JPH0458313B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、ギ酸の製造法に関する。 （従来の技術） 従来、メタノール資化性酵母のアルコールオキ
シダーゼにより、メタノールからホルムアルデヒ
ドを製造しうることが知られている。 （Biotechnolo.Bioeng.，20，333−348（1978））。 CH₃OH＋O₂ ＝HCHO＋H₂O₂ （アルコールオキシダーゼによる反応） H₂O₂ H₂O＋1/2O₂ （カタラーゼによる反応）₃ ＋12₂＝＋₂ （全体） しかしながら、この反応を工業的に行う場合、
アルコールオキシダーゼがその反応生成物である
ホルムアルデヒドにより失活することが問題とな
り、生成した目的産物ホルムアルデヒドを連続的
に反応系外にトラツプするか、さらに有価値で酵
母反応を阻害しない物質に導く必要がある。 本発明者らは、このような方法において、メタ
ノールより一気に高収率で、しかも補酵素の添加
なしにギ酸を製造する方法について種々検討を行
つた。その中で、ホルムアルデヒドデイスミユー
ターゼがホルムアルデヒドを基質として反応する
点（Agric.Biol.Chem.，47(1)，39−46，1983）に
着目して、本発明に到達した。 すなわち、本発明の要旨は、メタノールよりギ
酸を製造する際に、メタノールをアルコールオキ
シダーゼ、カタラーゼ及びホルムアルデヒドデイ
スミユーターゼの共存下で、かつ酸素の存在下に
反応させて、ギ酸に転換することを特徴とするギ
酸の製造法にある。 （発明の構成） 以下、本発明を詳細に説明する。 本願発明においてメタノールからギ酸が製造さ
れる過程を反応式で示すと、以下のようになる。 CH₃OH＋O₂ →HCHO＋H₂O₂ （アルコールオキシダーゼによる反応） H₂O₂ →H₂O＋1/2O₂ （カタラーゼによる反応） HCHO＋1/2H₂O →1/2CH₃OH＋1/2HCOOH （ホルムアルデヒドデイスミユーターゼによる反
応） 12₃＋12₂ →12＋12₂
即ち、補酵素内在型の酵素であると考えられる
ホルムアルデヒドデイスミユーターゼを用いれ
ば、特に補酵素を添加することなく、この基質で
あるホルムアルデヒドに作用し、従つて、メタノ
ールからギ酸へとほぼ100％転換させることがで
きる。 まず、本発明において用いられるアルコールオ
キシダーゼ、カタラーゼは、通常酵母から取得さ
れ、たとえば、メタノール資化性酵母ハンセヌ
ラ・ポリモルフアCBS4732 （Hansenula Polymorpha CBS4732）より得ら
れる。 このハンセヌラ・ポリモルフアCBS4732の菌
学的性質は、たとえば、ザ イースツ（The
Yeasts） ロダ（J.LODDER）第２版（1970）第296〜299
頁に記載されている。 また、その他の酵母の代表的な例としては、ク
ロエツケラsp、（Kloeckera sp、）、キヤンデイ
ダ・ボイデイニイ（Candida boidinii）（いずれ
も、European Jounnal of Biochemistry，64，
341−350，1976）等が挙げられる。 また、本発明方法において用いられるアルデヒ
ドデイスミユーターゼ（アルデヒド不均化酵素）
は、補酵素の添加なしにアルデヒド類の酸化還元
を同時に行なう酸素であり、たとえばシユードモ
ナスプチダF61（Pseudomonas PutidaF61（微工
研条寄第1023号）から得られる。 このシユードモナスプチダF61の菌学的性質を
以下に示す。 第一次鑑別 （オキソイドCM3培地（30℃）で生育させ
た形態と生理観察） 形 態 桿菌 グラム − 芽 胞 − 運動性 ＋ コロニーの形態 淡黄色、円形、不透明、全円、
光沢あり、低凹型、24時間に直径約0.5mm 生育温度（℃） ５ ＋ 37 ＋ 41 − 45 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ Ｏ−Ｆテスト ０ 一次鑑別による同定：グラム陰性、酸化により糖
を分解。 第二次鑑別 ピオシアニン − 螢 光 ＋ DL−アルギニン ＋ ベタイン ＋ グルコース ＋ 乳酸塩 ＋ 酢酸塩 ＋ ペニシリンＧ − ストレプトマイシン ＋＋＋ クロラムフエニコール − テトラサイクリン ＋＋ ノボピオシン − ポリミキシンＢ ＋＋ ０／129 − レバン − 生育因子要求性 − グルコースからのガス生成 − グルコースからの酸生成 ＋ ONPG − アルギニンジヒドロゲナーゼ ＋ リジンデカルボキシラーゼ − オルニチンデカルボキシラーゼ − 硝酸塩から亜硝酸塩への還元 − 硝酸塩から窒素ガスへの還元 − デオキシリボヌクレエース − ゼラチン含有高層培養（20℃） − ゼラチン含有平地培養 − カゼイン加水分解 − 澱粉加水分解 − 卵黄反応 − リパーゼ活性 NH₃ ＋ インドール − H₂S − “トウイーン（Tween）80”加水分解 − 以上により、本菌株は、シユードモナスプチダ
と同定された。なお、固定に際しては、 （）バージーズ（Bergey′s） マニユアル
（Manual） オブ（of） デイターミネイテイブ
（Determinative） バクテイオロジー
（Bacteriology），8th edition（1974）及び（）
コーワン（Cowan）らのマニユアル（Manual）
フオア（for） ジ（the） アイデンテイフイ
ケーシヨン（Identification） オブ（of） メ
デイカル（Medical） バクテリア（Bacteria）
（1974）が参照された。 この微生物の培養に必要な栄養物としては、と
くに限られるものではなく、通常微生物の培養に
用いられるものが利用される。たとえば、炭素源
としては、グルコース、シユクロース、フラクト
ース、グリセロール、ソルビトール、糖密、澱粉
加水分解物等の糖質、酢酸、フマル酸等の有機
酸、等が利用される。窒素源としては、硝酸塩
類、アンモニウム塩類、コーンステイ−プリカ
−、酵母エキス、肉エキス、酵母粉末、大豆加水
分解液、綿実粉、ポリペプトン、ペントン等が挙
げられる。無機塩としては、リン酸カリウム、リ
ン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム等が利用できる。 培養温度は20〜40℃、特に25〜37℃が好適であ
る。培養は、通常16〜72時間程度、好気的に行な
われる。 このようにして得られるアルデヒドデイスミユ
ーターゼは、主として微生物の菌体内に存在して
おり、培養物より採取した菌体自体を使用するこ
ともできるし、さらに超音波処理、硫安分別、イ
オン交換クロマトグラフイー、ゲル過等の公知
の方法によつて分離精製して使用することもでき
る。 すなわち、培養後得られた菌体を遠心分離によ
つて集めた後、超音波処理、ホモゲナイザー、ガ
ラスビーズによる磨砕等の機械的手段又は細胞壁
溶解酵素等による化学的手段により細胞を破砕し
た後、遠心分離により上清を得る。つぎに、この
上清を硫安分別、“DEAE−セフアセル”等のイ
オン交換クロマトグラフイー、ハイドロキシアパ
タイト等による吸着クロマトグラフイー、“セフ
アクリル”、”セフアデツクス”等によるゲルクロ
マトグルフイー等、フエニル−クロルセフアロー
ス等による疎水クロマトグラフイー等の組み合わ
せで精製される。 この精製酵素の性質は次のとおりである。 () 分子量：2.2×10⁵（ゲルろ過） （5.5×10⁴のサブユニツト４個） () 等電点：PH4.8 () 至適PH：8.0 () 至適温度：40℃ () HgCl₂、PCMB（ｐ−クロロマ−キユリ−
ベンゾエート）、 ヨウ化酢酸、Zn、Cu、Feで阻害される。 本発明方法においては、メタノールを、上記ア
ルコールオキシダーゼ、カタラーゼ及びホルムア
ルデヒドデイスミユーターゼの共存下で、かつ酸
素の存在下に反応させる。 反応は、通常PH5.5〜9.5、好ましくはPH７〜９
で、通常使用される緩衝液、たとえばリン酸カリ
ウム等、中で行なわれる。 本発明における上記酵素類は、精製物に限ら
ず、菌体（固定化菌体も用いうる）、抽出液、粗
精製物いずれの形でも用いられるが、反応温度は
通常10〜45℃、好ましくは30〜40℃である。 反応時間は、デイスミイターゼ等の酵素の使用
量（通常0.01〜10ユニツト程度）、基質の濃度お
よび種類ならびに反応温度によつて異なるが、10
分〜100時間、通常30分〜48時間程度から選ばれ
る。基質であるメタノールの濃度は、通常１ｍＭ
〜数Ｍから選ばれる。酸素は、たとえば空気又は
酸素吹込み法により存在させることができるが、
その量は、通常、メータノールの等モル量以上が
用いられる。 このようにして得られた生成物は常法にしたが
つて、たとえばイオン交換樹脂処理、等によつて
単離される。 （発明の効果） 本発明方法によれば、メタノールより、補酵素
の添加を必要とせず、中間生成物のホルムアルデ
ヒドの阻害を受けることなく一気にギ酸を高収率
で得ることができる。 （実施例） 以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明
する。 なお、実施例中、FDMはホルムアルデヒドデ
イスミユーターゼ、AODはアルコールオキシダ
ーゼ、CATはカタラーゼを意味する。 実施例 １ （使用菌株） メタノール資化性酵母、Hansenula
PolymorphaDL1をＡ倍地（表１）で30℃、48時
間振とう培養し、集菌・洗浄後凍結保存（−15
℃）した。FDM生産菌、Pseudomonas putida
F61はＢ培地（表２）で30℃、72時間振とう培養
し、上と同様に凍結保存した。

【表】 上記の棒地１を２容坂口フラスコに入れ
る。

【表】 表２ Ｂ倍地の組成 ペプトン 10ｇ 肉エキス ５ NaCl ５ K₂HPO １ グリコース 10 脱イオン水 1000ml PH 7.0 上記の培地１を２容坂口フラスコに入れる。 （酸素の精製） () AODおよびCAT：H.polymorpha DL1の
菌体を超音波破砕して得た無細胞抽出液を硫安
沈澱（80％飽和）し、透析した後 DEAE−セフアセルのカラムにかけた。CAT
は0.1Mリン酸緩衝液で、AODは0.1Mリン酸緩
衝液＋0.2MNaClで溶出された。各活性画分を
集めて硫安沈殿（80％飽和）し、透析した後冷
蔵庫に保存した。この状態でAODは２週間程
度は安全であるが、それより長期間の場合には
酵素液を等量のグリセロールと混合して−15℃
以下に保存する必要がある。 () FDM：P.putida F61の無細胞抽出液をプ
ロタミン処理した後アセトン分画し、DEAE−
セフアセルカラムクロマトグラフイーによつて
精製した。 使用した各酵素標品の活性は表３に示したとお
りである。ここで、１分間に1μmolの基質を変化
させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。 表３ 部分精製酵素の比活性 酵素 比改正 （μmol／mm・mg蛋白） 7.58 CAT 6600FDM 90.9 （反応条件） 反応液組成は0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）、0.1
〜1Mメタノール、5.7U／mlAOD、200U／ml
CAT、50U／mlFDMを含み、全量を5.0mlとし
た。反応は30℃で、PHスタツトを用い
0.1MNaOHでPH7.5に保ちながら行つた。また、
純酸素をボンベで反応液に吹き込んだ。 結果を表４に示す。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ メタノールよりギ酸を製造する際に、メタノ
   ールを、アルコールオキシダーゼ、カタラーゼ及
   びホルムアルデヒドデイスミユーターゼの共存下
   で、かつ酸素の存在下に反応させて、ギ酸に転換
   することを特徴とするギ酸の製造法。