JPS63500631A - 酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光投与方法、その投与に使用する支持体、その投与の利用およびその支持体の利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、ポリスチレンに基づく請求の範囲第１１項〜第１３項の何れか一つに記載 の透明支持体。

１５、基質ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ，ＡＴＰ、これらの基質を生成する酵素、即ち デヒドロゲナーゼおよびキナーゼ、これらの酵素の基質および酵素阻害剤を分析 するだめの請求の範囲第１１項〜第１４項の何れか一つに記載の支持体の用途。

明　細　書 酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光投与方法、その投与に使用する支持体、 その投与の利用およびその支持体の利用本発明は１種以上の吸着されたまたは吸 着されない酵素で連続的に作用させることにより、一連の基質、酵素または酵素 阻害剤を生物発光によって分析することを可能にする少なくとも１種のルシフェ ラーゼが吸着された壁からなる分析装置に関する。本発明は一連の生物学的分子 を分析することを可能にし、従って生化学分析および医学および獣医学的診断に 用いることができる。

幾つかのルシフェラーゼはバクテリアから抽出された酵素であり、これは光子の 付ずい的な生成を伴って、フラビンヌクレオチド（以後ＦＭＮと称する）の還元 を触媒する。

これらの光子は光度計でまたは感光性検知機で定量的に検出し、測定できる。こ れらのルシフェラーゼはＮＡＤＨ；　ＦＭＮ酸化還元酵素またはＮＡＤＰＨ：　 ＦＭＮ酸化還元酵素（ＮＡＤＨ＝還元された形でのニコチンアミドアデニンジヌ クレオチド；ＮＡＤＰＨ＝還元された形でのニコチンアミドアデニンジヌクレオ チドホスフェート）と組合せることができる。従って同時に作用するこれら２種 の酵素によって、試験における１〜１０００　Ｘｌ０−”％ルの濃度範囲でＮＡ ＤＨまたはＨｋＤＰＨを分析することができる（ビー・イー争メソッズ・イン・ １９巻第７４９頁以下、１９８１のラビー等の論文）。

別のルシフェラーゼはフイレフリースから分離され、アデノシントリホスフェー ト（ＡＴＰ　）の分解から光子を作すアデノシンモノホスフエー）　（ＡＭＰ　 ）およびピロホス７エートとすることができる。

この方法の二つの発展が提案されたニ一方では臭化シアンとカップリングし、続 いてこれらの最初の二つの酵素を第三ＮＡＤＨ−またはＮＡＤＰＨ−依存デヒド ロゲナーゼと組合せてアガロースビーズ上にこれら二つの酵素の不溶性化をする 、これはこの後者の酵素の基質を測定することを可能にする。主たる業績はド・ ルカおよび彼のグループのものでアリ、テストステロン、Ｌ−マレート、Ｄ−グ ルコース、６−Ｐ−グルコネート、Ｌ−ラクテート、Ｌ−アラニンおよびＬ−グ ルタメートの分析に関し、最小分析範囲は１．５〜ｌ０ＸＩＯ”モルの範囲であ る（エム・ニー・ド・ルヵーマックエルロイの米国特許第４２３４６８１号；ウ ィーンハウゼン、ジーおよびドφルヵ、エム　のＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

第１２７巻第３８０頁１９８２年：フォード、ジェイおよびド・ルカ、エムのＡ ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第１１０巻第４３頁１９８１年ニラロンスキ−、イ ーおよびド・ルヵ、エムのメツド・イン・エンザイモロジー、第５７巻第２０２ 頁１９７８年）。１２種の胆汁α−ヒドロキシ酸も測定できる（ショルメリッヒ 等のＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第１３３巻第２０頁１９７８年）。この方法 はまたこれらのデヒドロゲナーゼを測定するためにも使用できる（ハガーティ、 シー等のＡｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ−第８８巻第１６２頁１９７８年）。この 方法は敏感で特異的であるが、それにも拘わらず固体支持体（アガロース等）を 導入する欠点を有する、そしてこれは発せられた光の若干の保持を生ぜしめ、測 定の時の攪拌に対し非常に敏感である、何故なら多孔性支持体（アガロース）の 使用はゲルのメツシュ中に基質を拡散させることを必要とするからである。これ らの問題のために提案された解決の一つは、これらの酵素が結合されているゲル を含有するセル中に溶液を連続的に通すことである（クリツカ等のＡｎａｌ、　 Ｂｌｏｃｈｅｍ、第１２９巻第３９２頁１９８３年）。この解決策は上述した欠 点の処置を与えるが、特殊な装置の使用により分析技術をより複雑なものにする ことを含んでいる。

一方近年、ブイ０ムーカムペスワーレンおよびスナンダ（ヨーロッパ特許第０１ ６９７６７号）は、グルタルアルデヒドで相互に結合したアルブミンから作られ たゲルにルシフェラーゼを共有結合させることを提案した。

本発明の目的は以下の方法で上述した種々の方法の欠点を克服することにある。

本発明は請求の範囲に特徴付けたように、簡単な写真フィルムであることができ る測定装置に好適である形および大きさのストリップ上または光度計中に導入さ れるチューブの壁土に酵素を吸着させることにある。この吸着はポリリシンまた はポリリシンと他の帯電した親水性分子との共重合体の層を介して達成される。

本発明者等はポリリシンおよびポリフェニルアラニンの共重合体を試験して成功 し、ルシフェラーゼの改良された結合を得た。吸着収率のこの増大はこの共重合 体の二重の親水性および疎水性特性によって説明される、これは従って溶液に対 する親水性側を維持しながらその疎水性部分を介して疎水性ボリスチレンの壁に 良く結合し、壁土Ｋルシフエラーゼが吸着されるようになるのであろう。ここで 吸着収率は親水性ボＩＪＩＪシンと別のより疎水性のアミノ酸の共重合体を用い て増大せしめられる。ポリヒスチジンの如き帯電した親水性アミノ酸の他の重合 体もポリリシンの代りに用いうる。

本発明の利点は上述したルシフエラーゼ系の感度とＦ？異性を保持することであ る、しかし多孔性支持体の使用によって生ずる基質の拡散および光の保持の問題 を避けることにある。ここに提案した場合において、酵素は反応溶液と直ちに接 触状態にする。クリッカ等によって開発された連続流動セル（上述した）におけ る分析と比較して、本発明はより簡単であり、市場で普通の光度計に直ちに適用 でき、連続流動分析によって課せられる要件、一定の流れ、適当に改変された測 定セル、大規模生産の困難を考慮に入れなくてよい利点を有する。

ムーカムペスワーレン＄よびスナンダの提案と比較して、本発明は分析のだめ使 用する支持体（テユーブまたはストリップ）を直ちに使用することができるよう にし、そして親水性分子を介してこの支持体上に直接酵素を吸着させることがで きるようにする。一方で本発明者等は化学的カップリング剤に対し特別に敏感で ある酵素の共有改変を避け、使用する支持体は検出装置のために使用される直接 的な支持体、即ちフラット検出器のだめのストリップまたは光度計のだめのチュ ーブであり、これはすぐ使用できる系を作ることを可能にし、工業的に用いるこ とを大きく容易にする。

本発明は、光子、所望によって１種以上の他のヒドロゲナーゼまたはキナーゼお よび必要によってＭＡＤ（Ｐ）Ｈ　：　ＦＭＮ酸化還元酵素の１種とルシフエラ ーゼを測定するための光度計中に導入されるか他の装置の前に置かれるチューブ またはストリップ上で不動化することにある。この方法で被覆されたチューブは デヒドロゲナーゼまたはキナーゼの基質、酵素自体またはこれら後者の阻害剤を 分析するために使用できる。

このだめ請求める目的によって、デヒドロゲナーゼ（またはキナーゼ）の基質、 ＭＡＤ　（またはＮＡＤＰまたはＡＤＰ　）、ＦＭＮ　（またはなし）およびル シフエラーゼの基質、通常デカナールを適切な割合で加えることが必要である、 これらの分子は通常酵素を安定化する分子の存在下にバツファ一中に加える。一 般的な法則として、試験分子は系の他の構成成分に対して限定された量で導入す る。発光された光を測定し、分析の正確度を増大させるため一定時間通常積分す る。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ　：　ＦＭＮ酸化還元酵素およびルシフエラーゼと連続的に使用 できるＮＡＤ一またはＮＡＤＰ依存デヒドロゲナーゼの多数がある。例示すると これらの幾つかを以下に示す：ラクトースデヒドロゲナーゼ Ｄ−グルコースデヒドロケｆ−−ｔ’ β一Ｄ−ガラクトースデヒドロゲナーゼグルコース−６−ホスフエートテヒドロ ゲナーゼマンニトールデヒドロケナーゼ マンニトール−１−Ｐ−デヒドロゲナーゼンルビトールデヒドロゲナーゼ ポリオールデヒドロゲナーゼ ベンチトールデヒドロゲナーゼ Ｄ−ギシリトールデヒドロゲナーゼ ２，３−シスーボリオールデヒドロゲナーゼＬ−スレオニン酸デヒドロゲナーゼ リボールデヒドロゲナーゼ ラクテートデヒドロゲナーゼ グリオキシレートデヒドロゲナーゼ ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ ホルメートデヒドロゲナーゼ アルデヒドデヒドロゲナーゼ アルコールデヒドロゲナーゼ アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ フコースデヒドロゲナーゼ ３−α−ヒドロキシステ口イドデヒドロゲナーゼβ−ヒドロキシステロイドデヒ ドロゲナーゼ７−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ３−α−２０β− ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ本発明者等は以下にβ−ヒドロキシステ ロイドデヒドロゲーゼを使用するテストステロンあよびラクテートデヒドロゲナ ーゼの分析の実施例を示す。本発明者等はこの酵素の分析がジ声チルスチルボス トロール（　ＤＥＳ　）の如きこの酵素の阻害剤の濃度を測定するために使用で きたことを示した。ＤＥＳｏ量およびβ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー ゼの阻害百分率の間の関係は直線的でなく、それにも拘わらず阻害剤の分析は標 準ＤＥＳ調剤で作られた検量曲線を参照することによって達成できる。

ＡＴＰ依存ルシフエラーゼと連続的に使用しうる多数のキナーゼがある。例示す るとこれらの幾つかを以下に示す：アセテートキナーゼ ピルペートキナーゼ ホスホグリセレートキナーゼ これらのキナーゼはルシフエラーゼで共に不動化させて、使用でき、あるいは溶 液の形で自由に、あるいは別の蛋白質に結合させて使用できる、その濃度は測定 することが望まれる濃度である。例えばキナーゼはそれを抗体に結合させて測定 できる。これはまた上述したデヒドロゲナーゼにも適用される。

このリストは限定するものではなく、本発明方法の適用によって分析できる種々 の基質および酵素を示す。記載した方法で作ったチューブは凍結乾燥でき、それ らの活性の実質的部分を保有しながら長期間貯蔵できる。

実施例　Ｉ　ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＥの分析本実施例においては、本発明者等 はルシフェラーゼおよびＮＡＤＨ：　ＦＭＮ酸化還元酵素の不溶性化を詳細に説 明する。

この不溶性化は種々のパラメーター二支持体の種類、ポリリシンの使用、ポリ− Ｌ　−リシンの濃度、酵素の結合のｐＨ１酵、素の安定化に関して最適にした。

効果において、これら２種の酵素の吸着は他のデヒドロゲナーゼとの関連におけ る発見に拡張のだめの基準として作用する。

本発明者等はそれらの高吸着力のために特別に設計したポリスチレンチューブを 使用した（スターチューブ、　ＮＵＮＣ。

ロスキルド、デフマーク）。ポリ−シーリシンの吸着は、ｐＨ８で、リン酸ナト リウム５０　ｍｍｏ１／ＩｌおよびＮａＣ！Ａ　１０ｍｍｏｌ／Ａの溶液中８０ μ２／−の濃度でボＩＪ　−Ｌ　−ＩＪシン溶液０．５−をチューブ１本につい て加えて行なった。チューブを５　ｒ、ｐ、ｍの回転で２０℃で１時間培養し、 次いでｐＨ７，５でリン酸ナトリウムバッファー５０　ｍｍｏ１／Ａで３回洗っ た。

ジチオスレイトール２ｍｍｏｌ／Ａを含有し、ｐＨ７，５でリン酸ナトリウムバ ッファー５　Ｑ　ｍｍｏｌ／λ中に溶解したフォトバクテリウム　フィシエリ− （Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ　）（シグマ、　ｃｕｔ、 ４７６−４８０　）から抽出したＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ＦＭＮ酸化還元酵素１羊位お よびビブリオ　ハーベイ（Ｖｉｂｒｉ。

ｈａｒｅｙｉ　）　（シグマ門セントルイス↓ミズリーＬＩ６３７）から抽出し たルシフェラーゼの０．５η／−を含有する酵素溶液（０，２ｗ　）を次いでチ ューブに加え、５　ｒ、ｐ、ｍの回転下４℃で３０分培養する。チューブを、牛 血清アルブミン５■／ｄおよびジチオスレイトール２ｍｍｏｌ／ｊＱを含有する ｐａ　７．５のリン酸ナトリウムバッファー１０ｍｍｏｌ／ｌ中で２回洗い、こ のバッファー中で保存する。

分析のため、０．５１１１１０反応容積に、２．５　μｍｏ１／ＸのＦＭＮ　。

０、０００５％のデカナール、２ｍｍｏｌ／Ｘのジチオスレイトール、５　ｖｑ ／ａｄの牛血清アルブミンおよび、、Ｈ７，５のリン酸ナトリウムバッファーＩ 　Ｑ　ｍｍｏｌ／Ｊ２中で濃度を増大させＮＡＤＨを含有させる。最高発光を測 定した。この発光は、試験における１〜２００００Ｘ１０　”ｍ、ｏ’ｌの範囲 の濃度に対して反応媒体中に存在するＮＡＤＨの濃度に比例することが見出され る。最大強度で１秒について発せられる光子の数は２０〜１００００の範囲であ る。

実施例　２　デヒドロゲナーゼの分析 本実施例においては、実施例１に記載し庭如くルシ７工５−　セオヨヒＮＡＤＨ ：　ＦＭＮ酸化ｉ元酵素を吸着させたテ１−プを使用する、しかしそれらは溶液 の形のラクテートデヒドロゲナーゼの分析のため使用する。このため、基質は、 酵素の濃度が限定的ファクターであるよう過剰に加える。

、０．５−の反応溶液は、２．５　ｐｒｎｏ１／１２　（７）　ＦＭＮ　、　Ｏ ，ＯＯ０５％のデカナール、２ｍｍｏ１／ｊ！のジチオスレイトール、５■／ｄ の牛血清アルブミン、０．３　ｍｍｏｌ／ＡのＮＡＤ＋および０．０１ｍｏ１／ 　ｉｔのＬ−ラクテート、および種々の謎度のラクテートデヒドロゲナーゼを含 有する。発せられる光を測定し、６０秒間積分する。分析は試験において２Ｘ１ ０”〜５゜Ｘ　１０　”ｍｏｘの範囲の濃度帯域でラクテートデヒドロゲナーゼ の測定を可能にする。

実施例　３　デヒドロゲナーゼの基質の分析本実施例においては、テストステロ ンの分析を行なうため、３種の酵素ルシフェラーゼ、ＮＡＤＨ：　ＦＭＮ酸化還 元酵素およびβ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼをチューブ上に不動化 する。

チューブ上での１ポリリシンおよび酵素の吸着は実施例１に記載した如く行なう 、しかし酵素溶液は０．０７５単位／ｄのβ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ ナーゼを含有する。

テストステロンの分析のため、チューブは０．５ｇｔｔの１０ｍｍｏ１／Ｌのリ ン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）および２５μｍｏｌ／４のＦＭＮ、　０． ０００１チのデカナール、５Ｗｑ／ｍ／の牛血清アルブミン、２ｍｍｏｌ／Ｘの ジチオスレイトール、１．２ｍｍｏ１／４のＭＡＤおよび種々の濃度のテストス テロンを含有する。光強度を測定し、６０秒間積分する。テストステロンは反応 溶液中５Ｘ１０”〜５　Ｘ　１０　’ｍｏｌの範囲の濃度帯域で測定できる。

高吸収力を有するポリスチレンチューブ（スターチューブ、ＮＵＮＣ！、　口Ｘ −４−＃　）’、デフ　？　−り）を、Ｑ、　０５　ｍｏｂ　／　ｌのリン酸塩 バッファーでｐＨ８に緩衝させた溶液中８０　ｐ９　／ｌｄの濃度でポリ（リシ ン−フェニルアラニン）の溶液の存在下３０分間３　ｒ、ｐ、ｍの回転を用い、 ４℃で一夜培養した。

次いでチューブを２回この同じバッファーで洗う。フォテイヌス　ビラリス（Ｐ ｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａ’ｌｉ日）　（シグマ、セントルイス、ミズリー）か ら抽出したルシフェラーゼの溶液（０、２ｗｌｔ）は４０μｒ／ｗＩｌを含有し 、０．０５ｍｏｌ／Ａのトリスアセテートバッファーに溶解した。、ｉｗ１／− の濃度での免疫グロブリン、６０μｍｏ１／４２のジチオトレイトールを含有し 、３０分４℃で５　ｒ、ｐ、ｍの回転下３０分培養する。チューブを２回酵素不 動化バッファー中で洗う。

分析のため０．５−の反応容量がＰ　７．７５の２５　ｍｍｏ’ｌ／ｊ？トリス アセテートバッファー４００μ２、ジチオスレイトール７５　μｍｏｌ／ｆ、Ｅ ＤＴＡ　１２５　μｍｏｌ　／　ｆｌ、、ＭｙＣｊＸ　！　６．２５　ｍ　ｍｏ ｂ　／Ｊ２およびルシフェリン７．５　Ｘ　１０　’ｍｏｌ／Ａを含有する。

反応を増加する濃度のＡＴＰの溶液１００μ２で開始する。

発光は１〜１００００　Ｘ　１０　”　’　ｍｏｂ　／　ｆＬの範囲の濃度帯域 でＡＴＰの濃度に比例する。

キナーゼ分析の例として、下記反応を触媒するアセテートキナーゼを用いた。

アセチルホスフェート＋ＡＤＰ−＋ＡＴＰ＋アセテートこの酵素は好熱菌（バチ ルス　ステアロテルモフィラス）から抽出でき、特別に安定である。このキナー ゼの生物発光分析の最適条件は次のとおりである：ｐＨ７，７５の２５　ｍｍｏ ｌ／　ｉｔ　）リスアセテートバッファーの４００μｎ、ＥＤＴＡｏ、１２５ｐ ｍｏ１／ｌ、ジチオスレイトール７５μｍｏ’ｌ／ｊ！、ＭｙＣｆｈ　６．２５ 　ｍｍｏｌ／ｉＶ、、ルシフェリン７．５Ｘ１０’ｍｏｌ　／　ｆｌ、アセチル ホス７エー）　１　ｍｍｏｌ／Ｊ！　：反応は１０−６ｍｏｘ　／　ｆＬのＡＤ Ｆ　（１００ｐｎ　）で開始し、作られたＡＴＰの分析はポリスチレンチューブ 上で不動化したＡＴＰ依存ルシフェラーゼで測定する。これらの条件の下、この 方法でキナーゼ１ｏ−Ｈおよび１０−”μｍｏｌという少量を分析できる。

国際調査報告 １＋＋Ｉ四加−１＾帥に−ｊｉ口ＰＣＴ／ＢＥ　８６１０００２０ＩＮＴＥＲＮ ＡＴＩＯＮＡｒ、Ａ？ＦＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＢＥ　８６１００ ０２０　（ＳＡ　１３５２１）

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．合成プラスチツクに基づいた透明支持体を使用し、支持体は、少なくとも１ 種のルシフエラーゼを含有する酵素系の吸着によつて結合させるため、帯電した 親水性物質で予め処理しておくことを特徴とする酵素、基質または酵素阻害剤の 生物発光分析法。
2. ２．親水性物質がポリアルギニンおよびポリヒスチジン単独の如きアミノ酸の重 合体および／またはその共重合体の一つを含有する請求の範囲第１項記載の酵素 、基質または酵素阻害剤の生物発光分析法。
3. ３．親水性物質がポリリシンおよび／またはその共重合体の一つを含有する請求 の範囲第１項記載の酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光分析法。
4. ４．酵素系がＮＡＤＨまたはＮＡＤＨ依存デヒドロゲナーゼの分析のためルシフ エラーゼおよびＮＡＤＨ：ＦＭＮ酸化還元酵素を含有する請求の範囲第１項，第 ２項または第３項記載の酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光分析法。
5. ５．酵素系がＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰＨ依存デヒドロゲナーゼの分析のためＮ ＡＤＰＨ：ＦＭＮ酸化還元酵素を含有する請求の範囲第１項，第２項または第３ 項記載の酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光分析法。
6. ６．酵素系が更に１種以上のデヒドロゲナーゼを含有する請求の範囲第１項〜第 ５項の何れか一つによる酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光分析法。
7. ７．分析すべきデヒドロゲナーゼが別の蛋白質および抗体に結合している請求の 範囲第１項〜第６項の何れか一つによる酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光 分析法。
8. ８．酵素系が基質としてＡＴＰを使用するルシフエラーゼを含有し、ＡＴＰを生 成するキナーゼまたはＡＴＰを分析可能にする請求の範囲第１項，第２項または 第３項記載の酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光分析法。
9. ９．酵素系が更に１種以上のキナーゼを含有する請求の範囲第１項，第２項，第 ３項または第８項記載の酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光分析法。
10. １０．分析すべきキナーゼが別の蛋白質特に抗体に結合している請求の範囲第１ 項，第２項，第３項，第８項または第９項記載の酵素、基質または酵素阻害剤の 生物発光分析法。
11. １１．合成材料を基にし、少なくとも１種のルシフエラーゼを含有する酵素系を 吸着によつて結合する帯電した親水性物質で予め処理した透明支持体。
12. １２．親水性物質がポリアルギニンおよび／またはポリヒスチジンの如きアミノ 酸の重合体および／またはそれらの共重合体の一つを含有する請求の範囲第１１ 項記載の合成材料に基づく透明支持体。
13. １３．親水性物質がポリリシンおよび／またはその共重合体である請求の範囲第 １１項記載の合成プラスチツクに基づく透明支持体。
14. １４．ポリスチレンに基づく請求の範囲第１１項〜第１３項の何れか一つに記載 の透明支持体。
15. １５．基質ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、これらの基質を生成する酵素、即ら デヒドロゲナーゼおよびキナーゼ、これらの酵素の基質および酵素阻害剤を分析 するための請求の範囲第１１項〜第１４項の何れか一つに記載の支持体の用途。