JPS59198980A - ａ因子およびそのプロセツシングシグナルを含むＤＮＡ構成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 生物学的革命の初めの段階は、下等生物中で哺乳動物性
遺伝子の発現を得る可能性を証明した。

細菌の調節配列に関する極めて多量の情報のため、細菌
が異種性タン・ぐりの生産に対して最初の宿主として選
ばれた。しかしながら、細菌は多くの欠点を有している
。これらの欠点のうち重大なものは、その生産物が浦乳
動物受容者に、例えば医薬として、投与されるべきもの
である場合に５完全に除去されなければならない腸毒素
を細菌が生産するという事実である。

さらに、異種性遺伝子のコドンは比較的低い効率で発現
される。それは、異種性タンパク源および宿主の好丑し
いコドンが実質的に異なるからである。さらに、注目の
生産物をノロセスする、例えば、グリコジル化、ポリベ
ノチド配列の除去による成熟化、も１〜くけ集合化する
必要がある場合には、細菌はこれらのプロセスにおいて
能力を有さないかもしくは非能率的であることが示され
る。

さらに、遺伝子工学的技法の商業的適用に際して、合成
された生産物が増殖培地中に分泌される場合において引
き続きの精製を容易にするため、限定された実験スケー
ルの使用のみの細菌のプロセスが９捷しい。

宿主としての酵母はその使用を推奨する多くの利点を有
している。酵母の商業的発酵は十分に確立されている。

酵母は細菌と異なる真核生物であるので、哺乳動物性生
物とよシ多くの共通性を有している。このように、酵母
は高等生物において観察される多くの！ロセッシング工
程が可能でありそして数種の天然ポリ＜ｆチドおよびタ
ンノヤクの分泌が知られている。さらに、酵母は腸毒素
を生産しない。

従って、酵母中の異種性タンパクの有効な生産のために
用いられてもよい調節シグナルを酵母に与えるととが望
ましい。調節シグナルの存在を予測し得るとはいえ、そ
の分離、取シ扱い、および調節シグナルが外来性ＤＮＡ
配列との連結において異種のフランク領域と共に働き得
ることを最終的に確立することは、十分に紳られた実験
計画、注意深い取り扱い、および含まれる多くの各段階
において予定された結果を達成したという厳格な証拠を
必要とする、長期的で根気のいる仕事である。

従来技術の記載 Ｒ，ツおよびダンク（Ｂｅｔｚａｎｄ　Ｄｕｎｔｚｅ　
）は。

ＦＪｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　（１９７９）９５
　：　４６９で、成熟α因子ペプチドの最初の単離およ
び予備的特徴付けを報告している。そしてペッツ、マン
ネイ（Ｍａｎｎｅｙ　）およびダンクは、Ｇａｍｅｔｅ
、　Ｒｅｓ。

（１９８１）４：５７１〜５８４で、成熟ａ因子ｄｆチ
ドに対するアミノ酸配列を提示している。

クルノヤンオヨヒヘルスコウィッッ（Ｋｕｒｊａｎａｎ
ｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）は、Ｃｅ１ｌ（１９８２）
３０：９３３〜９４３で、推定のα因子先駆物質を述べ
、その配列を記載し、そしてプロセッシング機構を仮定
している。米国特許第４，３３６，３２６号および第４
，３３８，３９７号は原核生物においてリーダーをコー
ドする配列を記載している。ユリウス（Ｊｕｌｉｕｓ　
　）らは、９艷す（１９８３）且ヱ：８３９〜８５２で
、α因子のプロセッシングにおける膜ゾペゾチターゼの
役割を述べている。１９８３年１月１２日に出願され、
出願係属中の米国特許出願第４５７．３２５号をも参照
されたい。この出願には、異種性ポリ（ノチドの発現に
対するプロセッシングシグナルおよびα因子リーダーの
使用が記載されている。

発明の要旨 それ自体の調節シグナルとの組合せの酵母α因子は、検
出され、単離され、そして注目のポリ−１？ゾチドをコ
ードするＤＮＡ配列に連結するように操作される。得ら
れる構成物は、栄養培地中への前記ポリベゾチドの分泌
を伴って前記ポリ被プチドの発現および成熟を与える。

小アダプター分子によってＤＮＡコード配列を正しい読
み枠において酵母α因子リーダーおよびプロセッシング
シグナルに連結させるための酵母α因子遺伝子の操作に
対しての実験設計を行なう。

特定の態様の詳細な記載 主題の発明に従って５分泌され、通常成熟したもしくは
成熟し得るポ１７　被グチドの生産のために真核性宿主
、とりわけ酵母を用い、そしてこれらのポＩＪ　ｄプチ
ドを栄養培地から収集してもよい。

前記ポリペゾチＰは、正しい読み枠において注目のポｌ
ｊ　ｄゾチドをコードするＤＮＡ配列に連結された酵母
α因子分泌リーダーおよびプロセッシングシグナルをコ
ードするＤＮＡ構成物を用いて生成される。得られた構
成物はゾロ？リイゾチドをコードし、前記プロ？リベゾ
チドの分泌に対するシグナルおよび前記ポリにゾチドの
好ましくは成熟？リベグチドへのプロセッシングに対す
るシグナルを細外内もしくは細胞外に含Ｘ７でいる。前
記グロポリセプチドが不完全にプロセスされる場合には
、適当な被ブチダーゼ、とりわけ膜４ｆチグーゼを前記
プロポＩＪ　ｄゾチドの成熟を完成するために用いるこ
とができる。本発明は、分泌されるゾロポリ　ｏｆチド
、とりわけプロセスされたグロポリペゾチドおよび成熟
、ぼり橡ノチドおよびこれらの混合物の生産を予定して
いる。

主題の発明の構造物は、プロポリペグチドを規定する下
記式を有する。

（（ＰＳ）　−（＆因子））ｎ−ｐｓ−遺伝子上式中、 ＰＳは５酵旬が認識し得る、アミノ酸の開裂および除去
に対するプロセッシングシグナルを示し、前記プロセッ
シングシグナルは少なくとも２個の塩基性アミノ酸を含
み、この塩基性アミノ酸はりシンおよびアルギニンであ
り； ａ因子は、成熟したａ因子５適常は完全ａ因子の少なく
とも一部をコードするＤＮＡ配列を意味し；ｎは、０ま
たは１であり：そして 「遺伝子」は、注目のン背り被ノチドをコードするオー
プンリーディングフレームを有する、ａ因子以外のＤＮ
Ａ配列を意味し、適当な読み枠において直接に先行する
ＰＳ（プロセッシングシグナル）の末端塩基で連結され
る。本発明の目的のために、「遺伝子」は融合タンパク
（この場合ある１つの構造遺伝子が正しい読み枠におい
て別の構造遺伝子中に挿入されていてもよい）、−緒に
連結される部分のもしくは完全々構造遺伝子を包含しま
たは任意の合成配列は公知の天然同族体を有さない。

大抵は、主題発明のＤＮＡ構成物は少なくとも下記式を
有する。

Ｌ−（ＰＳ−（ａ因子））ｎ−ＰＳ−遺伝子上式中、 Ｌは、酵母ａ因子分泌リーダー配列、または分泌に対す
る同様の配列を意味し；そして他の記号すべては前述し
て定義したものである。

ｐｓは、大抵下記式を有する。

Ｂ−Ｄ−Ｆ−Ｈ 上式中、 ＢおよびＤは、同一もしくは相異り、そして塩基性アミ
ノ酸すゾノおよびアルギニンに対するコドン（好ましく
はＡＡＧである）を定義し；そしてＦおよびＨは、同一
もしくは相異シ、酸性アミノ酸、アス・やラギン酸もし
くけグルタミン酸もしくはそれらのアミｒ、アスパラギ
ンまたはグルタミンに対するコドンを定義し、好ましく
は酸およびアミドの組み合わせであシ、さらに好ましく
は、ＦはＧＡＣでありＨはＡＡＣである。好ましいＩ）
ＮＡ配列はｌｙｓ　−１ｙｓ　−ａｓｐ　−ａｓｎをコ
ードする自然発生０ＤＮＡ配列である。

これに代えて、ＰＳは下記式を有していてもよい・（（
Ｂ−Ｄ）　　−（Ｆ−ｆ（）、　−（Ｂ−Ｄ）ｕ）ｖ上
式中５ ＳおよびＶは１〜３であり：そして ｔおよびＵは０〜３である。

このように、プロセッシングシグナルを、酸性アミノ酸
およびそのアミドの除去によって、または塩基性アミノ
酸の数の増加によって、または反復性のゾＲゾチド配列
として酸性アミノ酸および酸性アミノ酸のアミドを有す
るかもしくはさらに２個の塩基性アミノ酸を有する多様
のジペプチドもしくはテトラベゾチドを与えることによ
って、変化させてもよい。しかしながら、大抵は、これ
らの付加的アミノ酸は構造物の機構によけいに複雑さを
加えるので１通常は用いられない。

酵母ａ因子の分泌リーダー配列は、比較的短く５約１５
〜２０個のアミノ酸であシ、さらにとシわけ約１７個の
アミノ酸である。このリーダー配列はそのＮ末端にメチ
オニンを有する。

注目のポリペプチドを発現させるために、酵母に用いら
れるコンぎテント複製系および転写調節シグナルを有す
る構成物を調製することが必要である。しかしながら、
分泌およびプロセッシングシグナルが酵母以外の宿主に
よって認識される限りは、このような他の宿主に対する
複製系を用いてもよい。通常、この構成物がさらに他の
機能的ＤＮＡ配列を含む場合、この機能は構成物の構成
の間に用いられるものであってもよいしまたはポリー！
グチＰの発現の間有効な機能を発揮するものであっても
よい。

構りに物は、調製することが可能であり、必要な転写調
節シグナルを持っている。すなわち、このようｈ構成物
はＲＮＡ　７Ｉ＝　＋）メラーゼ結合部位を含み、隣接
配列もしくけ非隣接配列を有していてもよく、結合部位
はａ因子に対する野生型であってもよいしまたはさ寸ざ
まな他の酵母遺伝子に対するＲＮＡ１？リメラ一ゼ結合
部位、例えば、解糖系に含まれる酵素（例えば、ホスホ
グルコキナーゼ、グリセリルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒト０ログナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグルコ
インメラーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼ１等）に関するプロモータ
ー、も１〜〈はメタロチオネインに関するプロモーター
、ウィルスのプロモーター等であってもよい。これらの
プロモーターに対する文献は、ヒララマン（Ｈｉ　ｔＺ
ｅｍａｎ　）ら、Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｍ、　（１
９８０年）孔Σ５：１２０７３〜１２０８０に見い出さ
れる。

前記プロモーターに加えて、前記プロモーターを調節す
るさまざまな配列、例えば、リプレッサー、デリデレッ
サー、アクチペーター等に対するＤＮＡ結合部位および
エンハンサ−を用いてもよい。

包含されていてもよい他のＤＮＡ配列は、リポソームの
結合部位、キャッノ配列、終結コドン、転写ターミネー
タ−等を含んでいる。１もしくはそれ以上のこれらの配
列は、構成物の部分として存在していてもよいしまたは
ベクターとして働いてもよい複製系の一部として利用さ
れてもよい。通常、この複製系を、以下に記載する他の
機能と組み合わせる。

酵母ａ因子ブロモ−ターおよびリーダー領域を酵母複製
系、例えば、２μｍのシラスミドおよび／またはＡμ見
＋ＣＥＮ３に連結して１もしくはそれ以上の便利な制限
部位を有する発現ベクターを得てもよい。この発現ベク
ターは下記式 ％式％ によって、さらにとシわけ下記式 −Ｒ８−Ｐ−（ｃａｐ）ｒｎ−（ＲＢＳ）、−１ｃｍＬ
’−（ＰＳ−（ａ因子））ｎ−ｐｓ−遺伝子−ｓ　ｃ−
Ｔ−ｌＲａｐｓｌ、　　　　　−によって表わされても
よい。

上式中、 ｐｓおよび遺伝子は、前記定義したものであり；Ｒ８Ｆ
：ｉ、Ｐのどちら側に位置していてもよい調節シグナル
を意味しそしてリプレッサー、デリゾレッサーおよびア
クチペーターに対するＤＮＡ結合部位およびエンハンサ
−を含んでおり； Ｐは、ＲＮＡ　、背すメラーゼ結合部位またはプロモー
ター、とりわけａ因子野性型プロモーターであり； ｅａｐは、キャッノ配列であり： ＋　ｃ　ｌｄ：　％ホルミルメチオニン開始コドンであ
り、分泌リーダー配列の一部であり； Ｌ′は、ｉｃと共にａ因子リーダーのアオノ酸配列また
は分泌を与える同様の配列を定義するＤＮＡ配列であり
； ｌｉｅは、１もしくはそれ以上の終結コドンであり；Ｔ
は、転写ターミネータ−を意味し； １Ｒｅｐｓｌは、構成物の直接発現領域の外部の、ベク
ター中の任意の位置に存在していてもよい複製系を意味
し、一般に、野性型以外のフランク領域を有するエピソ
ーム性もしくはウィルス性の複製系を意味し； ｍ　、　ｎおよびｐおよびｒは、０または１であシ；ｑ
は、少なくとも１であり、そして２もしくはそれ以上で
あってもよく、通常は１〜２であり；Ｗは、０もしくは
小さな整数であシ、通常３もしくはそれ以下であシ、そ
して少なくとも１つのｎまたはＷは１であシ； 上式中、構造物は線状もしくは環状であってもよく、そ
して１Ｒｅｐｓｌを除いてはさまざまな配列が遺伝子に
向けられたプロモーターと共に示された頴序で並んでい
る。

リーダー分泌配列は、大抵は下記の、＠　ＩＪ　！　７
’チド配列をコードする。

ｍｅｔ−ｇｌｎ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｔｈｒ−ａｌａ−ｔ
ｈｒ−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−１ｙｓ−ｇｌｕ−１ｙ
ｓ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｇｌｕ！ロセッシングシ
グナル配列は、大抵、下記式のＩリ−！ゾチド配列をコ
ードする： ｇ１１１ｇＩｎ この場合、欄中の任意のアミノ酸を用いてもよい。

とりわけ興味深いのは、下記のアミノ酸配列＝ｌｙｓ　
Ｉｙｓ　ａｓｐ　ａｓｎ を有する天然のグロセッシングシグナルをコードするＤ
ＮＡ配列（特に断らない限シは、配列は５／−３７方向
で読む）： ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＡＣＡＡＣ である。

クローニングおよび発現構成物は、一般に約５〜５０　
ｋｂｐ　（キロペースにア）であり、この場合、！ラス
ミド１４．一般に約５〜２５ｋｂｐの範囲にある。ウィ
ルス性（フタ−を用いる１易合（には、・Ｐヮケーソン
グ要件は約５０ｋｂｐ−′？：、での構成物であっても
よい。

本発明の構成物を発現させるための１つの方法を１状下
に記載する：ノロａ因子をコードするＤＮＡ配列は、任
意の従来法、例えば、ラベルしたグローブを用いるハイ
ブリグイ−ビージョンによる検出によって、酵母ケ゛ツ
ムから得ることができる。フラグメントが約１０００ｂ
ｐよシ大きい場合には、利用できる制限部位における適
当な開裂によってフラグメントを減じてもよい。便利に
は、ａ因子遺伝子内の成熟ペゾチドのＣ末端付近にＡｖ
ａ［制限部位が存在し、ａ因子コード配列の第１塩基の
上流および近傍の便利な部位にフラグメントの末端を有
するように、Δｖａｌｌで制限されたフラグメントを切
除してもよい。好ましくは、この末端は５ゾロセッシン
グシグナル配列中にあシ、さらに好ましくは、Ａｖａｌ
ｌ開裂部位から２９塩基上流にある。次いで、このフラ
グメントは、平滑末端および接着末端を有するリンカ−
に連結されてもよく、その際、リンカ−は単独でまたは
フラグメントの末端塩基とのｊＡ２１−合わせでエンド
ヌクレアーゼ認識部位をコート９する。とシわけ、フラ
グメントの３個の３′−末端塩基が５’−ＡＧＧである
ように、５’−０ＣＴを有するリンカ−を付加すること
によって２９塩基を切除する場合には、Ｓｔｕ■（５’
−ＡＧＧＣＣＴ　−３’　）部位がつくられ、それによ
って所望の７ラグメントをスクリーニングすることがで
きる。これを説明する例において、リンカ−の付加およ
び任意の他の適当な取り扱い、例えば、エンドヌクレア
ーゼ消化の後、５ｔｕ１部位を定義するように３′−末
端ＡＧＧに連結された５′−配列ＣＣＴを含有するリン
カ−によってつくられた５ｔｏ１部位についてプラスミ
ドをクリーニングしてもよい。所望ならば、所望の連結
配列に相補的な、ラジオラベル付のオリテヌクレオチｐ
ｆローブを用いて、プラスミドをさらにプレスクリーニ
ングしてもよい。

認識部位から開裂して離すエンドヌクレアーゼに対する
認識部位をコードするリンカ−を用いる。

さらに、この認識部位の不斉は、この認識配列から上流
の、通常約３〜１５塩基上流の開裂を指示する。この例
において、認識部位はＨｇａ１部位である。５ｔｕ１部
位の存在は、Ｈｇａ　ｉ　開裂部位がａ因子分泌リーダ
ー配列中に存在することを確実にする。遺伝子のａ因子
リーダー領域においてＨｇａ　Ｉ開裂を用いる場合、突
出（ｏｖｅｒｈａｎｇ　）　ＤＮＡ配列は、なお一層の
構成に用いられるエンドヌクレアーゼに対する認識配列
ではない。

ａ因子リーダーフラグメントは、この時点で、その部位
のいずれかを今後の取り扱いに対して用いることができ
る且堕■およびＨｇａ１Ｍ！識および制限部位の双方を
含んでいる。

制限酵素およびア／７°ターの適当な選択によって、グ
ロポリペゾチドをコードするＤＮＡフラダメントを得る
ために、グロセッシングシグナルを通してリーダー配列
を遺伝子に結合させることができる。連結されたリーダ
ーおよび遺伝子ＤＮＡの配列に対するコード領域の外側
の便利な制限部位を得ることによって、存在する場合に
は、クローニング用運搬体で、ノロポＩ）＜ｆチドおよ
び転写調節シグナルに対するコードフラグメントをクロ
ーニングし、次いでクローニング用運搬体がらコードフ
ラグメントを切り取りそして、適当な場合には、転写調
節シグナルに対して適当な並列の位置で発現ベクター中
にこのフラグメントを挿入してもよい。好ましくは、以
下に記載するように、制限部位を用いる。その際、縦列
ブロモ−ターは許容されるが、発現ベクター中に挿入さ
れる構成物がプロモーターの存在を必要としないように
ａ因子の転写調節シグナルを維持する。

前ＭｒＦのａ　ｐＪ３子リーダーおよびプロセッシング
シグナルを、酵母もＬ＜は酵母に対して異種性のものの
いずれかより導かれた任意の注目のポリー！！ゾチドの
発現に対して用いることができる。大抵は、注目のポリ
ペプチドは、酵母以外のもの、とｂわけ動物、ざらにと
りわけ霊長類、そして最も頻繁には家畜もしくはヒトか
らの自然に生ずるポＩＪ　／Ｊ？ゾチドである。さらに
、合成；ｉｔ”）　被ゾチドも注目のものである。

前記構成物はベクター中への挿入に対する軽便な配列を
与え、その際、この構成物を、発現に対して注目の遺伝
子を含むように連結してもよい。

得られる複製構成物は、転写シグナル並びに分泌および
プロセッシングシグナルを有する便利な複製系であって
前記分泌およびプロセッシングシグナルと一緒の読み枠
において注目のポＩＪ−、’７’チドをコードする遺伝
子の挿入をアダプターの使用によって準備する制限部位
を有する便利な複製糸を与える。このようにして、分泌
されプロセスされたゾロポリ波デチドを生産する酵母分
泌シグナルを昭識する宿主においてこのような遺伝子の
発現を得ることが可能である。

最終の構成物は、宿主、とりわけ真菌性の宿主、例えば
、酵母中での安定な維持を可能とする工ぎソーム要素で
ある。この構成物は、１もしくけそれ以上の複製系、望
ましくは２つの複製系を含み、その個々の複製系は、発
現宿主、とシわけ酵母における維持および原核生物にお
けるクローニングを準備する、単一配列もしくは非隣接
の複数配列であってもよい。さらに、■もしくはそれ以
上の選択マーカーを含んでいてもよく、そのマーカーは
、どちらか一方のもしくは双方の宿主におけるエピソー
ム要素の維持のための選択圧を準備する。

さらに、エビソーム要素を大きいもしくは小さいコぎ一
数で維持してもよく、とのコピー数は通常的１〜２００
、さらに通常には１〜１００の範囲にある。大きいコピ
ー数のエビソーム要素を用いる場合、その：？−−数は
５一般に少なくとも１０、通常少なくとも２０であり、
そして通常は約１５０を越えず、さらに通常は約１００
のコぎ一数を越え々い。

注目の特定の、ｌｅ　ＩＪペプチドに依存し、宿主にお
けるポリ４ｆチド生産物の影響および分泌の能力を考慮
すると大きいもしくは小さいコピー数のいずれか一方が
望ましい。遺伝子の発現生産物の存在が宿主の生存能力
に有害な影響を与える場合には、小さいコピー数を指示
してもよい。

さまざまな宿主、とりわけ酵母宿主、とりわけ所望の特
質、補完を準備するいずれかの障害を有するミーータン
ト、特定の調節系を欠いているかもしくは有しているミ
ーータント等を用いてもよい。構成物の発現生産物の生
産率に依存して、プロセッシング酵素が生産のそのレベ
ルにおいてプロセッシングに対して適切であったりなか
ったりすることは正しく評価されるべきである。従って
、ゾロセッシング畠素の高められた生産を有するミーー
タントを指示してもよいしまたは酵素の高められた生産
をエピソーム要素によって得てもよい。

一般に、酵素の生産は所望の発現生産物の生産より低い
オーダーでなければならない。

これに代えて、細胞内のプロセッシングが望ましくない
状態が存在してもよい。この状態においては、その膜中
にプロセッシング酵素を欠いているかまたは比較的非能
率的プロセッシングを行なうミュータントが望ましい。

この状態においては、生産物を引き続き試、験管内でプ
ロセスすることができる。

さらに、構造遺伝子がインターゲイーニングゾロセッシ
ングシグナルと共に、縦列に繰り返し単位として存在し
ていてもよい。次いで、その生産物を総体的にまたは部
分的にプロセスしてもよく、その結果としてさまざまな
ポリ（アミノ酸）配列を引き続きのプロセッシングに対
して縦列の状態でまたは個々に得る。多くの状態におい
ては、異なる縦列配列を準備することが望ましく、その
際、各配列は特別のタン・ぐり生産物の副単祉である。

ある状態においては、多機能の融合生産物の生産を準備
するように、隣接する縦列の異種性構造遺針子間に介在
する！ロセッシングシグナルを除去することが望ましい
。

構造遺伝子は、任意の型の注目のポリペプチドをコード
してもよい。このｌリペプチドは、８個のアミノ酸のオ
リゴにゾチドと同程度に小さいものであってもよいしま
たは１００，０００ダルトンもしくはそれ以上であって
もよい。通常、単一鎖は、約３００．０００４１″ルト
ン以下、さらに通常は約１５０，０００ダルトン以下で
ある。とりわけ注目に値するのは、約５，０００〜１５
０，０００ダルトンのポリペプチド、さらにとりわけ約
５，０００〜１００，０００ダルトンのポリ−！ノチド
である。

実例となる注目のポＩＪ−ｅ７″チドは、以下に列挙す
るホルモンおよび要素を含んでいる。すなわち、例えば
、成長ホルモン、ツマトメノン、表皮の成長因子等；内
分泌物、例えば、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモ
ン、レラキシン、セクレチン、オキシトシン、インシュ
リン、・々ゾゾレッシン、レニン、カルシトニン、４１
ｔｆｌＪ激ホルモン、プロラクチン等：造血要素、例え
ば、工ＩＪ　）ロポエチン、ゴロニースティミュレイテ
ィングファクター（ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａＮｎ
ｇ　ｆａｃｔｏｒ　）等；リンフ才力イン、例えば、イ
ンターロイキン−２；グロビン、グロブリン、例えば、
免疫グロブリン、アルブミン；インターフェロン、例え
ばα、βおよびγ；調節タン・ぐりおよびレプレッサー
：酵素おＪ：　Ｕ　’ｔ’ｆＪＪ　造タンパク；エンド
ルフィン（ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ）　ｂ例ｔば、β−エン
ドルフィン、エンケファリン（＠ｎｋｅｐｈａＮｎ　）
　、ダイノルフィン（ｄｙｎｏｒｎｈｉｎ　）％哺乳動
物性病原体タンパク、例えば、ＨＢｓＡｇ、　カデシＰ
タンノンク等を含んでいる。

本発明の構成物を含有するエピソーム要素を調製した後
に５このような要素を適当な宿主中に導入してもよい。

導入方法は従来的なものであシ、宿主中にＤＮＡを導入
するために広範囲の種類の方法がある。便利には、例え
ば、ヒンネン（ｆ（ｉｎｎｅｉ等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　
（１９７８）　７５　：　１９１９〜１９３３の方法ま
たはステインクコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　）等、ヨ
ーロ、ｔ４’特許出願第００４５５７３号の方法を用い
てスフェロプラストを調製する。次いで形質組換体を適
当な栄養培地中で増殖させてもよく、そ１−て適当な場
合には１選択的圧力を形質転換体上に維持してもよい。

発現が誘発可能な場合には、高密度までの酵母の増殖を
準備することおよび次いで発現を誘発することが可能で
ある。分泌はされるが生産物の実質的割合が用辺質空間
に保たれるような状態においては、酵素、例えば、ザイ
モラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ　）もしくはリチカーゼ（
ｌｙｔｉｃａｇｅ　）を用いて酵母細胞を処理すること
によって生産物を解放することができる。

生産物を任意の便利な方法５例えば、遠心法によって収
集してもよく、次いでタンＡ？りをろ過、クロマトグラ
フィー、電気泳動、透析、溶剤−溶剤抽出等によって精
製１〜でもよい。

主題の発明に従って、生産物収率を大いに高め、精製を
簡単にし、所望の生産物の減成を最小にし、そｊ〜でノ
ロセッシング準備および操作要件を簡単にするように、
広範囲の種類のポＩＪ−ｅ７″チドの分泌を準備するこ
とができる。さらに、生産性に基づく栄養物の利用を大
いに増大させることができ、それによってポリ−２グチ
ドのより経済的かつより有効な生産を達成できる。同様
に、酵母の使用は５原核生物と共に存在しているかもし
れない腸毒素を避けること、および長期間にわたり酵母
に対して開発されてきた公知の醗酵技術（この技術は酵
母生産物の単離も含んでいる）を用いること、それら双
方において多くの利点を有している。

下記の実施例を、限定的でなく本発明をさらに説明する
ために提供する。

実施例 下記の配列を有するオリゴヌクレオチドの収集物を合成
する。

これらのオリゴヌクレオチドを、シラスミドｙｇｐ　１
３中でクローニングされた酵母ＤＮＡフラグメントライ
ブラリー（ナスミスおよびタットケル（Ｎａｇｍｙｔｈ
　ａｎｄ　Ｔａｔｅｈｅｌｌ　）　、Ｃｅ１ｌ　（１９
８０）１９ニア５３）のハイブリダイゼーションによる
探知に用いる。このオリゴヌクレオチドゾールを、成熟
ａ因子４ゾチドの報告された構造（ペッツ他５ｏｐ、　
ｅｆｔ、、Ｉｎｆ　ｒａ）に基づいて、ａ因子ペプチド
をコート０するＤＮＡの領域に相補的な分子を含むよう
に計画する。この成熟ａ因子〈グチドのアミノ酸配列は
下記の通りであると報告され、オリゴヌクレオチドプロ
ーブは、　Ａｓｘの第２塩基を通して第２１１ｅをコー
ドする第１の５′−塩基から伸びている。

１９．５キロベースのプラスミド％　ｐＡＢｌ　５１を
このオリゴヌクレオチドゾールに対するノ１イブリダイ
ゼーションによって同定する。制限酵素旦υＲ１および
Ｘｂａ　ＩによるｐＡＢ　１５１の消化に続いて、　Ｄ
ＮＡのハイブリダイゼーション検出セグメントを含有す
る１５００ｂｐフラグメントを同定する。ＤＮＡ　、ｔ
？リメラーゼクレノー断片を用いたこの７ラグメントの
突出末端の修復およびＢａｍＨＩオリゴヌクレオチ１７
１Ｊンカーの付加に続いて、このフラグメントをシラス
ミドｐＢＲ３２２のＢ　ａｍＨＴ部位中に連結し、シラ
スミドｐＡＢ　１６１である５９００ｂｐｆラスミドを
得る。このフラグメントの方向がａ因子遺伝子のコード
方向によって決められている場合には、このフラグメン
トから上流にＳａｌ　Ｉフラグメントがあり、ａ因子か
ら上流のＢａｍＨｌ　　部位のその部位の近傍に［ａｏ
Ｒ１フラグメントがあり、下流シェＨＩ部位から下流に
ｇｃｏＲＩがあシ、下流ｇｃｏ　Ｒ４部位の近傍でかつ
下流旦副Ｒ■部位およびＢａｍＨｉ部位の間にＴＨｎｄ
１部位がある（第１図を参ｆｆ＠）。

推定のａ因子構造遺伝子の構造 ｐＡＢ１６１における挿入のＤＮＡ配列を決定しそして
これが１５６９の塩基対からなることを見い出した。こ
のＤＮＡの一領域は報告されたａ因子〈ゾチド配列の大
部分をコードするヌクレオチドを含有していることが見
い出された。この配列は、下記の配列中に示される推定
のａ因子前駆体コーＰＡＢ　１６１中の１５００　ｂｐ
ＢａｍＨｌ　７ラグメントが機能的ａ因子構造遺伝子を
含んでいるという下記の２つの型の生学的証拠を得た： （１）プラスミドｐＡＢ　１６１を、ａ−缶体、α−倍
缶体たはａ／Ｃ１二倍体交缶体のＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ株からＲＮＡを探知するために用いる。ａ交配型
の細胞だけがｐＡＢ　１６１にハイブリッド形成するＲ
ＮＡを生産する。従って、ｐＡＢ　１６１における挿入
はａ種の遺伝子をコードする。

（２）ｐＡＢ１６１からの１５００ｂｐシワＨｌフラグ
メントをハイコピー酵母！ラスミドｐｃ１／１　　のＢ
ａｍＨＩ部位中に連結し、グラスミドｐＡＢ１６３を得
る。（プラスミドｐｃ１／１はｐＪＤＢ　２１９の誘導
体であり（ペックス（Ｂｅｇｇｓ　）、Ｎａｔｕｒｅ　
（１９７８）２７５：１０４）、その誘導体においてｐ
ＪＤＢ２１９中で細菌性グラスミドｐＭＢ９に対応する
領域をｐｃ１／１中ｐＢＲ３２２によって置きかえた。

ｐ　Ｃ１／１は完全酵母２μｍレグリケーター、酵母Ｌ
ＥＵ　２遺伝子および完全ｐＢＲ３２２を含んでいる。

）ｐＡＢ　１６３を、形質転換およびＬｅｕ＋形質転換
体の火択によって酵母株ＡＢＩＯＩ（１１リユ又見μ］
　−り」」勺上土）中に導入する。レプリカプレート・
ぐイオアッセイによって判断した場合、これらの形質転
換体が対照株より少々くとも１０倍多計のａ因子を生産
することが見い出される。

村ッツ等によって報告されたアミノ酸配列（Ｏｐ。

ｃｔｔ、、１ｎｆｒａ）と比較すれば、ｐＡＢ　１．６
１のＤＮＡ配列は、成熟ａ因子配列のアミノ末端および
カル、ゼキシ末端の双方の付加的アミノ酸をコードする
。

さらに、成熟ａ固子波ノチＰの力ルゼキシ末端に対応す
るアミノ酸の順序に相違がある（ＤＮＡ配列の生産：　
−Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｈａ　−：　報告された
ベプチｒ配列：　−Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｓｘ　Ｐｒｏ　
）　。

構成物の調製 発現のために遺伝子としてヒト表面成長因子を用いる構
成物についての良型的手順は以下の通りであった。！ラ
スミドｐＡＢ　１６１をＡｖａ　ＩＩを用いて開裂しそ
して得られたフラグメントをヌクレアーゼＢａ１１３１
を用いて切除し各末端から約２９ｂｐを除去する。下記
の配列 ５′３′ を有するオリゴヌクレオチドを得られた混合物に連結す
る。連結混合物を酵素シＬｒｎＨＩ　およびＳａｔ　■
を用いて消化しそして約６９０　ｂｐの７ラグメントを
ゲル単離する。これらのフラグメントを、　Ｂａｒｒｆ
（ｌおよびシリ■を用いて消化したｐＢＲ３２２に連結
する。得られたシラスミドを、下記の配列５’−ＧＡＣ
ＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴ　−３’を有する　Ｐ−フジ
オシ４ル付の化学的に合成されたオリがヌクレオチドプ
ローブにハイブリッド形成する分子についてスクリーニ
ングする。次いで、そのようにして選択したプラスミＰ
をさらにＳｔｕ７部位の存在についてスクリーニングす
る。

このような分子を、下記式 で示されるａ因子遺伝子の所望の位置での前記オリゴヌ
クレオチドの連結によってつくる。

得られた分子は今や、ａ因子前駆体のａ因子リーダーを
コードする領域に隣接したＳｔｕ　ｌおよびＨｇａ　Ｉ
　認り部位の双方を有している。Ｓｔｕ　■を用いた開
裂により、下記式 のように、遺伝子のａ因子リーダー領域中に開裂を生じ
る。これに代えて、下記式 で示される生産物を生ずるようにａ因子リーダー開裂に
対してＨｇａ　ｌを用いてもよい。次いで、これらの生
産物配列のいずれか一方を、シラスミドｐ　３２８　Ｅ
ＧＦ−１の開裂によって誘導されたヒト表面成長内子に
対する遺伝子を含有するＤＮＡ分子に連結するととが可
能である。

Ｈｇａ　ｌを用いたｐ　３２８　ＥＧｌｉ’−１の開裂
から得られたＤＮＡ配列は下記の通りである。

以下余白 （３８） これらの分子の連結は、以下のオリテヌクレオチドアダ
プター分子： （１）ａ内子リーダーを開裂する前にＳｔｕ　ｌを用い
た場合には、 または ／２）　　Ｈｇａ　Ｉを用いた場合には、とそして Ｃ３）　　Ｉ（ｇａ　１−　Ｓａｌ　ｌアダプター、を
用いて実施する。

これらの連結混合物のいずれか一方の加旧および５ａｌ
Ｉを用いた開裂は８７０　ｂｐのフラグメントを生じる
。このフラグメントは単離され、そして制限酵素シラ旧
およびシ状１を用いて完全消化されおよびアルカリンフ
ォスファターゼを用（３９） いて処理されたｐｃ１／１中に連結される。この混合物
を用いてＥ、　Ｃｏ１１．ＨＢ　１０１細胞を形質転換
する。

形質転換体をアンピシリン耐性によって選び出しそして
それらのシラスミドを制限エン−ヌクレアーゼ消化によ
って分析する。１つの選ばれたクローン（ｐＹａＥＧＦ
ｌ）からのシラスミドＤＮＡを調製しそしてこれを用い
て酵母ＡＢ１０２細胞を形質転換する。形質転換体をそ
のＬｅｕ＋表現型によって選び出す。

発現生産物のアッセイおよび特命づけ 前記シラスミドｐＹａＦＧＥ　１を用いて形質転換され
た酵母株ＡＢ１０２（上５．稈ツ１−１５轡旦−払μに
１月・県ｙ−測・勇４−５８０）の５０ミＩＪ　ＩＪッ
トル培養物を、飽和（６００ｎｍでの光学濃度５）まで
ロイシン欠如培地中で３０℃において増殖する。細胞上
澄を遠心法によって集めそして線維芽細胞しセプタ競合
結合ア、セイを用いてと）　ＥＧＦの存在について分析
する。ＥＧＩｉ’のアッセイ（ｄ、ヒト包皮線維芽細胞
上の結合部位に対する１２５■−ラベル付マウスＥＧＦ
と競合するマウスおよびヒ）ｇＧＦの双方の能力に基づ
いている。標ｉＭＡｉｔの１２５Ｉ−ラベル付マウスＥ
ＧＦの結合に対する増加量のＥＧ　Ｆの影響を測定する
ことによって標準曲線を得ることが可能である。これら
の条件下に２〜２０　ｎｇのＥＧＦをたやすく測定する
ことができる。ヒ１４１維芽細町への　　■−フペル付
表面成長因子の結合についての詳細は、カー波ンター（
Ｃａｒｎｅｎｔｅｒ　）等によってＪ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　（１９７５）２５０：４２９７に記載され
ている。このアッセイを用いて、培地が１リットル当り
容易に測定可能な量のヒ）　ＥＧＦ’を含んでいること
が見い出される。

上澄中に存在するヒ）　ｇＧＦを適当な生化学的分析方
法、例えば、ｒル雪気泳動、ＨＰＬＣおよびアミノ酸配
列分析に付してもよい。これらの手順の結果により、ざ
らに生産物の同定を確実にする。

一層の特徴付けのために、上澄中に存在するヒ）　ＥＧ
Ｆ’を、イオン交換相ｔ１１￥Ｂｉｏｒｅｘ−７０への
吸収および８０％エタノール中１０ｍＭＨＣ４を用いた
溶離によって精製する。ＨＣｌおよびエタノールの蒸発
の後、１ｍＧＦを水中に可溶化する。この物質は、１７
、５４５ｒ）Ｓ　ｌ”ル中を分子量約６．０００（Ｄ単
−主タンノ？りとして泳動し、おおよそ真正マウスＦＪ
ＧＦ’（分子量〜６，０００）と同一である。このこと
は、ａ因子リーダー配列が分泌プロセスの間正しく切り
取られたことを示している。高分離液体クロマトグラフ
ィー（マイクロデンダノぐツク（ｍ１ｃｒｏ−ｂｏｎｄ
ａｎａｃｋ　）　ＣＩ　Ｌ　　ウォーターズ（Ｗａｔｅ
ｒｓ　）製カラム）による分析は、この生産物が真正マ
ウスｇＧＦ標準物と同様の保持時間で泳動することを示
す。

主題の発明に従って、ベクター中に挿入されポＩＪ−１
’７’チドの発現を与える新規の構成物を提供する。こ
の新規の構成物は、Ｊ　ＩＪ　ｄ　７’チドの分泌を与
え並びに成熟のもしくは余分のアミノ酸の遊離が可能な
プロセスされたポリペプチド生産物を生じるプロセッシ
ングを与えるＮ末端リーダー配列および１もしくはそれ
以上のプロセッシングシグナルを有している。このよう
に、！ロポリー！グチドの分泌を得てもよく、続いてそ
れを生体内もしくは試験管内でプロセスして成熟化音物
を得てもよい。この方法により、自然発生のポリペプチ
ドと同一のアミノ酸配列を有するポリ４７°チドを得る
ことが可能である。ざらに、酔母中でプリー！！ゾチド
を生産することが可能であるので、グリコジル化が起こ
り得て、それによって自然発生の生産物と同一も１−＜
は実質的に同一な生産物を得ることができる。さらに、
この生産物が分泌されるので、細胞数に基づく大いに高
められた収率を得ることが可能でありそして処理および
精製が大いに平易化される。

前述の発明を、理解の明確化のために説明および実施例
によっである程度詳細に記載したが、本特許請求の範囲
内での所定の変更および修正が可能かことは明白であろ
う。

なお、この発明に関連する細菌細胞株Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ
Ｉ　０１　（ｐＡＢｌ　６３　）が、１９８３年４月２
０日にアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクショ
ン（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ）に寄託され、第３９３４２

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＡＢ　１６１の図解図である。 特許出願人 チロン　コーポレイション 特許出願代理人 弁理士　背　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士吉田維夫 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也 ｒ因チ ＦＩＧ、　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 】、　プロセッシングシグナルを含むａ因子の酵母リー
   ダー配列、および前記リーダー配列およびプロセッシン
   グシグナルと読み枠を共通にする異種性遺伝子を含んで
   なるＤＮＡ構成物。 ２、下記式： ％式％ 〔式中５ Ｌはａ因子分泌リーダー配列であり； ＰＳはプロセッシングシグナルであり；遺伝子は酵母に
   異種性の遺伝子であり；そしてｎはＯまたは１である〕 の特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構成物。 ３、前記遺伝子が哺乳動物性遺伝子またはその部分であ
   る、特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ構成物。 ４、前記遺伝子が哺乳動物性病原体遺伝子またはその部
   分である、特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ構成物。 ５、下記式： ％式％ 〔式中、 Ｐは酵母ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモ
   ーターであシ； Ｌばａ因子分泌リーダー配列であり； ＰＳはプロセッシングシグナルであシ；遺伝子はＬおよ
   びＰＳと位相状態にあるオーブンリーディングフレーム
   を有し、酵母に対して異種性のポリーｏ、ｏチドについ
   てコードするＤＮＡ配列であり； ｇおよびｖ（Ｊ少なくとも１であシフ １Ｒｅｐｓｌ１４．酵母によって認識される複製系であ
   り、末端としてのＰおよび遺伝子によって規定される直
   接発現領域外の構成物中のどこに位置していてもよく：
   そして ｎおよびｒｌＺＯまたは１であり、ｎまたはｒの少々く
   とも１つｌｆｆ１である〕 のＤＮＡ構成物。 ６、　　ｒが１でありそして前記ポリペプチドが哺乳動
   物性ポリペプチドである、特許請求の範囲第５項記載の
   構成物。 ７、　　ｒが１でありそして前記ポＩＪ　ｄゾチドが哺
   乳動物性病原体遺伝子またはその部分である。特許請求
   の範囲第５項記載の構成物。 ８、前記ノロモーターがａ因子ブロモ−ターである、特
   許請求の範囲第５項記載の構成物。 ９、酵母によって認識される前記複製系が酵母２μｍ７
   ’ラスミドまたはその部分である。特許請求の範囲第５
   項記載の構成物。 １０、式中ｑが２であり、そしてさらに細菌によって認
   識される複製系を含んでなる、特許請求の範囲第５項記
   載の構成物。 １１、　　分泌されるポリ４プチド生産物の生産方法で
   あって。 特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ構成物を含有する酵
   母細胞を増殖させること、それによって前記分泌リーダ
   ー配列、グロセッシングシグナルおよび前記、１１Ｊ−
   、！ゾチドをコードする遺伝子が融合ポリペプチドとし
   て発現され、前記融合ポリペプチドが前記酵母細胞によ
   って分泌されそしてプロセスされること を含んでなる生産方法。 １２、オープンリーディングフレームを有する別種の源
   からの２個のＩｌ’ＪＡフラグメントであって、この２
   個のフラグメントが第１７ラグメントおよび第２７ラグ
   メントであり、そして前記第１フラグメントの少々くと
   も一部が上流フラグメントであり、前記第２７ラグメン
   トの少なくとも一部が下流フラグメントである２個のＤ
   ＮＡフラグメントを位相状態に連結する方法であって、 前記第１７ラグメントを変形して、少なくとも２個の塩
   基（但しエンドヌクレアーゼの認識部位よりも２個より
   多くない数だけ少ない塩基）を有する３′末端を与える
   とと； 前記変形した３′末端に、前記認識部位を完成させるダ
   末端を有するリンカ−を連結するとと：前記エンドヌク
   レアーゼ認識部位において開裂すること：そしてアダゲ
   タ−を用いて読み取シ位相内に前記上流フラグメントお
   よび下流フラグメントを連結すること を含んで々る方法。 １３、オープンリーディングフレームを有する別種の源
   からの２個のＤＮＡフラグメントであって、この２個の
   ７ラグメントが第１７ラグメントおよび第２７ラグメン
   トであり、そして前記第１７ラグメントの少なくとも一
   部が上流フラグメントであり、前記第２７ラグメントの
   少なくとモ一部が下流フラグメントである２個のＤＮＡ
   フラグメントを位相状態に連結する方法であって、 前記第１７ラグメントを変形して、少なくとも２個の塩
   基（但しエンドヌクレアーゼの認識部位よりも２個より
   多くない数だけ少ない塩基）を有する３′末端を与える
   とと； 前記変形した３′末端に、前記認識部位を完成させそし
   て第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を規定する５′末
   端を有するリンカ−を連結させるとと、その際、前記認
   識部位から離れた上流の部位に対して開裂が指令される
   とと； 前記第２のエンドヌクレアーゼ認！　部位において開裂
   するとと；そしてアダプターを用いて読み取シ位相内に
   前記上流フラグメントおよび下流フラグメントを連結す
   ること を含んでなる方法。