JPS6342472A - 抗インスリン様成長因子２モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその使用法 - Google Patents
抗インスリン様成長因子２モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその使用法Info
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- JPS6342472A JPS6342472A JP61187197A JP18719786A JPS6342472A JP S6342472 A JPS6342472 A JP S6342472A JP 61187197 A JP61187197 A JP 61187197A JP 18719786 A JP18719786 A JP 18719786A JP S6342472 A JPS6342472 A JP S6342472A
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- insulin
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はインスリン様成長因子Ｕ （ｉｎｓｕｌｉｎ−
１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｌＩ、以下ＩＣ
Ｆ−ＩＩという）を特異的に認識するモノクローナル抗
体、その製造法およびその使用法に関する。
１ｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｌＩ、以下ＩＣ
Ｆ−ＩＩという）を特異的に認識するモノクローナル抗
体、その製造法およびその使用法に関する。
ＩＣＦ−ＩＩはソマトメジン類として知られるボリペプ
チド性の成長因子の一つである。ソマトメジン類は哺乳
ぜｊ物の細胞増殖因子としての働きを有し、成長ホルモ
ンによる個体の成長は成長ホルモンが直接骨や軟骨に作
用するのではな（、ソマトメジン類を介して作用してい
るものと考えられている。
チド性の成長因子の一つである。ソマトメジン類は哺乳
ぜｊ物の細胞増殖因子としての働きを有し、成長ホルモ
ンによる個体の成長は成長ホルモンが直接骨や軟骨に作
用するのではな（、ソマトメジン類を介して作用してい
るものと考えられている。
本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ［モノクローナル抗体はソマトメ
ジン類のうちＩＧＦ−ＩＩを特異的に認識するから、該
モノクローナル抗体を使用して生体体液、組織または細
胞培養液に含まれるＩＧＦ−１１の精製並びに測定に使
用することができる。
ジン類のうちＩＧＦ−ＩＩを特異的に認識するから、該
モノクローナル抗体を使用して生体体液、組織または細
胞培養液に含まれるＩＧＦ−１１の精製並びに測定に使
用することができる。
従来の技術
従来、ソマトメジン類としてはヒトの血漿から抽出され
たソマトメジン−Ａ （Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。
たソマトメジン−Ａ （Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。
Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、、 ６１，９５７ ９６２
、１９７４） 、ソマトメジン−Ｃ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、 １９，７９０−７９７ 、１９８０）、Ｉ
Ｇ Ｆ −１（Ｊ、 ｌ１ｉｏ１． Ｃｈｅｍ、、
２５３ 、２７６９−２７７６、１９７８）およびＩ
Ｇ Ｆ −Ｉ［（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、、 ８９．２８
１２８６ 、１９７８） 、並びにラット肝細胞の培養
液から分離された細胞増殖促進因子（ｍｕｌｔｉｐｌｉ
−ｃａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇａｃｔｉｖｉ
ｔｙ；Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｔ＋ｅｍ、。
、１９７４） 、ソマトメジン−Ｃ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、 １９，７９０−７９７ 、１９８０）、Ｉ
Ｇ Ｆ −１（Ｊ、 ｌ１ｉｏ１． Ｃｈｅｍ、、
２５３ 、２７６９−２７７６、１９７８）およびＩ
Ｇ Ｆ −Ｉ［（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、、 ８９．２８
１２８６ 、１９７８） 、並びにラット肝細胞の培養
液から分離された細胞増殖促進因子（ｍｕｌｔｉｐｌｉ
−ｃａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇａｃｔｉｖｉ
ｔｙ；Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｔ＋ｅｍ、。
」聾、 ６８５９−６８６５．１９８１）と称されるも
のが知られていた。近年の研究の進歩によりこれらソマ
トメジン類の理化学的並びに生物学的性質が次第に解明
されるに至り、現在ソマトメジン類はｒＧＦ−■ （ソ
マトメジンＡおよびＣが含まれる）およびＩＧＦ−ｎ
（ラット肝細胞培養由来の細胞増殖促進因子はヒ）ＩＧ
Ｆ−ＩＩと高度な相同性を示し最近は、ラットＩＧＦ−
１１とされている）の２種に大別されている。
のが知られていた。近年の研究の進歩によりこれらソマ
トメジン類の理化学的並びに生物学的性質が次第に解明
されるに至り、現在ソマトメジン類はｒＧＦ−■ （ソ
マトメジンＡおよびＣが含まれる）およびＩＧＦ−ｎ
（ラット肝細胞培養由来の細胞増殖促進因子はヒ）ＩＧ
Ｆ−ＩＩと高度な相同性を示し最近は、ラットＩＧＦ−
１１とされている）の２種に大別されている。
従来、ＩＧＦ−ＩＩに対する抗体としては、まず、ヒト
血漿由来のＩＣＦ−ＩＩまたはその合成フラグメントで
免疫したウサギの抗血清から得られた抗体（ポリクロー
ナル抗体）が知られている（Ｊ。
血漿由来のＩＣＦ−ＩＩまたはその合成フラグメントで
免疫したウサギの抗血清から得られた抗体（ポリクロー
ナル抗体）が知られている（Ｊ。
Ｃｌ１ｎ、 Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ、 Ｍｅｔａｂ、、
５４，４４２−４４６．１９８２およびＪ、 Ｃｌ１ｎ
、 Ｉｎｖｅｓｔ、、 ６８．１３２１−１３３０．１
９８１）。
５４，４４２−４４６．１９８２およびＪ、 Ｃｌ１ｎ
、 Ｉｎｖｅｓｔ、、 ６８．１３２１−１３３０．１
９８１）。
次ぎに、ＩＧＦ−ＩＩに対するモノクローナル抗体とし
ては、ＩＧＦ−ｎの特定のアミノ酸配列を認識するとさ
れた抗体が報告されているが、この抗体はその製法およ
び特異性等の性質が記載されていない（Ｅｘｐｅｒｉｅ
ｎｔｉａ、３９．６５０．１９８３）。
ては、ＩＧＦ−ｎの特定のアミノ酸配列を認識するとさ
れた抗体が報告されているが、この抗体はその製法およ
び特異性等の性質が記載されていない（Ｅｘｐｅｒｉｅ
ｎｔｉａ、３９．６５０．１９８３）。
発明が解決しようとする問題点
従来ＩＧＦ−ＩＩは主にヒトの血漿から抽出されてきた
が、この場合原料数トンかられずか数■のＩＧＦ−［Ｉ
Ｌか得られず、その精製操作は繁雑さを窮めていた。ま
た、ＩＣＦ−１１はその生体体液または組織中の濃度と
疾病との関係がＩＩ論されながらＩＧＦ−４を微量定量
する方法がなく、その確立が待たれていた。
が、この場合原料数トンかられずか数■のＩＧＦ−［Ｉ
Ｌか得られず、その精製操作は繁雑さを窮めていた。ま
た、ＩＣＦ−１１はその生体体液または組織中の濃度と
疾病との関係がＩＩ論されながらＩＧＦ−４を微量定量
する方法がなく、その確立が待たれていた。
上記したＩＧＦ−１１の精製または測定の改良のため前
掲のポリクローナル抗体を使用することが考えられるが
、この場合は次のような不利を免れない。即ち、ポリク
ローナル抗体は、一般に、異なる抗原決定基に対して反
応する性質の異なる特異抗体の混合物であり、目的とす
る抗原物質と類似したｆ（々の物質を認識するとされて
いる。さらにポリクローナル抗体の場合は、それが含ま
れる抗血清を一定の品質で得ることが難しく、従ってそ
れから精製して得た抗体も一定ではないのである。
掲のポリクローナル抗体を使用することが考えられるが
、この場合は次のような不利を免れない。即ち、ポリク
ローナル抗体は、一般に、異なる抗原決定基に対して反
応する性質の異なる特異抗体の混合物であり、目的とす
る抗原物質と類似したｆ（々の物質を認識するとされて
いる。さらにポリクローナル抗体の場合は、それが含ま
れる抗血清を一定の品質で得ることが難しく、従ってそ
れから精製して得た抗体も一定ではないのである。
本発明はかかる問題点の解決に有用なＩＧＦ−ＩＩを特
異的に認識するモノクローナル抗体、その製造法および
該抗体を使用したＩＧＦ−ｎの精製法並びにその測定法
を提供するものである。
異的に認識するモノクローナル抗体、その製造法および
該抗体を使用したＩＧＦ−ｎの精製法並びにその測定法
を提供するものである。
問題点を解決するための手段
本発明者らはある種のラット上皮細胞がソマトメジン様
の物質を分泌することを見い出した。このソマトメジン
様の物質を精製単離して、その分子量、等重点、阻害剤
に対する感受性、アミノ酸の一次配列等の理化学的性質
、並びに培養ウサギ肋軟骨細胞のプロテオグリカンの合
成促進作用および培養ヒト線維芽細胞と培養ウサギ肋軟
骨細胞のＤＮＡ合成促進作用の生物学的性質を分析した
ところ、この物質はラットＩＧＦ−ＩＩと同一であるこ
とが確認された。
の物質を分泌することを見い出した。このソマトメジン
様の物質を精製単離して、その分子量、等重点、阻害剤
に対する感受性、アミノ酸の一次配列等の理化学的性質
、並びに培養ウサギ肋軟骨細胞のプロテオグリカンの合
成促進作用および培養ヒト線維芽細胞と培養ウサギ肋軟
骨細胞のＤＮＡ合成促進作用の生物学的性質を分析した
ところ、この物質はラットＩＧＦ−ＩＩと同一であるこ
とが確認された。
本発明によれば、抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体は
、ＩＣＦ−１１で哺乳動物を免疫して抗体産生細胞を得
、この抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合せしめ、得
られたハイブリドーマをクローニングして抗ＩＣＦ−Ｉ
Ｉモノクローナル抗体を産生するクローンを選択し、こ
のクローンを増殖せしめることによりＩＣＦ−ＩＩを特
異的に認識する抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体を製
造することができる。
、ＩＣＦ−１１で哺乳動物を免疫して抗体産生細胞を得
、この抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合せしめ、得
られたハイブリドーマをクローニングして抗ＩＣＦ−Ｉ
Ｉモノクローナル抗体を産生するクローンを選択し、こ
のクローンを増殖せしめることによりＩＣＦ−ＩＩを特
異的に認識する抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体を製
造することができる。
抗原として用いるラットＩＧＦ−ＩＩを分離するには、
ラット上皮細胞の培養上清から公知の手段、即ち塩析、
限外ろ過、透析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、高速液体クロマトグラフィー、等電点分画などの
手段が用いられる。但し、哺乳動物を免疫するための抗
原として使用されるＩＧＦ−ｎは純粋である必要はなく
、粗製のＩＣＦ−ＩＩで十分である。
ラット上皮細胞の培養上清から公知の手段、即ち塩析、
限外ろ過、透析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、高速液体クロマトグラフィー、等電点分画などの
手段が用いられる。但し、哺乳動物を免疫するための抗
原として使用されるＩＧＦ−ｎは純粋である必要はなく
、粗製のＩＣＦ−ＩＩで十分である。
本発明において、ハイブリドーマの調製手段は、自体公
知の方法に準じて行うことができる（例えば、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２５６．４９５ ４９７ 、１９７５） 、免
疫方法は、＋ＧＦ−ＩＩと卵白アルブミンとのコンジュ
ゲートをマウス、ラットなどの哺乳動物の腹腔内または
皮下に投与して行われる。投与スケジュールは、初回免
疫後、２〜３週間後に追加免疫を行い、以後１〜２週間
毎に３〜１５回追加免疫を行い、総計０．１〜３曙の抗
原を投与する。最終免疫を腹腔内または静ｌ主投与した
（友、３日日に肺臓を摘出する。
知の方法に準じて行うことができる（例えば、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２５６．４９５ ４９７ 、１９７５） 、免
疫方法は、＋ＧＦ−ＩＩと卵白アルブミンとのコンジュ
ゲートをマウス、ラットなどの哺乳動物の腹腔内または
皮下に投与して行われる。投与スケジュールは、初回免
疫後、２〜３週間後に追加免疫を行い、以後１〜２週間
毎に３〜１５回追加免疫を行い、総計０．１〜３曙の抗
原を投与する。最終免疫を腹腔内または静ｌ主投与した
（友、３日日に肺臓を摘出する。
この肺臓中の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合せし
めてハイブリドーマを形成する。ミエローマ細胞として
は、公知のマウスのＰ３−ＮＳ−１／ １−八ｅ、４−
１ 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
１１など、ラットの２１０．ＲＣＹ、Ａｇ１．２．３な
どの細胞が用いられる。
めてハイブリドーマを形成する。ミエローマ細胞として
は、公知のマウスのＰ３−ＮＳ−１／ １−八ｅ、４−
１ 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
１１など、ラットの２１０．ＲＣＹ、Ａｇ１．２．３な
どの細胞が用いられる。
融合反応は、上記肺臓細胞とミエローマ細胞を融合促進
剤を含む培地中でインキュベートすることによって行わ
れる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール、
センダイウィルスなどが用いられる。融合反応における
牌ｒｆ＆細胞とミエローマｊ、ｌＩＩ胞の比は１：１〜
１０：１である。培地としては、ミエローマ細胞の増殖
に通常用いられるＭＥＭ培地、ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４
０培地などが用いられる。
剤を含む培地中でインキュベートすることによって行わ
れる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール、
センダイウィルスなどが用いられる。融合反応における
牌ｒｆ＆細胞とミエローマｊ、ｌＩＩ胞の比は１：１〜
１０：１である。培地としては、ミエローマ細胞の増殖
に通常用いられるＭＥＭ培地、ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４
０培地などが用いられる。
生成したハイブリドーマの選択は次のように行われる。
叩ち、前記のミエローマ細胞はヒボキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株であり、また
正常肺臓細胞は増殖能がなく死滅するから、ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（
ＨＡＴ培地）に生育できる細胞を選択するとによってハ
イブリドーマが得られる。
ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株であり、また
正常肺臓細胞は増殖能がなく死滅するから、ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（
ＨＡＴ培地）に生育できる細胞を選択するとによってハ
イブリドーマが得られる。
目的の抗ｒＧＦ−■モノクローナル抗体を産生ずる能力
を有するハイブリドーマの選択は、免疫沈澱法またはラ
ジオリセプターアツセイ法（ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌ、８０．１４ ３１．１９７５）によりハイブリド
ーマの培養上清の抗体の有無を分析することによって行
われる。とくに免疫沈澱法が簡便で好ましい。即ち、ハ
イブリドーマの培養上清と放射能ラベルしたラットＩＣ
Ｆ−ｎをインキュベートし、生成した抗原−抗体複合体
をポリエチレングリコールで沈澱させ、この沈澱の放射
能の強度を測定することによって抗体産生性ハイブリド
ーマが選択される。かくして得られたハイブリドーマは
、限界希釈法によりクローニングし、目的のモノクロー
ナル抗体産生性クローンを得ることができる。
を有するハイブリドーマの選択は、免疫沈澱法またはラ
ジオリセプターアツセイ法（ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌ、８０．１４ ３１．１９７５）によりハイブリド
ーマの培養上清の抗体の有無を分析することによって行
われる。とくに免疫沈澱法が簡便で好ましい。即ち、ハ
イブリドーマの培養上清と放射能ラベルしたラットＩＣ
Ｆ−ｎをインキュベートし、生成した抗原−抗体複合体
をポリエチレングリコールで沈澱させ、この沈澱の放射
能の強度を測定することによって抗体産生性ハイブリド
ーマが選択される。かくして得られたハイブリドーマは
、限界希釈法によりクローニングし、目的のモノクロー
ナル抗体産生性クローンを得ることができる。
このようにして得られたクローンは半永久的に継代培養
が可能であり、その間抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体
を産生じ続けることができる。
が可能であり、その間抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体
を産生じ続けることができる。
本発明の抗ＴＧＦ−４モノクローナル抗体は、このクロ
ーンを常法に従い細胞培養用培地に培養し、その培養上
清から分離する方法か、若しくはこのクローンを哺乳動
物の腹腔内に投与して増殖させ、その腹水から分離する
方法により得られる。
ーンを常法に従い細胞培養用培地に培養し、その培養上
清から分離する方法か、若しくはこのクローンを哺乳動
物の腹腔内に投与して増殖させ、その腹水から分離する
方法により得られる。
本発明によれば、抗ＩＣＦ−１１モノクローナル抗体の
使用法として、まず、ＩＧＦ−ＩＩの精製への利用が挙
げられる。即ち、抗ＩＣＦ−■モノクローナル抗体を水
不溶性担体に結合せしめて抗体不溶化担体を作成し、こ
れを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うこ
とにより血漿、血清あるいは細胞培養液に含まれるＴＧ
Ｆ−Ｉｆが精製される。用いられろ水不溶性担体、水不
溶性担体と抗体との結合手段、抗体不溶化担体とＩＣＦ
−ｎとの吸着、溶離手段はとくに制限されず、通常のア
フィニティークロマトグラフィーに用いられる担体、手
段を使用することができる。この抗体不溶化担体は繰り
返し使用することが可能である。
使用法として、まず、ＩＧＦ−ＩＩの精製への利用が挙
げられる。即ち、抗ＩＣＦ−■モノクローナル抗体を水
不溶性担体に結合せしめて抗体不溶化担体を作成し、こ
れを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うこ
とにより血漿、血清あるいは細胞培養液に含まれるＴＧ
Ｆ−Ｉｆが精製される。用いられろ水不溶性担体、水不
溶性担体と抗体との結合手段、抗体不溶化担体とＩＣＦ
−ｎとの吸着、溶離手段はとくに制限されず、通常のア
フィニティークロマトグラフィーに用いられる担体、手
段を使用することができる。この抗体不溶化担体は繰り
返し使用することが可能である。
さらに、本発明によれば、抗ＩＣＦ−■モノクローナル
抗体を用いたラジオイムノアッセイまたはエンザイムイ
ムノアッセイによるＩＧＦ−［［の測定法が提供される
。測定操作自体は競合法、サンドイツチ法等の公知の方
法を用いることができる（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ、 Ｍｅｔａｂ、、５１＋ ７８１−７８
８＋１９８０、同、 ５４，４７４−４７６、１９８２
）。例えば、本発明の抗ＩＣＦ−１１モノクローナル抗
体、放射能または酵素で標識したＩＧＦ−ｎおよびＩＧ
Ｆ−ＩＩが含まれる試料をインキュベートして競合的免
疫反応を起こさしめ、生成した抗原抗体複合体の標識物
を測定することによりＩＧＦ−ｎが定量される。
抗体を用いたラジオイムノアッセイまたはエンザイムイ
ムノアッセイによるＩＧＦ−［［の測定法が提供される
。測定操作自体は競合法、サンドイツチ法等の公知の方
法を用いることができる（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ、 Ｍｅｔａｂ、、５１＋ ７８１−７８
８＋１９８０、同、 ５４，４７４−４７６、１９８２
）。例えば、本発明の抗ＩＣＦ−１１モノクローナル抗
体、放射能または酵素で標識したＩＧＦ−ｎおよびＩＧ
Ｆ−ＩＩが含まれる試料をインキュベートして競合的免
疫反応を起こさしめ、生成した抗原抗体複合体の標識物
を測定することによりＩＧＦ−ｎが定量される。
以下参考例および実施例を示して本発明の詳細な説明す
るが、これらは何等本発明を躍定するものではない。
るが、これらは何等本発明を躍定するものではない。
実施例１ 抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体の製造
ネ１１製ラットＩＣＦ−ｎと卵白アルブミン（３：１；
重量比）をグルグルアルデヒドで結合させてコンジュゲ
ートを作り、このコンジュゲートを６通船の雄ＢＡＬＢ
／Ｃマウスに２週間間隔で１０回、各回１５０Ｉｔｇず
つ皮下に投与した。第１回目の投与はフロイント完全ア
ジュバント（デイフコ・ラボラトリーズ社製）中でコン
ジュゲートを乳化し、第２回目以降はフロイント不完全
アジュバント（同社製）中でコンジュゲートを乳化した
のち投与した。最終免疫として、コンジュゲート１５０
ｚ＋ｇを生理食塩水に溶解して上記マウスの腹腔内に
投与した１＆、３日目にマウスの肺臓を摘出した。この
肺臓細胞８ Ｘ １０７個とヒポキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼを欠ｔｉするマウスミ
エローマＰ３−ＮＳ−１／ １−へｇ４−１細胞（フロ
ラ・ラボラトリーズ社製）４Ｘ１０７個を試騙管に入れ
、ポリエチレングリコール１ 、４５０の５０％ン容／
夜（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社製） ０
．５ｒｎｅをメ１力下し、３７℃で２分間インキュベー
トした。得られた融合細胞を１５％牛脂児血清、０．１
ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリンおよ
び１６μＭチミジンを含むＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培
地（フロラ・ラボラトリーズ社製）に３ＸＩＯｆ固／−
となるように懸濁し、９６ウエルのマイクロプレート（
コーニング：宮城硝子社製）４枚に１００ｕ宛まき、３
７゛Ｃ１５％二酸化炭素の存在下で培養した。培養に際
しフィーダーレイヤーとして上記ＢＡＬＢ／Ｃマウスの
腹腔浸出細胞を約５，０００ ｆ［Ｉ／ウェル添加した
。培養開始後、５．８および１１１日目各ウェルの培地
の半量を新たな上記と同じ培地に交換した。さらに、１
４．１６および１８８日目培地の半量を新たな１５％牛
脂児血清、０．１ｍＭヒポキサンチンおよび１６μＭチ
ミジンを含むＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地と交換した
。これ以後の細胞の増殖、維持等の操作はすべて１５％
牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で行った。以
上の操作で最終的に生育してきたハイブリドーマの培養
上清４０ｇと１２５１でラベルしたラットＩ Ｇ Ｆ
−ＩＩ ｌｎｇ （約５．０００ ｃｐｍ ）を０．
２５％牛血清アルブミンを含む３０ｍ Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）２００ｐβ中で、３０℃、４時間インキ
ュベートした。
重量比）をグルグルアルデヒドで結合させてコンジュゲ
ートを作り、このコンジュゲートを６通船の雄ＢＡＬＢ
／Ｃマウスに２週間間隔で１０回、各回１５０Ｉｔｇず
つ皮下に投与した。第１回目の投与はフロイント完全ア
ジュバント（デイフコ・ラボラトリーズ社製）中でコン
ジュゲートを乳化し、第２回目以降はフロイント不完全
アジュバント（同社製）中でコンジュゲートを乳化した
のち投与した。最終免疫として、コンジュゲート１５０
ｚ＋ｇを生理食塩水に溶解して上記マウスの腹腔内に
投与した１＆、３日目にマウスの肺臓を摘出した。この
肺臓細胞８ Ｘ １０７個とヒポキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼを欠ｔｉするマウスミ
エローマＰ３−ＮＳ−１／ １−へｇ４−１細胞（フロ
ラ・ラボラトリーズ社製）４Ｘ１０７個を試騙管に入れ
、ポリエチレングリコール１ 、４５０の５０％ン容／
夜（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社製） ０
．５ｒｎｅをメ１力下し、３７℃で２分間インキュベー
トした。得られた融合細胞を１５％牛脂児血清、０．１
ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリンおよ
び１６μＭチミジンを含むＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培
地（フロラ・ラボラトリーズ社製）に３ＸＩＯｆ固／−
となるように懸濁し、９６ウエルのマイクロプレート（
コーニング：宮城硝子社製）４枚に１００ｕ宛まき、３
７゛Ｃ１５％二酸化炭素の存在下で培養した。培養に際
しフィーダーレイヤーとして上記ＢＡＬＢ／Ｃマウスの
腹腔浸出細胞を約５，０００ ｆ［Ｉ／ウェル添加した
。培養開始後、５．８および１１１日目各ウェルの培地
の半量を新たな上記と同じ培地に交換した。さらに、１
４．１６および１８８日目培地の半量を新たな１５％牛
脂児血清、０．１ｍＭヒポキサンチンおよび１６μＭチ
ミジンを含むＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地と交換した
。これ以後の細胞の増殖、維持等の操作はすべて１５％
牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で行った。以
上の操作で最終的に生育してきたハイブリドーマの培養
上清４０ｇと１２５１でラベルしたラットＩ Ｇ Ｆ
−ＩＩ ｌｎｇ （約５．０００ ｃｐｍ ）を０．
２５％牛血清アルブミンを含む３０ｍ Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）２００ｐβ中で、３０℃、４時間インキ
ュベートした。
このインキュベート液にｌＯ％仔牛血清を含むクーンの
Ｆ−１ｊ（以下Ｃｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２という）培地３
００成、２１％ポリエチレングリコール６．０００を含
むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２培地１ｒｄ！を順次加え、よ
く攪拌した後、１．８７０ Ｘ ｇ、 ４℃で２０分間
遠心分離した。
Ｆ−１ｊ（以下Ｃｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２という）培地３
００成、２１％ポリエチレングリコール６．０００を含
むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２培地１ｒｄ！を順次加え、よ
く攪拌した後、１．８７０ Ｘ ｇ、 ４℃で２０分間
遠心分離した。
上清を除いて、得られた沈澱の放射能をγカウンター（
Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ ５６５０型；パラカード社製）
で測定し、抗ＩＧＦ−ｎ抗体の産生が認められたハイブ
リドーマを得た。このハイブリドーマを限界希釈法によ
りクローニングし、抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体
を産生ずるクローンを得た。即ち、ハイブリドーマ２．
５個／−１前記フィーダーレイヤー２５ 、０００個／
−となるように１５％牛脂児血清を含むＲＰ Ｍ Ｉ
−１６４０培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロプレー
トに２００ｇ宛まき、培養した。生育してきたクローン
の培養上清を前記と同じ免疫沈澱法による測定に供し、
最も抗体産生量の多いクローンを選択した。
Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ ５６５０型；パラカード社製）
で測定し、抗ＩＧＦ−ｎ抗体の産生が認められたハイブ
リドーマを得た。このハイブリドーマを限界希釈法によ
りクローニングし、抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体
を産生ずるクローンを得た。即ち、ハイブリドーマ２．
５個／−１前記フィーダーレイヤー２５ 、０００個／
−となるように１５％牛脂児血清を含むＲＰ Ｍ Ｉ
−１６４０培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロプレー
トに２００ｇ宛まき、培養した。生育してきたクローン
の培養上清を前記と同じ免疫沈澱法による測定に供し、
最も抗体産生量の多いクローンを選択した。
あらかじめブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン；アルドリッチ・ケミカル社製）０．
５−を投与しておいたＢＡＬＢ／ Ｃマウスの腹腔内に
、ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地０．５ｍｅニ懸濁した
上記抗体産生クローン２ Ｘ １０７個宛を投与した後
、１０〜１４日目にその腹水を回収した。集めた腹水１
００−を５０％硫安塩折塩析し、生成した沈澱を１７．
５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，３）に熔解し、同じ緩衝
液に対して一晩透析した。この透析液をあらかじめ上記
と同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワッ
トマン社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行い
、抗ＩＧＦ−ＩＴモノクローナル抗体４３４■を得た。
チルペンタデカン；アルドリッチ・ケミカル社製）０．
５−を投与しておいたＢＡＬＢ／ Ｃマウスの腹腔内に
、ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地０．５ｍｅニ懸濁した
上記抗体産生クローン２ Ｘ １０７個宛を投与した後
、１０〜１４日目にその腹水を回収した。集めた腹水１
００−を５０％硫安塩折塩析し、生成した沈澱を１７．
５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，３）に熔解し、同じ緩衝
液に対して一晩透析した。この透析液をあらかじめ上記
と同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワッ
トマン社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行い
、抗ＩＧＦ−ＩＴモノクローナル抗体４３４■を得た。
免疫グロブリンクラスの分析
本発明の抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体の免疫グロブ
リンクラスを０ｕｃｈ ｔｅｒ Ｉｏｎｙ法に準じて分
析した（Ａｒｋｉｖ、 Ｋｅｍ、 Ｍｉｎｅｒａｌ、
Ｇｅｄ、、２６Ｂ ＋ １１１９８４）。即ち、ヤギ抗
−マウスＩｇＧ１血清、ヤギ抗−マウスＩ ｇＧ２ ａ
血清、ウサギ抗−マウスＩｇＣ，２ｂ血清、ウサギ抗−
マウスＩ ｇＧ３血清（以上ノルデイク・イムノロジカ
ル・ラボラトリーズ社製）、ウサギ抗−マウスＩｇＭ血
清およびウサギ抗−マウスＩｇＡ血清（以上マイルズ・
ラボラトリーズ社製）を寒天ゲル平板上の周辺部に、本
発明の抗ＩＣＦ−Ｉ［モノクローナル抗体をその中心部
にブレーティングし、室温において一晩インキユヘート
した後、生成した免疫沈降線を検出した。その結果、本
発明の抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体はＩｇＧ１クラ
スに属することが決定された。
リンクラスを０ｕｃｈ ｔｅｒ Ｉｏｎｙ法に準じて分
析した（Ａｒｋｉｖ、 Ｋｅｍ、 Ｍｉｎｅｒａｌ、
Ｇｅｄ、、２６Ｂ ＋ １１１９８４）。即ち、ヤギ抗
−マウスＩｇＧ１血清、ヤギ抗−マウスＩ ｇＧ２ ａ
血清、ウサギ抗−マウスＩｇＣ，２ｂ血清、ウサギ抗−
マウスＩ ｇＧ３血清（以上ノルデイク・イムノロジカ
ル・ラボラトリーズ社製）、ウサギ抗−マウスＩｇＭ血
清およびウサギ抗−マウスＩｇＡ血清（以上マイルズ・
ラボラトリーズ社製）を寒天ゲル平板上の周辺部に、本
発明の抗ＩＣＦ−Ｉ［モノクローナル抗体をその中心部
にブレーティングし、室温において一晩インキユヘート
した後、生成した免疫沈降線を検出した。その結果、本
発明の抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体はＩｇＧ１クラ
スに属することが決定された。
特異性の試験
試料としてラット上皮細胞の培養上清より精製したラッ
トＩＧＦ−ｎ、ヒト血漿より精製したｌ０Ｆ−ＩＩ、Ｉ
ＧＦ−１（アムゲン・バイオロジカルズ社製）、ラット
ＩＧＦ−ｎ （コラボラテイブ・リサーチ社製の粗製品
をクロマトグラフィーに付して精製し、純品としたもの
を使用した）および生インスリン（シグマ社製）を使用
し、これら試料の種々量と１２５１でラベルしたＩＧＦ
−Ｉ［２ｎｇ（約１０，０００ ｃｐｍ）および本発明
の抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体Ｌｏｎｇを０．５％
生血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐｌ＋ ７．４）中で、４°Ｃにおいて１６時間インキ
ュベートした。１０％仔牛血清を含むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ
−１２培地３００ｐｌ、２１％ポリエチレングリコール
６．０００を含むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２培地１−を順
次加え、よく混合したのち、生成した沈澱の放射能をγ
カウンターで測定した。試料を添加したときの測定値（
Ｂ）と無添加のときの測定値（Ｂｏ）の比率（Ｂ／Ｂｏ
）に対する試料添加量の関係を第１図に示す。ラットＩ
ＧＦ−ＩＦに対する交叉性を１００％としたときのその
他の試料との交叉性は、ラットｒａＦ−ｒｉ ＜コラボ
ラテイブ・リサーチ社製）とは１００％、ヒトＩＧＦ−
ｎとは１００％、ＩＣＦ−Ｉとは約１０％交叉したが、
インスリンとは全く交叉しなかった。本発明の抗ＩＧＦ
−ＩＩモノクローナル抗体はヒトおよびラツ）ＩＣＦ−
１１に特異的な抗体である。
トＩＧＦ−ｎ、ヒト血漿より精製したｌ０Ｆ−ＩＩ、Ｉ
ＧＦ−１（アムゲン・バイオロジカルズ社製）、ラット
ＩＧＦ−ｎ （コラボラテイブ・リサーチ社製の粗製品
をクロマトグラフィーに付して精製し、純品としたもの
を使用した）および生インスリン（シグマ社製）を使用
し、これら試料の種々量と１２５１でラベルしたＩＧＦ
−Ｉ［２ｎｇ（約１０，０００ ｃｐｍ）および本発明
の抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体Ｌｏｎｇを０．５％
生血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐｌ＋ ７．４）中で、４°Ｃにおいて１６時間インキ
ュベートした。１０％仔牛血清を含むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ
−１２培地３００ｐｌ、２１％ポリエチレングリコール
６．０００を含むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２培地１−を順
次加え、よく混合したのち、生成した沈澱の放射能をγ
カウンターで測定した。試料を添加したときの測定値（
Ｂ）と無添加のときの測定値（Ｂｏ）の比率（Ｂ／Ｂｏ
）に対する試料添加量の関係を第１図に示す。ラットＩ
ＧＦ−ＩＦに対する交叉性を１００％としたときのその
他の試料との交叉性は、ラットｒａＦ−ｒｉ ＜コラボ
ラテイブ・リサーチ社製）とは１００％、ヒトＩＧＦ−
ｎとは１００％、ＩＣＦ−Ｉとは約１０％交叉したが、
インスリンとは全く交叉しなかった。本発明の抗ＩＧＦ
−ＩＩモノクローナル抗体はヒトおよびラツ）ＩＣＦ−
１１に特異的な抗体である。
実施例２ 抗体不溶化カラムを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーによる■ ＧＦ−ＩＩの精製（Ａ） 本発明の抗ＩＣＦ−ＩＩモノクローナル抗体１５０■と
Ａｆｆｉｇｅｌ １０ （バイオラド・ラボラトリーズ
社製”） １０ｍ１’を反応させ、抗体不溶化カラムを
作成した。この抗体不溶化カラムには抗Ｉ ＧＦ−ｎモ
ノクローナル抗体７５■が結合した。一方、ラット上皮
細胞の培養上清４０１を９５℃、５分間加熱処理し、次
いでＩＮ酢酸でｐＨ５，０に調整した後、０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）
にて平衡化したＮａ＋型のＤｏｗｅｘ ５０Ｘ ８カラ
ム（ベツド容１ｉ２６、ダウケミカル社製）に通した。
ロマトグラフィーによる■ ＧＦ−ＩＩの精製（Ａ） 本発明の抗ＩＣＦ−ＩＩモノクローナル抗体１５０■と
Ａｆｆｉｇｅｌ １０ （バイオラド・ラボラトリーズ
社製”） １０ｍ１’を反応させ、抗体不溶化カラムを
作成した。この抗体不溶化カラムには抗Ｉ ＧＦ−ｎモ
ノクローナル抗体７５■が結合した。一方、ラット上皮
細胞の培養上清４０１を９５℃、５分間加熱処理し、次
いでＩＮ酢酸でｐＨ５，０に調整した後、０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）
にて平衡化したＮａ＋型のＤｏｗｅｘ ５０Ｘ ８カラ
ム（ベツド容１ｉ２６、ダウケミカル社製）に通した。
カラムを上記同緩衝液で洗浄した後、０． ＩＮアンモ
ニア水で溶出した。溶出液は直ちにＩＮ酢酸でｐｌ＋
５．０に調整し、 １ＯＯ−まで減圧濃縮した。次にＩ
Ｎ酢酸で平衡化したセファデックスＧ−７５（ベツド容
ｆｆ１２ｆ、ファルマシア社製）カラムを用いてゲルろ
過を行い分子９約１２．０００〜３，０００の両分を集
め凍結乾燥標品１０．３ｍｇを得た。このものを等張リ
ン酸緩衝液（ρ１１７．４）に溶解し、あらかじめ同緩
衝液で平衡化した上記抗体不溶化カラム（ヘッド容量４
ｍｌ！ ）に流した。カラムを同緩衝液で、続いて５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７．４）で洗浄した。
ニア水で溶出した。溶出液は直ちにＩＮ酢酸でｐｌ＋
５．０に調整し、 １ＯＯ−まで減圧濃縮した。次にＩ
Ｎ酢酸で平衡化したセファデックスＧ−７５（ベツド容
ｆｆ１２ｆ、ファルマシア社製）カラムを用いてゲルろ
過を行い分子９約１２．０００〜３，０００の両分を集
め凍結乾燥標品１０．３ｍｇを得た。このものを等張リ
ン酸緩衝液（ρ１１７．４）に溶解し、あらかじめ同緩
衝液で平衡化した上記抗体不溶化カラム（ヘッド容量４
ｍｌ！ ）に流した。カラムを同緩衝液で、続いて５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７．４）で洗浄した。
カラムに０．５Ｍ酢酸を流して溶出を行いラッ・ト■０
Ｆ−ＩＩの部分精製標品８４３ｐｇを得た。ここで使用
したカラムは上記の吸着、溶離に少なくとも１０回繰り
返して使用できた。
Ｆ−ＩＩの部分精製標品８４３ｐｇを得た。ここで使用
したカラムは上記の吸着、溶離に少なくとも１０回繰り
返して使用できた。
この部分精製ラフ１−ＩＣＦ−ＩＩ標品５００ｚ＋ｇを
０．２％トリフルオロ酢酸に溶解した後、オクタデシル
シランカラム（ＴＳＫ ＯＤＳ １２０Ｔ、 ４
．６ｎφ×２５ｃｆｆｌ；東洋曹達工業社）を使用した
高速液体クロマトグラフィー装置（ウォーターズ５１０
型；ウォーターズ社製）にかけた。２０から４０９４ま
での１度のアセトニトリルを用いる直線濃度勾配により
溶出を行い、約３０％アセトニトリルで溶出される活性
画分を集め、これを凍結乾燥して、精製）ットＩＧＦ−
ＩＩ標品６４ｐｇを得た。
０．２％トリフルオロ酢酸に溶解した後、オクタデシル
シランカラム（ＴＳＫ ＯＤＳ １２０Ｔ、 ４
．６ｎφ×２５ｃｆｆｌ；東洋曹達工業社）を使用した
高速液体クロマトグラフィー装置（ウォーターズ５１０
型；ウォーターズ社製）にかけた。２０から４０９４ま
での１度のアセトニトリルを用いる直線濃度勾配により
溶出を行い、約３０％アセトニトリルで溶出される活性
画分を集め、これを凍結乾燥して、精製）ットＩＧＦ−
ＩＩ標品６４ｐｇを得た。
実施例３ 抗体不溶化カラムを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーによる■ ０Ｆ−ＩＩ のネ青製 （Ｂ） ラット上皮細胞の培養上清ｔ 、 ＯＯＯ＋ｎｅを遠心
分離して細胞の破片や不溶物を除去した後、実施例２と
同じ方法でＩｌｌした抗体不溶化カラム（ベツド容量４
−）に流した。カラムを等張リン酸緩衝液（ｐｌ＋７．
４）で洗浄後、０．５Ｍ酢酸を流し溶出を行った。ラッ
トＩＣＦ−ｎの回収率は４５％であり、比活性は後述実
施例５のラジオイムノアッセイで測定したところ７３倍
に上界したのが確認された。
ロマトグラフィーによる■ ０Ｆ−ＩＩ のネ青製 （Ｂ） ラット上皮細胞の培養上清ｔ 、 ＯＯＯ＋ｎｅを遠心
分離して細胞の破片や不溶物を除去した後、実施例２と
同じ方法でＩｌｌした抗体不溶化カラム（ベツド容量４
−）に流した。カラムを等張リン酸緩衝液（ｐｌ＋７．
４）で洗浄後、０．５Ｍ酢酸を流し溶出を行った。ラッ
トＩＣＦ−ｎの回収率は４５％であり、比活性は後述実
施例５のラジオイムノアッセイで測定したところ７３倍
に上界したのが確認された。
実施例４ 抗体不溶化カラムを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーによるＩ ＧＦ−ＩＩの精製（Ｃ） ヒト血漿１００ｍｅを５０ｍ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，
８）に透析した後、セファデックスＧ−７５（ファルマ
シア社製；ベツド容量２．ＯＯＯｍｅ）を用いたゲルろ
過に付し、分子量１２．０００〜３，０００の両分を集
めた。
ロマトグラフィーによるＩ ＧＦ−ＩＩの精製（Ｃ） ヒト血漿１００ｍｅを５０ｍ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，
８）に透析した後、セファデックスＧ−７５（ファルマ
シア社製；ベツド容量２．ＯＯＯｍｅ）を用いたゲルろ
過に付し、分子量１２．０００〜３，０００の両分を集
めた。
この両分のｐｌ＋を７．４に調整した後、実施例２と同
じ方法で調製した抗体不溶化カラム（ベツド容量４ｍｆ
’）に流し、カラムを等張リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
で洗浄後、 ０．５Ｍ酢酸を流し溶出した。溶出液を実
施例２と同じ高速液体クロマトグラフィーに付し、溶出
された活性画分を凍結乾燥して精製Ｉ ＣＦ −Ｕ ３
４ｐｇを得た。回収率は３０％であった。
じ方法で調製した抗体不溶化カラム（ベツド容量４ｍｆ
’）に流し、カラムを等張リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
で洗浄後、 ０．５Ｍ酢酸を流し溶出した。溶出液を実
施例２と同じ高速液体クロマトグラフィーに付し、溶出
された活性画分を凍結乾燥して精製Ｉ ＣＦ −Ｕ ３
４ｐｇを得た。回収率は３０％であった。
実施例５ 血清中のＩＧＦ−Ｉｆの測定血清試料５０鷺
と８７．５％エタノール−１２，５％２Ｎ塩酸の混合溶
液０．２−を混合し、室温で３０分間静置した後、４℃
において １，８６０Ｘ ｇ、３０分間遠心分離した。
と８７．５％エタノール−１２，５％２Ｎ塩酸の混合溶
液０．２−を混合し、室温で３０分間静置した後、４℃
において １，８６０Ｘ ｇ、３０分間遠心分離した。
この上清１８０度に０．８５５ Ｍ ）リス７２ｍを加
え中和したものを以下の測定の検体として使用した。こ
の検体１５ｕと本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ［モノクローナル
抗体１０ｎｇおよびＥ■でラベルした■ＧＦ−１１２ｎ
ｇ（約１０，０００ ｃｐｍ）を０．５％牛血清アルブ
ミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）２
００ ｍ中に加え、４°Ｃにおいて１６時間インキユベ
ートシた。このインキュベート液に１０％仔牛血清を含
むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２培地０．３−および２１％ポ
リエチレングリコール１−を加え、直ちに攪拌した後、
３．０００ Ｘ ｇ、２０分間遠心分離し、得られた沈
澱の放射能をγ−カウンターで測定した。あらかじめ試
料として既知濃度のＩＣＦ−１１を使用して、上記と同
し操作を行い作成しておいた検量線と上記測定値を対比
して試料中のＩＧＦ−■濃度を求めた。
え中和したものを以下の測定の検体として使用した。こ
の検体１５ｕと本発明の抗ＩＧＦ−Ｉ［モノクローナル
抗体１０ｎｇおよびＥ■でラベルした■ＧＦ−１１２ｎ
ｇ（約１０，０００ ｃｐｍ）を０．５％牛血清アルブ
ミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）２
００ ｍ中に加え、４°Ｃにおいて１６時間インキユベ
ートシた。このインキュベート液に１０％仔牛血清を含
むＣｏｏｎ’ｓ Ｆ−１２培地０．３−および２１％ポ
リエチレングリコール１−を加え、直ちに攪拌した後、
３．０００ Ｘ ｇ、２０分間遠心分離し、得られた沈
澱の放射能をγ−カウンターで測定した。あらかじめ試
料として既知濃度のＩＣＦ−１１を使用して、上記と同
し操作を行い作成しておいた検量線と上記測定値を対比
して試料中のＩＧＦ−■濃度を求めた。
上記の方法によりヒトの血清試料のＩＣＦ−ＩＩを測定
したところ、正常人の血清中のレベルは１５４３±２２
９ ｎｇ／ｍｅ （平均±ＬＳＤ）であるのに対し、肝
疾患の患者のそれは４９２±３１４ ｎｇ／ｍｅ （同
）であった（第２図に示す）。
したところ、正常人の血清中のレベルは１５４３±２２
９ ｎｇ／ｍｅ （平均±ＬＳＤ）であるのに対し、肝
疾患の患者のそれは４９２±３１４ ｎｇ／ｍｅ （同
）であった（第２図に示す）。
発明の効果
本発明の抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体を使用して
アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより細
胞培養液または血漿中の微量のＩＧＦ−１’ｌを高純度
に精製することが容易になった。
アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより細
胞培養液または血漿中の微量のＩＧＦ−１’ｌを高純度
に精製することが容易になった。
また、本発明の抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体を使
用して血中に微量に存在するＩＧＦ−ＩＩの測定が可能
となった。さらに本発明の抗ＩＧＦ−■モノクローナル
を使用した疾病の診断並びに治療が期待される。
用して血中に微量に存在するＩＧＦ−ＩＩの測定が可能
となった。さらに本発明の抗ＩＧＦ−■モノクローナル
を使用した疾病の診断並びに治療が期待される。
第１図は本発明の抗ＩＣＦ−ｎモノクローナル抗体の特
異性を表す図である。 第２図は、本発明法により測定した正常人と肝疾患の患
者の血清中のＩＣＦ−ｎのレベルを表す図である。なお
第１図中−口−はラツ） ＩＧＦ−■ （ラット上皮細
胞由来）を、−（）−はヒトＩＧＦ−ｎを、−・−はＩ
ＧＦ−１を、−△−はラットＩＧＦ−ＩＩ （コラボラ
テイブ・リサーチ社製）を、−Ｇ−はインスリンをそれ
ぞれ示すものである。
異性を表す図である。 第２図は、本発明法により測定した正常人と肝疾患の患
者の血清中のＩＣＦ−ｎのレベルを表す図である。なお
第１図中−口−はラツ） ＩＧＦ−■ （ラット上皮細
胞由来）を、−（）−はヒトＩＧＦ−ｎを、−・−はＩ
ＧＦ−１を、−△−はラットＩＧＦ−ＩＩ （コラボラ
テイブ・リサーチ社製）を、−Ｇ−はインスリンをそれ
ぞれ示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ インスリン様成長因子IIを特異的に認識する抗イン
スリン様成長因子IIモノクローナル抗体。 ２ ラット上皮細胞に由来するインスリン様成長因子I
Iで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞
を融合せしめて形成されたハイブリドーマから抗インス
リン様成長因子IIモノクローナル抗体を産生するクロー
ンを選択し、このクローンを増殖せしめて産生した抗イ
ンスリン様成長因子IIモノクローナル抗体を採取するこ
とを特徴とする抗インスリン様成長因子IIモノクローナ
ル抗体の製造法。 ３ 抗インスリン様成長因子IIモノクローナル抗体を産
生するクローンを哺乳動物の腹腔内に投与して増殖せし
め、哺乳動物の腹水中に抗インスリン様成長因子IIモノ
クローナル抗体を産生せしめこれを採取する特許請求の
範囲第２項記載の抗インスリン様成長因子IIモノクロー
ナル抗体の製造法。 ４ 抗インスリン様成長因子IIモノクローナル抗体を結
合させた水不溶性担体にインスリン様成長因子IIを含有
する試料を接触せしめてインスリン様成長因子IIを吸着
させたのち、このインスリン様成長因子IIを溶離するこ
とを特徴とするインスリン様成長因子IIの精製法。 ５ 抗インスリン様成長因子IIモノクローナル抗体を用
いたイムノアツセイにより試料中のインスリン様成長因
子IIを測定することを特徴とするインスリン様成長因子
IIの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61187197A JPS6342472A (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | 抗インスリン様成長因子２モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその使用法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61187197A JPS6342472A (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | 抗インスリン様成長因子２モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその使用法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6342472A true JPS6342472A (ja) | 1988-02-23 |
Family
ID=16201797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61187197A Pending JPS6342472A (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | 抗インスリン様成長因子２モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその使用法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6342472A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5624269A (en) * | 1995-06-07 | 1997-04-29 | Yazaki Corporation | Electrical contact terminal for printed circuit board |
| US5764487A (en) * | 1996-08-06 | 1998-06-09 | Yazaki Corporation | Junction block with integral printed circuit board and electrical connector for same |
-
1986
- 1986-08-08 JP JP61187197A patent/JPS6342472A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5624269A (en) * | 1995-06-07 | 1997-04-29 | Yazaki Corporation | Electrical contact terminal for printed circuit board |
| US5764487A (en) * | 1996-08-06 | 1998-06-09 | Yazaki Corporation | Junction block with integral printed circuit board and electrical connector for same |
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