過プロパー（proper）
は、高分子量の溶質および保持物中に見出される
膜上に保持される蛋白質を分離し、他方乳糖、ビ
タミン類無機塩および水の部分は透過物
（permeate）中に除去される。800の膜を有する
DSSモジユール（module）（膜表面＝７m2）を使
用することにより、保持物／透過物比率は約１：
3.1であり、かくして透過物580Kgおよび保持物
274.7Kgが14.17Kg／m2ｈの透過物の平均取り出し
で得られる。 第２工程はダイア過（diafiltration）であ
り、その間に水825Kgが保持物に連続的に加えら
れ、そして溶液は第１工程におけると同じ条件下
に循環する。ダイア過は透過物の電導度が必要
な値に達したときに中止し、加えた水に対する保
持物の比率は約１：３である。かくして、透過物
825Kgおよび保持物274.7Kgが11.75Kg／m2ｈの
透過物の平均取り出しで分離する。第３工程は、
透過物82.5Kgの脱離により、保持物を乾燥物含
量約10％まで膜に再循環することによつて随意に
行なわれる濃縮工程である。かくして、192.2Kg
の予濃縮溶液（preconcentrated solution）が得
られる。変法においては、この第３工程は省か
れ、その代りに、無菌化過段階に直接進行す
る。 無菌化過工程は、加熱処理がIg′Sの変性を生
じて無菌化に適用できないので、全体として本方
法において重要な工程である。無菌化過は保持
物からなおそれに存在しうる微生物（それらの大
部分はクリーム、カゼインおよびかすの分離の間
に既に除去されている）、を取り除く。無菌化
過器が閉鎖されるようになるのを防止するため
に、保持物の遠心分離および三重過による清澄
化が必要である。清澄化の後、保持物は貯蔵器中
に貯え、そして直列に配列した３個の過器（ザ
イツ・スプラ100、EK，EKS）上の予過
（prefiltration）段階からなる過ラインに通し、
引続いて直列に配列した（過熱水で直前に滅菌し
た）ザイツ・スプラ20濾過器およびミリポア
（Millipore）HA（0.45μ）過器上で無菌化過
する。無菌化保持物は500容滅菌貯蔵器中に貯
える。 以下の操作のすべては無菌条件下に行なう。以
下の蒸発工程への移行はたとえば滅菌し、圧縮し
そして過した窒素下になしうる。 蒸発工程は薄層蒸発機（１m2の表面を有する落
下膜を有する）中、75度Ｃの加熱温度で乾燥物含
量少なくとも20％まで行なわれ、生成物の温度は
約30度Ｃである。感染を避けるために、移行は蠕
動ポンプにより保持物貯蔵器から蒸発機を包含す
る輪（loop）に連結された濃縮物貯蔵器へなさ
れ、濃縮操作は閉鎖回路中で行なう。この操作は
Ig′Sの活性に影響しない。 濃縮物（96ｇ）はついで任意の適当な手段、た
とえば凍結と引続く凍結乾燥により乾燥する。凍
結は板上−40度Ｃで行ないうる。Ig′Sは−30度Ｃ
で約45日間活性の何らの損失なしに貯蔵しうる。
−30度Ｃにおける生成物は−50度Ｃの冷却器温度
で、チエンバー中の板上0.5トールで凍結乾燥さ
れ、そして30ないし35度Ｃの温度に加温される。
乾燥に使用される方法はIg′Sの活性に影響しな
い。かくして25ないし35％のIg′Sを含有する乾燥
生成物19.1Kgが得られ、滅菌条件下に包装され
る。 例 ３ 出産後の最初の８日間の乳および授乳の最後の
４週間に採取した乳を処理するために例２に記載
した方法を採用することにより、次の平均組成を
有する蛋白濃縮物が得られる： 蛋白質 75±５％ イムノグロブリン類 30±５％ α−ラクトグロブリン類 15±５％ β−ラクトグロブリン類 35±５％ 血清アルブミン類 ５±２％ 他の微量蛋白質 ５±２％ 残留水分 ４±0.5％ 乳 糖 10±２％ 無機塩類 ５±２％ 非蛋白性窒素含有物質 ５±２％ 例 ４ 方法は、クリームとカゼインを水で抽出して若
干の損失Ig′Sを回収することを除いては例２にお
ける如くであり、水は製造ラインに再循環させ
る。 −冷却脱脂（工程Ａ）は、クリームに随伴する
（entrained）Ig′Sを含有する蛋白質の画分を抽出
するための平行水抽出ラインで行なう。第１の遠
心分離操作から生ずるクリーム（115Kg）を、撹
拌機を付した1000容貯蔵器中に貯え、そして40
度Ｃの微温水150Kgと混合し、全体を30分間撹拌
し、そして脱脂機中で遠心分離する。クリーム
115Kgおよび溶液150Kgがこのようにして分離し、
溶液は脱脂しそして清澄化した乳と再組合せす
る。かくして熱脱脂（工程Ｂ）および凝固のため
の液体1130Kgが得られる。 −カゼインの分離は、脱脂し、レンネツト添加
しそして酸性化した乳1145Kgから、ホエイ991Kg
およびカゼイン154Kgを与える。凝乳から水で
Ig′Sを含有する蛋白質画分を抽出するために、平
行ラインを使用する。自己清浄化清澄機から出し
て、凝乳を撹拌機を付した貯蔵器中に貯え、そし
て40度Ｃの微温水300Kgと30分間撹拌し、そして
コロイドミルに移す。魔砕凝乳の懸濁液をついで
自己清浄清澄機中で分離する。洗滌したカゼイン
154Kgおよび洗滌液体300Kgを回収し、洗滌液体は
引続く操作のためにホエイと再組合せする。ホエ
イ1291Kgを過および限外過して透過物（，
および）2010Kgおよび予濃縮物216Kgを得る。
蒸発は濃縮物108Kgを与え、それはついで乾燥に
より乾燥生成物21.6Kgを与える。これは例２に記
載した方法に比し約14％のIg″Sの増加を示す。 例 ５ 例２または４に従い製造した粉末１Kg、あるい
は例３に従い製造した粉末２Kgを、乳粉末100Kg
と均質に混合し、それをついで無菌条件下に包装
して、例２または４に従い製造したIg−濃縮物
250mg／Kg／日、あるいは例３に従い製造したIg
−濃縮物500mg／Kg／日に相当する140cal／Kg／
日の等熱量飼料のためのIg″Sの予防量を含有する
生成物を得る。 例 ６ −乳性Ig′Sが人間Ig″S中に通常見出される抗体
特異性を有すること、およびこの特異性が製造工
程中維持されること、 −特異性の乳性Ig′Sが腸病源性微生物の病源機
構の妨害による保護活性を示すこと、 を実証するために、各種のインビトロおよびイン
ビボ試験を、以後“Ig−濃縮物”として示す例２
または４に従う蛋白濃縮物で行なつた。 受動血球凝集 羊からの赤血球を特異エツシエルヒア・コリ血
清型の尿素抽出物で感作した。この抽出物はブロ
ードヘージ法〔ブロードヘージ（Brodhage H.，
（1961）、ジヤーナル、オブ、ザ、ハイジーン（J.
Hyg.）、1961、148、94〕によつて得られた。細
菌はルー（Roux）のびん中、栄養寒天（デフコ）
上、37度Ｃで30時間培養した。培養物をホスフエ
ートでPH7.2に緩衝化した塩溶液10ml（8.8ｇNaCl
＋1.86ｇNa2HPO4・2H2O＋0.43ｇKH2PO4／
1000mlH2O）で採取した。尿素（メルク）10ｇ
の添加に続いて、懸濁液を37度Ｃで90時間ゆつく
り撹拌した。遠心分離の後、上澄層をホスフエー
トでPH7.2に緩衝化した塩溶液に対し完全に透析
し、ホスフエートでPH7.2に緩衝化した塩溶液で
最終容量50mlに希釈し、そして小量ずつ−20度Ｃ
で凍結した。羊赤血球を、アブラミアス等の方法
〔アブラミアス（Avrameas S.）、タウドウ
（Taudou B.）、チユイロン（Chuilon S.）イム
ノケミストリー（Immunochemistry）、1969、
６、67〕およびオツトー等の方法〔オツトー
（Otto H.）、タカミヤ（Takamiya H.）、ボーグ
ト（Vogt A.）、ジヤーナル、オブ、ジ、イムノ
ロジカル、メソーズ（J.Immunol.Methods）、
1973、３、137〕の方法の組合せにより、この抗
原で感作した。羊の赤血球をグルタールアルデヒ
ドで予備処理し（最終濃度、羊の赤血球５％およ
びグルタールアルデヒド0.5％）、洗滌し、ホスフ
エートでPH7.2に緩衝化した塩溶液に懸濁して20
％懸濁液を形成させ、ついで同容量の尿素抽出物
と混合した。緩和に撹拌しつつ20度Ｃで16時間イ
ンキユベートした後、感作された羊赤血球を数回
洗滌し、そして直接使用のために１％の水準に懸
濁した。10％懸濁液の形で羊赤血球は４度Ｃで数
週間貯蔵しうる。 過の前に、試験すべき各検体は、グルタール
アルデヒドで予備処理した羊赤血球に吸収させな
ければならない（Ig−濃縮物１mlにつき沈降した
羊赤血球0.1ml、37度Ｃ、60分間）。 滴定はＶ−型凹みを形成したポリスチレン板を
使用し、マイクロタイター系下に行なつた〔セー
バー（Sever J.L.）、J.Immunol.，1962、88、
320、およびコンラース（Conrath T.B.）、ハン
ドブツク、オブ、マイクロタイター、プロセデユ
アズ（Handbook of Microtiter Procedures）、
1972）。１／200に希釈した正常家兎血清中の１系
列の50μ希釈を調製し、そして１％感作羊赤血
球の25μを各希釈に加えた。他の系列を非特異
凝集対照として非感作羊赤血球で調製した。結果
を２時間後に読み取り、血球疑集力価は明らかな
陽性反応を導く最終希釈により得た。 ５種のエツシエリヒア・コリ血清型につき得ら
れた結果を次表に示す：エツシエリヒア・コリ血清型 凝集力価 Ｏ 55 １／256 Ｏ 111 １／64 Ｏ 119 １／128 Ｏ 127 １／128 Ｏ 128 １／64 対 照 − インビトロにおける静菌活性 Ig−濃縮物を培地に加えることにより各種エツ
シエリヒア・コリ血清型の生育に対する静菌活性
を試験した。最少量の検体が試験に使用され、そ
して同時に最大数の検体が試験されることを可能
とするために、培養に適合したマイクロタイター
系を使用した。 各培養物はグルコース１％を含有する最小媒質
または富化培地のいずれか中の最終容量0.25mlを
有した。試験するインキユベーシヨン時間の各値
につき、容量の変化に帰因する誤差の危険を減少
させるために２検体を取つた。結果は栄養寒天の
板上10μ部分の二重計数により評価した。細菌
接種物は２×103細菌／mlを含有する最小媒質中
の16時間培養物の希釈物からなる。インキユベー
シヨンは湿つた雰囲気中37度Ｃの温度で行なつ
た。最終濃度1μg／ml、10μg／ml、100μg／mlお
よび１mg／mlにおけるIg−濃縮物を２×103エツ
シエリヒア・コリ／mlの接種に先立ち培地に加え
た。Ig−濃縮物の10μg／ml濃度で、エツシエリ
ヒア・コリO111：B4の明瞭な阻害がインキユベ
ーシヨンの最初の４時間に観察された。培地それ
自体により形成された対照との比較により、より
大きな生育が非免疫雌牛から得られた正常乳清１
mg／mlの存在において観察された。 マウスにおけるエツシエリヒア・コリの清掃率
（Clearance） マウス８匹（体重20ないし24ｇの雄スイス白マ
ウス）を各試験に使用し、２匹は対照とし、そし
て６匹は３つの試験を２回行なつた。すべてのマ
ウスはヘパリン（500UI／ml）0.1mlを皮下注射し
た。エツシエリヒア・コリO111：B4の16時間培
養物を滅菌塩溶液で１：10の比率に、ついで対照
については１：10の比率に希釈し、そしてIg−濃
縮物の３種の選択した濃度を含有する胎児性雌牛
血清（デフコ）の添加により１：100の比率に希
釈した。得られた溶液0.2mlを尾静脉に静脉内注
射し、各マウス（マウス２匹は対照、そして２×
３は試験用）は約２×106細菌を受け取り、そし
てもとの細菌懸濁液は109細菌／mlを含有した。
注射直後（to時間）、そして20，40および60分後
に、血液50μを、眼静脉叢から、検定したヘパ
リンがけ毛細管（calibrated heparin−lined
capillary tubes）の挿入によつて取り、そして
検体を直ちに滅菌塩溶液５mlに移し（血液希釈
10-2）、それをついで塩溶液中10-3および10-4に
希釈した。計数は、寒天板（デフコ）上、各希釈
１mlで行ない、そして食菌インデツクスＫは、ビ
オツチ等〔ビオツチ（Biozzi G.）、スチツフル
（Stiffel G.）、ハルペルン（Halpern B.M.）、ル
ミノール（Le Minorl.）モートン（Mauton
D.）、J.Immunol.，1961、87、296）に従つて決
定した： Ｋ＝logC1−logC2／T2−T1 C1およびC2はT1およびT2時間における計数に
相当する。 この様にして、胎児性雌牛血清の存在において
網膜内皮系中の脱離により細菌数の正常な減少が
観察され、他方注射溶液へのIg−濃縮物10μgの
添加は、20分間に血流からの細菌の99.6％の消失
を生じた。 結果を次表に示す： 【表】 オプソニン作用過程の特異性を決定するため
に、エツシエリヒア・コリのO111：B4血清型で
のIg−濃縮物の徹底的吸収により試験を行ない、
そしてこの吸収は食菌作用の増加における活性の
実際上全部をIg−濃縮物の１mgの量においてさえ
も破壊することを示した。 次表は20分後に得られた食菌作用インデツクス
Ｋを示す： 【表】 マウスにおける保護試験 109細菌／mlを含有する栄養培地（デフコ）中
のエツシエリヒア・コリO111：B4の培養物の対
数希釈（log10）調製して５％ムチン（細菌の発
病力を強化するための顆粒状ムチン、1701−Ｗ
型、ウイルソン・ラボラトリーズ（Wilson
Laboratories）、シカゴ市、イリノイ州の製品）
中の10-4，10-5，10-6および10-7希釈を得た。 各希釈物３mlをついで試験される溶液0.6ml、
即ち、それぞれ塩溶液、Ig−濃縮物および正常ホ
エイ蛋白質（非免疫雌牛）と混合した。各希釈に
つきマウス５匹を使用し、得られた混合物0.6ml
を各マウスに腹腔内注射した。処理されたマウス
５匹のうち48時間後の死亡マウスの数の評価の結
果を次表に示す。 【表】 μ
＊ 乳性Ig′S35ないし45％を含有する総蛋白
質として計算。
Ig−濃縮物100μgは試験したすべての細菌濃度
につき完全な保護を生じ、他方非免疫雌牛の乳か
ら単離したホエイ蛋白質100μgは保護を生じなか
つた。 例 ７ 第１の系列の臨床試験は乳性Ig′Sが腸管内に
おいて不活性断片への蛋白分解性破壊に抵抗す
ることを示した。 各種の理由によつて入院しているが胃腸炎にか
かつていない２週ないし１年の幼児11名（男９
名、女２名）を、例２または４に従い製造したIg
−濃縮物を含有する乳で、24時間に等しく分配さ
れる２ｇ／Kg体重に相当する等熱量用量において
養つた。Ig−濃縮物を合体させた最初および最後
の食餌はカーミン赤（Carmine red）0.2ｇで標
識した。少なくとも１回の糞便をＩ−濃縮物の投
与前に採取し、そして引続く糞便を72時間にわた
り組織的に採取し、糞便は−20度Ｃで貯蔵した。
ホスフエートでPH7.2に緩衝化した塩溶液１部に
対し、糞便２部を添加し、その後糞便を０度Ｃに
おいてガラス棒で分散させることによつて、糞便
の抽出物を調製した。懸濁物をついでミニ−スタ
ーラー（mini−stirrer）を使用して室温で20分
間撹拌（400rpm）した。懸濁物をついで０度Ｃ
に急速に冷却し、そしてその温度で15分間遠心分
離（3500G）した。ついで上澄層を注意深く取つ
た。 糞便抽出物中の活性Ig′Sの存在は二重免疫拡散
（オクタロニー試験）および免疫電気泳動により
確認した。この試験に使用した抗血清は、乳性抗
体１mgまたはG1Ig 0.1mgを家兎に繰返し皮下注射
および静脉内注射することによつて調製した。オ
クタロニー試験のためには、9.5mmの間隔でへだ
てた４mmの凹みをパンチ〔LKB−Producteur
AB〕により形成したガラス板（94×84mm）を、
ホスフエートでPH7.2に緩衝化した塩溶液中の１
％寒天ゲルの層で被覆し、牛の初乳乳清の抗蛋白
抗血清および牛乳の１価の特異性抗−G1Ig抗血
清を使用した。 免疫電気泳動のためには、ガラス板（100×85
mm）を、PH8.3に緩衝化した0.05Mバルビチユレ
ート（水１当り、バルビツール酸ナトリウム
10.3ｇ＋クエン酸0.5ｇ＋シユウ酸0.5ｇ）中の１
％寒天ゲル12mlで被覆し、そして電気泳動による
分離は、室温、４ボルト／cmで90分間行なつた。
抗血清の拡散（24時間）の後、板を塩溶液で洗滌
し、乾燥し、そしてアゾカルミンＢ（azocarmine
Ｂ）で発色させた。 乳性Ig′Sは、それらの出現の時期およびIg−分
泌の期間のかなりの変化にもかかわらず、糞便中
に存在することが認められた。また、カルミン赤
標識およびIg′Sの出現と消失の間には、よい対応
性があつた。 それら乳性Ig′Sの活性を確認するために、イン
ビボン血清保護試験を、マウスで（例６に記載し
た如く）、各系列につき６糞便抽出物を使用して
行ない、結果を次表に示す： 【表】 免疫電気泳動の陽性結果と糞便抽出物中に含ま
れる物質の保護能力の間に明らかな相関が認めら
れる。特に、抽出物（幼児M.D.）そしてお
よび（幼児S.G.）中の乳性Ig′Sの濃度はIg−濃
縮物少なくとも１mgに相当すると評価される。 第２の系列の臨床試験は、例２または４に従
つて製造したIg−濃縮物の治療および予防性質
を決定するために行なつた。 治療性質 この試験は、エツシエリヒア・コリによつて生
ずるベニン（benine）ないし急性の胃腸炎にかか
つている５ケ月令までの幼児で行なつた。各系列
の試験において、総数152名の患者にそれらの食
餌を経てIg−濃縮物２ｇ／Kg／日５日間または１
ｇ／Kg／日10日間を与えた。患者には、医薬たと
えばスルホンアミドまたは抗生物質は、経口的ま
たは経皮的のいずれでも、何も与えなかつた。糞
便培養物を各投与の翌日に調製し、最後はIg−濃
縮物の最終投与の36ないし48時間であつた。43名
の患者を、同様にであるがIg−濃縮物の代りに、
非免疫雌牛のホエイ蛋白質で処置した。 陰性の糞便培養物が、処置期間中90名の幼児
（57.7％）で得られた。対照の系列においては、
14名の幼児（27.7％）のみが、糞便培養物中にお
けるエツシエリヒア・コリの自然消失を示した。
非免疫雌牛からの乳清の天然蛋白質は、小量の抗
エツシエリヒア・コリIgを含有するという事実を
斟酌しなければならない。最高用量をより短期間
投与した場合においては、治療はよりしばしば不
成功であることがまた認められた。 糞便のかたさを各例において試験した。試験
は、多数の例において下痢の消失および著しい臨
床的改善を、糞便が陽性を保つている場合におい
てさえも示した。糞便培養物が陰性の場合には、
糞便のかたさは、Ig−濃縮物を低乳糖含量の乳調
合物中において投与するとき、より急速に改善さ
れた。 予防性質 早産児はエツシユリヒア・コリによる胃腸炎に
関する限り極端に感受性の高い群である。臨床的
予防試験に選択したのはこの群であつた。 各試験は、各室に８つのインキユベーターを有
する２室で６ケ月間行なつた。各室における試験
および対照は、すべての患者が同じ条件下にさら
されるように分配し、４つのインキユベーターを
試験にそして４つを対照目的に使用した。各患者
は平均41日間留まり、幼児はその群（試験または
対照）にかかわらず、回復後に移動し、そして他
の者と交代した。70例を追跡し、36例は対照と
し、そして34例を試験群とした。 試験群は、0.25ｇ／Kg／日の量で24時間に分配
する各食事においてIg−濃縮物を与えた。糞便培
養物を試験の開始から、調製し、そして各５日間
試験した。総数666の糞便培養物のうち、339は対
照群に属し、そして327は試験群に属した。後者
のうち33例（10.1％）はエツシエリヒア・コリの
存在を示し、他方339の対照培養物のうち96例
（28.3％）が陽性であつた。胃腸炎の急性形とし
ばしば関係する血清型エツシエリヒ・コリ
O119：B14をそれ自体試験したとき、陽性糞便
培養物の頻度は、対照群で23.3％であるのに対し
試験群で5.5％であつた。 早産児の乳への特異抗エツシエリヒア・コリ乳
性Ig′Sを含有する蛋白濃縮物の合体は、新生児の
この特に感受性の群におけるエツシエリヒア・コ
リによる感染の程度を著しく減少させると結論し
うる。
図面は、本発明の蛋白濃縮物の製造法を説明す
るための線図である。
るための線図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 幼児の腸病原性E.Coliに対し有効な、未変性
で活性のIgGイムノグロブリンを含有する乳起原
のタン白濃縮物の製造方法において、 (a) 出産前約８週から２週に非経口的および局所
経路により、かつ出産前最後の約２週間経口投
与により抗原を一連の連続投与でウシをワクチ
ン接種し、そして終期の分泌については、推定
泌乳終期前約2.5ケ月に一連の連続抗原投与を
非経口、局所および経口と交互に開始しそして
出産後最初の８日目から、任意には泌乳最後の
２ケ月から乳を集め、 (b) 最初に低温で、次に高温の２工程で行なう脱
脂操作によりクリームと夾雑物を分離し、 (c) 清澄化しかつ脱脂した乳を凝固させ、 (d) カゼインを分離し、濾過し、限外濾過し、そ
してホエイタン白を濾過により無菌化し、予備
濃縮、無菌化ホエイを無菌条件下で蒸発し、イ
ムノグロブリンを変性させず、かつ無菌性を保
持する条件下で生成物を乾燥することを特徴と
する、上記製造方法。 ２ 工程(d)は：カゼインを分離し、濾過し、３工
程、すなわち限外濾過プロパー、透析濾過および
予備濃縮の工程で限外濾過し、濾過によりホエイ
タン白を無菌化し、無菌条件下の閉鎖回路で予備
濃縮、無菌化ホエイを蒸発し、次に蒸発ホエイを
凍結し、続いて凍結乾燥により乾燥し、次に無菌
条件下で生成物を包装する、特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ３ ワクチン接種したウシの同種血清とこのワク
チンを局所投与する前に混合する、特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ４ 幼児の胃腸炎に対し有効な、非変性活性IgG
イムノグロブリンを含有する乳起原のタン白濃縮
物の製造方法において、 (a) 出産前約８週から２週に非経口的および局所
経路により、かつ出産前最後の約２週間経口投
与により抗原を一連の連続投与でウシをワクチ
ン接種し、そして終期の分泌については、推定
泌乳終期前約2.5ケ月に一連の連続抗原投与を
非経口、局所および経口と交互に開始しそして
出産後最初の８日目から、任意には泌乳最後の
２ケ月から乳を集め、 (b) 最初に低温で、次に高温の２工程で行なう脱
脂操作によりクリームおよび夾雑物を分離し、 (c) 清澄化し、脱脂した乳を凝固させ、 (d) カゼインを分離し、濾過し、限外濾過し、そ
してホエイタン白を濾過により無菌化し、 (e) 脱脂操作およびカゼイン分離中失なわれるイ
ムノグロブリンはクリームおよびカゼインを水
でそれぞれ抽出することにより回収し、各洗液
と脱脂乳およびホエイを再組み合せし、次に (f) イムノグロブリンを変性させず、かつ無菌性
を保持する条件下で生成物を蒸発し、乾燥する
ことを特徴とする、上記製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPS6340771B2 true JPS6340771B2 (ja) | 1988-08-12 |
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ID=4280585
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4409378A Granted JPS53130411A (en) | 1977-04-15 | 1978-04-14 | Production of immunoglobulin containing protein concentrate |
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