JPS6350000B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、動物ステリン又は植物ステリンをミ
コバクテリウム・スペツク（Mycobacterium
spec.）NRRL−Ｂ−3683（米国特許第3684657号
明細書に公知；DSM2966）又はNRRL−Ｂ−
3805（米国特許第3759791号明細書に公知；
DSM2967）又はその変種及び突然変異種の培養
液を用いて発酵させることにより、一般式 〔式中、〓結合は単結合又は二重結合を表わす〕
の21−ヒドロキシ−20−メチルプレグナン誘導体
を製造する方法に関し、該方法はこの発酵を硼酸
イオン又は有機硼素化合物の存在下に、6.0〜8.0
のPH値で実施することを特徴とする。 ミコバクテリウム・スペツク
（Mycobacterium spec.）NRRL Ｂ−3683及び
NRRL Ｂ−3805の培養体が、動物又は植物ステ
リンから一般式の21−ヒドロキシ−20−メチル
プレグナン誘導体を形成する能力を有することは
公知である〔アプライド・ミクロビオロギー
（Applied.Microbiology）第23巻、1972年、72頁
以降、及びアプライド・アンド・エンバイロメン
タル・ミコビオロギー（Applied and
Enviromental Micobiology）第32巻、1972年、
310頁以降〕。しかし、この化合物はほんの痕跡程
度又は非常に僅かな収量しか形成されないで、公
知法は工業的にはほとんど使用不可能である。 本発明方法により、公知方法によるより極めて
高い収率が、一般式の21−ヒドロキシ−20−メ
チル−プレグナン誘導体に関して達成される。 発酵に適する動物又は植物ステリンは、例え
ば、コレステリン、スチグマステリン、カンペス
テリン、ブラシカステリン又はシトステリン、３
−アシル化合物、例えばこれらステリンのアセテ
ート又はこれらステリンからオツペナウアー酸化
により得られた３−ケト−Δ⁴−ステロイド、例
えば、４−コレステン−３−オン、４−スチグマ
ステン−３−オン、４−シトステン−３−オン又
は４−カンペステン−３−オンである。 本発明により、発酵は硼酸イオン又は有機硼素
化合物の存在下に実施される。好適な硼素化合物
は、例えば、硼酸、メタ硼酸ナトリウム、テトラ
硼酸二ナトリウム、メタ硼酸カルシウム又は硼酸
トリフエニルである。発酵は有利に硼酸イオン供
給試薬0.1％〜0.5％の存在下に実施される。硼酸
イオン供給試薬の添加は有利に発酵開始後10〜30
時間で実施される。 硼酸イオン供給試薬の添加の際に、通常、発酵
培養液のPH値を6.0〜8.0の間に合わせるように注
意する。 その他は、通常の条件下にこの発酵を実施す
る。微生物を好適な培養基中で換気下に、深部培
養で培養する。次いで、基質（好適な溶剤中に溶
かして又は有利に乳状の形で）を培養液に添加
し、最高基質変換が得られるまで発酵させる（約
96〜160時間）。 好適な基質溶剤は、例えば、メタノール、エタ
ノール、グリコールモノメチルエーテル、ジメチ
ルホルムアミド又はジメチルスルホキシドであ
る。基質の乳化は、例えば、これを微細の形で又
は水と混合可能な溶剤（例えば、メタノール、エ
タノール、アセトン、グリコールモノメチルエー
テル、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホ
キシド）に溶かし、強力な渦巻形成下に、常用の
乳化助剤を含有する水（有利に、脱灰した水）中
に噴射注入することにより生ぜしめることができ
る。好適な乳化助剤は非イオン系乳化剤、例えば
ポリグリコールの脂肪酸エステル又はオキシエチ
レン付加物である。好適な乳化剤としては、例え
ば、市販の湿潤剤テギン（Tegin）、タガート
（Tagat）、ツウイーン（Tween）及びスパ
ン（Span）を挙げることができよう。 発酵の際に、基質の乳化はしばしば高めた基質
添加、かつこれにより、基質濃度の上昇を可能と
する。しかし、もちろん、本発明方法の際に、発
酵の技術分野の専門家にとつてすでに公知であ
る、他の基質添加上昇のための方法を使用するこ
とも可能である。 最高な基質濃度、基質添加時間及び発酵継続時
間は使用基質の構造に依る。微生物でのステロイ
ド変換の際に、一般に必要なように、これらの程
度を、当技術分野の専門家において慣行のよう
に、各々の場合に、予備実験であらかじめ調べな
ければならない。 反応生成物のそれ以上の上昇は、ミコバクテリ
ウム属の菌株を通常の方法で選択し、変異させて
得られる。 例えば、ミコバクテリウム・スペツクNRRL
Ｂ−3805（有利に、変異誘発素での処理後）を血
液寒天培養基板上にぬり、形態学的に異なつた外
観の各コロニーを得ることができる。この各コロ
ニーを単離し、一般式の21−ヒドロキシ−20−
メチルプレグナン誘導体形成に対する各各の能力
を調べると、円いコロニーを形成する選択菌株は
選択されなかつた菌株より1.5〜３倍高い収率の
21−ヒドロキシ−20−メチル−プレグナン誘導体
を形成する菌株であることが判明した。 一般式の21−ヒドロキシ−20−メチル−プレ
グナン誘導体は薬理作用のあるステロイド合成の
ための重要な中間生成物である。例えば、この化
合物を酸化し一般式の相応するプレグナン−20
−カルボン酸にし、更に、これをラツシツヒ
（H. Ruschig）等により記載された方法〔ケーミ
ツシエ・ベリヒテ（Chem.Ber.）第88巻、1955
年、第883頁以降参照〕により、相応する式の
プレグナン−３、20−ジオン誘導体に変換するこ
とができる。 （Ｙ＝水素又は17α−ヒドロキシ） こうして得られた化合物はその黄体ホルモン作
用により、公知のように優れており、かつ、更に
薬理作用を有する多数のステロイドの合成のため
の重要な中間生成物でもある。 次に実施例につき本発明を詳細に説明する。 例 １ (a) 酵母抽出液 １％ 燐酸水素二ナトリウム 0.45％ 燐酸二水素カリウム 0.34％ タガート02 0.2％ （PH6.7に調整） を含有する無菌培養基500mlを有する２三角
コルベンに、ミコバクテリウム・スペツク
NRRL Ｂ−3805の乾燥培養体の洗出液を接種
し、30℃で、１分間190回転で３日間振動させ
る。 (b) シトステリン22ｇをテギン（Tegin）4.4
ｇ及び水430mlと共に、95℃で、ウルトラ−テ
ユラツクス（Ultra−Turrax）（ジヤンケ・
ウント・クンケル（Jahnke u.Kunkel）社）で
25分間乳化し、次いで水で513ｇに満たす。こ
の乳剤を120℃で20分間滅菌する。 (c) コーンステイープリカー ２ｇ 燐酸水素二アンモニウム 0.3ｇ タガート02 0.25ｇ （PH6.5に調整） を含有する無菌培養基65mlを有する500ml三角
コルベンにミコバクテリウム・スペツク培養液
５mlを接種する。次いで１(b)で製造した懸濁液
28ml（これはシトステリン1.2ｇに相応する）
及び、24時間後に、４％テトラ硼酸ナトリウム
水溶液を添加し、30℃で、更に120時間、振盪
下に発酵させる。 発酵完結後、培養液汁を塩化エチレン各100
mlで２回抽出する。次いで、合併塩化エチレン
抽出液に活性炭11ｇを添加し、襞付き濾紙で濾
過する。次いで濾液を40℃で、回転蒸発器で濃
縮し、酸化アルミニウムのクロマトグラフイー
にかける。クロマトグラフイー終了後、融点
140〜141℃（酢酸エチルから）の21−ヒドロキ
シ−20−メチル−４−プレグネン−３−オン
135mgが得られる。 同様の条件下で、但しテトラ硼酸ナトリウムの
添加なしで反応を実施する場合、21−ヒドロキシ
−20−メチル−４−プレグネン−３−オン45mgが
得られる。 例 ２ (a) 例1b中の記載と同様にして、４−コレステ
ン−３−オン22ｇから乳剤513ｇを製造する。 (b) 例1cの条件下にミコバクテリウム・スペツク
NRRL Ｂ−3805培養液70mlを培養し、４−コ
レステン−３−オン−乳剤28mlを、24時間後に
４％テトラ硼酸ナトリウム４mlを添加し、30℃
で更に120時間振盪下に発酵させる。例1cに記
載した様に、発酵配合物を処理し、融点142〜
144℃の21−ヒドロキシ−20−メチル−４−プ
レグネン−３−オン95mgが得られる。 同様の条件下で、但しテトラ硼酸ナトリウムの
添加なしで反応を実施する場合、21−ヒドロキシ
−20−メチル−４−プレグネン−３−オン40mgが
得られる。 例 ３ 例1bにより製造したシトステリン乳剤28mlを
例1cに記載した様に、ミコバクテリウム・スペツ
クNRRL Ｂ−3805培養液70mlで発酵させ、この
際、テトラ硼酸ナトリウム水溶液の代わりに４％
テトラ硼酸カルシウム懸濁液６mlの添加を使用す
る。 例1c中の記載と同様の処理後、融点141〜144℃
の21−ヒドロキシ−20−メチル−４−プレグネン
−３−オン120mgが得られる。 例 ４ 例1bにより製造したシトステリン乳剤28mlを
例1cに記載した様に、ミコバクテリウム・スペツ
クNRRL Ｂ−3805培養液70mlを用いて発酵さ
せ、この際、テトラ硼酸ナトリウム水溶液の代わ
りに４％硼酸トリフエニル溶液５mlを添加する。 例1c中の記載と同様の発酵配合物処理の後に、
融点142〜143℃の21−ヒドロキシ−20−メチル−
４−プレグネン−３−オン125mgが得られる。 例 ５ (a) 例1aの条件下に、ミコバクテリウム・スペ
ツクNRRL Ｂ−3683培養体を培養する。 (b) 例1c記載の培養基65mlにミコバクテリウム・
スペツクNRRL Ｂ−3683培養液５mlを加え
る。次いで、この培養液に例1b中に記載のシ
トステリン乳剤28ml及び24時間後に、４％テト
ラ硼酸ナトリウム溶液４mlを添加し、更に120
時間発酵させる。例1cに記載のようにして発酵
配合物を処理すると、融点180〜182℃（酢酸エ
チル−アセトンより）の21−ヒドロキシ−20−
メチル−１，４−プレグナジエン−３−オン90
mgが得られる。 例 ６ 例1aにより製造したミコバクテリウム・スペ
ツクNRRL Ｂ−3805の培養液40mlを１分間に
4000回転で遠心分離する。 こうして得られたバクテリア物質を塩化ナトリ
ウム0.5％、硫酸マグネシウム（５水和物）0.012
％及び燐酸二水素カリウム1.36％を含有する、PH
６に緩衝された塩溶液で２回洗浄し、この塩溶液
40ml中に懸濁させ、0.5％１−メチル−３−ニト
ロ−１−ニトロソグアニジン10mlと混合する。こ
のバクテリア懸濁液を30℃に１時間恒温保持し、
バクテリアを遠心分離し、２回前記塩溶液で洗浄
し、これを血液寒天培養基板（製造会社、オキソ
イド（Oxoid）社、ロンドン在）上にぬる。生じ
た各々のコロニーから、それぞれ円いコロニーを
形成するものを選択し、これから、それぞれ1a
に記載したように培養液を製造する。この培養コ
ロニーをそれぞれ例1c中に記載した発酵を実施す
るために使用し、次の結果を得る。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 動物ステリン又は植物ステリンをミコバクテ
   リウム・スペツクNRRL−Ｂ−3683又はNRRL
   −Ｂ−3805又はその変種及び突然変位種の培養液
   を用いて発酵させることにより、一般式 ［式中、〓結合は単結合又は二重結合を表わす］
   の21−ヒドロキシ−20−メチルプレグナン誘導体
   を製造する場合に、この発酵を硼酸イオン又は有
   機硼素化合物の存在下に、6.0〜8.0のPH値で実施
   することを特徴とする、21−ヒドロキシ−20−メ
   チルプレグナン誘導体の製法。 ２ 一般式 ［式中、〓結合は単結合又は二重結合を表わし、
   Ｘはオキソ基又は水素原子を表わし、R₁は水素
   原子、メチル基又はエチル基を表わす］の動物ス
   テリン又は植物ステリンを発酵させる、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３ 硼酸イオン供給試薬として、オルト硼酸、メ
   タ硼酸、ポリ硼酸又はそのアルカリ又はアルカリ
   土類金属塩を使用する、特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載の方法。 ４ 有機硼素化合物として、硼酸トリフエニルを
   使用する、特許請求の範囲第１項から第３項まで
   のいずれか１項記載の方法。 ５ ミコバクテリウム・スツペク培養液１当
   り、硼酸イオン供給試薬１〜５ｇを使用する、特
   許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 硼酸供給試薬を発酵開始10〜30時間で添加す
   る、特許請求の範囲第５項記載の方法。