JPS6344899A - 酵母による分泌型タンパク質の生産方法 - Google Patents

酵母による分泌型タンパク質の生産方法

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JPS6344899A
JPS6344899A JP62191475A JP19147587A JPS6344899A JP S6344899 A JPS6344899 A JP S6344899A JP 62191475 A JP62191475 A JP 62191475A JP 19147587 A JP19147587 A JP 19147587A JP S6344899 A JPS6344899 A JP S6344899A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野）　　　。
本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に関する。１つの面に
おいて、本発明は異種タンパク質の分泌に関する。他の
面において、本発明は酵母の原栄養株が生育し得ない炭
素源上での酵母菌株の生育に関する。
（従来の技術） 組換えＤＮＡ技術を使用して種々のポリペプチドを生産
する開業的努力は、今まで、主に宿主生物として大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に集中していた
。しかしながら、いくつかの場合において、大腸菌は宿
主として不適当であることが判明した。
例えば、大腸菌は医薬品として有用なあらゆるポリペプ
チドから排除されねばならない多数の毒性発熱４因子を
含む。この精製が達成される効率は、もちろんそれぞれ
のポリペプチドにより変化するであろう。さらに、大腸
菌のタンパク質分解作用はいくつかの有用な生産物の収
量をかなり減少させる。その上、大腸菌により高レベル
で発現されるタンパク質はしばしば細胞封入体の中に包
み込まれるので１．可溶化するのが困難である。従って
、大腸菌からの生理活性タンパク質の回収は往々にして
煩雑である。大腸菌のタンパク質産物の回収において直
面する困難性、ならびにこの種のタンパク質の低い生物
学的活性は、大腸菌がある種の翻訳後プロセッシング（
例えば、組換えＤＮＡ技術により生産されたタンパク質
のグリコシル化）を行えない結果である。これらおよび
他の考察は別の宿主への関心を高め、特にポリペプチド
産物を生産するための真核生物の使用に対して興味が高
まっている。
真核生物系（例えば酵母）においてポリペプチド産物を
生産する方法が利用できれば、組換えＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドの生産のために大腸菌のような原
核生物系を使用することに比べて顕著な利点が提供され
るだろう。酵母は、大規模な大腸菌発酵の出現が比較的
最近であるのに対して、数世紀もの量大規模発酵におい
て利用されてきた。酵母はしばしば細菌よりも高い細胞
密度へ増殖することができ、しかも連続発酵法に容易に
適合し得る。実際に、ピチア・バストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　）のような酵母の超高細胞密度
（すなわち１００，９／Ａ以上の細胞密度）への増殖が
ウニブナ−（Ｗｅｇｎｅｒ　）の米国特許第４４１４３
２９号明細書（フィリップス・ペトロレウム社に譲渡）
に開示されている。
酵母宿主のさらに別の利点は、この生物の多くの重要な
機能（例えば酸化的リン酸化）がオルガネ→の中に存在
し、その結果野生型宿主細胞にとって外来性のポリペプ
チドの生産に関して起こりうる有害な作用にさらされな
いということである。
この種の有害作用を回避する別の方法は、異種タンパク
質（すなわち、ｉ換えＤＮＡ技術を用いて生産される外
来性タンパク質）を分泌型で生産することであ呂。異種
タンパク質の分泌は宿主細胞に対する影響を減する利点
をもつばかりでなく、さらに生産物の゛精製が簡単なこ
と、グリコシル化される場合にタンパク質の安定性が増
大すること、および細胞中のタンパク質分解酵素への目
的生゛産物の接触が減少することなとめ利点を有する。
また、酵母は真核生物として高等生物と同じコドン優先
性を示すことが可能であり、こうして哺乳動物遺伝子ま
たは例えば哺乳動物がｍ　Ｒ’　Ｎ　Ａからの逆転写に
より得られる相補Ｄ’ＮＡ　（ｃ　ＤＮＡ　）からの発
現産物をより効果的に生産する傾向がある。
発現されたポリペプチド産物をグリコシル化する酵母の
能力、ならびにとの種のグリコシル化の程度およびパタ
ーンは、グリコクル化がポリペプチド産物の生理活性に
とって重要である場合には大切な考慮すべき事柄である
。組換えＤＮＡ技術により発現されたポリペプチド産物
を一貫した方法でグリコシル化する能力は非常に望まし
いだろう。
いくつかの変換方゛法において酵母を使用する際に起こ
りうる１つの欠点は、多数の酵母菌株を生育する炭素お
よびエネルギー源の範囲が不都合なことに制限されると
いうことである。例えば、ピチア・バストリスの菌株は
ショ糖または乳糖を利用する能力をもたず、従ってこれ
らの入手しやすい安価な炭素源上で生育することができ
ない。他の例として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ
ａ−ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
）の菌株は乳糖を利用する能力をもたず、この場合もこ
の入手しやすい安価な炭素源上で生育できない。従って
、種々の酵母菌株が安価な炭素およびエネルギー源上で
生育できる能力をもつようになれば、非常に望ましいで
あろう。　　　　　″ 、　　　（１７＋ （発明の目的） 本発明の１つの面は、ｍｌ換えＤＮｈａｍ酵゛母から′
高マンノース型′囃乳動物タンパク質のグリコシル化パ
ターン゛をもつタンパク質を分泌させる方法の開発−関
する。
本発明の他あ面は、野生型酵母菌株が炭素およびエネル
ギー源として同化し得ない基質上で酵母菌株を生育させ
る方法の開発−関する。゛本発明のさらに別の面は、野
生型酵母菌株が生育のために利用し得ない炭素およびエ
ネルギー源上で生育する能力をもつ新規な酵母菌株を提
供する。　　　　　　“ 本発明のさらに別の面は、酵母による異種タンパク質の
飼御された発現および分′泌にとって有用な新規ＤＮＡ
フラグメントを提供する。
本発明のこれらおよび他の面は以下′の記載内容、図面
および特許請求の範囲を考察することにより明らかにな
る゛であろう。
（発明の構成） 本発明によれば、酵母プロモーターおよび酵母−ｈｓｌ 分泌シグナルの制御下にピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属の宿
主細胞内で目的タンパク質をコードする核酸配列を発現
させることにより、高マンノース型補乳動物タンパク質
のグリコシル化パターンをもつタンパク質を生産する方
法が開発された。
本発明に従って生産されたタンパク質は、他の哺乳動物
以外の宿主系を用いる組換えＤＮＡ技術（より作られた
タンパク質よりも哺乳動物タンパク質のグリコシル化パ
ターンによく似たグリコシル化パターンをもち、それ故
に天然に存在するタンパク質と類似した物理的、化学的
および生物学的性質をもつと思われる。さらに、本発明
のグリコシル化生産物は分泌型で生産されるので、異種
タンパク質が細胞外物質としてではなく細胞内物質とし
て生産される。場合の生産物の単離に比べて、生産物の
精製が非常に簡単である。
さらに本発明によれば、初めに野生型酵母に存在しない
遺伝子機能の発現および分泌をコードする新規ＤＮＡフ
ラグメントで酵母を形質転換し；その形質転換体を非選
択培地上で再生し；そしてその再生形質転換体を、形質
転換のために使用した新規ＤＮＡフラグメントを組み込
んだコロニーのみが生育しうる選択増殖培地にさらす；
ことから成る野生型酵母菌株が生育のために利用し得な
い炭素およびエネルギー源上で生育する能力を酵母菌株
に与える方法が開発された。前記工程に従って選択され
た形質転換体は、野生型酵母菌株が上記ＤＮＡフラグメ
ントの導入ならびにその遺伝子産物の発現および分泌な
しでは生育のために利用し得ない基質上で生育すること
ができる。
本発明のこの面に従って作られた新規菌株は容易に入手
しうる安価な炭素源上で生育しうる。
本発明の１つの面によれば、高マンノース型哺乳動物タ
ンパク質のグリコシル化パターンと実質的に類似したグ
リコシル化パターンをもつタンパク質は、プロモーター
および酵母分泌シグナル（例えばサッカロミセス・セレ
ビシエのインベルターゼ遺伝子分泌シグナル）の制御下
にピチア属の宿主細胞内で目的タンパク質をコードする
コード配列を発現させることにより）、酵母から分泌型
で生産される。
本発明に従って発現されるタンパク質には、高マンノー
ス型補乳動物タンパク質のグリコシル化パターンと類似
したグリコシル化パターンにより特徴づけられるタンパ
ク質が含まれる。このようなパターンは一般にグリコシ
ル化部位当たり平均して５〜９のマンノース単位の結合
を含み、そして各グリコシル化部位でグリコシル化の、
ために使用された糖単位の約７１％以上（しかし８２％
以下）は通常マンノース糖単位である。本発明によれば
、ピチアによって与えられたグリコシル化パターンは一
般にグリコシル化部位当たり平均して９〜１４マンノ一
ス単位の結合を含み、そ七て各グリコシル化部位でグリ
コシル化のために使用された糖単位の約８０％以上（し
かし８８％以下）はマンノース糖単位であることが見出
された。従って、高マンノース型哺乳動物タンパク質の
グリコシル化パターンに対するピチア誘導グリコシル化
パターンの実質的類似性のために、、ピチアによりグリ
コシル化されたタンパク質は高マンノース型哺乳動物グ
リコシル化パターンをもつオーセンティックタンパク質
とよく似た物理学的構造および生物学的活性の両方をも
つことが期待できる。
“高マンノース型”哺乳動物グリコシル化パターンの上
記定義に含まれるタンパク質の例には以下のものが含ま
れる： ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｍ　　ｅ　ｎ　ｖタンパク質、ニワト
リ卵アルブミン、 シンドビス（５ｉｎｄｂｉｓ）ウィルスタンパク質、ウ
シロドプシン、 ヒト免疫グロブリン、および ウィルス抗原など。
本発明において使用されるピチア菌株の例にはピチア・
パストリスＮＲＲＬＹ−１１４３０、ピチア・パストリ
スＮＲＲＬＹ−１１４３１、ピチア・パストリスＮＲＲ
Ｌ　Ｙ−１５８５１、ピチア・パストリスＮＲＲＬ　Ｙ
−１８０１４、ピチア′・パストリスＮＲＲＬ　Ｙ−１
８０１７などが含まれる。
酵母宿主内で遺伝子発現を調節すべ（機能する調節領域
はどれも本発明の実施にＳいて使用するのに適している
。本明細書で用いる”調節領域″なる用語は、制御され
た遺伝子発現にとって必要な様々な機能、例えばプロモ
ーター領域、上流活性化因子配列、異化産物感受性領域
などを含むものである。当分野で習熟した者は、性状決
定がなされ且つ本発明の実施において使用し得る多数の
調節領域を熟知しているであろう。
酵母による遺伝子発現を調節する調節領域の例にはサッ
カロミセス・セレビシエから単離された酸ホスファター
ゼ、インベルターゼ、α接合因子およびグリセルアルデ
ヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの調節領域；ピ
チア・バストリスかう単離された第１アルコールオキシ
ダーゼ（ＡＯＸｉ　）、ジヒドロキシアセトンシンター
セ（ＤＡＳＩ）およびｐ４０の調節領域；ピチアＨＩＳ
４調節領域などが含まれるが、これらに限定されな本発
明の実施において使用される目下の好適な調節領域は、 （１）メタノール、 （２）非異化産物抑制炭素源（例えばグリセロール、ガ
ラクトース、アセテートなど）、（３）　　異化産物抑
制炭素源（例えばグルコース、エタノール、フルクトー
スなど；それに続く炭素源の飢餓）、 を含有する培地に応答するそれらの能力により特徴づけ
られる。
これらの目下の好適な調節領域の例は第１．２および３
図に示す制限地図により表わされる。第１図に示す調節
領域はピチア・バストリスの第１ジヒドロキシアセトン
シンターゼ（ＤＡＳＩ）遺伝子から誘導される。第２図
に示す調節領域はピチア・パストリスの第１アルコール
オキシダーゼ（ＡＯＸＩ　）遺伝子から誘導される（ピ
チアは以後ＡＯＸ１およびＡＯＸ２と呼ばれる２種のア
ルコールオキシダーゼ遺伝子をもつ）。第３図に示す調
節領域はピチア・パストリスのｐ４０遺伝子から誘導さ
れる。当分野で習熟した者は、上記性質をもつ他の調節
領域が例えばピチア・バストリスのようなメチロトロー
フ酵母から単離し得ることを認めるであろう。上記の調
節領域の性質と類似した調節特性をもつこのような別の
調節領域もまた本発明の範囲に含まれるものである。
酵母分泌シグナルの例にはサッカロミセス・セレビシエ
から単離したインベルターゼ、酸ホスファターゼの分泌
シグナル；ピチア・パストリスから単離した酸ホスファ
ターゼ分泌シグナルなどが含まれる。
本発明の実施において使用する目下の好適な分泌シグナ
ルはインベルターゼ遺伝子の分泌シグナルである。本発
明の実施において使用するこの好適な分泌シグナルは次
のアミノ酸配列をコードする遺伝子である： Ｍｅ　ｔ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌ　ｎ−Ａｌ　ａ
−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ａｌ
　ａ−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１
１ｅ−８ｅｒ−１ａ− １つのこのようなヌクレオチド配列は次の５７塩基対フ
ラグメントによって表される： ＡＴＧ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＴＴＣ−Ｃ
ＴＴ−ＴＴＣ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＣＴ−ＧＧＴ−ＴＴ
Ｔ−ＧＣＡ−ＧＣＣ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＴＣＴ−ＧＣＡ
−。
所定のプロモーター、分泌シグナルおよび目的とするコ
ード配列は当分野で習熟した者に知られた技術を用いて
連続配列で連結し、それにより新規のＤＮＡフラグメン
トを形成する。これらの新規ＤＮＡフラグメントを用い
てピチア属の宿主菌株を形質転換し、その後使用したプ
ロモーターを活性化する条件にその形質転換宿主細胞を
さらして、所望の高マンノース型哺乳動物グリ、コシル
化パターンをもつ分泌型の目的タンパク質を発現させる
。本発明の別の態様によれば、酵母細胞は意図する炭素
／エネルギー源の代謝に必要とされる遺伝子機能をその
宿主酵母細胞に与えることにより、酵母細胞が通常代謝
し得ない炭素／エネルギー源上で生育する能力をもつよ
うになる。
本発明のこの態様に従って使用される宿主酵母細胞は原
栄養株（プロ））ローフ）または栄養要求、変異株のい
ずれかであり得る。原栄養株を使用することの利点は、
それらが容易に入手できしかも往々にして栄養要求変異
株よりも良好な生育能をもつということである。一方、
栄養要求変異株は形質転換体の選択を可能にし、また欠
失遺伝子機能の相補性による形質転換体に対する選択圧
の連続適用を可能にするものである。
ピチア属のいくつかの菌株が欠いている遺伝子機能には
ショ糖（すなわちインベルターゼ遺伝子）、メリビオー
ス（すなわちα−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ラクトー
ス（すなわちβ−ガラクトシダーゼおよびラクトースパ
ーミアーゼ遺伝子）、マルトース（すなわちβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子）のような炭素／エネルギー源の利用
に関与するものが含まれる。
ピチア・パストリスを形質転換するための実験方法は以
前に開示されており〔フレラグ（Ｃｒｅｇｇ）ら、モル
・アンド・セル・ビオル（ＭｏＡ！、　＆　Ｃｅ１ｌｌ
ｌ。
Ｂｉｏｌ、　）＋第５巻、第３３７６〜３３８５頁（１
９８５年）を参照〕、以下（実施例１）でより詳しく説
明する。サツカロミセス・セレビシエヲ形質ｌり＾ 転換するための実験方法はイ）−（Ｉｔｏ）らによって
すでに開示されていゲジエー・バクチリアル（Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉ（１０）、　）　！第１５３巻、第１６３
〜１６８頁（１９８３年５を参照〕。
本発明は今や次の非限定的実施例に関して詳細に説明さ
れるであろう。
（実施例） 次の試薬および培地は以下の実施例全体を通ｔ７て使用
される： ＳＥＤ　　　２Ｍソルビトール ０．２Ｍ　　ＥＤＴＡ ＬＭ　　　ＤＴＴ −一−ｐＨｓに調整 ＳＣＥ　　　２Ｍ　　ソルビトール １Ｍ　クエン酸ナトリウム ２Ｍ　　ＥＤＴＡ ＣａＳ　　　ＩＭ　　ソルビトール １Ｍ　　）リス−Ｈｃ　ｌ　（ｐ　Ｈ７，５）ＩＭ　　
ｃｚｃｚ２ ＰＥＧ　　　２９　　ＰＥＧ４’ＯＯＯ溶液　　　　７
．、。
−−−Ｈ，Ｏを用いて全容量１０−にするＳＯ８ＩＭ　
　ソルビトール ０．３ＸＹＰＤ培地 １０ｍＭ　　ＣａＣ１１゜ レムリ泳　６２．５ｒｒＬＭ　　）リス−Ｈｃｌｌ　（
ｐＨ６，８）１０％　グリセロール ５％　２−メルカプトエタノール ０．０１％　ブロムフェノールブルー インベル　０．（１８Ｍ　　酢酸ナトリウム、ｐＨ５，
１０，２％　トリトンＸ−１００ グルコ−３，ＯＵ／ｍＪ　　／ｙコニーオキシターセ試
薬　　０．１５Ｆｎｇ／プ　ロージアニシジン０．１ｍ
ＭＮ−エチルマレイミド ０．０１Ｍ　　リン酸カリウム、ｐ　Ｈ７，０ＹＰＤ　
　酵母エキス（１０ｇ）、ペプトン（２０ｇ）Ｒよびデ
キストロース（１０，１／リットルＭＤ　　　アミノ酸
不含酵母窒素塩基 （ＹＮＢ、１３．４ｇ）、デキストロース（ｌｏｇ）、
およびビオチン（４００μＦ　）／リットル ＭＳｕ　　ＹＮＢ　（１３，４，ｌｉ’　）、ショ糖（
１０，！ｉ’）、およびビオチン（４００μＥｌ’）／
リットル発酵培地０ｉは全培地１００−当たりの所定成
分のミ′リグラム数である）　　　　 全ての菌株はＭＭ最少培地に維持した：（ＫＨｚ　Ｐ　
Ｏａ　’　８７：５’ｎ９％；　Ｋ、　ＨＰＯ，＋　１
２．５１＃％；　（ＮＨ４）　＊ＳＯ４’　１００”ｌ
Ｐ％　；　Ｍ９ＳＯａ　”　７Ｈｔ０．５０ｍ１ｉｉ’
％；　Ｎ　ａ　Ｃｌ　＋１（１４％　；　ＣａＣｌ　ｔ
　・Ｈ２０，１０００％；　Ｆ　ｅ　ｃ　ｔ　３　・ｓ
　Ｈ２０＋５Ｈｇ％；　Ｚｎ５Ｏ，・７Ｈ，０，７ｎｇ
％；　Ｈ３ＢＯ４、１ｎｇ％；ＣｕＳＯ４−５Ｈｚ０．
１　ｎｇ％；Ｋ１．１　ｎｇ％）、ｐＨ５，８：必要に
応じて１％グルコースまたは１％ショ糖、５Ｈｇ％ビオ
チン、および２■％ヒスチジンを補給する。
ケモスタット培養は２リツトルのＩＸＦＭ−２１最少培
地中で開始させた：（８５％Ｈ３Ｐ０，１３．５　ｍＬ
　／　１００　ｍＬ　；　ＣａＳＯ４・２　Ｈｚｏ、　
１５１１！５７　；に、Ｓｏ、、２３８ダ；　Ｍ　ｇ　
Ｓ　（１４・７Ｈ！０．１９５■％；ＫＯ）Ｌ　６５■
％；Ｆ　ｅ８（１４　・７Ｈ２ＣＬ　　６．５ｊｇ％：
Ｃｕ　Ｓ　（１４　・５Ｈｒ０，６７”５７　％　；　
Ｚｎ　Ｓ　（１４　・７　Ｈ２，０，２０Ｔｎ９％；Ｍ
ｎ３Ｏ４・Ｈｔｏ、３”９％；ビオ千ｙ、４．１　ｎｇ
％；ダウ・コーニングＦＧ−１０アンチフオーム、８滴
／リットル；必要に応じて２％グルコースまたはショ糖
を補給し且つＮＨ，ガスでｐ　Ｈ４，０に保持する。
ベクター カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ　、）およびポットスタイ
ン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　）、　Ｎ　Ａ　Ｒ第１１巻：ｉ
ｌ　９４３頁（１９８３年）に記載されるように一すツ
ガロミセス・セレビシェ由来の５ＵＣ２遺伝子はすでに
単離され、その塩基配列が決定されている。プロモータ
ー、シグナル配列および構造遺伝子の位置はカールソン
およびポットスタインによって図示され、説明された。
アルコールオキシダーゼ（ＡＤＸＩ　）遺伝子およびそ
のプロモーターはすでに単離され、エリス（Ｅｌｌｉｓ
）ら、モル・セル・ビオ＃　（Ｍｏｌ　、　ｅｅｌ　ｔ
。
ｇｉｂｌ、　）第５巻：第１１１１頁（１９８５年）に
記載されている。ＡＯＸ１プロモーターの制限地図は第
２図に示す。
本明細書中で論じられるピチアおよびサツカロミセスの
インベルターゼに基づく分泌ベクターは上記の５ＵＣ２
およびＡＯＸ１配列、ならびにベクターの保持および選
択に必要な種々の他の成分を用いて構築された。
人、細胞増殖 １、　ピチア・パストリスＧＳ　１１５　（ＮＲＲＬＹ
−１５８５１）のコロニーをＹＰＤ培地約１０−に接種
し、３０℃で１２〜２０時間振と５培養する。
２　約１２〜２０時間後、細胞を約０．０１〜０．１の
０１）　６００に希釈し、そして対数期の細胞なＹＰＤ
培地中３０℃で約６〜８時間維持する。
１　約６〜８時間後、ＹＰＤ培地１００−に約０．１の
□　Ｄ　６００の種培養物０．５−（または等量）を接
種し、３０℃で約１２〜２０時間後とうする。
４　　（）ｐ６００が約０．２〜０，３になったとき（
約１６〜２０時間後）培養物を１５００Ｘｇで５分遠心
し、集菌する。　　。
Ｂ、スフェロプラストの調製 １、滅菌水Ｉｏｎ／で細胞を１回洗う。（工程１〜５の
遠心はすべてｉ５ｏ、ｏｘｙで５分間行う。）２　新た
に調製したＳＥＤ１０ｍ／で細胞を１回洗う。
３、滅菌１Ｍソルビトール１０プで細胞を２回洗う。
４、ＳＣＥ緩衝液１０プ中に細胞を再懸濁する。
５．４を／ｄチモリアーゼ６０，０００（マイルズ・ラ
ボラトリーズ）５〜１０μｌを加え、細胞を３０℃で約
３０〜６０分間インキュベーションする。
スフェロプラストの調製は形質転換法において重要な工
程であるので、スフェロプラストの形成を次のようにし
て監視すべきである：チモリアーゼの添加前または添加
直後およびインキュベージ６ｊ ョン期間中のいろいろな時期に、細胞の１００μ！アリ
コートに５％５ＤＳ９００μｌおよび１Ｍソルビトール
９００μｌを添加する。細胞がＳＤＳ中に溶解するがソ
ルビトールには溶解しない時点（通常３０〜６０分のイ
ンキュベーション）でインキュベーションを停止する。
６、スフェロプラストを滅菌ＩＭフルビーール１０ｍ／
中１０００Ｘ、９で５〜１０分遠心することにより２回
洗う。（遠心時間および速度は変化しうる；スフェロプ
ラストを沈澱させるのに十分であるが、それらを遠心力
で破壊しない程度に遠心する。） ７、滅菌ＣａｓｌＯｍＪで１回細胞を洗う。
８、全量０．６ＷＬｌのＣａｓ中に細胞を再懸濁する。
Ｃ０形質転換 １、ＤＮＡ試料（容量２０μ！以下）を１２×７５顛滅
菌ポリ、プロピレンチューブに加える。（ＤＮＡは水ま
たはＴＥ緩衝液中に存在すべきである；少量のＤＮＡで
最大形質転換頻度を得るために、約１μｌの５ｒｎ９／
−超音波処理大腸菌ＤＮＡを各試料に添加することが得
策である。） λ　各ＤＮＡ試料にスフェロプラスト１００μｌを加え
、室温で約２０分間インキュベーションする。
３゜各試料にＰＥＧ溶液１−を加え、室温で約１５分間
インキュベーションする。
４、試料を１１００Ｏｘで５〜１０分間遠心し、ＰＥＧ
溶液をデカントする。
５、試料を８（１８１５０μｌ中に再懸濁し、室温で３
０分間インキュベーションする。
６、滅菌１Ｍソルビトール８５０μｌを加え、以下で述
べるように試料のアリコートをまく。
１、再生寒天培地の処方： ａ、寒天−ソルビトール−９１バクトー寒天、５４．６
９ソルビトール、２４０ｍＪＨ，Ｏ、オートクレーブ滅
菌。
ｂ、１０Ｘグルコース−２０，９デキストロース、１０
０−ＨｔＯ、オートクレーブ滅菌。
ｃ、　：１ｏｘ　Ｓ　Ｃ−６，７５、ｌｉ’酵母窒素塩
基−（３ｓ） （アミノ酸不含）、１００ＷＬＩＨ，０、オートクレー
ブ滅菌。（オートクレーブ滅菌の前または後に２００μ
９／１１１１の濃度までの所望アミノ酸または核酸を加
える。） ｄ、溶融した寒天−ソルビトール溶液３００ＩＭＫ１０
ｘグｙｖコーｘ３０ｍ／！および１０１０Ｘ５Ｃ３０を
加える。０．２１１１９／ｍ／ビオチン０．６ｄおよび
他の所望のアミノ酸または核酸を２０μ９／ＴＲＩの濃
度で加える。溶融した再生寒天培地を５５〜６０℃に保
持する。
２　形質転換試料の平板培養： 形質転換試料を準備する少なくとも３０分前に、プレー
ト当たり１０−の再生寒天培地の下層寒天を注入する。
形質転換試料がＳＯ８中に存在する間に、４５〜５０℃
の浴中のチューブに再生寒天培地の１０献アリコートを
分配する。再生寒天培地を加えたチューブに上記の形質
転換試料のアリコートを加え、プレートの下層寒天の上
に注入する。４５〜５０℃に保持した溶融再生寒天培地
の１０献アリコートに一定量の各試料を加え、再生寒天
培地の固体の１０ｄ下層寒天を含むプレート上にそれぞ
れ注入する。
λ　スフェロプラスト調製物の品質の測定＝１つの試料
１０μノを取り出し、１Ｍソルビトール９９０μノに加
えて１００倍に希釈する。
１００倍希釈物１０μノを取り出し、１Ｍソルビトール
の第２の９９０μ！アリコートに加えてさらに１００倍
に希釈した。ＹＰＤ寒天培地に両方の希釈物１００μｌ
をスプレッダ−でまき、スフェロプラスト調製物中に残
存するスフェロプラスト化されていない完全細胞の濃度
を測定する。各希釈物１００μｌを４０μｍ１７ｍ１ヒ
スチジンを補給した再生寒天培地１０ｍに加えて、再生
可能な全スフェロプラストを測定する。形質転換実験に
とって良好な値は１〜３×１０　全再生可能スフェロプ
ラスト／−および約ｌＸｌ０”完全細胞／ゴである。
本　プレートを３０℃で３〜５日間インキエベーション
する。
■、サッカロミセス・セレビシエ Ｓ．セレビシエの形質転換はイト−（Ｉｔｏ）らの方法
〔ジエー・バクテリオ−ｙｖ　（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、）。
第１５３巻、第１６３〜１６８頁（１９８３年）を参照
〕に従って実施した。
第４図４１８．セレビシェ５ＵＣ２遺伝子のプロモータ
ー、シグナル、および構造部分から成るピチアベクター
ｐＴｓＵ１の線状制限地図を表す。使用した発現カセッ
ト（すなわちプロモーター、シグナル配列および構造遺
伝子）の３つの成分は以後プロモーター−シグナル−構
造遺伝子という短縮形で呼ばれる。従って、ｐＴｓＵｌ
において使用される発現カセットは５ＵＣ２−８ＵＣ２
−８ＵＣ２と称される。プラスミドｐＴｓＵ１は容易に
入手可能なプラスミドｐＲＢ５８をＥｃｏＲＴで切断し
、全５ＵＣ２遺伝子を単離することにより、プラスミド
ｐＲＢ５８から誘導される。Ｅｃ。
ＲＩ末端５ＵＣ２遺伝子とＥ　ｃｏ　ＲＩ切断ｐＹＪ３
０プラスミド（イリノイ州ビオーリア、ＵＳＤＡ。
（３Ｂ） ノザン・ジージョナル・リサーチ・センターから寄託番
号ＮＲＲＬＢ−１５８９０として大腸菌宿主より　入手
可能）との連結はベクターｐ　Ｔ　Ｓ　Ｕｌをもたらし
、このベクターはアンピシリン耐性であり、ピチア自律
複製配列ＰＡＲ３１をもち、そしてＨｉｓ４−ピチア細
胞での選択のためにＰ、パストリスＨｉｓ４遺伝子を含
んでいる。大腸菌宿主中のプラスミドｐＴｓＵ１は、本
出願が特許として発布された際にこのプラスミドを一般
の人々が利用できるように、イリノイ州ビオーリアの米
国農務省（ＵＳＤＡ）ノザン・ジージョナル・リサーチ
・センターに寄託された。この菌株は実験家名ＨＢＩＯ
Ｉ／ｐＴｓＵ１をもち寄託番号ＮＲＲＬｎ−１ｓｏｓａ
を指定された。
メタノールによって調節可能なピチア・バストリスＡＤ
Ｘ１プロモーターは、発現カセットＡＤＸｉ−８ＵＣ２
−８ＵＣ２中の５ＵＣ２シグナル−：５Ｕｃ２構造遺伝
子の発現を促進するために使用される。第５図はベクタ
ーＥ）ＧＳ１（１２０作製工程を概略的に示す。広く入
手可能なプラスミドｐｓＥＹ３（１３中の５ＵＣ２遺伝
子は完全な５ＵＣ２構造遺伝子の前にシグナル配列を一
部だけ含むので、欠失しているシグナル配列を付加すべ
く次の配列を有するリンカ−が２本の合成オリゴヌクＶ
オチドをハイブリダイズさせることにより製造された： ５ｌ−ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＣＡ−３１
３１−ＧＴＡＣＴＡＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡ−５１
得られたベクターｐＧＳ１００は完全な５ＵＣ２シグナ
ル−構造遺伝子をもち、このベクターなＥｃａＲＩで切
断してＰＡＲ８１およびＡＯＸＩプロモーターを含むｐ
ＢｓＡＧＩ５Ｉ　（イリノイ州ビオーリアのＵＳＤＡ、
ノザンパジージヲナル・リサーチ・センターから寄託番
号ＮＲＲＬＢ−１８（１２１として大腸菌宿主より入手
可能）由来のＥｃｏＲＩフラグメントに連結させると、
ベクターｐＧＳ１０１が形成される。ｐＹＪ　３０　（
イリノイ州ピオーリ、アのＵＳＤＡ、ノザン・ジージョ
ナル・リサーチ・センターから寄託番号ＮＲＲＬＢ−１
５８９０として大腸菌宿主より入手可能）由来の大きい
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ’ＶフラグメントをｐＧｓｌｏｌに
連結するとｐＧＳ　１（１２が得られ、これはピチアな
転換するために使用した。ｐＧｓｌｏｌおよびｐＧＳ　
１（１２の詳細な制限地図はそれぞれ第６図および第７
図に示す。
これらのベクター・を用いて形質転換するための適当な
宿主には以下のものが含まれる；ピチアＧＳ　１１５　
（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１）ピチアＫＭ７１ サツカロミセス５ＥＹ２１（１２ サツカロミセス５ＥＹ５１８８（分泌変異株）。
ピチアＧ５１１５はピチア・パストリスのｈｉｓ４欠損
変異株であり、イリノイ州ビオーリアのＵＳ。
ＤＡ、ノザン・ジージョナル・リサーチ・センターから
寄託番号ＮＲＲＬ　Ｙ＝１５８５１として入手可能であ
る。
ピチアＫＭ７１は遺伝子型：　（ｈｉｓ　４　ａｏｘｌ
　：：５ＡＲＧ　４　）をもつピチア菌株である。この
菌株はピチアＰＰＦ　１　（ｈｉｓ４　ａｒｇ　４２重
栄養要求変異株、イリノイ州ビオーリアのＵＳＤＡ、ノ
ザン・ジージョナル・リサー゛チ・センターから寄託番
号ＮＲＩＬ　Ｙ−１８（）１７として入手可能）をプラ
スミドｐＹＭＩ　７　（３’−および５１ピチアアルコ
ールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ　）配列で両側をは
さまれたサッカロミ′セスＡＲＧ４遺伝子を含む）の線
状化部分で形□質転換することにより作られた。
プラスミドｐＹＭＩ７Ｎ！プラスミドｐＹＭ２５（イジ
ーノイ州ビオーリアのＵＳＤＡ、ノザン・ジー′ジヲナ
ル・リサーチ・センターから寄託番号ＮＲＲＬ・Ｂ−’
１８０１’、５として大腸菌宿主より入手可能であり、
このプラスミドはサツカロミセスＡＲＧ４遺伝子を含む
）由来の２．９　Ｋｂｐ　ＢａｍＴ−Ｉ　Ｉ　二Ｓ　（
１０）　Ｉフラグメン、トをｊ３ａｍＨＩ３重ｐＰＧ４
．ｏ（イリノイ・州ビオーリアのＵＳＤＡ；　ノザン・
す゛−ジ目ナル・リサーチ・センターから寄託番号ＮＲ
ＲＬ　Ｂ−１’５８６８として大腸菌宿主より入手可能
）に挿入することにより作製された。この挿入はＡＯＸ
Ｉ遺伝子の５１部分から約６ｏｏｂｐ（この遺伝子のは
ぼに）、の欠失をもたらす。プラスミドｐＹＭＩ７はＰ
ｖｕｌｉおよびＥｃｏＲＩで消化して線状化、し、次い
でＡｒｇ十原栄養株について選択することによりＰ　Ｐ
Ｆ　１　（ａｒｇ　４　　ｈｉｓ４．ＮＲＲＬ　Ｙ　−
Ｊ　８０１７）に形質転換した。形質転換体を再生寒天
から抽出し、超音波処理し、そして０．１％グルコース
およシ４０μｇ〜ヒスチジンを含むＳＤ培地寒天プレー
ト上にまいた。得られたコロニーはその後次の炭素源＝
１）炭素源なし；２）０．５％メタノール；３）２％グ
ルコースを含む（ヒスチジン含有）ＳＤ培地寒天プレー
ト上でレプリカ樟養した。Ａ１　ｇ　七軍ンの約８１．
０％はメタノール上で正常に生育できなかった。メタノ
ール非利用声の１つから得られたゲノムＤＮＡのサザン
プロット分析は、ＡＯＸ１遺伝子がこの醒株（ＫＭ、７
１と称す）では破壊されていることを示した。
サツカロミセス菌株５ＥＹ２１．（１２およびＳ、ＥＹ
５１８８は両方とも広く分布して一つ、容易に入手可能
である。１．　　　　、 実施例■ インベルターゼ分泌 ａ、培葉増殖条件 Ｐ、　ハストリス細胞は炭素源としてグルコース、グリ
セロールまたはメタノールを補給した酵母窒素塩基（Ｙ
ＮＢ）中で増殖させた。形質転換体はプレートから２％
グルコースまたは３％グリセロール、を補給したＹＮＢ
中に０．（１２〜０．０５０Ｄ６００単位の細胞密度で
接種した。１００〜２００１１１１の培地を含む振と５
フラスコ（５００ｍ／）中で中間対数期（０，５〜１．
０　ＯＤ　　　単位）まで細胞を増殖させた。メタノー
ル培地へ移す前に、グリセロ−〃培養からの細胞を遠心
し、滅菌水で１回洗い、その後０，５％メタノールを含
むＹＮＢ　１００〜２００ゴ（５００献の振とうフラス
コ）中に０．０５〜０．１０Ｄ　　　単位で再懸濁した
。ｐＧｓ１（１２またはｐＴｓＵｌを含むＰ、パストリ
ス形質転換体、は通常、細胞および培地の分析に先立っ
て、メタノール培地中で増殖させた。上記のプラスミ、
ドＤＮＡを含まない宿主細胞は同一条件下で増殖させた
が、ただし培地に、ヒスチジン（２０Ｉｎ９／１．）を
加えた。
Ｓ．セレビシエ細胞はグルコースおよびロイシン（３０
ｒｎ９／４）およびヒスチジン（２０１ｎ９／ｌ）を補
給した酵母窒素塩基（ＹＮＢ）、またはグリセロールを
補給した酵母エキスおよびペプトン（ＹＰ）中で増殖さ
せた。形質転換体はプレートから５％グルコースおよび
ロイシンおよびヒスチジン（２０〜３０１ｎ９／ｌ）を
補給したＹＮＢ中に０．０５〜０．１０Ｄ６００単位で
接種した。１００〜２００ｄの培地を含む振とうフラス
コ（５００ｍｊ？）中で中間対数期（０，５〜１．００
Ｄ６００単位）まで細胞を増殖させた。０．１％グルコ
ースを含むＹＮＢまたは３％グリセロールを含むＹＰへ
移す前に、細胞は蒸留水で１回洗った。ベクターｐＲＢ
５８を含むＳ．セレビシエ形質転換体は通常、細胞の分
析に先立って、インベルターゼの抑制解除を起こすべく
０．１％グルコース培地、に移した。ベクターｐＧｓ　
１０１を含む形質転換体は一般に、アルコールオキシタ
ーゼプロモーターを活性化させてインベルターゼを生産
させるべくグリセロール培地に移した。上記のプラスミ
ドＤＮＡを含まない宿主細胞は同一条件下で増殖させた
が、ただしウラシル（２０Ｉｎ９／ｌ）を増殖培地に加
えた。Ｓ．セレビシエ分泌変異株は低グルコース培地へ
移す前に（３０℃の代わりに）２４℃で増殖させた。
ｂ、インベルターゼ検定 ０６，１〜１ゴの培養物をエッペンドルフ遠心機で遠心
した。細胞沈澱物から細胞不合、増殖培地を注意しなが
ら分離し、、１０〜１００μｌをインベルターゼ検定（
分泌されたインベルターゼ）のだ、めに使用した。細胞
沈澱物は０．（１２〜０．２０Ｄ６ＱＯ単位の細胞密度
で水に再懸濁した。この懸濁液５０μノまたは１〜１０
ミリ−０Ｄ６°０単位の細胞をインベルターゼ検定（細
胞内インベルターゼ）のために使用した。検定混合物０
．２・５ゴをこの細胞懸濁液または培地アリコートに加
えて３７℃で１０〜３０分間インキュベーションした。
この反応を０．２ＭＫｔＨＰＯ，０，３ｍ／で停止させ
、試料を沸騰水浴中で５分間沸騰させた。氷上で冷却後
、この検定物にグルコースオキシダーゼ試薬２゛コを加
えて３０℃で３０分間インキュベーションした。この反
応を６ＮＨＣ１，２ｖｔｌで停止させ、吸光度を５４０
ｎｍで読み取った。同時に、１ｍ９／Ｔｎｌ！グルコー
スの１０〜５０μｌアリコートを標準としてこの検定に
含めた。インベルターゼ単位（Ｕ　）は３７°Ｇで１分
間に１μモルのグルコースを放出させる酵素の量として
定義され、次の式に従って算定されＣ９結果 上記のようにして増殖させた種々の形質転換体において
測定されたインベルターゼ単位を下記の表に要約する。
表の結果は、プラスミドｐＧＳ１（１２からのピチアに
よるインベルターゼの発現がピチアＡＯＸＩプロモータ
ーにより調節可能な方法で制御されることを示している
。グリセロールの存在下ではインベルターゼが全く合成
されず、一方メタノールの添加の際には多量のインベル
ターゼが合成された。さらに、ＡＯＸｌ−ピチア宿主は
インベルターゼの生産および分泌に関して、ピチアＡＯ
Ｘ１＋宿主またはサツカロミセス形質転換体のどれより
も良好な宿主であると思われる。
また、有意レベルのインベルターゼが非ピチア誘導５Ｃ
Ｕ２プロモーターの制御下でさえもピチアにおいて得ら
れるということに留意すると面白いだろう。
次の分析はべりプラスミック（細胞壁と細胞膜の間に存
在する）インベルターゼに対して実施された。これらの
場合に、分泌インベルターゼをさらに分析した場合の結
果はべりプラスミックインベルヌーイの場合に見出され
た結果と同一であった（結果は示さず）。
１００Ｄ６００単位の細胞（約５×１（１８細胞）を培
養物から取り出し、エッペンドルフ遠心機で遠心した。
増殖培地を除き（分泌インベルターゼを除く）、細胞沈
澱物を５０ｍＭ）リス・ＨＣ／（ｐＨ７，５）０．５ｒ
ＩＬｌで洗った。洗った細胞沈澱物は同じ緩衝液０．１
ｄ中に再懸濁した。１．４Ｍβ−メルカプトエタノール
３μノおよびデモリアーゼ４００単位（４り／コのチモ
リアーゼ約１２μりを加え、この懸濁液を３７℃で３０
分間インキュベーションした。溶菌液はエッペンドルフ
遠心機で１０分間遠心し、可溶性抽出物を細胞破片から
分離した。１０倍希釈した可溶性抽出物（細胞内インベ
ルターゼ）５〜１０μｌは上記方法に従ってインベルタ
ーゼ活性について検定した。
もとの可溶性抽出物５〜２０μ！（またはＩＵのインベ
ルターゼ活性）を等量の２倍濃縮しムリ（Ｌａ　ｅｍｍ
　Ｉ　ｉ　）泳動用緩衝液と混和し、沸騰水浴中で５分
間加熱した。試料を７．５％アクリルアミドゲル上にの
せ、レムリの方法〔ネーチャー（Ｎａ−ｔｕｒｅ）、第
２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）を参照〕
に従って電気泳動を行った。
いくつかの場合に、電気泳動に先立って可溶性抽出物中
のアスパラギン結合糖を除くためにエンドグリコシダー
ゼＨ（エンドＨ）を使用した。可溶性抽出物１０μノ（
またはＩＵのインベルターゼ活性）を０．　Ｉ　Ｍ　Ｎ
ａＡｃ　（ｐＨ’　５．１　）、０．４％ＳＤＳお′よ
びｌ　ｍｔ；／　／　ｍ／ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）２．５μｌに加え、この試料を沸騰水浴中宅３〜５分
間加熱した。試料を氷上で冷却し、エンドＨ２〜４μｌ
（ｏ、１５〜０．３μｇ）を加えて３７℃で５時間イン
キュベーションした。その後２倍濃縮しムリ泳動用緩衝
液２５μｌを加え、沸騰水浴中で５分間加熱した後７．
５％アクリルアミドゲル上で泳動した。ウェスターンプ
ロット分析はトウービン（Ｔｏｗｂｉｎ　）らの方法〔
ブロク・ナト・アガド・ＵＳＡ）、第７６巻、第４３５
０〜４３５４頁（１９７９年）を参照〕に従って行った
。脱グリコシル化Ｓ．セレビシエインベルターゼまたは
精製されたピチア産生インベルターゼに対するウサギ・
インベルターゼ抗血清および１２５工標識プロテインＡ
を検出のために使用した。
ウェスターンプロットパターンは次のことを明らかにし
た：ベクターｐＧｓ１（１２またはｐＴＳＵｌで形質転
換されたピチア菌株は７５〜８０ＫＤの範囲のインベル
ターゼタンパク質を生産し、これと対照的にＳ．セレビ
シエ産生インベルターゼは不均質であって１００〜１４
０ＫＤの範囲の分子量をもつ。エンドＨで処理後、ピチ
アおよびサツカロミセスの全ての醒株から産生されたイ
ンベルターゼは６０ＫＤのバンドに縮少された。このこ
とはすべての宿主においてインベルターゼタンパク質が
同じであり、グリコシル化の量および／またはタイプが
相違して異なる分子量をもたらすことを示唆している。
ｂ、インベルターゼ活性ゲル 可溶性抽出物の調製およびエンドＨでの処理はウェスタ
ーンプロット分析について記載した通りに行ったが、た
だし２倍濃縮しムリ泳動用緩衝液は加えなかった。
０．２〜０，５単位のインベルターゼ（３０〜５０μｉ
　ｏ’＞溶ｍ液＞　ヲ、微量のブロムフェノールブルー
を含む２５％グリセロール等量と混合した。これを４℃
での電気泳動のためにゲルに加えた。天然ゲル電気泳動
はロッドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ　）およヒクロムハ−
り（Ｃｈｒａｎｂａｃｈ）（アナル・バイオヶＡ　（Ａ
ｎ（１０）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第４０巻：第９５
〜１３４頁（１９７１年）を参照〕に従って４．５％ポ
リアクリルアミドスラブ上で実施した。インベルターゼ
、はガブリ−／Ｉ／　（Ｇａｂｒｉｅｌ　）およびウォ
ｙ（Ｗａｎｇ）の方法〔アナル・バイオケム（Ａｎ（１
０）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第２７巻：第５４５〜５
５４頁（１９６９年）を参照〕を用いて０．１Ｍシヨ糖
含有０．１Ｍ酢酸ナトリウム（りＨ５，１）中３７℃で
１０〜９０分間インキュベーションした後でゲル中に局
在化された。
Ｃ１密度勾配分析 平衡密度勾配分析はアブラムス（Ａｂｒａｍｓ　）らの
方法〔ジェー・バクチリオール（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、）第１３５巻：第８（１９〜８１７頁を参照〕の
変法を用いて実施した。インベルターゼについて抑制解
除または誘発された細胞をエッペンドルフ遠心機１遠心
す７′３に１り集菌り、％容量″？・１Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ３，８）で１回洗い、同一緩衝液中に１００〜
２０００Ｄ６０°単位／−で再懸濁した。細門はポルテ
ックスミキサー上で１分間振とうして氷上に１分間静置
することにより、ガラスピーズで破壊した。細胞スラリ
ーをガラスピーズから分離し、粒状物質はエッペンドル
フ遠心機で１０分間遠心して除いた。可溶性抽出物の一
部（２、〜１０１００インベル、ターゼ活性）を−酸鐸
衝液３ｇおよびＣｓＣｌ　　２．５．！ｉ’と混合した
。酢酸緩衝液で７．．１４９に調節した試料は、ベック
マン社製５Ｗ５０．１０−ターを用いて３７０００　ｒ
ｐｍで４５時間遠心した。チュニブを底に穴をあけ、両
分を興収し、そして上記方法によりインベルターゼ活性
について検定した。密度は屈折計を用いて測定した。
密度曲線はピ・チア産生インベルターゼがサツカロミセ
スｓｅｃ　１８変異株と類似した浮遊密度をもつことを
示す。野生型サツカロミセス宿主により・産生されたイ
ンベルターゼはより不均質であ・す、・よ゛り高い密度
をもっている（ピチアおよびＳＥＣ変異株については約
１．４７ｇ／ｍ／対約１．４０ｇ／ｍ／）。
これらのデータは、ピチアーおよびサツカロミセス−産
生インベルターゼのグリコシル化パターンが相違するこ
とを再度示すものである゛。
ｄ、　Ｎ末端分析 精製された組換えインベルターゼのアミン末端配列は自
動エドマン分解を用いて決定した。、約′１００ピコモ
ルのタンパク質を気相シークエンサー（アプライド・バ
イオシステムズ社製）にかけてアミノ酸配列を決定した
。
ＧＳ　１１５／ｐＧｓ　１（１２産生インベルターゼの
配列は予期されたＮ末端アミノ酸配列をもたらし、こう
して真正の、正確にプロセッシングされたインベルター
ゼの合成が証明された。
実施例Ｖ ケモスタット実験はｐＨ１溶存酸素（Ｄｏ）、攪・拌速
度、温度および空気流のためのモニターおよびコントロ
ールを備えたフィリップス社製の２リットル連続発酵槽
を用いて行った。供給物゛の添加にはミルトン−ロイ・
ミニポンプを用いた。供給物はオートクレーブ滅菌し、
濾過により維持した（ボール・ウルチポア・ディスポー
ザブル・ライｙｖｐ−−アセンブリＤＦＡ　４００１　
ＡＲ，０，２ミクロン絶対）。それぞれの実験は空気流
の中にＮＨ，ガスを混入してｐＨ４，０に保った。温度
は３０℃に保った。−溶存酸素濃度は４号％〜８０％空
気飽和の範囲であった。ケモスタット作動容量は１．３
〜２．１ノの範囲であった。細胞密度、生産惟および収
量は洗浄細胞の乾燥重量から求めた。
それぞれのケモスタット実験は希釈速度（ｄｌが培養物
の生長速度に等しくなる定常状態の条件下で行った。従
って生長速度は発酵槽への新しい培地の流れを調節する
ことにより制御した。一般的なりの値は０１４３ｈｒ−
１〜０．０６７ｈｒ、−’の範囲であった。
ケモスタット培養はＭＭ培地１．００　ｍ中で新たに生
育された５％接種物から開始し、６００　ｒｎＪ！Ａ＋
の濾過空気を散布した。始動培地中の初期炭素源の枯渇
後、適当な炭素源（１０％）を補給した１×ＦＭ−２１
を０．１ｈｒ’のＤ値でケモスタットの中にポンプ注入
した。７０％溶存酸素濃度は空気流を高め、必要に応じ
て純粋Ｏ７を補給することにより維持した。４０の一定
ｐＨはＮＨ，を定期的に添加して維持した。培養物が定
常状態および細胞密度約５（１９７１！に達したとき、
供給物は２０％の炭素源を補給した２ｘＦＭ−２１に変
えて、細胞密度約１００．９７Ｊの定常状態へ到達させ
た。
最後に、供給物を３０％炭素源を補給した３ｘＦＭ−２
１に変えて定常状態へ導いた。その、供給ポンプ速度お
よび培養物の生長速度を約０．１４ｈｒ”ω値に高め（
約７時間の世代時間に相当する）、そして細胞密度、生
産性および収量の測定を行った。ケモスタット出口にお
けるショ糖およびグルコースの濃度は、ジアスティック
ス・グルコースオキシダーゼ試薬片（マイルス・ラボラ
トリーズ社製ンを用いて測定した。
ショ糖ケモスタット中でＳｕｅ＋ピチア菌株を高細胞密
度へ増殖させた後に得られた細胞は（１）どの位の割合
の細胞がＳｕｃ十表現型を保持するか、および（ｌｌｌ
ｓＵｃ２遺伝子の状態（すなわち自律的であるか又は染
色体に組み込まれたものであるか）を調べるために分析
した。ＮＲＲＬＹ−１１４３０／Ｓｃ■＋３−１４構築
物のケモスタット試料の場合には、Ｓｕｃ＋細胞の相対
数が１／ａ　Ｏ，０００の初期値から、ケモスタット中
での２生長サイクルの終わりには１／１５００の値にま
で増加したことがわかった。下記の表■を参照されたい
。
表■ 第１回シヨ糖ケそスタット： ２４　ｈ　　　　　　　　　　１／２５．０００　０．
０（１４　ＮＤ＃４８ｈ　　　　　　　　　　　１／１
１．０００　０．０（１９紹Δみ１２０ｈ　（最終試料
）　　　　　１／６０００　　０．０１７組込み第２回
シヨ糖ケモスタット： 最終試料　　　　　　　　　１／１５００　　０．０７
　　組込み振とうフラスコ中７２ｈ： Ｍ　Ｓｕ　（１％　ショ糖）　　　　１／１０００　　
０．１　　’ＮＤＭＤ（１％デキストａ　−、ｒ、）　
１／１００．００００．００１　ＮＤ低Ｍ　Ｓ　ｕ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　組込み（０，０５％
ショ糖）　　　　　１１５０　　　２　　＋師酌＊　異
なる条件下で生育させた１　１４３０／Ｓｕｃ＋３−１
４形質転換体を希釈し、そのアリコートをＭｓ　ｕ上に
まいて、Ｓｕｃ十表現型を保持する細胞のパーセントを
求めた。細胞の総数はＭＤプレート上に希釈物をまくこ
とにより測定した。第２回ケモスタットサイクルからの
最終試料のアリコートは、第２回ケモスタットサイクル
のための接種物としく５９） て役立った。振とうフラスコ実験では、３種の他のＳｕ
ｃ＋１１４３０−８Ｃ５形質転換体すべての場合に類似
した結果が得られた（データは表示せず）。１つの代表
的な形質転換体（Ｓ　ｕ　ｃ　＋３−１．４）のみをケ
モスタットにおいて試験した。
＊＊　測定せず。
サザンハイプリダイゼーシ甘ン分析もまたこれらの試料
に対して実施され、この分析は５ＵＣ２遺伝子が染色体
ＤＮＡと結合して存在し得ることを示した。この構築物
はケモスタット中で十分に働（ので、集団中の小割合（
約０．０７％）のＳｕｃ＋細胞がショ糖の十分な細胞外
分解を引き起こして、他の細胞を最適に生育させるので
あろうと目下のところ考えられる。これらの生育条件下
では、Ｓｕｃ＋細胞をこれ以上高めることはできないか
もしれない。
上記実施例は本発明の実施を例示するためにのみ提供さ
れたものであり、本発明の範囲または特許請求の範囲を
何ら制限するものではない。不発明の本質および精神か
ら逸脱しない理にかなった変更および修飾は、希望しか
つ要求する特許請求の範囲に含まれることを意味する。
【図面の簡単な説明】
第１図は主なピチアジヒドロキシアセトンシンターゼ遺
伝子（ＤＡ、Ｓｌ）の調節領域の制限地図である。 第２図は主なピチアアルコールオキシダーゼ遺伝子（Ａ
ＯＸＩ　）の調節領域の制限地図である。 第３図はピチアｐ　４．　？遺伝子の調節領域の制限地
図である。 第４図は閉環状プラスミドｐＴｓＵ１の線状制限地図で
ある。 第５図はプラスミドｐＧｓ１０１およびｐＧＳ１（１２
を作製するために使用される工程の概略図である。 第６図はプラスミドりＧＳ　１０１の制限地図である。 第７図はプラスミドｐＧｓ　１（１２の制限地図である
。 （６］） 以下の略号は制限酵素を表すために図面において使用さ
れる： Ａ　　＝ＡｓｕＩＩ　　　　　Ｐｓ　　＝　ＰｓｔＩＢ
　　＝ＢａｍＨＩ　　　　　Ｐｖ、　　＝　ＰｖｕＩＢ
２　　＝：ＢｇｌＩＩ　　　　　ｐ（１０）！　　＝　
ＰｖｕＩＩＢｃ　＝ＢｃｌＩ　　　　　　Ｒ１＝　Ｅｃ
ｏＲＩＣ＝ＣＩ　ａ　Ｉ　　　　　　Ｒｓ　　　””　
Ｅｃ　ｏＲＶＨ，＝ＨｉｎｃＩＩ　　　　　Ｓ　　　＝
　５（１０）ＩＨ３＝ＨｉｎｄＩＩＩ　　　　Ｓｓ　　
＝　５ｓｔＩＫ　　＝ＫｐｎＩ Ｎ　ｄｌ　’＝ｎ　ｄ　ｅ　Ｉ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）目的タンパク質をコードするコード配列をピチア
    （Ｐｉｃｈｉａ）属の宿主細胞中でプロモーターおよび
    分泌シグナルの制御下に発現させることから成る、高マ
    ンノース型哺乳動物タンパク質のグリコシル化パターン
    と実質的に類似したグリコシル化パターンをもつ分泌型
    目的タンパク質の酵母による生産方法。
  2. （２）目的タンパク質に与えられるグリコシル化パター
    ンはグリコシル化部位当たり平均８〜１４のマンノース
    単位を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. （３）各グリコシル化部位でグリコシル化のために使用
    される糖単位の少なくとも８０％、しかし８８％以下は
    マンノース単位である、特許請求の範囲第１項または第
    ２項に記載の方法。
  4. （４）高マンノース型哺乳動物グリコシル化パターンを
    もつタンパク質は次の群： ＨＴＬＶ−IIIｅｎｖタンパク質、 ニワトリ卵アルブミン、 シンドビスウイルスタンパク質、 ウシロドプシン、 ヒト免疫グロブリン、および ウイルス抗原 から選ばれる特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項
    に記載の方法。
  5. （５）分泌シグナルは次の群： Ｓ．セレビシエのインベルターゼ分泌シグナル、 Ｓ．セレビシエの酸ホスファターゼ分泌シグナル、 Ｓ．セレビシエのα接合因子分泌シグナル、およびピチ
    ア・パストリスの酸ホスファターゼ分泌シグナル、また
    はその機能的均等物、 から選ばれる、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１
    項に記載の方法。
  6. （６）インベルターゼ分泌シグナルは長さが５７塩基対
    であり、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 をもつ、特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. （７）インベルターゼ分泌シグナルは次のアミノ酸配列
    ： 【遺伝子配列があります】 をコードする、特許請求の範囲第５項記載の方法。
  8. （８）上記プロモーターは分泌シグナルの５’末端に配
    置されたときメッセンジャーＲＮＡの転写を制御でき；
    上記分泌シグナルはポリペプチドコード領域の５’末端
    に配置され；上記プロモーターが次の群： （ I ）上記ＤＮＡフラグメントを含む宿主生物が接触
    する培地中にメタノールが存在すること、 （II）上記ＤＮＡフラグメントを含む宿主生物が接触す
    る培地中にメタノール以外の非異化産物抑制炭素源が存
    在すること、および （III）上記ＤＮＡフラグメントを含む宿主生物が異化
    産物制御炭素／エネルギー源上で生育した後、その宿主
    生物が接触する培地中に炭素源が存在しないこと、 から選ばれる条件の少なくとも１つに応答する、特許請
    求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
  9. （９）上記プロモーターは次の群： ピチアＡＯＸ１調節領域、 ピチアＤＡＳ１調節領域、 ピチアグリセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒドロ
    ゲナーゼ調節領域、 ピチア酸ホスファターゼ調節領域、 サッカロミセス酸ホスファターゼ調節領域、 サッカロミセスα接合因子調節領域、 サッカロミセスグリセルアルデヒド−３−ホスフェート
    デビドロゲナーゼ調節領域、 およびピチアｐ４０調節領域およびその機能的均等物、 から選ばれる、特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１
    項に記載の方法。
  10. （１０）上記コード配列の発現は、ピチア属の宿主酵母
    細胞を、プロモーター配列がポリペプチドコード配列の
    発現を活性化する条件下で培養することにより達成され
    る、特許請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の
    方法。
  11. （１１）上記宿主細胞は次の群： ピチアＮＲＲＬＹ−１５８５１（ＧＴＳ１１５）、 ピチアＮＲＲＬＹ−１８０１４（ＧＳ１９０）、 ピチアＮＲＲＬＹ−１８０１７（ＰＰＦ１）、 ピチアＮＲＲＬＹ−１１４３０、および ピチアＮＲＲＬＹ−１１４３１ から選ばれる、特許請求の範囲第１〜１０項のいずれか
    １項に記載の方法。
  12. （１２）酵母菌株が一般に炭素／エネルギー源として利
    用し得ない基質上で酵母菌株を生育させる方法であって
    、 （ａ）酵母菌株を、野生型酵母菌株がもち合わせていな
    い遺伝子機能をコードするＤＮＡフラグメントで形質転
    換し、 （ｂ）工程（ａ）の結果として得られた形質転換体を非
    選択的再生培地上で再生し、 （ｃ）工程（ｂ）に従ってつくられた再生形質転換体を
    、上記ＤＮＡフラグメントによりコードされる遺伝子機
    能を組み込んだコロニーのみが生育できる選択的生育条
    件にさらし、 （ｄ）工程（ｃ）に示した条件下で生育する再生形質転
    換体を選択し、そして （ｅ）工程（ｄ）に従って選択された再生形質転換体を
    、ピチアが炭素／エネルギー源として利用し得ない上記
    基質上で生育させる、 ことから成る上記方法。
  13. （１３）酵母菌株はピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロ
    ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミ
    セス（Ｋ−ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃ
    ａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
    ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕ−ｌａ）、シゾサッカ
    ロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ−ｙｃｅｓ
    ）、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソ
    レン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、デバロミセス（Ｄｅｂ
    ａｒｏｍｙｃ−ｅｓ）、メシユニコビア（Ｍｅｔｓｃｈ
    ｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｔ
    ｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏ
    ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙ
    ｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉ−
    ｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏ
    ｐｔｉｓ）などより成る属から選ばれる、特許請求の範
    囲第１２項記載の方法。
  14. （１４）酵母菌株はピチア属から選ばれる、特許請求の
    範囲第１２項記載の方法。
  15. （１５）上記ＤＮＡフラグメントは次の群： インベルターゼ遺伝子、 α−ガラクトシダーゼ遺伝子、 β−ガラクトシダーゼおよびラクトースパーミアーゼ遺
    伝子、および β−グルコシダーゼ遺伝子またはその機能的均等物、 から選ばれる、特許請求の範囲第１２〜１４項のいずれ
    か１項に記載の方法。
  16. （１６）上記ＤＮＡフラグメントはショ糖のフルクトー
    スおよびグルコースへの加水分解を促進し得るタンパク
    質をコードする、特許請求の範囲第１２〜１５項のいず
    れか１項に記載の方法。
  17. （１７）上記ＤＮＡフラグメントはサッカロミセス・セ
    レビシエの菌株から単離されたインベルターゼ遺伝子の
    少なくとも一部である、特許請求の範囲第１２〜１６項
    のいずれか１項に記載の方法。
  18. （１８）ピチア属の酵母菌株は原栄養株である、特許請
    求の範囲第１４項または第１６項記載の方法。
  19. （１９）ピチアの原栄養株はピチア・パストリス（Ｐｉ
    ｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）の１員である、特許請求の
    範囲第１８項記載の方法。
  20. （２０）上記の原栄養株はピチア・パストリスＮＲ−Ｒ
    ＬＹ−１１４３０である、特許請求の範囲第１９項記載
    の方法。
  21. （２１）ピチア属の酵母菌株は次の群： ピチア・パストリスＮＲＲＬＹ−１１４３０、 ピチア・パストリスＮＲＲＬＹ−１１４３１、 ピチア・パストリスＮＲＲＬＹ−１５８５１、 ピチア・パストリスＮＲＲＬＹ−１８０１４、 およびピチア・パストリスＮＲＲＬＹ−１８０１７、 から選ばれる、特許請求の範囲第１４項記載の方法。
  22. （２２）炭素／エネルギー源はショ糖である、特許請求
    の範囲第１６〜２１項のいずれか１項に記載の方法。
  23. （２３）（ａ）分泌シグナルおよびポリペプチドコード
    領域の５′末端に配置されたときメッセンジャーＲＮＡ
    の転写を制御することができ、且つ次の群： （ I ）下記ＤＮＡフラグメントを含む宿主生物が接触
    する培地中にメタノールが存在すること、 （II）下記ＤＮＡフラグメントを含む宿主生物が接触す
    る培地中にメタノール以外の非異化産物抑制炭素源が存
    在すること、および （III）下記ＤＮＡフラグメントを含む宿主生物が異化
    産物抑制炭素／エネルギー源上で生育した後、該宿主生
    物が接触する培地中に炭素源が存在しないこと、 から選ばれる少なくとも１つの条件に応答する調節領域
    ； （ｂ）酵母分泌シグナル；および （ｃ）高マンノース型哺乳動物タンパク質のグリコシル
    化パターンをもつとき生物学的に活性であるタンパク質
    をコード配列； から成る連続配置ＤＮＡフラグメント。
  24. （２４）分泌シグナルは次の群： Ｓ．セレビシエのインベルターゼ分泌シグナル、 Ｓ．セレビシエの酸ホスファターゼ分泌シグナル、 Ｓ．セレビシエのα接合因子分泌シグナル、および ピチア・パストリスの酸ホスファターゼ分泌シグナルま
    たはその機能的均等物、 から選ばれる、特許請求の範囲第２３項記載のＤＮＡフ
    ラグメント。
  25. （２５）インベルターゼ分泌シグナルは長さが５７塩基
    対であり、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有する、特許請求の範囲第２４項記載のＤＮＡフラグ
    メント。
  26. （２６）インベルターゼ分泌シグナルは次のアミノ酸配
    列： 【遺伝子配列があります】 をコードする、特許請求の範囲第２４項記載のＤＮＡフ
    ラグメント。
  27. （２７）（ａ）次の群： ピチアＡＯＸ１調節領域、 ピチアＤＡＳ１調節領域、 ピチアグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロ
    ゲナーゼ調節領域、 ピチア酸ホスファターゼ調節領域、 サッカロミセス酸ホスファターゼ調節領域、 サッカロミセスαの接合因子調節領域、 サッカロミセスグリセルアルデヒド−３−ホスフェート
    デヒドロゲナーゼ調節領域、および ピチアＰ４０調節領域およびその機能的均等物、 から選ばれるプロモーター； （ｂ）酵母分泌シグナル；および （ｃ）高マンノース型哺乳動物タンパク質のグリコシル
    化パターンと実質的に類似したグリコシル化パターンを
    もつとき生物学的に活性であるタンパク質をコードする
    コード配列； から成る連続配置ＤＮＡフラグメント。
  28. （２８）分泌シグナルは次の群： Ｓ．セレビシエのインベルターゼ分泌シグナル、 Ｓ．セレビシエの酸ホスファターゼ分泌シグナル、 Ｓ．セレビシエのα接合因子分泌シグナル、 ピチア・パストリスの酸ホスファターゼ分泌シグナルお
    よびその機能的均等物、 から選ばれる、特許請求の範囲第２７項記載のＤＮＡフ
    ラグメント。
  29. （２９）インベルターゼ分泌シグナルは長さが５７塩基
    対であり、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有する、特許請求の範囲第２８項記載のＤＮＡフラグ
    メント。
  30. （３０）インベルターゼ分泌シグナルは次のアミノ酸配
    列： 【遺伝子配列があります】 をコードする、特許請求の範囲第２８項記載のＤＮＡフ
    ラグメント。
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