DD297841A5 - Herstellung von superoxiddismutase in pichia pastoris hefezellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Methoden fuer die Herstellung des Enzyms Superoxiddismutase und insbesondere Humansuperoxiddismutase durch Zuechten von P. pastoris, die zur Expression des Enzyms transformiert worden ist, zur Verfuegung.{Superoxiddismutase; Superoxiddismutase enthaltende Zusammensetzung; Verfahren zur Herstellung von Superoxiddismutase; Pichia pastoris-Zuechtung; P. pastoris AOX1-Gen}

Description

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft allgemein Fortschritte in der Molekularbiologie und der Technik der In-vitro-DNA-Rekombination. Die Erfindung ist speziell auf ein Verfahren der Technik der In-vitro-DNA-Rekombination zur Herstellung von Polypeptiden mit Superoxiddismutasewirksamkeit (nachfolgend auch als SOD-Wirksamkeit bezeichnet) in Pichia pastoris Hefezellen gerichtet.

Pichia pastoris Transformanten, die in ihrem Genom mindestens eine Kopie einer ONA-Sequenz enthalten, die das gewünschte Polypeptid unter der Regulation einer Promotorregion eines P. pastoris Gens operierbar kodiert, werden unter Bedingungen gezüchtet, die die Ausprägung des SOD-Genprodukts ermöglichen. Die Erfindung betrifft ferner die P. pastoris Transformanten, DNA-Fragmente und Expressionsvektoren, die für deren Herstellung und sie enthaltende Kulturen verwendet werden.

Ausgangssituation der Erfindung

Eine Vielzahl von normalen und pathologischen Prozessen in aeroben Zellen führt zur Erzeugung von gewebeschädigenden freien Radikalen. Es wird davon ausgegangen, daß Superoxidraoikal (O₂.'), in vielen Fällen durch das Enzym Xanthinoxidase erzeugt, der Hauptvermittler für solche Schäden ist, die beispielsweise dann vorkommen können, wenn Gewebe nach einem Organtransplantat oder nach Entfernung eines Blutkuchens reperfunr'iert wird. Superoxidradikal spielt auch eine Rolle bei der Entzündungsreaktion von Phagozyten. Dies wird durch die Beobachtung bestätigt, daß eine Familie von Enzymen, die Superoxid (Superoxiddismutasen) zerstören können, den Superfusionsschaden wesentlich reduzieren kann und entzündungshemmende Eigenschaften besitzt.

Superoxiddismutasen sind Enzyme, die entweder Cu(II) und Zn(II) oder Mn(II) allein oder Fe(II) allein im aktiven Zentrum haben, um die Reaktion

O₂." + O₂." + 2H⁺ -> H₂O₂ + O₂

zu katalysieren.

Das erste Protein, bei dem 1969 Superoxiddismutasewirksamkeit nachgewiesen wurde (McCord et al., J. Biol. Chem. 244,6049 [1969]), wurde 1939 aus Erythrozyten isoliert und Erythrocuprein benannt. Seitdem sind die Gene verschiedener Glieder der Familie kloniert worden (Sherman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. IJSA 80,5465 [1983]; Hallewell et al., Nucleic Acids Res. 13,2017 [1985]; Beck et al., Nucleic Acids Res. 15,9076 [1987]), und für das Rinder-Cu/Zn-Enzym (Richardson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72,1349 [1975]) ist die Röntgenkristallstruktur bestimmt worden. Die Aminosäuresequenz von Humansuperoxiddismutase (HSOD), einem eukarvotischen, zytoplasmatischen Cu/Zn-En/ym, ist in Jabusch et al., Biochemistry 19,2310 (1980) beschrieben. Danach ist HSOD ein nichtkovalentes Dimer von identischen Untereinheiten, von denen jede 153 Aminosäuren enthält. Der Aminoterminus der Polypeptidkette ist acetyliert. Die Nukleinsäure- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen des HSOD-Monomers sind, wie in der Veröffentlichung der Europäischen Patentanmeldung Nr. 233.244 beschrieben, in Figur 1 dargestellt. Die in der Literatur angeführten Sequenzen können mehrere Nukleotidunterschiede aufweisen, dies scheint jedoch keine Wirkung auf die Gesamtstruktur und die Eigenschaften von HSOD zu haben.

Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von reifer menschlicher extrazellulärer Superoxiddismutase (EZ-SOD) mit denen von Cu/Zn-Superoxidismutasen von Mensch, Schwein, Kuh, Pferd, Schwertfisch, Fruchtfliege, Spinat, S. cerevisiae und P. leiognathi wird von Hjalmarsson et al. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,6340 (1987) ergeben.

Die Fähigkeit von Superoxiddismutasen, die Zerstörung von Superoxidradikalen zu katalysieren, macht sie bei einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen nützlich. Vom Rind abgeleitete SOD wird gegenwärtig als ein entzündungshemmendes Humanpharmazeutikum oder als ein Veterinärprodukt, insbesondere zur Behandlung von Sehnenentzündungen bei Pferden, vertrieben. Die potentiellen pharmazeutischen Anwendungen sind sogar noch zahlreicher. Um das volle therapeutische Potential von Superoxiddismutasen auszuschöpfen, kann es vorteilhaft sein, das HSOD-Enzym für die Humantherpeutik zur Beseitigung der bei dem antigen ausgeprägten Rinderenzym möglichen negativen immunologischen Reaktionen zu verwenden. Sowohl Human- als auch Veterinäranwendungen von Superoxiddismutasen erfordern große Mengen dieser Stoffe, die nur mittels der Technik dor In-vitro-DNA-Rekombination hergestellt werden können.

Die Expression von Cu/Zn-HSOD in E.coli unter der Regulation des tacl-Promotor ist von Hallewell et al., Nucleic Acids Res. 13, 2017 (1985) beschrieben worden. In dem in E.coli ausgeprägten Polypeptid ist das N-terminale Methionin entfernt und im Gegensatz zu der authentischen HSOD ist die N-terminale Alaningruppe nicht acetyliert. Von 500 untersuchten Klonen synthetisierten nur etwa 25 5% oder mehr des löslichen Zellproteins als SOD. In einem Versuch, der ihr Optimum zu sein scheint, wurden ca. 15% lösliches Zellprotein als SOD identifiziert. Das Fehlen der N-terminalen Acetylierung ist nachteilig. Wo die natürlich vorkommende Form eines Polypeptids, wie das bei HSOD der Fall ist, N-acetyliert ist, werden für therapeutische oder diagnostische Zwecke die authentischen, d. h. N-acetylierten rekombinanten Produkte bevorzugt. Auf diese Weise kann die Immunogenität ausgeschalten oder zumindest minimiert werden, wenn das rekombinante Produkt einem menschlichen oder tierischen Wirt verabreicht wird. Auch sind acetylierte Polypeptide gewöhnlich stabiler und gegenüber Abbau durch Proteasen widerstandsfähiger.

Hefen haben sich aus einer Reihe von Gründen als Wirte für die Herstellung von Superoxiddismutasen als gute Alternativen gezeigt. Im Falle von eukaryotischen heterologen Proteinen, z. B. SOD's, können Hefen eindeutige Vorteile gegenüber Bakterien bieten. Die intrazelluläre Umgebung von Hefen, die selbst Eukaryoten sind, ist dem richtigen Falten des Moleküls eher förderlich. Darüber hinaus können Hefen im allgemeinen bis zu einer höhei η Zelldichte gezüchtet werden als Bakterien. Des weiteren wird der Initiator Methionin oft durch Hefe verarbeitet; in Bakterien wird dies nicht oft beobachtet.

Die Herstellung von HSOD in S. cerevisiae (Backhefe) ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 84111416.8, die am 24.4.1985 unter der Nummer 0.138.111 veröffentlicht wuro'o, beschrieben. In Laborversuchen war Cu/Zn HSOD in der Größenordnung von ca. 10 bis 30% des Gesamtzeilproteins in N-acetyiierter, authentischer Form ausgeprägt.

Hallewell et al., Bio/Technology 5,363 (1987) (Erfinder der oben angegebenen Patentanmeldung), berichten bei Anwendung eines Saccharomyces cerevisiae Stammes 2150-2-3 leu über die Herstellung einer N-acetylierten, authentischen Form von Cu/Zn HSOD. Obwohl nach diesem Artikel HSOD unter der Regulation des Hefeglyceraldehydphosphatdehydrogenase-Promotors auf „sehr hohem Niveau" ausgeprägt ist, geben die Autoren keine quantitativen Werte hinsichtlich des Ausprägungsgrades an. Darüber hinaus zitieren die Autoren keine Werte, die anzeigen, daß der Ausprägungsgrad allein aus HSOD und heißer HSOD in Kombination mit Hefe-SOD besteht. Es wird angegeben, daß der HSOD-Grad zwischen 30% und 70% des Gesamtzellproteins in Hefe der stationären Wachstumsphase liegt. Ihre Ergebnisse in exponentiell wachsenden Zellen waren wesentlich schlechter, so daß HSOD während der exponentiell Wachstumsphase gelegentlich nicht nachweisbar war. Dies bedeutet daraufhin, daß das

Vermehren der Zellen bis zur stationären Wachstumsphase zur Erreichung eines angemessenen Ausprägungsgrades notwendig ist. Dies führt wiederum zu einem langen Fermentationsverfahren ohne die praktische Möglichkeit der kontinuierlichen Arbeitsweise.

Obwohl S. cerevisiae wahrscheinlich die am gründlichsten untersuchte Hefe ist, ist sie gewöhnlich nicht die geeignetste Hefe für die Herstellung von Fremdproteinen. In vielen Fällen ist man in dem Versuch, vom Labormaßstab auf einen kommerziell zweckmäßigen Maßstab überzugehen, auf Probleme gestoßen. Eine Problemquelle besteht darin, daß die für die Ausprägung in S. cerevisiae verfügbaren Promotoren relativ schwach und nicht gut reguliert sind. Infolgedessen müssen Ausprägungsgefüge normalerweise auf Plasmide mit hoher Kopienzahl gebracht werden, um einen akzeptablen Ausprägungsgrad zu erreichen. Dies gilt für die Herstellung von HSOD in S. cerevisiae, wie von Hallewell et al., Supra, beschrieben worden ist. In Fermentoren.die mit hoher Zelldichte arbeiten, geht die Selektion zur Plasmiderhaltung verloren, und Plasmidverteilung, Kopienzahl und Stabilität werden zum Problem.

Um diese und andere Probleme zu überwinden, die bei S. cerevisiae aufiiöien, ist ein !!oiesusprugursgsoycterr! auf der Basis von Pichia pastoris entwickelt worden. P. pastoris ist eine methylotrophe Hefe; sie hat Stoffwechselwege, die auf Methanolnutzung reagieren und diese regulieren. Ein Schlüssolenzym in dem Methanolweg ist Alkoholoxidase, ein Protein, das durch zwei Gene kodiert ist, Alkoholoxidase I (AOX 1) und Alkoholoxidase Il (AOX2). Wenn P. pastoris Zellen in Gegenwart von Methanol gezüchtet werden, werden die AOX1 und A0X2-Gene transkribiert, und es wird eine große Menge Alkoholoxiriaseprotein hergestellt. Der hohe Grad der AOX-Genausprägung ist haup' -ächlich auf den AOX1 -Genpromotor zurückzuführen, der in Gegenwart von Methanol aktiviert wird und stark ausgeprägt und straff reguliert ist (siehe beispielsweise Europäische Patentanmeldung Nr. 85113737.2, die am 30.10.1984 unter der Nummer 183.071 veröffentlicht worden ist). Eine vollständigere Beschreibung eines auf Methanol reagierenden P. pastoris Ausprägungssystems, das heterologe Gene unter die Regelung des P. pastoris AOX1-Promotors bringt, findet man bei Cregg et al., Bio/Technology 5,479 (1987). Obwohl P. pastoris erfolgreich für die Herstellung von verschiedenen heterologen Proteinen, z. B. Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBOAg) (Cregg et al.. Supra) oder Tumornekrosefaktor, verwendet wird, haben Bemühungen zur Herstellung anderer heterologer Genprodukte in Pichia gemischte Ergebnisse gebracht. Beim gegenwärtigen Erkenntnisstand zum P. pastoris Ausprägungssystem kann nicht vorhergesagt werden, ob ein gegebenes Gen in dieser Hefe ausgeprägt werden kann, ob der Ausprägungsgrad zufriedenstellend ist oder ob Pichia das Vorhandensein des rekombinanten Genprodukts in seinen Zellen toleriert oder nicht.

Summarische Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung beruht auf der Nutzung des P. pastoris Ausprägungssystems für die Herstellung von Polypeptiden mit SOD-Wirksamkeit durch die Technik der In-vitro-DNA-Rekombination. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr effizient, indem es SOD, insbesondere HSOD, in überraschend hohem Grad erzeugt, und es läßt sich ohne wesentliche Veränderungen bei den Fermentationsbedingungen oder Wirksamkeitsverlust leicht von Schüttelgefäßkulturen auf große Fermentoren übertragen. Da Doppelkopiestämme einen wesentlich höheren Ausprägungsgrad ergeben als Stämme, die nur eine einmalig vorkommende Kopie der Ausprägungskassette in ihrem Genom integriert haben, verfügt das erfindungsgemäße Ausprägungssystem über ein großes Potential zur weiteren Erhöhung des Ausprägungsgrades durch Einführung zusätzlicher Kopien der Ausprägungskassette in das Hefegenom.

Pichia pastoris ist ein bekannter industriell genutzter Hefestamm, der Methanol als einzigste Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen kann. Nach unseren Versuchen können Polypeptide mit SOD-Wirksamkeit, z. B. Human-SOD (HSOD), wirksam hergestellt werden, indem mindestens eine Kopie einer Ausprägungskassette, die eine DNA-Sequenz enthält, welche das gewünschte SOD-Polypeptid unter der Regulation einer Promotorregion eines P. pastoris Gens verschlüsselt hat, in das Genom des Wirtsstammes integriert wird.

Zur Gensubstitution wird ein lineares DNA-Fragment, das mindestens eine Kopie der Ausprägungskassette enthält, in einen gewünschten Genort, z. B. den AOX1 -Genort, wo es das endogene Gen ersetzt, eingefügt. Wenn das AOX1 -Gen infolge des Einschubs der Ausprägungseinheit gestört wird, liefert das noch funktioneile AOX 2-Gen genügend Alkoholoxidase für ein langsames Wachstum auf Methanol. Diese Stämme werden als Mut⁺ bezeichnet, das für defekte Methanolnutzung steht. In den Stämmen, die unter Anwendung der Genadditionsverfahrensweise entwickelt werden, wird die auf dem transformierenden Plasmid enthaltene Ausprägungskassette in den gewünschten Genort, z. B. den AOX1 oder HIS4-Genort, ohne Unterbrechung des endogenen Gens eingefügt. Diese Stämme werden mit Mut* bezeichnet und zeigen Wildtypwachstum auf Methanol.

Eine stabile Integration wurde sowohl durch Gensubstitution als auch durch Plasmidaddition erreicht. In beiden Fällen führt die Entwicklung von Transformanten durch die Anwendung von integrierenden Vektoren im Gegensatz zu den auf autonomen Plasmiden basierenden (wie bei S. cerevisiae) zu produktiveren rekombinanten Stämmen.

Bei der Herstellung von SOD-Polypeptiden schnitten sowohl Mut" als auch Mut⁺-Stämme gut ab, allerdings zeigte sich Mut* überlegen. Der ΜυΓ-Stamm, der zwei integrierte Kopien der SOD-Ausprägungskassette in seinem Genom enthielt, erzeugte HSOD in einer mindestens dreimal höheren Konzentration als der ebenfalls ungewöhnlich hohen, von Stämmen mit einer einmalig vorkommenden Kopie erzeugten Konzentration.

Diese Erfindung betrifft eine P. pastoris Zelle, die in ihrem Genom mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz enthält, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit unter der Regulation einer Promotorregion eines P. pastoris Gens operierbar verschlüsselt.

Nach einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung DNA-Fragmente, die in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion eines ersten P. pastoris Gens, eine Sequenz, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit operierbar verschlüsselt, und ein Transkriptionsterminationssegment eines zweiten P. pastoris Gens umfassen, wobei das erste und zweite P. pastoris Gen gleich oder unterschiedlich sind. Das erfindungsgemäße DNA-Fragment kann des weiteren ein selektierbares Marker-Gen und Enden mit ausreichender Homologie mit einem Zielgen, um die Integration des DNA-Fragments darin zu bewirken, umfassen. Die DNA-Fragmente können aber auch in ringförmigen Plasmiden enthalten sein oder solche darstellen, die linearisiert werden können und an einer Homologiestelle zwischen Wirt und Plasmid eingebaut werden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptide mit SOD-Wirksamkeit, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß P. pastoris Transformanten, die in ihrem Genom mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz enthalten, die in P. pastoris ein Polypeptid mit Superoxiddismutasewirksamkeit unter der Regulation einer Promotorregion eines P. pastoris Gens operierbar verschlüsselt, unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Ausprägung der DNA-Sequenz in dem P. pastoris Stamm ermöglichen.

Die Polypeptide mit SOD-Wirksamkeit we den erfindungsgemäß in richtig gefallener, authentischer Form hergestellt, haben die richtige Größe und Oberflächenladung. Die gewonnenen Polypeptide sind voll funktionell, um die erwartete spezifische Aktivität zu liefern.

Die Erfindung ist auf die obigen Aspekte und alle damit im Zusammenhang stehenden Methoden und Mittel zur Erreichung dieser gerichtet. Die Erfindung schließt zum Beispiel die ^Technik ein, die für ein angemessenes Wachstum der P. pastoris Wirtszellen, Fermentation und Extraktion des SOD-Polypeptidgenprodukts erforderlich ist. Die Erfindung umfaßt des weiteren Methoden und Mittel für die Entfernung oder Inaktivierung des endogenen P. pastoris SOD-Gens. Der Ersatz dieses Gens durch eine DNA-Sequenz, die Human-SOD verschlüsselt, unter der Steuerung eines Promotorregion des endogenen P. pastoris SOD-Gens, verbessert weiter die Produktionshöhe und bringt HSOD in hoher Reinheit ohne begleitende endogene Pichia SOD. Zerreißen und Substitution des Gens können nach Methoden realisiert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. P. pastoris wird als ein Modellsystem für den Einsatz eines methylotrophen Hefewirts, hauptsächlich wegen dessen einmaliger Ausprägungsmerkmale beschrieben. Andere nützliche methylotrophe Hefen können vier Gattungen entnommen werden, und zwar sind das Candida, Hanensula, Pichia und Torulopsis. Äquivalente Arter ius diesen können hierin hauptsächlich auf der Grundlage ihrer nachgewiesenen Charakterisierung, für das Wachstum und die Ausbeutung auf Methanol als einzigster Kohlenstoffnährquelle tragbar zu sein, eingesetzt werden. Siehe beispielsweise Gleeson et al., Yeast 4,1 (1988).

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1: zeigt die Nukleinsäure und vorhergesagte Aminosäuresequenzen von HSOD. In Figur 2 sind die Ergebnisse von bestimmten HSOD Fermentationsversuchen dargelegt. Figur 3 ist eine Darstellung von Superoxiddismutasebestimmungen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

1. Definitionen und allgemeine Methoden

Es wird ein für die Herstellung von Polypeptiden mit SOD-Wirksamkeit geeignetes Ausprägungssystem zur Ve. fügung gestellt. Der Begriff „Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit" erstreckt sich auf Polypeptide jeglicher Herkunft, einschließlich i'flanzen, Tiere wie Säugetiere einschließlich des Menschen, ihre Analogstücke und Fragmente, die Superoxiddismutasewirks, nkeit aufweisen. So gehören zum Beispiel Polypeptide, bei denen einem oder beiden Monomeren, deren Aminosäuresequenz in Figur 1 dieser Anmeldung oder in Figur 2 des Artikels von Hjallmarson et al.. Supra, dargestellt ist, eine oder mehr Aminosäuren fehlen, oder Polypeptide, die zusätzliche Aminosäuren enthalten, oder Polypeptide, bei denen eine oder mehr Aminosäuren in den dargestellten Aminosäuresequenzen durch andere Aminosäuren ersetzt sind, zum Umfang dieser Erfindung, so lange sie in der Art SOD-Wirksamkeit aufweisen. Der Begriff ist so zu verstehen, daß er Dimergefüge, die zwei identische Untereinheiten (Homodimere) enthalten, sowie Dimere, die aus zwei verschiedenen Untereinheiten (Heterodimere) bestehen, einschließt. Der Begriff „SOD-Wirksamkeit" und grammatische Variationen, wie sie in der Spezifikation und den Ansprüchen gebraucht werden, beziehen sich auf die Wirksamkeit, die Superoxiddismutasen aufweisen, welche aus einer natürlichen Quelle in auf dem Fachgebiet anerkannten biologischen Versuchen wie spektrofotometrischen Versuchen und elektrophoretischen Wirksamkeitsversuchen isoliert wurden.

Da das Substrat für SOD das Superoxidanion ist, welches ein instabiles freies Radikal ist, gibt es keine zweckmäßige Methode für den direkten Nachweis der Enzymwirksamkeit. In der Literatur werden verschiedene indirekte Versuche beschrieben, die die Konzentration von Superoxid im stationären Zustand überwachen, wenn dieses Elektronen zu einer Indikatorverbindung weiterleitet. Die Superoxiddismutasewirksamkeit wird nach seiner Wirkung als Konkurrent für das Substrat, Superoxid, gemessen. Diese indirekten Bestimmungen müssen eine Methode für die Erzeugung als auch den Nachweis von Superoxid einschließen. Die Erzeugung von Superoxid kann enzymatisch, ζ. B. mit Xanthinoxidase und Xanthin, oder fotochemisch, z.B. mit Riboflavin und Tetramethylethylendiamin (TEMED) erfolgen. Superoxid kann aber auch mit Elektronenakzeptoren wie Ferricytochrom C, Nitroblautetrazolium (NBT), oder durch Oxidation mit Hydroxylamin nachgewiesen werden. Die SOD spektrofotometrische Standardanalyse verwendet Xanthinoxidase, die auf Xanthin wirkt, und molekularen Sauerstoff zur Erzeugung von Superoxid sowie die Geschwindigkeit der Cytochrom-C-Reduktion für dessen Nachweis. Da Superoxid nicht in ausreichenden Mengen zur Sättigung des Enzyms erzeugt werden kann, sind klassische Methoden zur Berechnung der Enzymmenge nicht zweckmäßig. Stattdessen wird eine Einheit der Wirksamkeit als die Menge definiert, die eine 50%igo Hemmung der Cytochrom-C-Reduktion unter spezifischen Bedingungen bewirkt (McCord et al., J. Biol. Chem. 244,6049 [1969]). Eine bessere Methode zum Messen der SOD-Wirksamkeit ist eine Endpunktmethode, die auf der Oxidation von Hydroxylamin zu Nitrit basiert, welches dann mit einem Indikatorfarbstoff nachgewiesen wird (Elstner et al., Anal. Biochem. 70,616 [1976]). Die endogene und die heterologe SOD-Wirksamkeit kann aber auch getrennt und in P. pastoris in einem Acrylamidgel nach einer nichtdenaturierenden Elektrophorese analysiert werden. Für diese Analyse sind der geeignetste Superoxiderzeuger und -detektor Riboflavin/TEMED bzw. Nitroblautetrazolium (NBT) (Beauchamp et al.. Anal. Biochem. 44,276-287 [1971 ]). Obwohl es manchmal schwierig ist, Versuchsbedingungen genau zu kopieren, und Ergebnisse verschiedener Veröffentlichungen variieren können, sind Polypeptide, die die gleiche Wirksamkeit zeigen, als natürlich vorkommende Superoxiddismutasen in jeder der oben angeführten Analyse oder in anderen, auf dem Fachgebiet bekannten Analysen, stets im Umfang der Erfindung mit eingeschlossen.

Die Aminosäuren, die in den verschiedenen Aminosäuresequenzen vorkommen, auf die in der Spezifikation Bezug genommen wi^rd, haben ihre üblichen aus drei und einem Buchstaben bestehenden Abkürzungen, die auch routinemäßig auf diesem Gebiet verwendet werden:

Aminosäure	Abkürzung	A
L-Alanin	AIa	R
L-Arginin	Arg	N
L-Asparagin	Asn	D
L-Asparaginsäure	Asp	C
L-Cystein	Cys	Q
L-Glutamin	GIn	E
L-Glutaminsäure	GIu	G
Glycin	GIy	H
L-Histidin	His	I
L-Isoleucin	He	L
L-Leucin	Leu	K
L-Lysin	Lys	M
L-Methionin	Met	F
L-Phenylalanin	Phe	P
L-Prolin	Pro	S
L-Serin	Ser	T
L-Threonin	Thr	W
L-Tryptophan	Trp	Y
L-Tyrosin	Tyr	V
L-VaMn	VaI

Erfindungsgemäß werden Polypeptide mit SOD-Wirksamkeit durch P. pastoris Hefezellen hergestellt, die in ihren Genomen mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz enthalten, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit unter der Regulation einer Promotorregion eines P. pastoris Gens operierbar verschlüsselt. Die SOD-verschlüsselnde DNA-Sequenz ist ein SOD-verschlüsselndes Gen, Analogteile und Fragmente davon entsprechend der obigen Definition. Das Gen kann durch bekannte chemische Syntheseverfahren - die Sequenz ist ja veröffentlicht und somit verfügbar - oder durch Transkription einer Messenger-RNA (mRNA), die der SOD entspricht, zu einer komplementären DNA (cDNA) und Umwandeln der gewonnenen einzelsträngigen cDNA in eine doppelsträngige cDNA gewonnen werden. Die mRNA kann aus jeder Säugerzelle abgetrennt werden, die Polypeptide mit SOD-Wirksamkeit herstellen kann, z. B. von einer menschlichen Leberzelle beim Erwachsenen, Die erforderliche DNA-Sequenz kann beispielsweise auch durch Endonucleaseverdauung von bekannten Vektoren, die das Gen enthalten, entfernt werden. Beispiele für solche Vektoren und die Mittel für deren Herstellung können den folgenden vorveröffentlichten Dokumenten entnommen werden: Hallewell et al., (1985) Supra (ptao5SOD Plasmide), Europäische Patentanmeldung Nr.88104880.5, veröffentlicht am 28.September 1988 unter der Nummer 0.284.105 (pMSE-4 menschliches Mangansuperoxiddismutase-Expressionsplasmid und verwandte Plasmide), Europäische Patentanmeldung Nr. 84111416.8, veröffentlicht am 24.ApH11985 unter der Nummer 0.138.111 (Plasmide pC 1/1GAPSOD und pe 1/1 GALAPSOD) usw. Die Promotorregion, die zum Antreiben der SOD-Genausprägung angewendet wird, wird aus einem methanolregulierten Alkoholoxidasegen von P. pastoris abgeleitet. Wie oben beschrieben worden ist, enthält P. pastoris bekanntlich zwei funktioneile Alkoholoxidasegene; Alkoholoxidase-I-(AOX 1)- und Alkoholoxidase-Il-{AOX 2)-Gene. Die kodierenden Abschnitte der zwei AOX-Gene sind bei den DNA- und vorhergesagten Aminosäuresequenzwerten sehr homolog und teilen sich gemeinsame Restriktionsorte. Die von den zwei Genen ausgeprägten Proteine haben ähnliche enzymatische Eigenschaften, allerdings ist der Promotor des AOX1 -Gens wirksamer und hoch ausgeprägt, so daß er für die SOD-Ausprägung bevorzugt wird. Das AOX1 -Gen einschließlich dessen Promotor ist isoliert und umfassend charakterisiert worden (Ellis et al., Mol Cell. Biol. 5,1111 [1985]). Eine Ausprägungskassette einschließlich der SOD kodierenden DNA mit der Promotorregion und einem Transkriptionsterminationssegment wird mittels eines linearen DNA-Fragments oder eines ringförmigen oder linearisierten Plasmids, das das DNA-Fragment enthält, in das Wirtsgenom eingefügt. Das Transkriptionsterminationssegment ist ein DNA-Segment von einem P. pastoris Protein kodierenden Gen, welches ein Untersegment, das ein Polyadenylierungssignal und einen Polyadenylierungsort in dem Transkript von dem in der Ausprägungskassette verwendeten Promotor kodiert, sowie ein weiteres Untersegment, das ein Transkriptionsterminationssignal für die Transkription von diesem Promotor liefert, einschließt. Das Transkriptionsterminationssegment kann von dem gleichen oder einem anderen P. pastoris Gen abgeleitet werden, das als Quelle für die Promotorregion verwendet wird.

Der hier und in der ganzen Spezifikation und den Ansprüchen verwendete Begriff „Ausprägungskassette" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die für die Ausprägung funktionelle Sequenzen einschließt.

Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente können des weiteren ein selektierbai us Marker-Gen umfassen. Zu diesem Zweck kann jedes in P. pastoris funktionelle, selektierbare Marker-Gen angewendet werden, z. B. jedes Gen, das auf P. pastoris Zellen einen Phänotyp überträgt und dadurch ermöglicht, daß diese aus einer riesigen Mehrheit nichttransformierter Zellen identifiziert und selektiv gezüchtet werden können. Geeignete selektierbare Marker-Gene umfassen beispielsweise selektierbare Marker-Systeme, die aus einem auxotrophen mutierten P. pastoris Wirtsstamm und einem biosynthetischen Wildtypgen, der ein Defekt des Wirts ergänzt, bestehen. Zur Transformation von his 4~ P. pastoris Stämmen kann beispielsweise das S.cerevisiae oder P,pastoris HIS4-Gen bzw. zur Transformation von arg4-Mutanten das S.cerevisiae ARG4-Gen oder das P.pastoris ARG4-Gen verwendet werden.

Erfolgt die Transformation des Hefestamms mit einem linearen DNA-Fragment mit dem SOD-Gen unter der Regulation einer Promotorregion eines P. pastoris Gens, wird die Ausprägungskassette nach einem beliebigen, auf dem Fac.igebiet bekannten Gensubstitutionsverfahren wie der einstufigen Gensubstitution in das Wirtsgenom integriert. (Siehe beispielsweise Rothstein, Methods Enzymol, 101,202 [1983]; Gregg et al., Bio/Technology 5,479 [1987].) Die Integration kann auch durch zweistufige

Gensubstitutionsmethoden erfolgen (ζ. B. Scherer und Davis, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 76,4951 (1979]). Das lineare DNA-Fragment wird auf den gewünschten Genort gerichtet, d. h. auf das Targetgen oder Zielgen, das mittels flankierender DNA-Sequenz unterbrochen werden soll, die über eine ausreichende Homologie mit dein Zielgen verfugen, um die Integration des DNA-Fragments darin zu bewirken. Einstufige Genunterbrechungen sind gewöhnlich erfolgreich, wenn die einzubringende DNA über eine so geringe Homologie mit dem Fragmentort des Zielgens wie 0,2 kb verfügt. Es ist allerdings zu bevorzugen, den Homologiergrad der Effizienz wegen zu maximieren.

Wenn das erfindungsgemäße DNA-Fragment in einem Expressionsvektor enthalten ist oder einen solchen darstellt, z. B. ein ringförmiges Plasmid, können eine oder mehr Kopien des Plasmids an dem gleichen oder an unterschiedlichen Genorten durch Addition integriert werden. Die Linearisierung des Plasmids mit Hilfe einer geeigneten Restriktionsendonuclease erleichtert die Integration.

Der Begriff „Expressionsvektor" beinhaltet Vektoren, die darin enthaltene DNA-Sequenzen ausprägen können, wo solche Sequenzen sich in operativer Verbindung mit anderen Sequenzen befinden, die ihre Ausprägung bzw. Expression bewirken können, d. h. Promotorsequenzen. Im allgemeinen haben Expressionsvektoren, die gewöhnlich in der Technik der In-vitro-DNA-Rekombination verwendet werden, oft die Form von „Plasmiden", d. h. sie sind ringförmige, doppelsträngige DNA-Schleifen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosmon gebunden sind. In dieser Spezifikation sind die Begriffe „Vektor" und „Plasmid" austauschbar. Die Erfind mg soll aber auch andere Formen von Expressionsvektoren enthalten, die äquivalent funktionieren. In den erfindungsgemäßen DNA-Fragmenten befinden sich die Segmente der Ausprägungskassette in „operativer Verbindung". Die DNA Sequenz kodierenden Polypeptide mit SOD-Wirksamkeit sind funktionell in bezug auf den Promotor und den Transkriptionsterminator positioniert und ausgerichtet, so daß das Polypeptid kodierende Segment unter der Regulation der Promotorregion in ein Transkript transkribiert wird, das bei Translation das gewünschte Polypeptid in P. pastoris zur Verfugung stellt.

Die entsprechende Leserastereinstellung und -ausrichtung der verschiedenen Segmente der Ausprägungskassette sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt; weitere Einzelheiten sind in den Beispielen angeführt.

Die von der Erfindung zur Verfügung gestellten DNA-Fragmente können Sequenzen einschließen, die deren Replikation und Selektion in Bakterien, insbesondere E. coli, ermöglichen. Auf diese Weise können durch Replikation in Bakterien große Mengen des DNA-Fragments h< rgestellt werden.

Methoden zur Umwandlung von Pichia pastoris sowie Methoden für die Züchtung von P. pastoris Zellen, die in ihrem Genom ein Gen für ein heterologes Protein enthalten, sind dem Fachmann allgemein bekannt.

Die Ausprägungskassetten werden erfindungsgemäß entwedei durch das Sphäroplastverfahren, das von Cregg et al., Mol. Cell Biol.5,3376 (1985) beschrieben worden ist, oder durch das Ganzzell-Lithiuirchloridhefetransformationssystem (Ito et al., Agric. Biol. Chem.48,341 [1984)) in P. pastoris Zellen umgewandelt, wobei geringfügige Modifikationen zur Anpassung an P.pastoris erforderlich sind. Obwohl die Ganzzell-Lithiumchloridmethode bequemer ist, da sie keine Generation und Erhaltung von Sphäroplasten erfordert, wird für die Zwecke dieser Erfindung die Sphäroplastmethode bevorzugt, hauptsächlich, weil sie eine größere Zahl von Transformanten ergibt.

Positive Transformanten werden hinsichtlich des Ortes der DNA-Integration und der Anzahl der Integranten durch die Southern-Blot-Analyse (Maniatis et al.. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA [1982]) und hinsichtlich der auf Methanol reagierenden SOD-Gentranskription durch Nothern Blots (Maniatis, Op.Cit., R.S.Zitomer jnd B.D.Hall, J.Biol.Chem., 251 6320 (1976)) charakterisiert.

Transformierte Stämme, die dem gewünschten Phänotyp und Genotyp entsprechen, werden in Fermentoren gezüchtet. Zur großtechnischen Herstellung von rekombinanten DNA-Produkten in P. pastoris wird normalerweise ein zweistufiges Batch-Fermentationssystem mit hoher Zelldichte angewendet. In der ersten oder Wachstumostufe werden Expressionswerte in einem definierten Minimalmedium mit Glycerol als Kohlenstoffquelle gezüchtet. Auf dieser Kohlenstoffquelle wird die Heterologgenausprägung vollständig unterdrückt, wodurch die Generation von Zellmasse bei Fehlen der Ausprägung von heterologem Protein ermöglicht wird. Nach der Erschöpfung der unterdrückenden Kohlenstoffquelle wird Methanol hinzugegeben, wodurch die Ausprägung des gewünschten heterologen Proteins initiiert wird. Diese zweite Stufe ist die sogenannte Produktionsstufe.

Der Begriff „Kultur" bedeutet eine Ausbreitung von Zellen in einem ihrem Wachstum förderlichen Medium sowie alle Subkulturen davon. Der Begriff „Subkultur" bezieht sich auf eine Kultur von Zellen, die aus Zellen einer anderen Kultur (Quellkultur) gezüchtet worden sind, oder auf jede Subkultur der Quellkultur unabhängig von der Anzahl der zwischen der jeweiligen Subkultur und der Quellkultur durchgeführten Subkultivierungsschritte. In den Fermentationsversuchen wurden die folgenden Haüptmediumbestandteile eingesetzt:

1OX Grundsalze	Gramm/Liter
Chemikalie	42,0 ml
Phosphorsäure, 85%ig	1,8
Calciumsulfat- 2H2O	28,6
Kaliumsulfat	23,4
Magnesiumsulfat 7 HjO	6,5
Kaliumhydroxid

-8- 297 841 B. IM, Lösung aus Spuiensalzen

Chemikalie	Gramm/Liter
KupferdD-sulfat · 5H2O	0,06
Kaliumiodid	0,08
Mangansulfat- H2O	0,30
Natriummolybdat	0,20
Borsäure	0,02
Zinksulfat H2O	2,00
EisendlD-chlorid · H2O	4,80
Schwefelsäure	5,00ml/l

C. YTM₄ Spurenlösung + Biotin

Chemikalie	Gramm/Liter
Eisen(ll)-sulfat-7H2O	65,0
Kupfersulfat-5H2O	6,0
Zinksulfat-7H2O	20,0
Mangansulfat H2O	3,0
Schwefelsäure	5,0 ml
Biotin	0,1

2. Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet das für die Herstellung von Polypeptiden mit SOD-Wirksamkeit angewendete Heterologproteinausprägungssystem den Promotor, der von dem methanolregulierten AOX1-Gen von P. pastor is abgeleitet ist, welches sehr wirkungsvoll ausgeprägt und streng reguliert ist. Dieses Gen ist auch die Quelle des Transkriptionsterminationssegments.

Die mit der Ausprägungskassette zu transformierenden Wirtszellen sind P. pastoris Zellen mit mindestens einer Mutation, die durch ein an einem transformierenden DNA-Fragment vorhandenes Marker-Gen ergänzt werden kann. Es werden vorzugsweise his4 (GS 115) auxotrophe mutierte P. pastoris Stämme verwendet.

Die Ausprägungskassette, die eine einzelne Kopie des SOD-Gens unter der Regulation des AOX1 -Promotors und Transkriptionsterminators enthält, wird in einen auf pBR322 basierenden Pichia Expressionsvektor gegeben, der auch ein selektierbares Merker-Gen wie HIS4-Gen enthält, wenn der P.pastoris Wirtsstamm eine his4 auxotrophe Mutante ist. Die Ausprägungskassette wird vorzugsweise durch Transformation des Wirts mit einem ungeschnittenen ringförmigen Plasmid, das die Kassette einschließt, in das Wirtsgenom integriert. Die Integration erfolgt durch Addition an einem Genort oder Genorten mit Homologie mit einer oder mehreren Sequenzen, die an dem Transformationsvektor vorhanden sind, z. B. 5'AOX1,3Ά0Χ1, HIS4, wobei das AOX 1-Gen intakt bleibt. Auf diese Weise erhält man Mut⁺ Stämme, die ein Wildtypwachsen auf Methanol aufweiset.. Ein Mut* Stamm, der zwei integrierte Kopien der Ausprägungskassette enthielt, erwies sich als besser, indem er eine wesentlich höhere HSOD-Konzentraticn ergab als Einfachkopiestämme. Es können auch weitere Kopien der Ausprägungskassette in den Wirtsstamm eingeführt werden, indem ein Plasmid verwendet wird, das zwei oder mehr SOD-Gen-Ausprägungskassetten enthält, vorzugsweise in Tandemkopplung, wodurch die Produktivität noch weiter erhöht werden kann.

Die Ausprägungskassette kann aber auch in das Wirtsgenom nach Verdauung des Expressionsvektors mit einem entsprechenden Enzym unter Bildung eines linearen DNA-Fragments mit für den AOX1 -Genort homologen Enden durch ein einstufiges Genersatzverfahren integriert werden. Im Ergebnis der Gensubstitution werden Mut" Stämme gewonnen. Das noch funktionell A0X2-Gen liefert genügend Alkoholoxidase für ein langsames Wachstum auf Methanol.

Auf jeden Fall führt die Entwicklung von Transformanten durch die Anwendung von integrierenden Vektoren im Gegensatz zu den auf autonomen Plasmiden basierenden zu stabileren, produktiven rekombinanten Stämmen.

Die Transformanten, in denen die Ausprägungskassette in den AOX 1-Genort integriert ist und diesen durch ortsgerichtete Rekombination unterbrochen hat, können durch ihren his4⁺ Phänotyp und durch ihre verminderte Fähigkeit zur Nutzung von Methanol (Mut") ausgewählt werden. Die Southern-Hybridisierung hat bestätigt, daß die vollständige Ausprägungskassette an dem AOX 1-Genort integriert ist. Positive Transformanten werden durch die Southern-Analyse hinsichtlich des Ortes der DNA-Integration und durch die Northern-Analyse hinsichtlich der auf Methanol reagierenden SOD-Gen-Transkription charakterisiert. P. pastoris Stämme, die eine oder Mehrfachkopien der Ausprägungskassette an einem gewünschten Ort integriert haben, werden durch Southern-Blot-Hybridisierung identifiziert.

P. pastoris Transformanten, bei denen festgestellt worden ist, daß sie den gewünschten Genotyp und Phänotyp haben, werden in Fermentoren gezüchtet. Es wird bezeichnenderweise ein zweistufiges Produktionsverfahren angewendet. Anfänglich werden Zellen auf einer reprimierenden Kohlenstoffquelle, vorzugsweise Glycerol, vermehrt. In diesem Stadium wird die Zellmasse in Abwesenheit von Expression gebildet. Nachdem das Glycerol verbraucht ist, wird Methanol allein (Methanol-Fed-batch-Arbeitsweise) oder Glycerol und Methanol (Mischsubstrat-Fed-batch-Arbnitsweise) in den Fermentor gegeben, was zu der Ausprägung des durch den AOX1 -Promotor getriebenen SOD-Gens führt. Mut⁺-Stämme werden vorzugsweise unter Anwendungg einer Methanol-Fed-batch-Verfahrensweise vermehrt, bei der Restmethanol begrenzt ist. Mut"-Stämme werden andererseits vorzugsweise nach einer Methanol-Fed-batch- oder Mischsubstrat-Fed-batch-Verfahrensweise vermehrt, bei der Restmethanol im Überschuß gehalten wird.

Polypeptide mit SOD-Wirksamkeit werden in P.pastoris intrazellulär hergestellt und werden gewöhnlich aus Pichia-Zellen, die mit Glasperlen aufgelöst sind, in Gegenwart von einfachen, dem Fachmann bekannten Pufferlösungen extrahiert. Im typischen Fall wird eine 5OmM Natrium- oder Kaliumphosphatpufferlösung mit 0,1 mM EDTA bei einem pH-Wert von 7,8 verwendet, und die Ausbeute beträgt nach Korrekturen beim Pelletvolumen mindestens 95%, gemessen nach Western-Slots oder der Wirksamkeitsanalyse. Die in dem Pellet verbleibende geringe Menge an SOD-Produkt kann mit einem starken Dete. gens wie Natriumdodecylsulfat extrahiert werden

Die Erfindung wird des weiteren durch die nachfolgenden nichteinschränkenden Beispiele veranschaulicht.

3. Beispiele

Beispiel 1

Konstruktion des HSOD-Expresslonsvektors, pSOD 104

Die in der Erfindung beschriebene Expressionsvektorkonstruktion erfolgte unter Anwendung von Standardverfahrensweisen, wie sie beispielsweise in Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Code Spring Harbor, New York, USA (1982) und Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York (1986) beschrieben sind.

Das menschliche SOD-Gen (HSOD-Gen, siehe Fig. 1) wurde als ein BamHI/Pstl-Fragment im Plasmid pEMBLt', sowie in einem Expressionsplasmid, pKK 223-3, das in E.coli JM 105 Zellen umgewandelt wurde, gewonnen, es kann abei auch aus allen anderen, früher veröffentlichten Vektoren gewonnen werden (Supra).

MC 1061 E. coli Zellen (die allgemein verfügbar sind) wurden mit dem pEMBL8 Plasmid transformiert, und es wurden amp" Kolonien selektiert. Plasmid wurde aus den amp" Zellen hergestellt und mit BamH! und Pstl aufgeschlossen. Das richtige Plasmid enthielt einen 480 bp BamHI/Pstl-Einschub, der das HSOD-Gen enthielt. Diese Kolonie wurde zur Herstellung von neuer Plasmid-DNA verwendet, das Plasmid wurde mit BamHI und Pstl aufgeschlossen, und 50 ng des 480 bp-Fragments (isoliert auf einem 0,8%igenAgarosegel) wurden in 10ngBamHI-Pstl-geschnittenes, phosphatasebehandeltes M 13mp 19 Plasmid (New England Biolabs) für Sequenzierung und Mutagenese ligiert. JM103 Zellen (die allgemein verfügbar sind) wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert, und es wurden weiße Plaques selektiert. Plasmid wurde aus den weißen Plaques hergestellt und mit BamHI und Pstl aufgeschlossen. Eine 480bp Bande war bezeichnend für das richtige Plasmid, das pSOD 101 genannt wurde. Die Bande, die die HSOD-kodierende Sequenz erhalten sollte, wurde vollständig in eine Richtung sequenziert, und die gewonnene Sequenz stimmte mit der des authentischen HSOD-Gens überein (Fig. 1).

Dann wurde ein EcoRI-Ort an das 3' Ende der HSOD-kodierenden Sequenz unmittelbar nach dem Translationsterminationscodon TAG addiert. Eine ortsgerichtete Mutagenese wurde nach der Methode von Zoller und Smith, Meth. Enzymol, 100,468 (1983) durchgeführt. Das mutagenisierende Oligonucleotid war von folgender Sequenz:

5'-GGA TCG CCC AAT AGG AAT TCC AGG CAT GCA AGC TT-3' Das Screening-Oligonucleotid war von folgender Sequenz: 5'-AAT AGG AAT TCC AGG CA-3'

Eine Minimatrize-Präparation wurde mit den Positiven aus dem Screening durchgeführt, und es wurden JM 103 Zellen mit der Präparation transformiert. Weiße Plaques wurden ein zweites Mal mit dem Screening-Oligonucleotid gescreent, und Positive aus dieser Runde des Screenens wurden zur Herstellung von Matrize zum Sequenzieren verwendet. Das Sequenzieren wurde nach der Sanger-Sequenzierungs-Technik (Sanger et al., PNAS 74:5463 [1977)) unter Verwendung des Universal-Primer der Sequenz GTm AAA CGA CGG CCA GT durchgeführt. Ein Plasmid wurde als Plasmid mit dem richtig modifizierten 3' Ende identifiziert und pSOD 102 bezeichnet.

Das 5' Ende des HSOD-Einschubs wurde so modifiziert, daß ein EcoRI-Ort unmittelbar vor dem Initiator-ATG-Codon addiert wurde. Die Mutagenese wurde nach derselben Methode wie die 3' Mutagenese durchgeführt, nur das Ausgangsplasmid war pSOD102; das mutagenisierende Oligonucleotid war von der Sequenz:

5'-TCG AGC TCG GTA CCC AAG AAT TCA TGG CGA CGA AGG CC-3' Das Screening-Oligonucleotid war von folgender Sequenz: 5'-TAC CCA AGA ATT CAT G-3',

und das Sequenzierungsoligonucleotid war der Universalprimer

Das Sequenzieren bestätigte das richtig mutagenisierte 5'-Ende des Plasmids. Das Plasmid mit EcoRI-Stellen an den 5'- und 3'-Enden des HSOD-Einschubs wurde mit pSOD 103 bezeichnet.

Das Plasmid pSOD 103 wurde mit EcoRI aufgeschlossen, und das ca. 480bp Fragment wurde auf einem 0,8% Agarosegel isoliert.

50ng des HSOD-Fragments wurden an 10ng EcoRI-geschnittenes, phosphatasebehandeltes pA0804 ligiert. (Die Herstellung von Plasmid pA0804 ist nachfolgend beschrieben.) Die Ligation wurde zu MC 1061-Zellen transformiert, und amp^R Kolonien wurden ausgewählt. Das richtige Plasmid wurde durch Screenen mit einem Oligonucleotid der nachfolgend angegebenen Sequenz identifiziert:

5'-AAA CGA GGA ATT CAJ GGC GA-3' AOX1 ECORI SOD

Das richtige Plasmid wurde pSOD 104 benannt.

Das in dem obigen Verfahren angewendete Plasmid ρAO804 wurde wie folgt aufgebaut:

Plasmid pBR322 wurde wie folgt modifiziert, um die EcoRI-Stelle zu eliminieren und in die Pvull-Stello eine Bg 11l-Stelle einzuschieben:

pBR322 wurde mit EcoRI aufgeschlossen, die hervorstehenden Enden wurden mit Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I aufgefüllt, und die entstehende DNA wurde unter Anwendung von T4-Ligase lezirkularisiert. Die rezirkularisierte DNA wurde verwendet, um E. coli MC 1061 zu Ampicillinresistenz zu transformieren, und die Transformanten wurden daraufhin gescreened, daß sie ein Plasmid von ca. 4,37kpb Größe ohne eine EcoRI-Stelle haben. Eine solche Transformante wurde ausgewählt und gezüchtet, um ein Plasmid zu ergeben, dessen Bezeichnung pBR322ARI ist und das pBR322 ist, bei dem die EcoRI-Stelle durch die Sequenz

5'-GAATTAATTC-3' 3'-CTTAATTAAg-B'

ersetzt ist. pBR 322 Rl wurde mit Pvull abgeschlossen, und der Linker von Sequenz

5'-CAGATCTG-S' 3'-GTCTAGAC-B'

wurde unter Verwendung von T4-Ligase an die entstehenden stumpfen Enden ligiert. Die entstehenden DNAs wurden ebenfalls mit T4-Ligaso rezirkuliert und anschließend mit BgIII aufgeschlossen und nochmals unter Anwendung von T4-Ligase rezirkuliert, um Mehrfach-Bglll-Stellen infolge von Ligation von mehr als einem Linker an das Pvull-gespaltene pBR322ARI zu eliminieren. Die zur Entfernung von Mehrfah-Bglll-Stellen behandelten DNA's wurden zur Transformation von E.coli MC 1061 zu Ampicillinresistenz verwendet. Die Transformanten wurden auf ein Plasmid von ca. 4,38 kbp mit einer Bglll-Stelle gescreent. Eine solche Transformante wurde ausgewählt und gezüchtet, um ein Plasmid mit der Bezeichnung pBR322ARIBGL für die weitere Arbeit zu liefern. Das Plasmid pBR322ARIBGL ist das gleiche wie pBR322ARI, nur daß pBR322ARIBGL die Sequenz

5'-CAGCAGATCtGCTG-S' 3'-GTCGTCTAGACGAg-B'

anstelle der Pvull-Stelle in pBR322 Rl hat.

pBR322 RIBGL wurde mit einem Sail und BgIII aufgeschlossen, und das große Fragment (ca. 2,97 kbp) wurde isoliert. Plasmid pBSAGI 51, das in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 0.226.752 beschrieben ist, wurde vollständig mit BgIII und Xhol aufgeschlossen, und ein ca. 850bp Fragment aus einer Region des P.pastoris AOX1-Genorts, stromabwärts von dem AOX1 -Gentranskriptionsterminator (bezogen auf die Transkriptionsrichtung von dem AOX1 -Promotor), wurde isoliert. Das Bglll-Xhol-Fragment von pBSAGI5l und das ca. 2,97kbp, Sall-Bglll-Fragment von pBR322ÄRIBGL wurden kombiniert und der Ligation mit T4-Ligase unterzogen. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli MC 1061 zu Ampicillinresistenz verwendet, und Transformanten wurden auf ein Plasmid der erwarteten Größe (ca. 3,8kbp) mit einer Bglll-Stelle gescreent. Dieses Plasmid wurde pAO 801 bezeichnet. Das überhängende Ende der Sall-Stölle von dem pBR 322 RIBGL-Fragment wurde an das überhängende Ende der Xhol-Stelle an dem 850bp pBSAGI5l-Fragment ligiert, und in dem Prozeß wurden die Sall-Stelle und die Xhol-Stelle in pAO801 eliminiert.

pBSAGISI wurde dann mit CIaI aufgeschlossen, und das ca. 2,0-kbp-Fragment wurde isoliert. Das 2,0-kbp-Fragment hat ein ca. 1,0-kbp-Segment, das den P.pastoris AOX1-Promotor und den Transkriptionsstartort einschließt, ein ca. 700-bp-Segment, das das Hepatitis-B-Virusoberflächenantigen („HBsAG") kodiert, und ein ca. 300-bp-Segment, das das P.pastoris A0X1-Gen-Polyadenylierungssignal und ortskodierende Segmente und Transkriptionsterminator einschließt. Das HBsAg kodierende Segment des 2,0-kbp-Fragments ist am Ende neben dem 1,0-kbp-Segment mit dem AOX1 -Promotor mit einer EcoRI-Stelle und an dem Ende neben dem 300-bp-Segment mit dem AOX1 -Transkriptionsterminator mit einer Stul-Stelle abgeschlossen und hat sein Subsegment, das HBsAg kodiert, in bezug auf das 1,0-kbp-Promotor-enthaltende und 300-bp-Transkriptionsterminatorenthaltende Segment operativ für die Ausprägung des HBsAg bei Transkription von dem AOX1 -Promotor ausgerichtet und positioniert. Die EcoRI-Stelle, die das Promotorsegment mit dem HBsAg kodierenden Segment verbindet, erscheint gleich stromaufwärts (in bezug auf die Transkriptionsrichtung von dem AOX1 -Promotor) von dem das Translationsstartsignal kodierenden Triplett des AOX1 -Promotors.

Weitere Einzelheiten zu den Promotor- und Termin^torsegmenten des 2,0kbp, Clal-Stelle-terminierten Fragments von pBSAGI 5I sind der Europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr.226.846 und Ellis et al. Mol.Cell Biol. 5,1111 (1985) zu entnehmen.

Plasmid pAO801 wurde mit CIaI geschnitten und unter Verwendung von T4-Ligase mit dem ca. 2,0 kbp Clal-Stella-terminierten Fragment von pBSAGI5I zur Ligation kombiniert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E.coli MC 1061 zu Ampicillinresistenz verwendet, und Transformanten wurden auf ein Plasmid der erwarteten Größe (ca. 5,8kbp) gescreent, welches bei Aufschluß mit CIaI und BgIII Fragmente von ca. 2,32 kbp (mit dem Replikationsstartpunkt und Ampicillinresistenzgen von pBR322) und ca. 1,9 kbp, 1,48kbp und 100bp ergab. Bei Aufschluß mit BgIII und EcoRI ergab das Plasmid ein ca. 2,48-kbp-Fragment mit dem 300-bp-Terminatorsegment von dem AOX1 -Gen und dem HBsAg-kodierenden Segment, ein Fragment von ca. 900 bp, das das Segment stromaufwärts von dem AOX1 -Protein kodierenden Segment des AOX1 -Gens in dem AOX1 -Genort enthielt, und ein Fragment von ca. 2,42kbp, das den Replikationsstartpunkt und das Ampicillinresistenzgen von pBR 322 und ein ca. 100bp Clal-Bglll-Segment des AOX 1-Genorts (weiter stromaufwärts von dem AOX1 kodierenden Segment als das zuerst erwähnte 900bp EcoRI-Bg 11l-Segment) enthielt. Ein solches Plasmid hatte das Clal-Fragment von pBSAGI 5I in der gewünschten Ausrichtung, in der entgegengesetzten unerwünschten Ausrichtung wurden EcoRI-Bglll-Fragmente von ca. 3,3 kbp, 2,38 kbp und 900 bp sein.

Eine derTransformanten, die das gewünschte Plasmid barg, mit der Bezeichnung μAO 802, wurde für die weitere Arbeit selektiert und gezüchtet, um dieses Plasmid zu bilden. Bei der gewünschten Ausrichtung des Clal-Fragments von pBSAGI5l in ρAO802 war die AOX1 -Promotorregion richtig ausgerichtet, um zu der korrekten Integration in das P. pastoris Genom an dem AOX1 -Genort des linearisierten Plasmids zu führen, das durch Schneiden an der Bglll-Stello an dem Endpunkt des 800bp-Fragments stromaufwärts vom AOX1-Gen in dem AOX 1-Genort (Terminatorregion) und der Bglll-Stelle am Beginn der Promotorregion hergestellt wurde.

pAO 802 wurde dann zur Entfernung des HBsAg kodierenden Segments behandelt, welches mit einer EcoRI-Stelle und einer Stul-Stelle abschloß. Das Plasmid wurde mit Stul aufgeschlossen, und ein Linker der Sequenz

3'-CCTTAAGG

wurde unter Verwendung von T4-Ligase an die stumpfen Enden ligiert. Das Gemisch wurde dann mit EcoRI behandelt und nochmals unter Verwendung von T4-Ligase der Ligation unterzogen. Das Ligationsgemisch wurde dann zur Transformation von E. coli MC 1061 zu Ampicillinresistenz verwendot, und Transformanten wurde auf ein Plasmid der erwarteten Größe (5,1 kbp) mit EcoRI-Bglll-Fragmenten von ca. 1,78kbp, 900 bp und 2,42 kbp und Bglll-Clal-Fragmenten von ca. 100 bp, 2,32 kbp, 1,48kbp und 1,2kbp gescreent. Dieses Plasmid wurde mit pAO803 bezeichnet. Eine Transformante mit dem gewünschten Plasmid wurde für die weitere Arbeit ausgewählt und zur Bildung von ρAO803 gezüchtet.

Plasmid pAO804 wurde dann aus ρAO803 hergestellt, indem in die BamHI-Stelle aus pBR322 in ρAO803 ein ca. 2,75kbp BgMt-Fragment aus dem P. pastoris HiS4-üen eingeschoben wurde. Siehe zum Beispiel Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5,3376 (1985) und die Europäischen Patentanmeldungen Nr.0.180.899 und 0.188.677. pAO803 wurde mit BamHI aufgeschlossen und mit dem HIS4-Gen enthaltenden Fragment, das durch die Bglll-Stelle terminiert ist, kombiniert. Das Gemisch wurde unter Verwendung von T4-Ugase der Ligation unterzogen. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli MC 1061 zu Ampicillinresistenz verwendet, und Transformanten wurden auf ein Plasmid der erwarteten Größe (7,85 kbp) gescreent, welches durch Sail geschnitten wird. Eine solche Transformante wurde für die weitere Arbeit selektiert, und das in ihr geborgene Plasmid wurde mit ρAO804 bezeichnet.

ρAO804 hat ein Sall-Call-Fragment von ca. 1,5 kbp und ein anderes von ca. 5,0 kbp und ein Clal-Clal-Fragment von 1,3 kbp; dies zeigt an, daß die Transkriptionsrichtung des HIS4-Gens in dem Plasmid die gleiche ist wie die Transkriptionsrichtung des Ampicillinresistenzgens und der Transkriptionsrichtung von dem AOX1 -Promotor entgegengesetzt ist. Die Ausrichtung des HIS4-Gens in pAO804 ist nicht entscheidend für die Funktion des Plasmids odor dessen Derivate mit cDNA-kodierenden Segmenten, die an der EcoRI-Stelle zwischen dem AOX1 -Promotor und Terminatorsegmenten eingeschoben sind. Somit wäre ein Plasmid mit dem HIS4-Gen in der entgegengesetzten Ausrichtung zu der des HIS4-Gens in ρAO804 ebenfalls für eine erfindungsgemäße Verwendung nutzbar.

Beispiel 2

Entwicklung von HSOD-ausprägenden P.pastorls Stämmen G- SOD 104C und G+SOD104C Plasmid pSOD104 des gleichen Aufbaus wie in der Beschreibung von Beispiel 1, wurde zur Entwicklung sowohl von Mut*- als auch von Mut"-Stämmen von P. pastoris eingesetzt. Der Wirtsstamm war der Histidin benötigende, auxotrophe GS115 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA [ATCC] Accession No. 20864, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt). Die Transformation wurde nach der von Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5,3376 (1985) beschriebenen Sphäroplast-Methode durchgeführt.

Zur Entwicklung von Mut⁺-Stämmen wurde nichtaufgeschlossenes psOD 104 in GS115 transformiert, und His⁺-2ellen wurden selektiert. Neun der HiS⁺ prototrophen Zellen wurden nach Southern Hybridisierungsanaiysen untersucht. Die chromosomalen DNAs wurden mit EcoRI aufgeschlossen und mit pAO803, das AOX1 5' und 3'-Regionen enthielt, oder ρYM4-, das das Pichia HIS4-Gen enthielt, untersucht. Ein Bglll-Aufschluß wurde ebenfalls durchgeführt und mit einem Oligonucleotid der Sequenz

5'-AAC TCA TGA ACA TGG AAT CCA TGC AGG CCT-3',

die homolog einem Segment des HSOD-Gens ist, untersucht. Die Ergebnisse der Southern-Analyse wiesen drei Klassen von Mut⁺-Transformanten aus, die nachfolgend zusammengefaßt sind:

Stammbezeichnung Kopienzahl Integrationsstelle

G+SOD104C1,4,5,7,8 eine AOX1

G+SOD104C2,9,10 eine HIS4

G+SOD104C3 zwei HIS4undAOX1

Drei von diesen Transformanten, G+SOD104C1 (eine Kopie am AOX1-Genort), G+SOD104C3 (eine Kopie an den Genorten AOX1 undHIS4) und G+SOD 104C10 (eine Kopie am HIS4-Genort) wurden zusammen mit der negativen Kontrolle, nichttransformiertem GS115, in Schüttelkolben vermehrt. Die Zellen wurden in Glycerol gezüchtet, wie nachfolgend für die Mut⁺-Stämme beschrieben ist, gewaschen und in 1X gepufferte Hefestickstoffbase (0,67%) mit 1 % Methanol bei einem ODeoo-Wert von ca. 0,05 geimpft. Aliquote Mengen, die jeweils 50 ODs enthielten, wurden nach 20,23 und 26 Stunden Wachstum auf Methanol zur Analyse der HSOD- und mRNA-Werte entnommen.

RNA wurde durch Northern-Blots analysiert. Ungefähr 5μ9 der Gesamt-RNA von jedem Zeitpunkt wurde denaturiert, auf einem Formaldehyd-Aragose-Gel getrennt und auf Cellulosenitrat übertragen. Der Blot wurde mit einem Oligonucleotid untersucht, das eine Länge von 30 Basen hatte (die gleiche Oligosequenz wie oben) und homolog HSOD war. Die Northern-Hybridisierungsanalyse zeigte, daß es zu allen Zeitpunkten eine .signifikante Menge an HSOD-mRNA gab. Die Transformante G+SOD 1014C3, die zwei Kopien des Expressionsvektors enthält, schien um ein mehrfaches mehr HSOD mRNAzu haben als die anderen zwei Transformanten. Die Kontrollprobe, GS115, zeigte keine mRNA, die der Oligonucleotidprobe homolog war.

Alle drei Transformanten schienen HSOD-Wirksamkeit bei Anwendung der elektrophonischen Separation und Analyse (beschrieben in Beispiel 4) zu besitzen.

Zur Entwicklung von Mut~-Stämmen wurde ein Bglll-Digest des Plasmid pSOD104 in GS115-Zellen transformiert, und His⁺-Zellen wurden selektiert. Die His⁺-Prototrophen wurden dann auf ihren Mut-Phänotyp wie folgt gescreent:

Das Screenen auf Mut-Phänotyp wurde durchgeführt, indem His⁺-Transformanten auf Minimalglycerol-Master-Platten (2%) ausgestrichen wurden, um aus den Finzelzellen stammende Kolonien zu gewinnen. Nach zwei Tagen Inkubation bei 3O⁰C wurden die Master-Platten auf Minimalglycerolplatten und Platten ohne Kohlenstoffquelle repliziert, zu der,en Methanol in der Dampfphase gegeben wurde. Dies erfolgte, indem ein Tropfen Methanol (ca. 200μΙ) auf die Unterseite des Deckels der Petrischale mit der Platte gegeben wurde. Die Platten wurden zwei Tage lang bei 30°C bei weiterer täglicher Methanolzugabe in der Dampfphase inkubiert.

Kolonien ohne sichtbares Wachstum wurden als Mut", solche mit sichtbarem Wachstum als Mut* verzeichnet.

Zirka 12% der Transformanten waren langsam wachsend, was bezeichnend für die Unterbrechung des AOX 1-Genortes ist. 22 dieser Transt'ormanten wurden hinsichtlich der Wachstumsraten auf Methanol mit dem Vergleichsstamm G-PAO 804 verglichen. Der Stamm G-PAO804 wurdo durch Spalten des AOX1-Genortes mit einem Bglll-Digest des Basenplasmids pAO804 entwickelt. Er zeigt den erwarte'en Muf-Phänotyp, er prägt jedoch kein rekombinantes Genprodukt aus. Alle HSOD Mut~-Transformanten schienen ungefähr mit der gleichen Geschwindigkeit zu wachsen wie G-PAO804. Eine langsamere Wachstumsrate kann auf Toxizität für die Zellen von einem heterologen Genprodukt hindeuten.

Neun der HiS⁺ ΜυΓ-Zellen wurden durch Southern-Blots analysiert, wie oben beschrieben ist. Bei allen neun Stämmen wurde gezeigt, daß sie eine Kopie der Ausprägungskassette an dem AOX1-Genort integriert haben, wodurch das Gen gespalten wird.

Diese Stämme wurden mit G-SOD104C1 bis G-SOD104C9 bezeichnet.

Drei davon sowie der Kontrollstamm G-PAO804 wurden in Schüttelkolben gezüchtet, um den Grad und die methanolregulierte Beschaffenheit von HSOD-spezifischer mRNA zu analysieren. Diese Zellen wurden bis zur stationären Phase in 1 % gepufferter Hefestickstoffbase (0,67%ig) mit 5% Glycerol gezüchtet, in Wasser gewaschen und bei einem CDeoo-Wert von ca. 1,0 in 1 χ Hefestickstoffbase mit 1 % Methanol geimpft. Aliquote Mengen, die jeweils 100ODs enthielten, wurden nach 48,96 und 120 Stunden Wachstum auf Methanol zur Bestimmung der HSOD- und mRNA-Werte entnommen.

RNA wurde durch Northern-Blots analysiert, wie oben beschrieben ist. Die drei Stämme schienen ähnliche Mö.-.^en von SOD mRNA zu haben, wobei jeder Stamm zum ersten Zeitpunkt, d. h. in einem frühen Stadium des Wachsen? auf Methanol, mehr aufwies als zu den späteren beiden Zeitpunkten. Der Kontrollstamm hatte keine mRNA, die zu der Oligonucleotidprobe hybridisierte. Alle drei Transformantenstämme besaßen HSOD-Wirksamkeit, wie durch die elektrophoretische Separation und Analyse (in Beispiel 4 beschrieben) gemessen wurde.

Beispiel 3

Wachstum von HSOD-ausprägenden P. pastoris Stämmen in 1 Liter großen Fermentoren Auf der Grundlage der Schüttelkolben-Ausprägungsergebnisse wurden zwei der Mut⁺-Stämme, G+SOD104C10 (eine Kopie) und G+SOD104C3 (zwei Kopien), und einer der Mut"-Stämme, G-SOD 104C5, in 1-Liter-Fermentoren für die Herstellung vcn HSOD beurteilt. Die Mut⁺-Zeiien wurden unter einem methanolbegrenzten Fed-batch-Regime vermehrt, und die ΜυΓ-Zellen wurden sowohl unter einem Methanolüberschuß-Fed-batch-Regime als auch unter einem Mischstrom-Fed-batch-Regime wie folgt vermehrt:

A. Fermentationsregimes

1. Methanol-Fed-batch-Fermentatlon, MeOH begrenzt, Mut⁺-Phänotypen

Versuch 441 G+SOD104C3 (Doppelkopie) Versuch 442 G+SOD104C10 (Einzelkopie bei HIS4) Versuch 459 G+SOD104C10 (Einzelkopie bei HIS4) Versuch 460 G+SOD104C3 (Doppelkopie)

Der Fermentor wurde mit 700ml Minimalsalzmedium (Endgrundsalzkonzentration 3,3%) und 4% Glycerol autoklaviert. Nach der Sterilisation wurden jeweils 3ml YTM 4 und IM 1 hinzugegeben, und der pH Wert wurde mit konzentriertem NH₄OH auf 5 gebracht. Danach wurde der pH von 5 durch die Zugabe von verdünntem (1:4) NH₄OH mit 0,1 % Struktol J 673 Antischaummittel (Struktol Co., Stow, OH) aufrechterhalten. Impfkulturen wurden aus selektiven Platten zubereitet und über Nacht bei 30°C in phosphatgepufferter 0,67%iger Hefestickstoffbase (pH 5) mit einem Glycerolgehalt von 2% vermehrt. Der Fermentor wurde mit gezüchteten Zellen geimpft, und das Batch-Wachstumsregime dauerte 18 bis 24 Stunden. Am Punkt der Substraterschöpfung wurde mit einer 50% Glycerolzufuhr (mit jeweils 12 ml YTM 4 und IM 1 pro Liter) bei 12 ml/h über 7 Stunden begonnen. Am Punkt der Substraterschöpfung, gewöhnlichnach 6 Stunden Glycerolzufuhr, wurde mit einer MeOH-Zufuhr (mit jeweils 12 ml YTM4 und IM 1 pro Liter) bei 1,5ml/h begonnen, und es wurden zusätzliche 3ml YTM 4 und IM 1 in den Fermentorgegeben. Im Verlaufe der nächsten 10 Stunden wurden bis zur Erreichung eines Enddurchsatzes von 7,5 ml/h alle 30 Minuten Einstellungen in Steigerungsbeträgen von 10% vorgenommen. Der Behälter wurde 48-80 Stunden nach der MeOH-lnduktion geerntet.

2. MeOH begrenzt, kontinuierliche Kultur, Mut⁺-Ph8notyp Versuch 476 G+SOD104C3 (Doppelkopie)

Der Fermentor wurde vorbereitet, wie oben für das F6d-batch-Regime mit begrenzter MeOH beschrieben ist. Bei Glycerolerschöpfung wurde mit einer 5%igen MeOH-Zufuhr (mit 4x Grundsalzgehalt und 12ml YTM4 und IM 1 pro Liter MeOH) bei 10ml/h begonnen. Die 5% MeOH-Zufuhr wurde über die nächsten 6 Stunden auf 60ml/h erhöht. Nach Erreichen eines Reaktorflüssigkeitsvolumens von 1 Liter (ca. 30 Stunden) wurde ein Erntestrom mit einem Durchsatz eingeleitet, der dem Durchsatz zur Aufrechterhaltung eines konstanten Volumens von 1 Liter in dem Fermentor entsprach. Bei 143 Stunden mit MeOH wurde 1 ml einer 1%igen Kupfer- und Zinklösung in den Reaktor gegeben. Nach 295 Stunden mit MeOH wurden die Zulauf- und Ablaufmengen auf 30ml/h reduziert. Die kontinuierliche Kultur wurde nach 431 Stunden auf Fed-batch-Regime umgestellt, indem von der 5-%-MeOH-Zufuhr auf eine 100-%-MeOH-Zufuhr (plus 12 ml/l YTM4 und IM1) umgeschaltet wurde und der Abflußstrom eingestellt wurde. Das Fed-batch-Regime wurde wie oben beschrieben über einen Zeitraum von 72 Stunden bei insgesamt 503 Stunden MeOH für den gesamten Versuch gefahren.

3. Methanol-Fed-batch-Regime, MeOH-Uberschuß, Mur-Phanotypen Versuch 445G-SOD104C5 (Einzelkopie bei A0X1)

Der Fermentor wurde wie oben beschrieben für einen Mut⁺-Methanol-Fed-batch-Versuch vorbereitet und geimpft. Am Punkt der Substraterschöpfung wurde mit einer Methanolzufuhr (YTM 4- und IM 1 -Gehalt von jeweils 12 ml/l) bei 0,5 ml/h begonnen, und es wurden zusätzlich 3 ml YTM 4 und 3ml IM 1 in den Fermentor gegeben. Der Durchsa .. wurde im Verlauf der Fermentation erhöht, um eine MeOH-Restkonzentration von ca. 4g/l aufrechtzuerhalten. Der Behälter wurde von 6 bis 10 Tagen nach der MeOH-lnduktion geerntet.

4. Mlschstrom-Fed-batch-Reglme, Mut~-Ph8notyp Versuch 446G-SOD104C5 (Einzelkopie bei AOX1)

Der Fermentor wurde wie oben beschrieben für den Mut⁺-Methf)nol-Fed-batch-Versuch vorbereitet und geimpft. Am Punkt der Substraterschöpfung wurde eine 50-%-Glycerolzufuhr (mit er jni YTM4- unrJ IM 1-Gehalt von jeweils 1 2 ml/l) bei 5,4ml/h über 6 Stunden gestartet. Danach wurdo der Glyceroldurchsatz aur 3,6ml/h reduziert, es wurden jeweils 3ml YTM4 und IM 1 hinzugegeben, und es wurde mit einer MeOH-Zufuhr mit einem YTM4- und IM 1 -Gehalt von jeweils 12 ml/l) begonnen. Die Anfangsmenge der MeOH-Zuführung betrug ca. 1 ml/h (Verhältnis von MeOH-: Glycerolzufuhr 0,7:1). Im Verlaufe der nächsten 10 Stunden wurden alle 30 Minuten Einstellungen in Stufen von 10% vorgenommen, bis ein Enddurchsatz von 4,9 ml/h (MeOH-:Glycerolzufuhr im Verhältnis von 2:1) erreicht wurde. Der MeOH-Durchsatz wurde so eingestellt, daß die MeOH-Restkonzentration 4g/l nicht überstieg. Der Behälter wurde 80 Stunden nach der MeOH-lnduktion geerntet.

B. Fermentationsergebnisse

Die Zeit-Verlauf-Diagramme in Figur 2 A zeigen die Entwicklung der Zelldichte, gemessen als Füllzeilnaßgewicht (WW), in den Versuchen 441,442,445 und 446. Die Zeilwachstumsprofile waren typisch für die routinemäßig beobachteten Profile in den Fermentationsregimen 1,3 und 4, die oben beschrieben sind.

Die Mut⁺-Stämme aus den Versuchen 441 und 442 (Doppel- bzw. Einzelkopie) erreichten eine hohe Zelldichte (340-350WW/I) in nur 54 Stunden; hier wurde das Methanol-Fed-batch-Regime (Fermentationsregime 1) angewendet. Das routinemäßig für Mur-Stämme angewendete Methanol-Fed-batch-Regime (Fermentationsregime 3) ist eine weitaus längere Fermentation; sie dauert normalerweise 6 bis 10 Tage. Dies ist durch Versuch 445 veranschaulicht, bei dem 150 Stunden erforderlich waren, um eine Zelldichte von 280g WW/I zu erreichen. Bei Anwendung einer Mischstrorn-Strr.tegie in Versuch 446 'Fermentationsregime 3) wurde nachgewiesen, daß der Mut"-Stamm G-SOD104 C 5 schnell bis zu einer Dichte gezüchtet werden konnte, die den Mut*¹'-Stämmen entsprach; eine Zelldichte von 380g WW/I (95g Trockengewicht/l) wurde in 80 Stunden erreicht.

Das Zait-Verlauf-Diagramm der HSOD-Ausprägung in den Versuchen 441,442,445 und 446 (Fig. 2 B) zeigt, daß in diesen Versuchen die höchsten HSOD-Werte (3500kU/l oder 0,92g/l auf der Basis einer spezifischen Wirksamkeit von 3,8υ/μρ) von dem Doppelkopie-Stamm G+SOD1CMC3 erzeugt wurden. Dieser Stamm zeigte auch eine der höchsten spezifischen Produktivitäten, 240U/g WW-h, wie in Tabelle I dargelegt ist.

Bei den Einzelkopiestämnen waren Ausprägungsgrad und spezifische Produktivität am höchsten bei den Mut⁺-Stämmen, gefolgt von den ΜυΓ-Stämmen, die auf einem Mischsubstrat gezüchtet wurden. Die unter einem methanolbegrenzten Fedbatch-Rügime gezüchteten ΜυΓ-Zellen waren weniger produktiv als die anderen.

Wie durch ähnliche Ausbeuten und spezifische Produktivitäten angezeigt wird (Tabelle I), wurden die Versuche 441 und 442 in den Versuchen 460 bzw. 459 erfolgreich reproduziert. Die letzteren zwei Versuche wurden auf Methanol über 80 Stunden induziert. Da die HSOD-Ausbeute sich proportional zu der Menge der unter induzierenden Bedingungen erzeugten Zellmasse verhält, wurde in den längeren Versuchen ein höherer Ausprägungsgrad, 5100kll/l bzw. 1400kU/l, erreicht (Fig. 2C). Bezogen auf unsere Bestimmung der spezifischen HSOD-Wirksamkeit wurde der beste Ausprägungsgrad in Versuch 460 realisiert. 1,3g HSOD wurden pro Liter Fermentorvolumen produziert.

Wie oben beschrieben ist, wurde der Versuch 476 zuerst in kontinuierlicher, danach in einer Fed-batch-Fahrweise durchgeführt.

Bei der kontinuierlichen Fahrweise wurden die HSOD-Werte 431 Stunden lang aufrechterhalten, sie waren gegenüber der Zugabe von Kupfer und Zink in den Reaktor unempfindlich. Wie in Tabelle I dargestellt ist, ergab der Doppelkopiestamm G+SOD 104C3, der nach dieser Fermentationsweise fermentiert wurde, die beste spezifische Produktivität (330U/g/h).

Die oben diskutierten HSOD-Ausprägungswerte basieren auf Daten von Wirksamkeitsanalysen, die nachfolgend in Beispiel 4 beschrieben sind. Da Wir' jamkeitsanalysen nur funktionell Moleküle messen können, würden denaturierte oder inaktive Enzyme vom Nachweis nicht erfaßt werden. Aus diesem Grunde sind die angegebenen Ausprägungsgrade niedere Grenzen; die echten Werte sind gleich oder größer als diese Werte.

Beispiel 4 Charakterisierung von HSOD A. Wirksamkeitsbestimmungen

(Das Prinzip von SOD-Wirksamkeitsbestimmungen ist in Fig. 3 dargestellt.)

1. Nitritbestimmung

Die Nitritbestimmung wurde zum Messen der HSOD-Wirksamk jit angewendet (Oyanagui, Anal. Biochem. 142,290 [1984]). Diese Bestimmung basiert auf der Oxidation von Hydroxylamin durch HSOD zu Nitrit, das dann mit einem Indikatorfarbstoff nachgewiesen wird.

Die Nitritbestimmung hat sich insbesondere zum Messen von HSOD-Konzentrationen in Pichia-Lysaten als erfolgreich erwiesen.

Tabelle Il zeigt, daß verschiedene, in Fermentationsversuchen genommene Proben eine hohe Wirksamkeit liefern, während die Kontrollprobe (G-PAO804) einen viel niedrigeren Wert ergibt, der oftmals nur 5% der rekombinanten Stämme ausmacht. Diese Bestimmung kann somit rekombinante HSOD-Wirksamkeit von anderen SOD-ähnlichen Wirksamkeiten in dem Lysat differenzieren und dies, wie in T belle Il gezeigt ist, mit einer Abweichung von allgemein weniger als 10%.

Tabelle I HSOD-auspragende Pichla	Stamm	Phäno typ	-StSmme	max. SOD kU/l	max. SOD g/i	Stun den	max. Naß gewicht g/i	spezifische Produktivität U/g/h	volumetrische Produktivität kU/L/h
Ver such	G+SOD104C3 G+SOD104C10 G+SOD104C10 G+SOD104C3	Mut1 Mut» Mut* Mut·	Kopie	3600 1 100 1400 5100	0,92 0,29 0,37 1,34	54 54 79 80	340 359 421 411	240 72 58 220	62 18 16 66
441 442 459 460	G+SOD104C3 G+SOD104C3	Mut* Mut*	2 1 1 2	640 4600	0,17 1,21	431 503	80 350	330 204	38 55
476" 476"	G-SOD104C5 G-SOD104C5	Mur Mur	CM CM	700 920	0,18 0.24	143 71	277 382	26 50	5,9 13
445 446	1 1

1 Versuch 476 wurde zunächst kontinuierlich, dann im Fed-batch-Regime durchgeführt. Bei der kontinuierlichen Fahrweise wurden die HSOD-Werte 431 h aufrechterhalten und waren gegenüber der Zugabe von Kupfer und Zink in den Reaktor unempfindlich.

2 Fed-batch-Reglme von Versuch 476.

Tabelle Il SOD-Bestlmmungsabweichung

Probe	Wirksamkeit"	"/«Abweichung21
(Versuch-Stunden)	(Einheiten/μΙ)
441-21	0,791	10,44
441-54	1,779	4,00
442-21	0,385	6,94
442-54	0,569	11,40
445-34	0,340	6,89
445-143	0,442	6,85
804 (Kontrolle)	0,089	17,10

1 Die Zahlen stellen den Mittelwert von 4 Bestimmungen dar.

2 berechnet aus der Standardabweichung der Probe vom Mittelwert.

Die Nitritbestimmung wurde auf die Cytochrom-C-Bestimmung standardisiert, indem sowohl eine menschliche Erythrozyt-SOD-Standardsubstanz (Sigma Chemical Company) als auch aus P. pastoris gereinigte, menschliche rekombinante SOD in jeder Analyse untersucht wurden. Vom Hersteller wurde angegeben, daß die Eryhtrozyt-SOD eine spezifische Wirksamkeit von 2,7 Einheiten/pg in der Cytochrom-C-Bestimmung hat. Von uns wurde eine spezifische Wirksamkeit von 3,8 Einheiten/pg in dieser Analyse gemessen, wir haben auch festgestellt, daß die erfindungsgemäß hergestellte gereinigte rekombinante KSOD den gleichen Wert ergab. Alle Proteinkonzeinrationen wurden unter Anwendung der quantitativen Aminosäureanalyse bestätigt. Die Nitritbestimmung ergab auch identische Werte für die zwei Präparate. Aus diesem Grunde kann die einfachere und besser unterscheidende Nitritbestimmung zum Analysieren von Lysatproben angewendet werden, wenn die von Unbekannten gewonnenen Werte stets mit den Weilen verglichen wurden, die von reinem Enzym bekannter spezifischer Wirksamkeit gewonnen werden.

2, Elektrophoretisch^ Trennung und Bestimmung

Die endogene und die heterologe HSOD-Wirksamkeit in P. pastoris können getrennt und in einem Acrylamidgel nach nichtdenaturierender Elektrophorese bestimmt werden. Für diese Bestimmung sind der geeignetste Superoxiderzeuger und -detektor Riboflavin/TEMED bzw. Nitroblautetrazolium (NBT) (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 44,276 [1971 ]). NBT wird in dem gesamten Gel mit Ausnahme von Bereichen, wo SOD zum Spülen des Superoxids vorhanden ist, in das blaue Produkt umgewandelt. Extrakte von transformierten Zellen, die in Schüttelkolben vermehrt wurden, wurden durch Elektrophorese abgetrennt und wiesen eine SOD-Wirksamkeit auf, die mit der Humanstandardsubstanz mithält. Kontrollzellextrakte erzeugten auch eine Clearing-Zone auf den Gels, allerdings in einem von der Position der Humanform von SOD gut isolierten Bereich des Gels, bei einer höheren elektrophoretischen Mobilität. Überraschenderweise haben transformierte Zellen, die Höchstwerte von Human-SOD ausprägen, keine bemerkenswerte Wirksamkeit in der gleichen Gelposition erzeugt wie die Kontrollzellen. Es gab allerdings eine neue Clearing-Zone, die bei einer dazwischenliegenden Mobilität zwischen der Position von endogener P. pastoris SOD und rekombinanter Human-SOD auftrat. Dies deutet darauf hin, daß zwischen der endogenen P. pastoris SOD und der rekombinanten Human-SOD ein Heterodimer gebildet werden kann.

Bei einer typischen elektrophoretischen Trennung und Bestimmung wurden aliquote Mengen, die 4μΙ Extrakt in 5OmM Phosphat bei einem pH-Wert von 7,8 entsprachen, der nichtdenaturierenden Elektrophorese unterzogen, und es wurden Superoxidradikale erzeugt und, wie oben beschrieben, nachgewiesen.

B. Immunnachwels

Ziegenantiserum zu authentischem HSOD wurde verwendet.

Kaninchen-Antiziegen-lgG-Antiserum (Organon Teknika, Weste!.ester, PA) wurde als ein zweiter Antikörper zur Erhöhung der Bindungseffizienz des ¹²⁶l-Protein Averwendet.

Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgelektrophorese wurde HSOD von den kreuzreaktiven Komponenten in P. pastoris Lysaten abgetrennt. Die Proben wurden reduziert, denatuiert und der Elektrophorese auf 15% Acrylamidgels unterzogen, um die 16-Kilodalton-HSOD-Monomere aufzulösen. Lysate von SOD-Transformanten, die im Schüttelkolben vermehrt wurden, hatten

sowohl einen immunreaktiven Streifen, der mit der HSOD-Standardsubstanz komigrierte als auch kreuzreaktive Substanz von höherer scheinbarer relativer Molekülmasse. Kontrollysate hatten andererseits eine sehr geringe Immunreaktivität in dem HSOD-Bereich des Gels, wiesen aber die gleiche Substanz mit der hohen relativen Molekülmasse auf. Beim Vergleichen der Schüttelkolbenlysate ergab der Zweikopien-Mut⁺-Stamm (G+SOD104C3) durchweg einen intensiveren Streifen als jeder der Einzelkopiestämme.

Western-Blots können ein quantitatives Maß für die Menge an immunreaktivem Protein in einem Lysat durch sorgfältigen Vergleich mit verschiedenen Konzentrationen der Standardsubstanz, auf dem gleichen Gel, liefern. Die Ergebnisse von quantitativen Western-Blots haben die Ergebnisse der spektrofotometrischen Nitritbestimmung und der NBT-Wirksamkeitsgele bestätigt und ergänzt. Die gemessene Menge an HSOD-Wirksamkeit und HSOD-Protein war innerhalb des Versuchsfehlers die gleiche. Dies ist ein wichtiger Vergleich, da er andeutet, daß alle HSOD-Polypeptide richtig gefeiten und voll wirksam sind. Zudem hat eine Coomassieblau-Färbung entweder der denaturierenden oder der nativen Gele klar sichtbare Streifen gezeigt, die mit der HSOD-Standardsubstanz komigrierten. Diese Coomassis-Streifen waren von einer Intensität, die nach den anderon Schätzungen des Gesamt-HSOD-Proteins in der Probe erwartet wurde. Da sich die denaturierenden Gele nach der Größe trennen und die nativen Gele sich auf der Grundlage von Größe und Ladung trennen, ist die Tatsache, daß die rekombinante HSOD mit der Standardsubstanz in beiden Systemen komigrierte, Beweis dafür, daß das in Pichia erzeugte rekombinante Enzym richtig gefalten ist, von der richtigen Größe ist und die richtige Oberflächenladung zeigt.

Beispiel 5

Reinigung und Stabilität von in P. pastoris erzeugter HSOD

Mehr als 90% der rekombinanten HSOD wurden aus P. pastoris Zellen extrahiert, die mit Glasperlen in Gegenwart von einfachen Pufferlösungen lysiert wurden. Es wurde im typischen Fall eine 5OmM Natrium- oder Kaliumphosphatpufferlösung mit 0,1 mM EDTA bei einem pH-Wert von 7,8 verwendet, und die Ausbeute betrug nach Korrektur des Pelletvolumens mindestens 95%, wobei entweder nach der Wirksamkeitsbestimmung oder nach Western-Blots gemessen wurde. (Es kann jede Pufferlösung, in der das Enzym stabil ist, vci wendet werden.) Rekombinante HSOD wurde aus dem Zellysat im wesentlichen so gereinigt, wie von McCord et al., J. Bio' Chem. 241, 6049 (1969) für Erythrozytlysate beschrieben worden ist.

Hämoglobin wird aus dem Erythrozytpräparat durch eine Ethanol-Chloroform-Behandlung ausgefällt. Es wurden ebenfalls viele Hefeproteine aus dem P. pastoris Lysat entfernt. Ethanol, 25% des Lysatvolumens, wurde tropfenweise zu der verrührten Lysatsuspension hinzugegeben, die unter 4°C in einem Salzwasser-Eis-Bad gehalten wurde. Chloroform wurde auf ähnliche Weise hinzugegeben (15% des Ausgangslysatvolumens). Kontaminierende Proteine konnten sich denaturieren und ausfällen, indem weitere 15 Minuten in dem Eisbad gerührt wurde, und der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt.

Superoxiddismutase wurde durch einen Phasenextraktionsschritt weiter gereinigt. Zweibasiges Kaliumphosphat wurde zu der überstehenden Flüssigkeit hinzugegeben, die auf 25°C erwärmt wurde. Als 30% KjHPO₄ (Masse zu Volumen) in der Ethanol-C hloroform-Lösung aufgelöst waren, verteilte sich HSOD in die obere Phase weg von der unteren, hochsalzhaltigen Phase. Die obe e Phase wurde auf 4⁰C gekühlt und durch Zentrifugieren geklärt.

Rekombinante HSOD wurde durch Ausfällen mit kaltem Aceton (75% des Volumens der überstehenden Flüssigkeit) eingedickt, zentrifugiert und in einem reduzierten Volumen wiederaufgeschwemmt. Die Lösung wurde gegen 2,5mM Kaliumphosphat, pH 7,8, bis zum Gleichgewicht dialysiert. (Anstelle von Kaliumphosphatpufferlösung könnte jede Pufferlösung mit niedriger lonenstärke um einen neutralen pH-Wert herum angewendet werden.) Diese Pufferlösung sollte die Äquilibrierungspufferlösung für DE-52 oder jeden anderen ähnlichen Anionenaustauscher sein, der in dem nächsten Schritt verwendet wird. HSOD eluierte aus DE-52 in einem Gradienten von 2,5 bis 10OmM Kaliumphosphat, pH 7,8.

Bei Lagerung als Lysat bei 3-5°C ist die HSOD-Wirksamkeit mindestens vier Wochen lang stabil. Als gereinigtes Protein ist rekombinante HSOD aus P. pastoris mindestens acht Wochen lang bei 3-5⁰C stabil.

Claims (39)

1. P. pastoris Zeile, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrem Genom mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz enthält, die in P. pastoris ein Polypeptid mit Superoxiddismutasewirksamkeit (SOD-Wirksamkeit) unter der Regulation einer Promotorregion eines P. pastoris Gens operierbar kodiert.

2. P. pastoris Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das P. pastoris Gen das P. pastoris A0X1-Genist.

3. P. pastoris Zelle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens zwei Kopien der DNA-Sequenz enthält.

4. P. pastoris Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrem Genom mindestens eine Kopie einer Ausprägungskassette enthält, die in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion eines ersten P. pastoris Gens, eine DNA-Sequenz, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit kodiert, und einen Transkriptionsterminator eines zweiten P. pastoris Gens umfaßt, wobei das erste und das zweite P. pastoris Gen identisch oder verschieden sind und sich die Segmente der Ausprägungskassette in Operationsassoziation befinden.

5. P. pastoris Zelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, deß das erste und das zweite P. pastoris Gen identisch sind und das P. pastoris AOX 1-Gen darstellen.

6. P. pastoris Zelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens zwei Kopien der Ausprägungskassette enthält.

7. P. pastoris Zelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine einzelne Kopie der Ausprägungskassette enthält, die durch Substitution an dem AOX 1-Genort des P. pastoris Genoms eingebaut ist.

8. P. pastoris Zelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine einzelne Kopie der Ausprägungskassette enthält, die durch Addition an dem HIS4-Genort des P. pastoris Genoms eingebaut ist.

9. P. pastoris Zelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine einzelne Kopie der Ausprägungskassette enthält, die durch Addition an dem AOX 1-Genort Hes P. pastoris Genoms eingebaut ist.

10. P. pastoris Zelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwei Kopien der Ausprägungskassette enthält, die durch Addition an den Genorten AOX1 und HIS 4 des P. pastoris Genoms eingebaut sind.

11. P. pastoris Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Zelle des P. pastoris Wirtsstammes GS115 (ATCC 20864) ist.

12. P. pastoris Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz menschliche Cu/Zn Superoxiddismutase (HSOD) in P. pastoris operierbar kodiert.

13. P. pastoris Zelle nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz HSOD in P. pastoris operierbar kodiert.

14. DNA-Fragment, das wahlweise in einem ringförmigen Plasmid enthalten ist oder ein ringförmiges Plasmid ist, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Kopie einer Ausprägungskassette einschließt, die in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion eines ersten P. pastoris Gens, eine DNA-Sequenz, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit kodiert, und einen Transkriptionsterminator eines zweiten P. pasloris Gens umfaßt, wobei das erste und das zweite P. pastoris Gen identisch oder verschieden sind und sich die Segmente der Ausprägungskassette in Operationsassoziation befinden.

15. DNA-Fragment nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite P. pastoris Gen identisch sind und das P. pastoris AOX 1-Gen darstellen.

16. DNA-Fragment nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren ein selektierbares Marker-Gen und Enden mit ausreichender Homologie mit einem Zielgen 2ur Herbeiführung der Integration des DNA-Fragments darin umfaßt.

17. DNA-Fragment nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielgen des P. pastoris AOX 1-Gen ist.

18. DNA-Fragment, nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das selektierba· β Marker-Gen das P. pastoris HIS4-Gen ist.

19. DNA-Fragment nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Seqeuenz HSOD in P. pastoris operierbar kodiert.

20. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Bglll-Digest des Plasmids pSOD104ist.

21. DNA-Fragment nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren ein selektierbares Marker-Gen und mindestens eine zusätzliche DNA-Sequenz mit ausreichendem Homologie mit einem Zielgen zur Herbeiführung der Integration in dieses umfaßt.

22. DNA-Fragment nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielgen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus dem P. pastoris A0X1-Gen und dem P. pastoris HIS4-Gen besteht.

23. DNA-Fragment nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das selektierbare Marker-Gen P. pastoris HIS4-Gen ist.

24. DNA-Fragment nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz HSOD in P. pastoris operierbar kodiert.

25. DNA-Fragment nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid pSOD 104 ist.

26. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Ausprägungskassette enthält, die in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion eines ersten

P. pastoris Gens, eine DNA-Sequenz, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit kodiert, und einen Transkriptionsterminator eines zweiten P. pastoris Gens umfaßt, wobei das erste und das zweite P. pastoris Gen identisch oder verschieden sind und sich die Segmente der Ausprägungskassette in Operationsassoziation befinden.

27. Expressionsvektor nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 15 bis 19 enthält.

28. Expressionsvektor nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß er des weiteren Sequenzen umfaßt, die dessen Replikation und Selektion in Bakterien ermöglichen.

29. Expressionsvektor nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß er ein pBR322-Derivat ist.

30. Kultur von vermehrungsfähigen P. pastoris Zellen, gekennzeichnet durch einen beliebigen der Ansprüche 1 bis 13.

31. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit SOD-Wirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, daß P. pastoris Transformanten, die in ihrem Genom mindestens eine Kopie einer DNA-Sequenz enthalten, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit in Operationsassoziation mit einer Promotorregion eines P. pastoris Gens operierbar kodiert, unter Bedingungen vermehrt werden, die die Ausprägung der DNA-Sequenz in dem P. pastoris ermöglichen.

32. Verfahren n?.ch Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die P. pastoris Transformanten in ihrem Genom mindestens zwei Kopien der DNA-Sequenz enthalten.

33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die P. pastoris Transformanten in ihrem Genom mindestens eine Kopie einer Ausprägungskassette enthalten, die in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion eines ersten P. pastoris Gens, eine DNA-Sequenz, die in P. pastoris ein Polypeptid mit SOD-Wirksamkeit kodiert, und einen Transkriptionsterminator eines zeiten P. pastoris Gens umfaßt, wobei das erste und das zweite P. pastoris Gen identisch oder verschieden sind und sich die Segmente der Ausprägungskassette in Operationsassoziation befinden.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformanten durch Transformation Πι. jinem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 14 bis 25 gewonnen werden.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformanten in einem Medium gezüchtet werden, das Methanol als eine Kohlenstoffquelle enthält.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformanten aus dem P. pastoris his4~-Stamm GS115 entwickelt werden.

37. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformanten den Mut~- Phänotyp haben.

38. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformanten den Mut⁺- Phänotyp haben.

39. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren den Schritt des Erntens der SOD von den Transformanten einschließt.