JPS6343079B2 - - Google Patents
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- JPS6343079B2 JPS6343079B2 JP54144858A JP14485879A JPS6343079B2 JP S6343079 B2 JPS6343079 B2 JP S6343079B2 JP 54144858 A JP54144858 A JP 54144858A JP 14485879 A JP14485879 A JP 14485879A JP S6343079 B2 JPS6343079 B2 JP S6343079B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規かつ有用なグルコース―６―リ
ン酸脱水素酵素およびその製造方法に関するもの
であり、さらに詳細には、医療分野における臨床
検査において、ブドウ糖、グルコース―６―リン
酸、ヘキソキナーゼ、ヘキソース―６―リン酸イ
ソメラーゼの測定、食品工業における果糖、ブド
ウ糖の測定などに用いられるグルコース―６―リ
ン酸脱水素酵素およびその製造方法に関するもの
である。 近時、酵素は、酵素反応の特徴である反応、基
質、光学の各特異性にすぐれている点などが注目
され、医療分析、食品分析等に広く触媒として利
用されている。なかでも、体液中のグルコース、
ヘキソキナーゼなどの含有量の測定は、臨床検査
の面で重要であることはよく知られている。ま
た、食品中のグルコース、果糖の含有量の分析も
転化糖工業の分野などで重要な検査項目となつて
いる。このような成分を分析するにさいし、近
年、グルコース―６―リン酸脱水素酵素を用いる
方法が、すでに述べたとおり、酵素の非常にすぐ
れた反応、基質、光学の各特異性の利点から広く
利用されている。この点でグルコース―６―リン
酸脱水素酵素は重要な酵素である。 酵素を用いる微量分析法には、上記の利点があ
る一方、一般に酵素は非常に不安定で、室温以下
で数日から数週間のうちに、触媒活性を失うのが
通例であり、それゆえ、この不安定性が、酵素を
用いる微量成分分析における大きな障害となつて
いる。従来、知られているグルコース―６―リン
酸脱水素酵素も同様不安定で、たとえば、ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌
（J.Biol.Chem.）、236巻、1225頁（1961年）に記
載されている、酵母から得られるグルコース―６
―リン酸脱水素酵素は、水溶液中（室温）で１〜
３週間のうちに活性をほとんど失うのが通例であ
つた。さらに、グルコース―６―リン酸脱水素酵
素のほとんどは、補酵素としてニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下NADP
という。）のみしか作用しなかつた。このNADP
は、広く知られているように非常に高価であつ
た。現在まで、アドバンシズ・イン・エンザイモ
ロジー（アルトマン・マイスター編）48巻、97頁
〜191頁（Advances in Enzymology、ed、by
Alton Meister）に記載されているように数多く
のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が知られて
おり、そのほとんどは補酵素としてNADPを反
応に必要とするものであるが、その中で、
NADPに比べ約10倍も安価なニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチド（以下NADという。）
を補酵素として反応に利用できるロイコノストツ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）やシユードモナス
（Pseudomonag）w6から得られるグルコース―
６―リン酸脱水素酵素がある。しかるに、このロ
イコノストツク・メセンテロイデスやシユードモ
ナスw6から得られる酵素は先に述べた熱安定性
および長期の安定性に欠けるものであるという大
きな欠点を有している。それゆえ、グルコース―
６―リン酸脱水素酵素を用いる分析法の利点を最
大限に発揮するうえで、安定で、かつ補酵素とし
てNADP以外の安価なものを利用しうる性質を
有するグルコース―６―リン酸脱水素酵素の出現
が強く要望されているのである。 そこで、本発明者らはこのような観点から、熱
に安定で、長期間活性を失なわないで、かつ補酵
素としてNADP以外の安価なものを利用しうる
性質を有するグルコース―６―リン酸脱水素酵素
を求めて鋭意研究した結果、バチルス属に属する
微生物菌体に上記の性質を有するグルコース―６
―リン酸脱水素酵素が存在することを見い出し本
発明を完成した。 すなわち、本発明は、約50℃の緩衝液中で約15
分間処理したのちの活性が処理前の活性の約80％
以上の値を保持している性質を有し、かつ次の理
化学的性質を有するグルコース―６―リン酸脱水
素酵素及びバチルス属に属する細菌を培養し、培
養物から約50℃の緩衝液中で約15分間処理したの
ちの活性が処理前の活性の約80％以上の値を保持
している性質を有し、かつ次の理化学的性質を有
するグルコース―６―リン酸脱水素酵素を採取す
ることを特徴とするグルコース―６―リン酸脱水
素酵素の製造方法である。 (a) 作用及び基質特異性 ヘキソース―６―リン酸＋補酵素（酸化型） ↑↓ ヘキソース・アルドン酸―６―リン酸＋補酵素
（還元型） 上記反応を触媒する。なお、上記式中のヘキソ
ース―６―リン酸は、グルコース―６―リン酸、
マンノース―６―リン酸、ガラクトース―６―リ
ン酸の総称であり、ヘキソース・アルドン酸―６
―リン酸は、グルコン酸―６―リン酸、マンノン
酸―６―リン酸、ガラクトン酸―６―リン酸の総
称である。また、上記式中の補酵素として、
NADP又はNADに作用する。 (b) 至適PH 約9.0（温度30℃）である。 (c) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約23万である。 本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵素
は、約50℃の緩衝液中で約15分間処理することに
より、グルコース―６―リン酸脱水素酵素の残存
活性がもとの活性の約80％以上、好ましくは約90
％以上、最適には約100％の値を保持している性
質を有し、特に約57℃の緩衝液中で約15分間処理
したのちの活性が処理前の活性の約80％以上の値
を保持している、優秀な性質を有している。緩衝
液の濃度およびPHは特に限定されないが、一般に
は濃度は5mMないし50mMであり、PHは７ない
し10.5である。特に本発明においては、100mM
の塩化カリウムを含む100mMのトリスー塩酸緩
衝液（PH約9.0）を用いることが好ましい。 次に本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵
素の理化学的性質を示す。 １ 作用及び基質特異性 前記したとおり。 なお、グルコース―６―リン酸のミカエリス定
数（km値）は、約0.16mMである。マンノース
―６―リン酸及びガラクトース―６―リン酸の同
一基質濃度での反応速度はグルコース―６―リン
酸を基質とした場合のそれぞれ、約40％、約20％
である。補酵素NADP及びNADに対するKm値
は、それぞれ約0.016mM、約1.64mMである。 ２ 至適PH 前記したとおり。 ３ 安定PH範囲 PH7.0〜10.5で４℃、24時間の処理でほとんど
失活が起らない。 ４ 作用適温の範囲 PH8.9で25℃より75℃まで温度の上昇とともに
活性は増大する。通常は、30℃において反応を行
なわしめる。 ５ 耐熱性 57℃、15分間の加熱に対して安定である。 ６ 分子量 前記したとおり。 なお ゲルクロマトグラフイーとしてセフアク
リルＳ―200（フアルマシア社製）を用いた。酵母
やロイコノストツク・メセンテロイデスからのグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素は同条件で約10
万の分子量であつた。 ７ 力価の測定法 PH8.9、50mM トリス―塩酸緩衝液中2mMグ
ルコース―６―リン酸、0.5mMNADP、5mM塩
化マグネシウムを含む混合溶液を調製し、その混
合液に適当量のグルコース―６―リン酸脱水素酵
素を加えて、NADP還元型（NADPH）の単位
時間あたりの340nmの吸光度の増加値より力価を
測定し、１分間あたり、１マイクロモルの
NADPHの340nmにおける吸光度を増加せしめる
酵素活性を１単位とした、精製酵素の力価は、30
℃で約100単位／mg精製酵素である。本発明のグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素は、耐熱性にす
ぐれているため、たとえば従来知られている酵母
の酵素が失活する温度、すなわち約50℃〜60℃で
も反応を行なうことが可能である。その温度での
力価はさらに高くなる。 ８ 単一性 精製標品は、PH9.4の7.5％アクリルアミドデイ
スク電気泳動法により陽極側に移動し、単一なバ
ンドを与えた。また、SDS電気泳動法により陽極
側に移動し単一なバンドを与えた。 ９ 元素分析 元素分析値にかえて、アミノ酸組成をモル％で
示す。 アスパラギン酸11.04％、スレオニン5.42％、
セリン4.56％、グルタミン酸11.86％、プロリン
3.66％、グリシン6.67％、アラニン7.92％、シス
チン（システイン）0.62％、バリン6.09％、メチ
オニン1.97％、イソロイシン5.59％、ロイシン
8.04％、チロシン3.72％、フエニルアラニン4.88
％、リシン5.28％ヒスチジン3.40％、アルギニン
6.56％、トリプトフアン2.72％ 10 結晶構造 現在、まだ結晶化されていないので測定してい
ない。 本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵素を
製造するには、次のごとき方法を採用することが
できる。すなわち、パチルス属に属する細菌を培
養し、その培養物から本発明のグルコース―６―
リン酸脱水素酵素を採取することによつて得るこ
とができる。 本発明に使用する細菌は、本発明のグルコース
―６―リン酸脱水素酵素を産生しうるパチルス属
の細菌であり、そのような細菌であれば、いかな
るものでも使用できる。好ましい細菌としては、
たとえば、パチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）があげられる。
ステアロサーモフイルスとしての具体例として
は、ATCC7953、7954、8005、10149、12980、
NCA1503などがある。 本発明における細菌を培養するに際して用いら
れる栄養倍地において炭素源として、たとえば、
グルコース、シユークロース、フルクトース、澱
粉加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、
酢酸、乳酸等の有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸および
グリセリン等が使用でき、窒素源として、たとえ
ば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、アンモニア、アミノ酸、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物
が使用できる。さらに、無機塩類として、たとえ
ばカリウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マ
グネシウム、マンガン、銅、カルシウム、コバル
ト等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、コー
ン・ステイーブ・リカー、ビタミン類、刻酸等を
使用してもよく、細菌の一般的栄養倍地が使用で
きる。 これらの培地を用いて、バチルス属に属する細
菌を20℃〜80℃、好ましくは40℃〜70℃、最適に
は60℃で、約２〜６時間、好気的に培養すればよ
い。また、工業的には、たとえば希釈率（発酵槽
に培地液を供給する速度および同時に発酵槽より
抜出す速度を発酵槽中の培養液量で割つた値）を
使用する菌株の最大比増殖速度の0.3〜1.0、好ま
しくは0.5〜1.0、最適には0.7〜1.0の範囲で制御
しながら連続的に培養する連続培養法も用いるこ
とができる。 次に得られた培養物から、本発明のグルコース
―６―リン酸脱水素酵素が採取されるが、培養
物、分離生菌体、分離菌体の処理物、粗製酵素、
精製酵素等のあらゆる段階で採取できる。精製法
としては、通常の酵素精製法を用いることができ
る。すなわち、遠心分離等により菌体を得た後、
菌体をマントンゴーリン、ダイノミル、フレンチ
プレス、超音波処理等により細胞破砕後、遠心分
離により細胞片を除去し、細胞抽出液を得、これ
に硫酸ストレプトマイシンまたは硫酸プロタミン
処理を行ない、さらには、硫酸アンモニア沈殿、
アセトン沈殿、加熱処理等を行ない、さらに精製
するために、DEAE―セルロースカラム等のイオ
ン交換クロマトグラフイー、ヒドロキシアパタイ
トカラム等の吸着クロマトグラフイー、セフアデ
ツクスクロマトグラフイー等のゲル濾過クロマト
グラフイー等のクロマトグラフイーを組合わせて
行なうことができる。このようにして本発明のグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素を単離、精製す
ることができる。 本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵素
は、熱に対して非常に安定であるから、従来のグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素と比較して、酵
素単離後、これを長期間保存することができる。
このため、生化学の研究、食品、臨床検査分野に
非常に有効である。たとえば、本発明のグルコー
ス―６―リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、
NAD、ATPおよび塩化マグネシウムからなる反
応液を用いて、食品や体液中のグルコース濃度を
精度良く測定することができる。この食品中のグ
ルコース濃度は、転化糖工業において操業分析に
重要であり、体液中のグルコース濃度は、糖尿病
などの診断に利用される。さらに、本発明のグル
コース―６―リン酸脱水素酵素、NAD、および
塩化マグネシウムからなる反応液を用いて、体液
中のグルコース―６―リン酸濃度を測定すること
により、ホスホグルコースイソメラーゼ活性を測
定することができる。これは転移性乳ガンなどの
ガンの検診に利用される。 また、本発明のグルコース―６―リン酸脱水素
酵素は、補酵素としてNADPに比べて非常に安
価なNADに作用する性質を有することから、安
価な検査用薬として経済的な有利性を発揮するこ
とができる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例１、比較例１ ポリペプトン0.5ｇ／dl、酢母エキス0.5ｇ／
dl、サツカロース1.0ｇ／dl、硫酸カリウム0.13
ｇ／dl、リン酸ニトリウム0.644ｇ／dl、硫酸マ
グネシウム0.027ｇ／dl、クエン酸0.032ｇ／dl、
硫酸第一鉄0.0007ｇ／dl、硫酸マンガン0.015
ｇ／dl、PH7.00に調整した培地250を115℃、10
分間加熱殺菌した後、パチルス、ステアロサーモ
フイルNCA1503株を接種し、60℃で３時間、内
圧0.5Kg／m2Ｇで通気培養した。 培養後、水で冷却しながら、直ちに、デラバル
型遠心分離機で菌体を採取し、700ｇの菌体を得
た。得られた菌体を、凍結状態で保存したのち、
凍結菌体300ｇを２倍量の0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）に懸濁し、フレンチプレスを用いて細胞を
十分に破壊後、遠心分離により細胞片を除去し、
グルコース―６―リン酸脱水素酵素を含む粗抽出
液を得た。この粗抽出液600ml当り１％の硫酸プ
ロタミン溶液300mlを添加し、十分撹拌した後、
生じた沈殿を遠心分離で除去し、プロタミン上清
を得た。この上清に固形硫酸アンモニウムを除々
に加えて50％飽和（４℃）とした。生成した沈殿
を遠心分離により集め再び0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）にとかし、ついで20倍量の0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）に対して透析、脱塩した。 あらかじめ、2mMメルカプトエタノール、
2mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む
20mMリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化した
DEAE―セルロースカラムに上記の粗酵素液を通
じ、塩化カリウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶
出せしめると塩化カリウム濃度0.15Mの近くで目
的のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が溶出し
た。この区分を集め、濃縮、脱塩後、さらに、
5mMリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムに、その溶出液を通し、
5mMリン酸緩衝液から250mMリン酸緩衝液の直
線勾配の溶出を行なつたところ、75mM濃度近く
に目的のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が溶
出した。この活性区分を濃縮、脱塩後0.1M塩化
カリウムを含む50mMトリス・塩酸緩衝液を溶出
液に用いたウルトロゲルACA34クロマトグラフ
イーにかけたのちに、さらに溶出した活性区分を
あらかじめ2mMメルカプトエタノール、2mMエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む30mMリ
ン酸緩衝液（PH7.7）で平衡化したDEAE―セフ
アデツクスＡ―50カラムに通じ、塩化カリウムを
上記緩衝液に加えた塩化カリウム濃度0.1Mから
0.4Mの直線勾配で溶出した。その結果、塩化カ
リウム濃度0.2Mの近くで精製されたグルコース
―６―リン酸脱水素酵素が溶出した。 このようにして得たグルコース―６―リン酸脱
水素酵素は、PH9.4の7.5％アクリルアミドデイス
ク電気泳動で陽極側に移動し単一なバンドを与
え、さらに、セフアデツクスＧ―200クロマトグ
ラフイーにおいても、分子量約23万のところに単
一のピークを与えた。 その収量は約10mgで、酵素１mgあたり約100単
位の力価をしめし、その精製度は粗抽出液を１と
すると約1500であつた。 次にこのようにして得たグルコース―６―リン
酸脱水素酵素と比較のため、酵母から得られたグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素（比較例１）の
安定性を調べた。 その結果を第１図および第２図に示す。なお、
第１図は100mMの塩化カリウムを含むPH9.0の
100mMトリス緩衝液中の各温度で15分間加熱し
たときの残存活性を示したもので、曲線Ａが実施
例１、曲線Ｂが比較例１である。第２図はPH9.0
の100mMトリス緩衝液中30℃で保存したときの
残存活性の経日変化を示したもので、曲線Ｃが実
施例１、曲線Ｄが比較例１である。これらの結果
から、明らかなように酵母から得られたグルコー
ス―６―リン酸脱水素酵素は、50℃で15分間処理
することにより、ほぼ完全にその活性を不可逆的
に失うのに対し、本発明のグルコース―６―リン
酸脱水素酵素は50℃では全く活性を失なわなかつ
た。さらに30℃では、酵母から得られたグルコー
ス―６―リン酸脱水素酵素は10〜20日間でほぼ活
性を失うのに対し、本発明のグルコース―６―リ
ン酸脱水素酵素は、50日経過した時点でも活性の
低下は全く認められなかつた。このように本発明
のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が驚くほど
熱に対して安定であり、これを長期間保存するこ
とができる性質を有している。この性質は、いま
までのグルコース―６―リン酸脱水素酵素にはな
いものである。 実施例 ２ 30容発酵槽にグルコース1.3ｇ、硫酸アンモ
ニウム1.0ｇ、酵母エキス0.5ｇ、リン酸―カリウ
ム0.5ｇ、リン酸ニナトリウム0.5ｇ、硫酸マグネ
シウム0.1ｇを水道水１に溶解して得た培地を
20張込み、121℃、１Kg／cm2で15分間、加圧蒸
気殺菌した。培養条件を57℃、PH6.5〜7.0（4N―
NaOHで調製した。）、通気量20／分（空気）、
撹拌数900rpmに設定した後、これにバチルス・
ステアロサーモフイルスATCC12980株を上記培
地であらかじめ前培養して得た。660nmでの吸光
度が約1.0に達した溶液を１接種した。まず、
約2.5時間バツチ培養を行ない、660nmの吸光度
が1.0に至つたときに、前記組成の殺菌済み栄養
培地を24.0／hrの速度で定量ポンプを用いて連
続的に供給し、同速度で発酵槽より培養液を抜出
すことにより、100の栄養培地を用いて連続培
養して培養液を得た。培養液を水で冷却しながら
直ちにデラバル型遠心分離機で菌体を採取し400
ｇの菌体を得た。 この菌体を1.5倍量の0.1Mリン酸緩衝液に懸濁
し、ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離
により不溶物を除去し、グルコース―６―リン酸
脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この粗抽出液
400ml当り、10％の硫酸ストレプトマイシン溶液
200mlを添加後、生じた沈殿を遠心分離で除去し、
ストレプトマイシン上清を得た。この上清に硫酸
アンモニウム分離をほどこし、25％飽和（４℃）
から、50％飽和（４℃）の間の分画部を得た。こ
の分画部を50mMトリスー塩酸緩衝液（PH8.0）
にとかした後、あらかじめ上記緩衝液で平衡化し
たDEAE―セフアデツクスカラムに通じ、塩化ナ
トリウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出せしめ
ると、塩化ナトリウム濃度0.2Mの近くで、目的
とするグルコース―６―リン酸脱水素酵素が溶出
した。この溶出部分を実施例１と同様な条件下に
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフイ
ーを行なつたのち、セフアクリルＳ―200カラム
に通じ0.1M塩化ナトリウムを含む30mMトリス
―塩酸緩衝液（PH8.0）で溶出して、実施例１と
同様にアクリルアミドデイスク電気泳動で単一な
バンドを与えるグルコース―６―リン酸脱水素酵
素標品を得た。さらに実施例１と同様にセフアデ
ツクスＧ―200クロマトグラフイーにおいても、
分子量約23万のところに単一のピークを与えた。 収量は約20mgであつた。その力価は酵素１mgあ
たり約100単位であつた。その精製度は粗抽出液
を１とすると約1100であつた。 参考例 １，２，３ 実施例１で得たグルコース―６―リン酸脱水素
酵素を用いて、グルコース濃度が既知の標準血清
を被検液として、グルコース濃度を次のようにし
て測定した。なお、標準血清として、標準血清中
のグルコース濃度が76mg／dl（参考例１）、155
mg／dl（参考例２）および43mg／dl（参考例３）
を有するものを用いた。 測定方法として、まず、100mMのリン酸緩衝
液PH8.51ml当り、グルコース―６―リン酸脱水素
酵素１単位／ml、ヘキソキナーゼ２単位／ml、
NAD2mM、ATP2mM、Mgcl22mMになるよう
に溶解して反応液を得た。この反応液を30℃で５
分間保つたのち、標準血清を20μl添加して混合し
て、30℃で５分間反応させた後、分光光度計を用
いて、340nmの吸光度値を読み取つた。同時に上
記組成の反応液に純水20μlを添加し、30℃で５分
間反応させた後、340nmの吸光度を読み取り、こ
れを対照とし、標準血清の340nmの吸光度から、
対照の吸光度を引いた値を吸光度の増加とした。
次に下記式を用いて、標準血清１dl中のグルコー
ス量（mg）を計算して求めた。 145.8×（吸光度の増加） ＝被検体１dl中のグルコース量（mg） その結果を表１に示す。 【表】
ン酸脱水素酵素およびその製造方法に関するもの
であり、さらに詳細には、医療分野における臨床
検査において、ブドウ糖、グルコース―６―リン
酸、ヘキソキナーゼ、ヘキソース―６―リン酸イ
ソメラーゼの測定、食品工業における果糖、ブド
ウ糖の測定などに用いられるグルコース―６―リ
ン酸脱水素酵素およびその製造方法に関するもの
である。 近時、酵素は、酵素反応の特徴である反応、基
質、光学の各特異性にすぐれている点などが注目
され、医療分析、食品分析等に広く触媒として利
用されている。なかでも、体液中のグルコース、
ヘキソキナーゼなどの含有量の測定は、臨床検査
の面で重要であることはよく知られている。ま
た、食品中のグルコース、果糖の含有量の分析も
転化糖工業の分野などで重要な検査項目となつて
いる。このような成分を分析するにさいし、近
年、グルコース―６―リン酸脱水素酵素を用いる
方法が、すでに述べたとおり、酵素の非常にすぐ
れた反応、基質、光学の各特異性の利点から広く
利用されている。この点でグルコース―６―リン
酸脱水素酵素は重要な酵素である。 酵素を用いる微量分析法には、上記の利点があ
る一方、一般に酵素は非常に不安定で、室温以下
で数日から数週間のうちに、触媒活性を失うのが
通例であり、それゆえ、この不安定性が、酵素を
用いる微量成分分析における大きな障害となつて
いる。従来、知られているグルコース―６―リン
酸脱水素酵素も同様不安定で、たとえば、ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌
（J.Biol.Chem.）、236巻、1225頁（1961年）に記
載されている、酵母から得られるグルコース―６
―リン酸脱水素酵素は、水溶液中（室温）で１〜
３週間のうちに活性をほとんど失うのが通例であ
つた。さらに、グルコース―６―リン酸脱水素酵
素のほとんどは、補酵素としてニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下NADP
という。）のみしか作用しなかつた。このNADP
は、広く知られているように非常に高価であつ
た。現在まで、アドバンシズ・イン・エンザイモ
ロジー（アルトマン・マイスター編）48巻、97頁
〜191頁（Advances in Enzymology、ed、by
Alton Meister）に記載されているように数多く
のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が知られて
おり、そのほとんどは補酵素としてNADPを反
応に必要とするものであるが、その中で、
NADPに比べ約10倍も安価なニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチド（以下NADという。）
を補酵素として反応に利用できるロイコノストツ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）やシユードモナス
（Pseudomonag）w6から得られるグルコース―
６―リン酸脱水素酵素がある。しかるに、このロ
イコノストツク・メセンテロイデスやシユードモ
ナスw6から得られる酵素は先に述べた熱安定性
および長期の安定性に欠けるものであるという大
きな欠点を有している。それゆえ、グルコース―
６―リン酸脱水素酵素を用いる分析法の利点を最
大限に発揮するうえで、安定で、かつ補酵素とし
てNADP以外の安価なものを利用しうる性質を
有するグルコース―６―リン酸脱水素酵素の出現
が強く要望されているのである。 そこで、本発明者らはこのような観点から、熱
に安定で、長期間活性を失なわないで、かつ補酵
素としてNADP以外の安価なものを利用しうる
性質を有するグルコース―６―リン酸脱水素酵素
を求めて鋭意研究した結果、バチルス属に属する
微生物菌体に上記の性質を有するグルコース―６
―リン酸脱水素酵素が存在することを見い出し本
発明を完成した。 すなわち、本発明は、約50℃の緩衝液中で約15
分間処理したのちの活性が処理前の活性の約80％
以上の値を保持している性質を有し、かつ次の理
化学的性質を有するグルコース―６―リン酸脱水
素酵素及びバチルス属に属する細菌を培養し、培
養物から約50℃の緩衝液中で約15分間処理したの
ちの活性が処理前の活性の約80％以上の値を保持
している性質を有し、かつ次の理化学的性質を有
するグルコース―６―リン酸脱水素酵素を採取す
ることを特徴とするグルコース―６―リン酸脱水
素酵素の製造方法である。 (a) 作用及び基質特異性 ヘキソース―６―リン酸＋補酵素（酸化型） ↑↓ ヘキソース・アルドン酸―６―リン酸＋補酵素
（還元型） 上記反応を触媒する。なお、上記式中のヘキソ
ース―６―リン酸は、グルコース―６―リン酸、
マンノース―６―リン酸、ガラクトース―６―リ
ン酸の総称であり、ヘキソース・アルドン酸―６
―リン酸は、グルコン酸―６―リン酸、マンノン
酸―６―リン酸、ガラクトン酸―６―リン酸の総
称である。また、上記式中の補酵素として、
NADP又はNADに作用する。 (b) 至適PH 約9.0（温度30℃）である。 (c) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約23万である。 本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵素
は、約50℃の緩衝液中で約15分間処理することに
より、グルコース―６―リン酸脱水素酵素の残存
活性がもとの活性の約80％以上、好ましくは約90
％以上、最適には約100％の値を保持している性
質を有し、特に約57℃の緩衝液中で約15分間処理
したのちの活性が処理前の活性の約80％以上の値
を保持している、優秀な性質を有している。緩衝
液の濃度およびPHは特に限定されないが、一般に
は濃度は5mMないし50mMであり、PHは７ない
し10.5である。特に本発明においては、100mM
の塩化カリウムを含む100mMのトリスー塩酸緩
衝液（PH約9.0）を用いることが好ましい。 次に本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵
素の理化学的性質を示す。 １ 作用及び基質特異性 前記したとおり。 なお、グルコース―６―リン酸のミカエリス定
数（km値）は、約0.16mMである。マンノース
―６―リン酸及びガラクトース―６―リン酸の同
一基質濃度での反応速度はグルコース―６―リン
酸を基質とした場合のそれぞれ、約40％、約20％
である。補酵素NADP及びNADに対するKm値
は、それぞれ約0.016mM、約1.64mMである。 ２ 至適PH 前記したとおり。 ３ 安定PH範囲 PH7.0〜10.5で４℃、24時間の処理でほとんど
失活が起らない。 ４ 作用適温の範囲 PH8.9で25℃より75℃まで温度の上昇とともに
活性は増大する。通常は、30℃において反応を行
なわしめる。 ５ 耐熱性 57℃、15分間の加熱に対して安定である。 ６ 分子量 前記したとおり。 なお ゲルクロマトグラフイーとしてセフアク
リルＳ―200（フアルマシア社製）を用いた。酵母
やロイコノストツク・メセンテロイデスからのグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素は同条件で約10
万の分子量であつた。 ７ 力価の測定法 PH8.9、50mM トリス―塩酸緩衝液中2mMグ
ルコース―６―リン酸、0.5mMNADP、5mM塩
化マグネシウムを含む混合溶液を調製し、その混
合液に適当量のグルコース―６―リン酸脱水素酵
素を加えて、NADP還元型（NADPH）の単位
時間あたりの340nmの吸光度の増加値より力価を
測定し、１分間あたり、１マイクロモルの
NADPHの340nmにおける吸光度を増加せしめる
酵素活性を１単位とした、精製酵素の力価は、30
℃で約100単位／mg精製酵素である。本発明のグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素は、耐熱性にす
ぐれているため、たとえば従来知られている酵母
の酵素が失活する温度、すなわち約50℃〜60℃で
も反応を行なうことが可能である。その温度での
力価はさらに高くなる。 ８ 単一性 精製標品は、PH9.4の7.5％アクリルアミドデイ
スク電気泳動法により陽極側に移動し、単一なバ
ンドを与えた。また、SDS電気泳動法により陽極
側に移動し単一なバンドを与えた。 ９ 元素分析 元素分析値にかえて、アミノ酸組成をモル％で
示す。 アスパラギン酸11.04％、スレオニン5.42％、
セリン4.56％、グルタミン酸11.86％、プロリン
3.66％、グリシン6.67％、アラニン7.92％、シス
チン（システイン）0.62％、バリン6.09％、メチ
オニン1.97％、イソロイシン5.59％、ロイシン
8.04％、チロシン3.72％、フエニルアラニン4.88
％、リシン5.28％ヒスチジン3.40％、アルギニン
6.56％、トリプトフアン2.72％ 10 結晶構造 現在、まだ結晶化されていないので測定してい
ない。 本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵素を
製造するには、次のごとき方法を採用することが
できる。すなわち、パチルス属に属する細菌を培
養し、その培養物から本発明のグルコース―６―
リン酸脱水素酵素を採取することによつて得るこ
とができる。 本発明に使用する細菌は、本発明のグルコース
―６―リン酸脱水素酵素を産生しうるパチルス属
の細菌であり、そのような細菌であれば、いかな
るものでも使用できる。好ましい細菌としては、
たとえば、パチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）があげられる。
ステアロサーモフイルスとしての具体例として
は、ATCC7953、7954、8005、10149、12980、
NCA1503などがある。 本発明における細菌を培養するに際して用いら
れる栄養倍地において炭素源として、たとえば、
グルコース、シユークロース、フルクトース、澱
粉加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、
酢酸、乳酸等の有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸および
グリセリン等が使用でき、窒素源として、たとえ
ば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、アンモニア、アミノ酸、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物
が使用できる。さらに、無機塩類として、たとえ
ばカリウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マ
グネシウム、マンガン、銅、カルシウム、コバル
ト等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、コー
ン・ステイーブ・リカー、ビタミン類、刻酸等を
使用してもよく、細菌の一般的栄養倍地が使用で
きる。 これらの培地を用いて、バチルス属に属する細
菌を20℃〜80℃、好ましくは40℃〜70℃、最適に
は60℃で、約２〜６時間、好気的に培養すればよ
い。また、工業的には、たとえば希釈率（発酵槽
に培地液を供給する速度および同時に発酵槽より
抜出す速度を発酵槽中の培養液量で割つた値）を
使用する菌株の最大比増殖速度の0.3〜1.0、好ま
しくは0.5〜1.0、最適には0.7〜1.0の範囲で制御
しながら連続的に培養する連続培養法も用いるこ
とができる。 次に得られた培養物から、本発明のグルコース
―６―リン酸脱水素酵素が採取されるが、培養
物、分離生菌体、分離菌体の処理物、粗製酵素、
精製酵素等のあらゆる段階で採取できる。精製法
としては、通常の酵素精製法を用いることができ
る。すなわち、遠心分離等により菌体を得た後、
菌体をマントンゴーリン、ダイノミル、フレンチ
プレス、超音波処理等により細胞破砕後、遠心分
離により細胞片を除去し、細胞抽出液を得、これ
に硫酸ストレプトマイシンまたは硫酸プロタミン
処理を行ない、さらには、硫酸アンモニア沈殿、
アセトン沈殿、加熱処理等を行ない、さらに精製
するために、DEAE―セルロースカラム等のイオ
ン交換クロマトグラフイー、ヒドロキシアパタイ
トカラム等の吸着クロマトグラフイー、セフアデ
ツクスクロマトグラフイー等のゲル濾過クロマト
グラフイー等のクロマトグラフイーを組合わせて
行なうことができる。このようにして本発明のグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素を単離、精製す
ることができる。 本発明のグルコース―６―リン酸脱水素酵素
は、熱に対して非常に安定であるから、従来のグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素と比較して、酵
素単離後、これを長期間保存することができる。
このため、生化学の研究、食品、臨床検査分野に
非常に有効である。たとえば、本発明のグルコー
ス―６―リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、
NAD、ATPおよび塩化マグネシウムからなる反
応液を用いて、食品や体液中のグルコース濃度を
精度良く測定することができる。この食品中のグ
ルコース濃度は、転化糖工業において操業分析に
重要であり、体液中のグルコース濃度は、糖尿病
などの診断に利用される。さらに、本発明のグル
コース―６―リン酸脱水素酵素、NAD、および
塩化マグネシウムからなる反応液を用いて、体液
中のグルコース―６―リン酸濃度を測定すること
により、ホスホグルコースイソメラーゼ活性を測
定することができる。これは転移性乳ガンなどの
ガンの検診に利用される。 また、本発明のグルコース―６―リン酸脱水素
酵素は、補酵素としてNADPに比べて非常に安
価なNADに作用する性質を有することから、安
価な検査用薬として経済的な有利性を発揮するこ
とができる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例１、比較例１ ポリペプトン0.5ｇ／dl、酢母エキス0.5ｇ／
dl、サツカロース1.0ｇ／dl、硫酸カリウム0.13
ｇ／dl、リン酸ニトリウム0.644ｇ／dl、硫酸マ
グネシウム0.027ｇ／dl、クエン酸0.032ｇ／dl、
硫酸第一鉄0.0007ｇ／dl、硫酸マンガン0.015
ｇ／dl、PH7.00に調整した培地250を115℃、10
分間加熱殺菌した後、パチルス、ステアロサーモ
フイルNCA1503株を接種し、60℃で３時間、内
圧0.5Kg／m2Ｇで通気培養した。 培養後、水で冷却しながら、直ちに、デラバル
型遠心分離機で菌体を採取し、700ｇの菌体を得
た。得られた菌体を、凍結状態で保存したのち、
凍結菌体300ｇを２倍量の0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）に懸濁し、フレンチプレスを用いて細胞を
十分に破壊後、遠心分離により細胞片を除去し、
グルコース―６―リン酸脱水素酵素を含む粗抽出
液を得た。この粗抽出液600ml当り１％の硫酸プ
ロタミン溶液300mlを添加し、十分撹拌した後、
生じた沈殿を遠心分離で除去し、プロタミン上清
を得た。この上清に固形硫酸アンモニウムを除々
に加えて50％飽和（４℃）とした。生成した沈殿
を遠心分離により集め再び0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.5）にとかし、ついで20倍量の0.1Mリン酸
緩衝液（PH7.5）に対して透析、脱塩した。 あらかじめ、2mMメルカプトエタノール、
2mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む
20mMリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化した
DEAE―セルロースカラムに上記の粗酵素液を通
じ、塩化カリウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶
出せしめると塩化カリウム濃度0.15Mの近くで目
的のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が溶出し
た。この区分を集め、濃縮、脱塩後、さらに、
5mMリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムに、その溶出液を通し、
5mMリン酸緩衝液から250mMリン酸緩衝液の直
線勾配の溶出を行なつたところ、75mM濃度近く
に目的のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が溶
出した。この活性区分を濃縮、脱塩後0.1M塩化
カリウムを含む50mMトリス・塩酸緩衝液を溶出
液に用いたウルトロゲルACA34クロマトグラフ
イーにかけたのちに、さらに溶出した活性区分を
あらかじめ2mMメルカプトエタノール、2mMエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む30mMリ
ン酸緩衝液（PH7.7）で平衡化したDEAE―セフ
アデツクスＡ―50カラムに通じ、塩化カリウムを
上記緩衝液に加えた塩化カリウム濃度0.1Mから
0.4Mの直線勾配で溶出した。その結果、塩化カ
リウム濃度0.2Mの近くで精製されたグルコース
―６―リン酸脱水素酵素が溶出した。 このようにして得たグルコース―６―リン酸脱
水素酵素は、PH9.4の7.5％アクリルアミドデイス
ク電気泳動で陽極側に移動し単一なバンドを与
え、さらに、セフアデツクスＧ―200クロマトグ
ラフイーにおいても、分子量約23万のところに単
一のピークを与えた。 その収量は約10mgで、酵素１mgあたり約100単
位の力価をしめし、その精製度は粗抽出液を１と
すると約1500であつた。 次にこのようにして得たグルコース―６―リン
酸脱水素酵素と比較のため、酵母から得られたグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素（比較例１）の
安定性を調べた。 その結果を第１図および第２図に示す。なお、
第１図は100mMの塩化カリウムを含むPH9.0の
100mMトリス緩衝液中の各温度で15分間加熱し
たときの残存活性を示したもので、曲線Ａが実施
例１、曲線Ｂが比較例１である。第２図はPH9.0
の100mMトリス緩衝液中30℃で保存したときの
残存活性の経日変化を示したもので、曲線Ｃが実
施例１、曲線Ｄが比較例１である。これらの結果
から、明らかなように酵母から得られたグルコー
ス―６―リン酸脱水素酵素は、50℃で15分間処理
することにより、ほぼ完全にその活性を不可逆的
に失うのに対し、本発明のグルコース―６―リン
酸脱水素酵素は50℃では全く活性を失なわなかつ
た。さらに30℃では、酵母から得られたグルコー
ス―６―リン酸脱水素酵素は10〜20日間でほぼ活
性を失うのに対し、本発明のグルコース―６―リ
ン酸脱水素酵素は、50日経過した時点でも活性の
低下は全く認められなかつた。このように本発明
のグルコース―６―リン酸脱水素酵素が驚くほど
熱に対して安定であり、これを長期間保存するこ
とができる性質を有している。この性質は、いま
までのグルコース―６―リン酸脱水素酵素にはな
いものである。 実施例 ２ 30容発酵槽にグルコース1.3ｇ、硫酸アンモ
ニウム1.0ｇ、酵母エキス0.5ｇ、リン酸―カリウ
ム0.5ｇ、リン酸ニナトリウム0.5ｇ、硫酸マグネ
シウム0.1ｇを水道水１に溶解して得た培地を
20張込み、121℃、１Kg／cm2で15分間、加圧蒸
気殺菌した。培養条件を57℃、PH6.5〜7.0（4N―
NaOHで調製した。）、通気量20／分（空気）、
撹拌数900rpmに設定した後、これにバチルス・
ステアロサーモフイルスATCC12980株を上記培
地であらかじめ前培養して得た。660nmでの吸光
度が約1.0に達した溶液を１接種した。まず、
約2.5時間バツチ培養を行ない、660nmの吸光度
が1.0に至つたときに、前記組成の殺菌済み栄養
培地を24.0／hrの速度で定量ポンプを用いて連
続的に供給し、同速度で発酵槽より培養液を抜出
すことにより、100の栄養培地を用いて連続培
養して培養液を得た。培養液を水で冷却しながら
直ちにデラバル型遠心分離機で菌体を採取し400
ｇの菌体を得た。 この菌体を1.5倍量の0.1Mリン酸緩衝液に懸濁
し、ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離
により不溶物を除去し、グルコース―６―リン酸
脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この粗抽出液
400ml当り、10％の硫酸ストレプトマイシン溶液
200mlを添加後、生じた沈殿を遠心分離で除去し、
ストレプトマイシン上清を得た。この上清に硫酸
アンモニウム分離をほどこし、25％飽和（４℃）
から、50％飽和（４℃）の間の分画部を得た。こ
の分画部を50mMトリスー塩酸緩衝液（PH8.0）
にとかした後、あらかじめ上記緩衝液で平衡化し
たDEAE―セフアデツクスカラムに通じ、塩化ナ
トリウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出せしめ
ると、塩化ナトリウム濃度0.2Mの近くで、目的
とするグルコース―６―リン酸脱水素酵素が溶出
した。この溶出部分を実施例１と同様な条件下に
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフイ
ーを行なつたのち、セフアクリルＳ―200カラム
に通じ0.1M塩化ナトリウムを含む30mMトリス
―塩酸緩衝液（PH8.0）で溶出して、実施例１と
同様にアクリルアミドデイスク電気泳動で単一な
バンドを与えるグルコース―６―リン酸脱水素酵
素標品を得た。さらに実施例１と同様にセフアデ
ツクスＧ―200クロマトグラフイーにおいても、
分子量約23万のところに単一のピークを与えた。 収量は約20mgであつた。その力価は酵素１mgあ
たり約100単位であつた。その精製度は粗抽出液
を１とすると約1100であつた。 参考例 １，２，３ 実施例１で得たグルコース―６―リン酸脱水素
酵素を用いて、グルコース濃度が既知の標準血清
を被検液として、グルコース濃度を次のようにし
て測定した。なお、標準血清として、標準血清中
のグルコース濃度が76mg／dl（参考例１）、155
mg／dl（参考例２）および43mg／dl（参考例３）
を有するものを用いた。 測定方法として、まず、100mMのリン酸緩衝
液PH8.51ml当り、グルコース―６―リン酸脱水素
酵素１単位／ml、ヘキソキナーゼ２単位／ml、
NAD2mM、ATP2mM、Mgcl22mMになるよう
に溶解して反応液を得た。この反応液を30℃で５
分間保つたのち、標準血清を20μl添加して混合し
て、30℃で５分間反応させた後、分光光度計を用
いて、340nmの吸光度値を読み取つた。同時に上
記組成の反応液に純水20μlを添加し、30℃で５分
間反応させた後、340nmの吸光度を読み取り、こ
れを対照とし、標準血清の340nmの吸光度から、
対照の吸光度を引いた値を吸光度の増加とした。
次に下記式を用いて、標準血清１dl中のグルコー
ス量（mg）を計算して求めた。 145.8×（吸光度の増加） ＝被検体１dl中のグルコース量（mg） その結果を表１に示す。 【表】
第１図は本発明のグルコース―６―リン酸脱水
素酵素（曲線Ａ）および酵母から得られたグルコ
ース―６―リン酸脱水素酵素（曲線Ｂ）の各温度
における15分間加熱後の残存活性を示す図で、第
２図は、本発明のグルコース―６―リン酸脱水素
酵素（曲線Ｃ）および酵母から得られたグルコー
ス―６―リン酸脱水素（曲線Ｄ）を30℃で放置し
た後の残存活性を示す図である。
素酵素（曲線Ａ）および酵母から得られたグルコ
ース―６―リン酸脱水素酵素（曲線Ｂ）の各温度
における15分間加熱後の残存活性を示す図で、第
２図は、本発明のグルコース―６―リン酸脱水素
酵素（曲線Ｃ）および酵母から得られたグルコー
ス―６―リン酸脱水素（曲線Ｄ）を30℃で放置し
た後の残存活性を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 約50℃の緩衝液中で約15分間処理したのちの
活性が処理前の活性の約80％以上の値を保持して
いる性質を有し、かつ次の理化学的性質を有する
グルコース―６―リン酸脱水素酵素。 (a) 作用及び基質特異性 ヘキソース―６―リン酸＋補酵素（酸化型） ↑↓ ヘキソース・アルドン酸―６―リン酸＋補酵素
（還元型） 上記反応を触媒する。なお、上記式中のヘキソ
ース―６―リン酸は、グルコース―６―リン酸，
マンノース―６―リン酸、ガラクトース―６―リ
ン酸の総称であり、ヘキソース・アルドン酸―６
―リン酸は、グルコン酸―６―リン酸，マンノン
酸―６―リン酸，ガラクトン酸―６―リン酸の総
称である。また、上記式中の補酵素として、ニコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸又
はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドに
作用する。 (b) 至適PH 約9.0（温度30℃）である。 (c) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約23万である。 ２ バチルス属に属する細菌を培養し、培養物か
ら約50℃の緩衝液中で約15分間処理したのちの活
性が処理前の活性の約80％以上の値を保持してい
る性質を有し、かつ次の理化学的性質を有するグ
ルコース―６―リン酸脱水素酵素を採取すること
を特徴とするグルコース―６―リン酸脱水素酵素
の製造方法。 (a) 作用及び基質特異性 ヘキソース―６―リン酸＋補酵素（酸化型） ↑↓ ヘキソース・アルドン酸―６―リン酸＋補酵素
（還元型） 上記反応を触媒する。なお、上記式中のヘキソ
ース―６―リン酸は、グルコース―６―リン酸、
マンノース―６―リン酸、ガラクトース―６―リ
ン酸の総称であり、ヘキソース・アルドン酸―６
―リン酸は、グルコン酸―６―リン酸、マンノン
酸―６―リン酸、ガラクトン酸―６―リン酸の総
称である。また、上記式中の補酵素として、ニコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸又
はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドに
作用する。 (b) 至適PH 約9.0（温度30℃）である。 (c) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約23万である。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
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