JPS63500659A - 合成ペプチドに基づく抗狂犬病組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成Ｒプチドに基く抗狂犬病組成物および方法技術分野 本発明は狂犬病の予防と診断のためのワクチン、抗血清および仇体に関する。更 に詳細には、本発明は合成ペプチドに基く抗狂犬病ワクチンならびに該ワクチン で免疫することによシ得られる抗血清および抗体に関する。

背景技術 狂犬病は人および犬や家畜を含む他の哺乳動物に感染する病気である。

狂犬病はラブドゝウィルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ　ｆａｍｉｌｙ　）、リ サウイルス属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｕｓ　）の向神経性アルボウィル スに起因する。

このウィルスは仮害省から仇害省へと唾液によυ媒介される。

狂犬病の動物に収まれることによっていったんウィルスが新しい宿主中に入ると 、このウィルスは神経筋接合部に集中し、そ５ｃｉｅｎｃｅ　２１５，１８２− １８４（１９８２）を参照されたい。いったん神経細胞中に入るとこのウィルス は神経に沿って逆方向に移動し、ついにはを髄および脳へと到達する。ウィルス はを髄および脳中で被襄し、そしてそこから放出される。神経細胞から放出され る際にウィルスは唾液腺に達し、そこで豚房細胞に感染し、そして豚房細胞から ウィルスは粗液中へと極めて多数放出される。かくして粗液中に存する高力価の ウィルスは咬むことによって他の動物へと伝染されうる。

最も重要なことは、脳細胞中におけるウィルスの複製が脳細胞を破壊し、脳炎を 生じさせることであり、このために被害者が死に到ることもある。

狂犬病の動物に咬まれた哺乳動物の神経細胞に狂犬病ウィルスが接近するのを遮 断することは、該哺乳動物における病気の進展を阻止するであろう。

一般には動物に咬まれることによって狂犬病ウィルスにさらされた人は現在以下 の３つの方法によって治療され・る。第１に、咬まれた傷を石ケンおよび水で徹 底的に洗う。巣２に、さらされた後なるべく早い時期に、不活化狂犬病ウィルス ワクチンで高度免疫したヒトドナー（供与＠）の血漿から単離したヒト抗狂犬病 ガンマグロブリンを筋肉内注射し、傷の部分およびその周囲の組織に浸透させる 。もしもヒトガンマグロブリンが入手できない場合には、代わりにウマ抗狂犬病 血清が用いられる。

ガンマグロブリンまたは血清製剤は抗狂犬病の受動免疫を与える。なぜなら、こ れらは狂犬病ウィルスに結合する抗体を含んの系を樹立してしまう前に咬まれた 個人の系からウィルスを除去することを容易にするからである。抗血清の抗狂犬 病ガンマグロブリンによって授与される受動免疫は約３週間の牛減期を有する。

第３に、上記の手当に加えて、不活化狂犬病ウィルスを５〜６回筋肉内注射する ことによってヒトにワクチン接種する。最初のワクチン接種は咬まれた後なるべ く早い時期に行い、その他の接種は初回から数えて３日、７日、１４日、２８日 および場合によっては９０日後に行う。最初の接種後７〜１０日頃からワクチン はヒトの狂犬病ウィルスに対する免疫応答を上昇させ、この応答で生産された抗 体が、ウィルスにさらされた個体中でウィルスが樹立される前にウィルスを中和 する作用をする。狂犬病予防に関するＡ　ＣＩ　Ｐ　（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏ ｎ　ＰｒａｃｉｉｃｅｓＡｄｖｉｓｏｒｙ　Ｃｏｍ１ｔｔｅｅ　）勧告、ＭＯｒ ｂｉｄｉｔｙ　ａｎｄ　ＭｏｒｔａｌｉｔｙＷｅｅｋｌｙＲｅｐｏｒｔ　３３． ３９３　（１９８４年７月２０日）（疾病コントロールセンター、アトランタケ ジョーシア州、アメリカ）を参照されたい。

予防的方法として、狂犬病の動物とＭ触したり、狂犬病ウィルスを用いる仕事を したりすることによシ狂犬病ウィルスに感染する危険の大きい人に不活化ウィル スワクチンを用いてウィルスに対する免疫をすることもできる。上記ＡＣＩＰ（ １９８４年７月２０日）参照。

狂犬病をコントロールする方法として、犬、猫、馬等の飼育哺乳動物や家畜に、 不活化または弱毒化ウィルス若しくはウィルスから単離した脱糖タンパク（ｃｏ ａｔ；　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）の注射によるワクチン化によって狂犬病ウ ィルスに対する免疫を行うこともできる。弱毒化ウィルスに基く経口ワクチンも 開発されており、キツネ等の野生動物を狂犬病に対して免疫化する試みに用いら れている。

現在入手できる抗狂犬病ワクチンには多くの危険性がある。

不活化または弱毒化ウィルスを含むワクチンは時々ワクチン投与した者に神経ま たは中枢神経系の病気を生じさせる。更に、不活化したと考えられる多数のウィ ルスワクチン中の全ウィルスが殺さｊする訳ではなく、丑た多くの弱毒化ウィル スワクチン中のいくつかのウィルスは毒性状態に逆もどりするかも知れず、従っ て生きた毒性ウィルスをた゛またま含むワクチン接種をすることによって個々の 哺乳動物に狂犬病が発生するかも知れない。

ペプチド９に基く抗狂犬病ワクチンはこのような危険を有しておらず、現在入手 できるワクチンよシも実質的に安全である。

ウィルスから単離しだ脱糖タンパクに基くワクチンもまた不活化または弱毒化ウ ィルスワクチンに関する危険と同様の危険を多く伴う。々ぜなら脱糖タンパクを 得るには生ウィルスを扱うからである。

抗血清（生ウィルスにさらされた人の病気に対して受動免疫を与えるのに用いら れる抗狂犬病ガンマグロブリンはこれに由来する）は上記したような不活化狂犬 病ウィルスで高度免疫したヒトから得られる。従って、抗狂犬病ガンマグロブリ ンを得ることは少なくとも現在入手しうるワクチンでワクチン接種するのと同等 に危険である。

抗血清を得ることは血を引き抜くことを必要とし、これもまた危険を伴う。更に 、抗血清からの分画を投与することは輸血に関連する多くの危険も伴う。

抗狂犬病ガンマグロブリンを得たシこれを使用することに伴う危険は、抗体を産 生ずるハイプリド−マを培養することによって大量にかつ実質的に純粋な形の抗 体（この抗体は狂犬病生ウィルスにさらされた個体中における狂犬病の樹立を阻 止するのに有効である）を産生させることによって避は得る。もしもバイブリド ゛−マの産生を合成ペプチドに基く抗狂犬病ワクチンを用いる哺乳動物の免疫化 、或は哺乳動物リンパ球の免疫化によって行う場合には、これらの危険は更に減 少するであろう。

即ちこの方法は上述したように、不活化または弱電化ウィルス或は培養ウィルス から得られるレンツξり質に基くワクチンよシもはるかに危険が少ないのである 。

ハプテン性合成イプチドを免役原性キャリア分子と接合させ、これが哺乳動物の 免疫系を誘導してハブテンにプチドに対する抗体を産生させるような合成ワクチ ンが知られている。このようなワクチン中のハプテン破プチドは、該ワクチンで 防制しようとする毒物または感染剤上に位置する抗原決定基の配列と同一である か或いは極めて類似した配列を含むアミノ酸配列を有している。このような合成 ワクチンで免疫化しだ哺乳動物の体内で生じる抗体のうちのいくつかは、毒物ま たは感染剤の表面上に位置する対応の抗原決定基に結合することが見い出されて いる。従って、このようなワクでンは該ワクチンが目的とする毒物または感染剤 による中毒または感染に対する免疫防御を提供する。かかるワクチンを開発する だめに重要な点は、毒物または感染剤上に位置する一連のアミノ酸配列を有する 抗原決定基を同定することである。即ち、抗原決定基は、該決定基が存在するタ ンパク質の一次構造中の連続した断片（ｕｎｉｎｔｅｒｕｐｔｅｄｆｒａｇｍｅ ｎｔ　）である。

一般に、一種類のウィルスには多数の株が天然に存在する。

各種の株は抗原変異、即ちその抗原決定基の１またはそれ以上のアミノ酸配列が 互いに異なるかも知れない。かくして、ある株によって誘導される抗体は他の株 に存在する抗原決定基とは反応しないので、ある種のウィルスのちる株は、ワク チン化した個体中において同じウィルスの他の株に対して免疫を与えないかも知 れない。このような個体はワクチン接種を受けたにもかかわらずそのウィルスに よって引き起こされる病気になお感染しやすいであろう。この免疫変異の問題は 実際に、現在入手しうる抗狂犬病ワクチンも遭遇してきた。従って、合成ワクチ ンでは、ウィルスの株によって配列が変化しえないような標的ウィルスの抗原決 定基の配列と同一または極めて類似したアミノ酸配列を含むものを合成Ｒプチド として用いることが有利である。このような決定基とは、ウィルスの繁殖にとっ て本質的な決定基であり、かつその配列が変化した場合には繁殖においてその本 質的役割が果たせなくなってしまうような決定基である。このような決定基の配 列はウィルスの全ての株においてよく保存されるであろう。従って、このような 配列を石する合成ペプチドを含むワクチンは抗原変異に限定されることなく、ま た該ワクチンが防御しようとするウィルスの全ての株に対して有効に防御するで あろう。もちろん、このようなワクチンを作るには各種の株においてよく保存さ れる配列を有するウィルス上の抗原決定基を同定することが必要である。

レンツらの上記文献は狂犬病ウィルス粒子が培養筋肉細胞に固着すること、およ びウィルスの分布はアセチルコリン受容体の分布と一致することを示している。

さらに、レンツらは狂犬病ウィルスは神経筋接合部でアセチルコリン受容体（Ａ ＣｈＲ）に結合することによって神経筋接合部に蓄積することを示唆するデータ を発表している。レンツらによって報告された知見によれば、神経筋接合部にお ける狂犬病ウィルスの結合は、この接合部を含む組織をクラーレ様のヘビ毒神経 毒であるα−ブンガロトキシン（ＡＣｈＲのアセチルコリン（Ａｃｉｄ）結合部 位に強く結合することが知られているつと共にあらかじめインキニ−ジョンする ことによって阻害される。

狂犬病ウィルス粒子は弾丸形である。その−重鎖（−）　ＲＮ　Ａゲノムはタン パク質のカバーで包まれており、このタンパク質のカバーからは狂犬病ウィルス 膜タンパク質ンパク・ξり）の分子である多数の”スパイク（５ｐｉｋｓ　）” が突出している。この糖タンパクはウィルスの免疫原性の原因となるものである 。従って、ウィルスの抗原決定基はＧタンパク上にある。

全ての狂犬病ウィルスの各種の株を用いてモノクローナル抗体が製造されている 。フラツフ）″（Ｆｌａｍａｎｄ　）らのＪ、Ｇθｎ。

■工凶、、４８，１０５（１９８０）を参照。

脱糖タン・ぐりに対する抗体は感架性ウィルスを中和すること７）ＥＴきる。デ ィエラ’／　ＥＩ　Ａ／　）’　（ＤｉｅｔＺ８ＣｈＯ１ｃｌ）らのＤｅｖ、　 Ｂコ、ｏｌ。

ジ田匣、４０．４５（１９７８）を参照。

狂犬病ウィルスの２種類の株から得た脱糖タンノξりの配列が知られている。ア ニリオニス（Ａｎｉｌｉｏｎｉｓ）　ラノＮａｔｕｒｅ　２９４゜２７５−２７ ８（１９８１）；イエルバー）　ン（Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ　）らの５ｃｉｅｎｃ ｅ　２１９．　６１４−６２０　（１，９８３）を参照。

感染細胞の外側のこれらの糖タンパクは膜では成熟形であ）、５０５個のアミノ 酸からなる配列を有している。この配列は約９０％が相同である。

神経筋接合部においてＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位に高い親和性で結合するα−ブ ンガロトキシンと類似のクラーレ様ヘビ毒神経毒が多数知られている。これらの 神経毒の６０以上の配列が公知である。これらの神経毒についてその三次元構造 決定、化学的修飾および各配列の比較等を含む研究を行うことによシ、ＡＣｈの 構造に類似する構造であってかつＡＧｈＲの活性部位、即ちＡＣｈ結合部位に神 経毒が結合する際に含唸れると考えられる構造を形成しそして安定化するのに寄 与する４種類の高度に保存されたアミノ酸を同定することができた。カールソン に記載の一連の神経挿配列に基〈アミノ酸番号付は法に従うと、これらの４つの アミノ酸残基は２９位のトリプトファン、３１位のアスパラギン酸、３７位のア ルギニンおよび３８位のグリシンである。２９位のトリプトファンは、３１位− アスパラギン酸のカルボキシル基と３７位−アルギニンのグアニジウム基との間 に形成されるイオン対を安定化すると考えられる。立体化学的に模疑アセチルコ リンと考えられるのはこのイオン対である〔チェルノグロウ（Ｔｓｅｒｎｏｇｌ ｏｕ　）ら、Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

１４．７１０（１９７８））。２９位−トリプトファン残基の修飾は約５０チの 毒性低下をもたらしたにすき゛ない〔リデン（Ｒｙｄｅｎ　）ら、Ｉｎｔ’　１ ．　Ｊｏｕｒ、　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　５　。

２６１−２７３（１９７３））。

発明の要約 我々は狂犬病ウィルス膜タンパク質ンパク、クラーレ様ヘビ毒神経青の断片の保 存配列に相同な配列を有していることを発見した。この神経毒は神経筋接合部に おいてＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位にそれを介して毒物が結合すると考えられてい る断片を含んでいる。

我々の発見を表Ｉに示す。表Ｉはその配列が公知である２種の狂犬病ウィルス膜 タンパク質ンパクる断片からの配列を、ＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位において青紫 がそれを介して結合すると考えられる数種のクラーレ椋ヘビ毒神経毒の断片の配 列と比較したものである。膜タンパク質配列の１９０位−アスパラギン酸、１９ ６位−アルギニンおよび１９７位−グリシンは谷々毒素配列中の３１位−アスパ ラギン酸、３７位−アルギニンおよび３８位−グリシン（カールソンの番号付は 法に従った）に対応する。２種の膜タンパク質の記載断片の配列に見られる高度 の相同性もまた表■から明らかである。

＊　表示配列のＮ末端残基の成熟タンパク中における位置を配列の前のカッコに 示した。

１、アニリオニスら、Ｎａｔｕｒｅ２９’４．　２７５（１，９８１）２、イエ ルバートンら、５ｃｉｅｎｃｅ　２１９．６１４　（１９８３）３、カールソン 、Ｈａｎｄｂ、　Ｅｘ　、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５２．１５９（１９７９）神 経参のＡＣｈＲ結合断片に相同な脱糖タンパクの断片はＡＣｈＲに対する狂犬病 ウィルスの結合中にも含まれていることを我々の発見は示唆した。この示唆は、 ウィルス糖タン・ξりのこの断片の三次元モデルがＡ　Ｃｂ、　ＲのＡＣｈ結合 部位の三次元モデルとよく適合するという我々の発見によって更に強められた。

更にとの示唆は、糖タンパクのこの断片が抗体にさらされ抗体に近付きやすいも のであシ、従って狂犬病ウィルスの抗原決定基であることも意味する。更に、狂 犬病の病因におけるＡＣｈＲ結合の本質的と思える役割の故に、この断片は狂犬 病ウィルスの各種の株において高度に保存されると思われる。従って、クラーレ 様ヘビ毎神経電のＡ、ＣｈＲ結合断片の配列に相同な膜タンパク上の断片の配列 に極めて類似した配列を有する合成ペプチドは、実質的に全ての株のウィルスに よって起こる狂犬病に対する合成ワクチンを製造するのに用いうろことを我々の 発見は意味した。

実際、ＣＤＩＦＴＮＳＢ、Ｇに極めて類似する配列を含む配列を有している合成 ペプチドを適当な免疫原性キャリアタンパクに結合させてかかる結合体の一部と して哺乳動物に接種した場合には、該哺乳動物を狂犬病生ウィルスでキヤレンジ （抗原投与）しても狂犬病がら哺乳動物を防御することを発見した。

かくして我々は合成杭狂犬病ワクチンの基脆となる合成Ｒプチドを発見した。

本発明の合成Ｒプチドは新規抗狂犬病抗血清および抗狂犬病抗体（４！Ｊクロー ナルおよびモノクローナル）を製造するだめの基礎をも提供する。このような抗 血清および抗体は狂犬病の診断と予防に有用である。

発明の詳細な説明 我々は神経筋接合部において神経末端にウィルスが取シ込まれる前にＡＣｈＲに 狂犬病ウィルスが結合するための分子学的基にを発見した。とｐわけ、ウィルス はその脱糖タンノξりの断片を通してＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位に結合するとい うことを発見した。この脱糖タンパクはある種のクラーレ様ヘビ毒神経毒（これ もまたＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位に結合する）の断片の保存配列と相同な配列を 有している。

この発見は狂犬病ウィルス脱糖タンパクのこの断片とＡ、ＣｈＲのＡＣｈ結合部 位との三次元モデルが極めて類似しているという我々の発見により支持される。

なおＡＣｈ結合部位については、ルイテ７　（Ｌｕｙｔｅｎ）、　Ｗ、　Ｈ，Ｍ 、　Ｌ、　、ケラリス（Ｋｅｌｌａｒｉｓ）。

Ｋ、、カイト（Ｋｙｔｅ）、　Ｊ、、　ノ１イネ？　ｙ　（Ｈｅｉｎｅｍａｎ） 、　Ｓ、およびパトリック（Ｐａｔｒｉｃｋ）、　Ｊ、のＡＣｈＲのＡＣｈ結合 部位のだめのモデル’　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ。

１’に２２１．１０（１９８４）を参照されたい。

上述した通シ、狂犬病ウィルスの病因における本質的段階は神経筋接合部にウィ ルスが蓄積することであり、これがＡＣｈＲに結合することにより媒介される。

ウィルスの繁殖におけるＡＣｈＲ結合の中心的役割と一致して、結合に寄与する 脱糖タン・モクの断片はその脱糖タンツク配列が既知であるウィルスの２種の株 において高度に保持されている。表Ｉを参照のこと。

表中の２種の既知狂犬病ウィルス脱糖タンパク配列間の相同性から、クラーレ様 ヘビ毎神経禅の保存ＡＣｈＲ結合断片との比較とモデル化を行うことによって以 下の配列：ＣＤＩＦＴＮＳＲＧ がＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位に緊密に適合する狂犬病ウィルス脱糖タンパク断片 の配列であることが明らかである。更に、この配列の中でり、　Ｒ，Ｇそしてお そらくはＣが本質的なものであると思われる。■をＧまたはアルキル側鎖を有す るアミノ酸で置換した場合、ＦをＷで置換した場合、ＴをＣまたはＳで置換した 場合、Ｎを３．Ｔ、ＡまたはＧで置換した場合およびＳをＴ、Ｇまたはアルキル 側鎖を有するアミノ酸で置換した場合にも断片はＡＣｈ結合部位で稔タンパクお よびウィルスに結合する機能を有するであろう。

ウィルスがそれを介してＡＣｈ結合部位に結合する狂犬病ウィルス膜タンパクの 断片はウィルス表面から突出して結合部位に接触するに違いないという事実から 、この断片またはその部分が狂犬病ウィルスの抗原決定基である可能性が強い。

事実、我々は以下の配列： ＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧ　（ただし、Ａ６はＮまたはＴである）を含む合成ペプチ ドをある哺乳動物において免疫原性であるキャリアタンノξりと接合させてかか る接合体の一部として該哺乳動物に接種する場合には、狂犬病ウィルスを中和す る抗体を含む抗血清を哺乳動物中に産生させることにより狂犬病生ウィルスによ るチャレンジから哺乳動物を防御するであろう。かくして、我々は合成にプチド に基く新規な種類の抗狂犬病ワクチンを発見した。

更に我々は新規抗狂犬病抗血清、抗体およびかかる抗体を分泌する新規ハイプリ ド−マを発見した。これらはいずれも本発明の新規ワクチン、該ワクチンの本質 的免疫原性成分である本発明の合成タンパク質または該合成タンパク質の本質的 成分である本発明の合成シプチドを用いて当業者により容易に製造される。

更に我々の発見は本発明のワクチン、抗血清および抗体で哺乳動物を狂犬病に対 して免疫する方法ならびに本発明の抗血清、抗体およびハイプリド−マ培養物を 産する方法を提供する。

我々の発見は捷た本発明の合成ペプチドおよび合成タンパク質を用いて狂犬病ワ クチンを投与しだ哺乳動物の血清中の抗狂犬病抗体の存在を検定する方法をも提 供する。

また更に、本発明によりｗ造される抗血清および抗体は狂犬病であると疑われる 或は狂犬病動物等に咬まれて狂犬病ウィルスにさらされることにより狂犬病にか かる危険性があると疑われる哺乳動物からの組織または唾液中の狂犬病ウィルス の存在を検査する方法も提供する。

本明細書中で使用するアミノ酸の簡略形を以下の表Ｈに示す。

表　■ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グリシン　Ｇ１７　Ｇ ヒスチジン　Ｈｌｓ　Ｈ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ トレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ 本明細書に記載する光学活性な全てのアミノ酸はＬ−配位である。

Ｒプチドの配列はＮ末端アミノ酸で始まシ、左から右へと読むように記載される 。

狂犬病ウィルス“膜タンパク”、狂犬病ウィルス“糖タンツク″、狂犬病ウィル ス６膜糖タンパク”および狂犬病ウィルス゛Ｇタン・ぐり”はいずれも本明細書 では”成熟形”で約５０５アミノ酸の抗原糖タンパク（包囲する狂犬病ウィルス の表面スパイクを形成する）を表すために用いられる。

本明細書ではＡＣｈ”は６アセチルコリン”を意味し、”ＡＣｈＲ”は゛アセチ ルコリン受答体”を意味する。

“哺乳動物”の語はヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む。

本明細書では狂犬病ウィルスに感染した唾液腺の豚房細胞から分泌される唾液中 に狂犬病ウィルスを有している場合に、ある哺乳動物は゛狂犬病にかかっている （　ｒａｂｉｄ、）”と記載する。

また、′狂犬病ウィルスにさらされた（　ｅｘｐｏｓｅｄ　）”哺乳動物とは、 狂犬病にかかる高い危険性がある状態でウィルスと接触したことがある哺乳動物 を意味する。最も一般的なのは狂犬病の動物に咬まれることである。他の原因と しては、掻き傷、擦過傷、開放側または狂犬病の動物の唾液のついた粘膜や他の 感染性物質（例えば脳組織）或はその他の生ウイルス源（例えば実験室培養物） が含まれる。上記ＡＣＩＰ（１９８４）等を参照されたい。

本明細書では６抗狂犬病ワクチン”および”狂犬病に対する哺乳動物のワクチン 接種用組成物”という語は同じように用いられる。

一面において、本発明は配列ＣＤＩＦＴＡ６ＳＥＬＧ（ここでＡ６はＮまたはＴ である）を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドを包含し、該ペプチドは哺乳 動物において免疫原性であるキャリアタンパクと接合させると狂犬病ウィルスに 対する免疫応答を該哺乳動物中に生じさせることができる。

上述したようにウィルスの抗原決定基に断片の全てまたは一部が似ていることに 基いて、配列ＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧを含む合成〈プチドの断片が狂犬病ウィルス に対する免疫応答を誘導することができるためには、該断片をキャリアタンパク と接合させたときに融通性のあることが不可欠であることが当業者には理解でき るであろう。従って、ＣＤＩＦＴＡ　６ＳＲＧ断片の融通性を確保するために、 合成ＲプチドはＹのような末酸アミノ酸を有すことが好ましいであろう。この末 端アミノ酸はそうでない場合にはＲプチド配列中にはないものであシ、これを介 してペプチドはキャリアタンパクと接合できる。

本発明の好適な抗狂犬病ウィルス抗原合成にプチドは（イ）、Ａ−□ｃＤＩＦＴ Ａ６ＳＲｃｙＫＲＡＳＡ１４Ｃ（Ｙ）ｊ（ただし、ｊおよびｊのいずれか一方は ０であシ他方は工であシ；Ａ−□はＳまたはＰであシ、Ａ６はＮまたはＴであり 、そしてＡ１４　はＮまたはＫである）の配列を有する。このにプチドのうち最 も好ましいのは５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹの配列ｅ有ｆるものＴ６る 。

上述した如く本発明はまた本発明の抗体を産生ずる融合細胞を含むハイプリド− マ培養物のスフリーリングおよび狂犬病に対するワクチン接種をしだ哺乳動物の 血清中の抗狂犬病抗体の存在の試験にそれ自体を用いうるある種の他のペプチド をも包含する。これらのペプチドにはＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧおよびＣ□ＣＤＩＦ ＴＡ６ＳＲＧＫＲＡＳＡ□４Ｇ（ただＬＡ　、　はＳｔ＆はＰであり、Ａ６はＮ またはＴであシ、そしてＡ□４はＮまたはＫである）の配列を有するものが含ま れる。

本発明のはプチドはまたキャリアタンパクに接合させずに直接哺乳動物にｉｎ　 ｖｉｖｏで接種することも、また本発明のハイブリド−マを製造するためのＢ細 胞の作製のためにｉｎ　ｖｉｔｒｏで哺乳動物のＢ細胞に接種することにも使用 できる。

更に本発明の範囲に含まれると思料されるのは本発明のＲプチド配列を有する放 射能標識にプチドであシ、それらには１または複数のチロシンを１２５■で標識 したもの、１または複数の炭素を１４Ｇで置換したもの、ｌまたは複数の水素を ３Ｈで置換したものおよび１または複数のＳを３５８で置換したものが含まれる 。放射能標識ペプチドは本発明の合成ペプチドの精製、本発明のハイプリドーマ のスクリーニングおよび哺乳動物血清中の抗狂犬病抗体の存在の診断に有用であ る。

他面において本発明は、本発明の合成杭狂犬病抗原ペプチドと哺乳動物に免疫原 性であるキャリアタンパクとが接合してなる合成タンパク質を包含し、該合成タ ン・ξり質は該哺乳動物に狂犬病に対する免疫応答を起こすことができる。

多くの好適なキャリアタン−ξりが免疫界で知られておシ、そのいずれもが本発 明の合成タンパク質の一部分として使用しうる。キャリアタン−ぐりとしては、 卵アルブミン、全ての哺乳動物の種から得た血清アルブミン、β−ラクトグロブ リンのようなグロブリン類、ヘモグロビンまたはそのサブユニットやミオグロビ ンやヘモシアニン等のような酸素運搬タンパクおよび小さなハプテン分子のだめ の免疫原性キャリアとして使用されたことのある各種合成ポリにプチド等が挙け られる。キャリアタンパクで免疫しだ哺乳動物におけるその機能は恐らくはＴ− ヘルパー細胞の活性化によって哺乳動物の免疫系を刺激し、キャリアに接合した 合成Ｒプチドに対する抗体を含む抗体を産生させることにある。この点からする と、ある種の哺乳動物には異なる種の哺乳動物からのキャリアタンパクを使用す ることが好ましい。本発明の合成タンパク質に使用する好適なキャリアタン／ξ りはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、）およびキーボールリンペットヘモシアニン （ＫＬＨ）である。合成タン・ξり質で免疫する種がＢｏｓ属のものである場合 には、好ましいキャリアタンノξりはＫＬＨである。

合成にプチドハプテンを免疫原性キャリアタンパクに接合させる全ての方法が本 発明の合成タンパク質を製造するために使用できる。しかしながら、キャリアタ ンパクに接合させる合成にプチド中の少なくともＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧ配列の完 全性と融通性を確保することに関する上記した理由のために、接合は合成にプチ ドの一方の末端に位置するチロシン残基を介してなされることが好ましい。この 接合を行うための好適な方法はビスジアゾ化ベンジジン（ＢＤＢ）を用いるもの である。

本発明の好適な合成タン・ξり質は合成ペプチドが以下のアミノ酸配列： （！Ｉ’）、Ａ−□ＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧＫＦＩＡＳＡ□４Ｇ（Ｙ）ｊ（ただし 、１およびｊのいずれか一方は０でｉ、他方は１であシ；Ａ−□はＳまたはＰで あシ、Ａ６はＮまたはＴであシ、そしてＡ□４はＮまたばＫである）を有してお り、そして該合成ＲプチドはＢＤＢの付いたチロシン残基を介してＢＳＡまだは ＫＬＨに接合される。これらの合成タンパクのうちで最も好ましいものは、合成 ペプチドのアミノ酸配列が５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ　であるもので ある。ただ１７、合成タンパクがＢｏｓ属の哺乳動物を免疫するのに用いられる 場合には好ましいキャリアタンパクはＫＬＨであるだろう。

本発明の合成タンパク質は、該合成タンパク質がワクチン接種した哺乳動物に狂 犬病ウィルスに対する免疫応答を引き起こすような本発明ワクチンの本質的有効 成分である。従って、また他面においては、本発明は本発明の合成タンパク質を 含む狂犬病に対して哺乳動物を免疫するだめのワクチンを包含する。

狂犬病に対して哺乳動物を免疫するための本発明の組成物は一般にワクチン界の 当業者に既知の他の成分を含む。これらの成分には希釈剤およびワクチン接種す る哺乳動物のだめの薬学的に許容されるアジュバントが含まれる。アジュバント は哺乳動物の免疫系を刺激してキャリアタンパクに接合したハプテン性合成ペプ チドに対する有効な免疫応答を上昇させる。生理学的に許容される希釈剤の例と してはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）のような生理学的食塩水が挙げられる。許 容されるアジュバントは例えば完全７０インドアジユバント、不完全フロイント アジコバント、酸化アルミニウム、ミョウバン等である。

本発明の好適なワクチンは合成タンパク質が本発明の好適な合成タンパク質であ るワクチンである。従って、哺乳動物に狂犬病のワクチン接種をするための最も 好適な組成物においては、合成タンパク質はその合成ペプチドが５ＣＤＩＦＴＴ ＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹのアミノ酸配列を有しているものでちり、キャリアタンノ ξりはＢＳＡまたはＫＬＨであシ、そして合成にプチドはＢＤＢ架橋の付いたチ ロシン残基を介してキャリアタンパクに接合する。

合成タンパク質と同様、ワクチン投与する哺乳動物がＢｏｓ属のものである場合 には最も好適なワクチンは免疫原性キャリアタンパクとしてＫＬＨを使用する。

本発明のワクチンは哺乳動物が狂犬病ウィルスにさらされる前にこれを免疫する ことによって予防的に使用されうる。本発明のワクチンはまた哺乳動物がウィル スにさらされた後これを治療するのにも使用されうる。このワクチンは接種した 哺乳動物中に活発な抗狂犬病免疫応答を誘導し、それによって哺乳動物が狂犬病 ウィルス誘導脳炎となったシ狂犬病となる危険を減少させる。

本発明はまた免疫原性量の本発明ワクチンを哺乳動物に投与することからなる狂 犬病に対して哺乳動物を免疫する方法も企図する。免疫処理はワクチンを１回投 与することでなしうる。

しかしながら、よシ一般的には、複数回の、一般には少なくとも２回の投与を行 う。各投与量は免疫原性量のワクチンを含む。

ヒトの予防的（ウィルスにさらされる前の）免疫においては、一般に０．　７お よび２８日目に筋肉内注射にょ９３回の投与を行う。狂犬病ウィルスにさらされ る危険性が高い人には、第１回の免疫後約６ケ月〜２年の間隔で血清を試験し、 もし抗狂犬病抗体価が低い場合にはブースター投与（追加抗原投与）を行う。ウ ィルスにさらされる前に免疫投与した人にとっては、さらされた後の免疫が必要 でアシ、抗狂犬病抗体の投与が好ましい。

狂犬病ウィルスにさらされた哺乳動物の治療における免疫方法は、一般には約３ 〜８回の連続投与を始めは１ケ月の間隔で、そしてその後は間隔を長くしながら 実施し、この最初の連続投与の２〜４ケ月に追加投与を行う。投与量の目やすは 哺乳動物の系に入った狂犬病ウィルスに対して強い活発な免疫攻撃をすることで ある。哺乳動物の種および特定の哺乳動物中における特定の年令、体重および医 学状態における適切な投与量の決定はワクチン界の当業者に理解されるであろう 。ヒトにおけるウィルスにさらされた後の投与量は背景技術の項で既に述べた。

哺乳動物に本発明の抗狂犬病ワクチンを投与する過程で当業界で公知の各種免疫 検定法によシ抗狂犬病ウィルス抗体の存在を見るために哺乳動物の血清を試験す ることができる。本発明の合成ペプチドおよび合成タンパク質はある種のこれら の方法に有用でちる。かかる抗体の存在はウィルスに対する活発な免疫応答が哺 乳動物によシなされたことを示し、抗体価が十分高い場合にはワクチンの追加投 与は一定の場合県しられる。上記Ａ、ＣＩＰ（１９８４年７月２０日）参照。

本発明ワクチンの哺乳動物への投与は該哺乳動物中に抗狂犬病免疫応答を生じさ せる。この免疫応答は抗狂犬病抗体の産生を伴う。従って、狂犬病ウィルスに対 する免疫応答が上昇したワクチン投与哺乳動物の血清には抗狂犬病抗体が含まれ るであろう。従って本発明は他面において、免疫原性量の本発明ワクチンを哺乳 動物に接種することからなる方法によって産生される抗力清である。

本発明の好適な抗狂犬病抗血清は本発明の好適なワクチンを用いて製造されるも のである。上記した如く、抗血清そのものまたは該抗血清から単離された抗体分 画はウィルスにさらされた哺乳動物における狂犬病ウィルスに対する一時的な受 動免疫を授けるのに有用であり、従って哺乳動物中に狂犬病が進行するのを防ぐ のに有用である。かかる治療に直接使用するかまたは抗体産生に使用するための 最も好適な抗血清は治療すべき哺乳動物と同種の哺乳動物から得られる抗血清で ある。

本発明の抗狂犬病抗血清から抗狂犬病抗体を単離するにはタンパク化学および免 疫学界で公知の各種精製法を用いうる。一般には、高性能液体クロマトグラフィ ーのようなりロフトグラフィー法を含むであろう。

精製には、本発明ワクチンで高度免疫した哺乳動物の血漿から得られるγ−グロ ブリン分画の冷エタノール沈殿を含み、この方法は不活化狂犬病ウィルスで高度 免疫したヒト志願者から抗狂犬病ｒ−グロブリンを単離するために現在使用され ている。

上記ＡＣＩＰ（１９８４年７月２０日）参照。

本発明の抗狂犬病抗体は本発明の合成にプチドまたは本発明の合成タンパク質上 のエピトープに結合することができ、且つ狂犬病ウィルスまたは狂犬病ウィルス 膜タンパクに結合することができる抗体である。これらの結合能を検定する方法 を以下に記載する。

本発明の上記抗体の１または複数を含み、且つ一般にはＰＢＳのような薬学的に 許容される希釈剤をも含む組成物は、本発明の抗狂犬病抗血清から単離された免 疫グロブリン分画と本質的には同じ方法で狂犬病ウィルスにさらされた哺乳動物 を治療するために用いうる。

１または複数の本発明の抗体を含み、他の抗体および本発明の抗狂犬病抗血清の 他の構成成分を実質的に含まない組成物は、全血清またはこれから単離された免 疫グロブリン分画よシも生ウィルスにさらされだ哺乳動物の治療には好適である 。これは精製抗体を使用した方法が全血清またはその免疫グロブリン分画を使用 するよシも副作用の危険が実質的に少ないことによる。

本発明の抗狂犬病抗血清は精製抗狂犬病抗体を含有する本発明の組成物と同様に 、動物が狂犬病であるか否かを決定するだめのまたは、狂犬病にさらされた疑い のある哺乳動物が実際にさらされたか否かを決定するための各種免疫検定法によ る診断にも用いうる。動物が狂犬病であるか否かを決定するには、該動物の唾液 を用いこれらの免疫学的方法のいずれかによって狂犬病ウィルスの存否を試験す る。哺乳動物がウィルスにさらされたか否かを決定するには、さらされた部位の 体液または組織試料を用いて狂犬病ウィルスの存否を免疫学的に試験する。

本発明のワクチンを接種し、そしてその結果として狂犬病ウィルスに対する免疫 応答が上昇した哺乳動物は本発明の抗狂犬病抗体を分泌するＢ細胞を有するであ ろう。

上記したように、キャリアタンパクに接合しない本発明の合成ペプチドを接種し た哺乳動物もまた本発明の抗狂犬病抗体を分泌するＢ細胞を有するであろう。更 に、このようなり細胞は、哺乳動物から単離し、次いでＮ−アセチルムラミル− Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンのようなアジュバントペプチドの存在下に本 発明の合成タン・ξり質または合成ペプチドによ・ってｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫 したＢ細胞懸濁液から単離することができる。

従って、本発明の更に別の一面は　（１）本発明の抗体を分泌するＢ細胞を有す るハイズリド−マを作製することからなる方法によって産生され且つ　（１１） 本発明の抗体を分泌するハイブリッド細胞を含むハイブリド−マ培養物である。

ハイズリドーマ作製のために当業者で公知の方法はいずれも使用しうる。本発明 の好適なハイズリドーマ培養物は、Ａ−□ＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧＫＲＡＳＡ□４ Ｇ（ただしＡ−□　はＳまたはＰであシ、Ａ６はＮまたはＴであシ、そしてＡ１ ４はＮ−ｉたはＫである）の配列を有するペプチド上のエピトープに結合しうる 本発明の抗体を分泌するものである。

最も好適なのは、ＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧ　（ただし、Ａ６はＮまたはＴである） の配列を有するペプチドに結合しうる本発明の抗体を分泌するバイブリド８−マ 培養物でちる。

本発明のモノクローナル抗体産生ハイプリド−マ培養物から産生されるモノクロ ーナル抗体は本発明の抗血清から物理化学的手法で単離される本発明の抗体と同 様に、上記の狂犬病ウィルスにさらされだ哺乳動物の治療および診断に％に有利 に利用される。

本発明のにプチドは合成、即ち天然に存在しないものである。

これらは完全固相法、部分同相法、断片縮合または古典的溶液付加等の適当な方 法によシ合成される。

このにプチドは組換えＤＮＡ法でも合成できる。

本発明の好適なペプチドは約２５よりも少ないアミノ酸を有し、好ましくは化学 的に、即ち組換えＤＮＡ法に基く微生物学的方法によらずに製造される。

しかしながら、組換えＤＮＡ法に基く微生物学的製造は本発明のより大きなにプ チド、特に約４０以上のアミノ酸を有するペプチドの製造には有利に使用される 。大腸菌や枯草菌のような細菌、Ｓ・セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉ日ｉａｅ　）の ような酵母および哺乳動物細胞中で合成ペプチドを生産する組換えＤＮＡ手法お よび４プチビ生産のために形質転換された上記微生物から目的とするペプチドを 単離する方法はよく知られている。例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ、第６８，１００，１０１巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）を参 照されたい。

本発明のペプチドを化学的に製造する場合には、当業者に公知の各種の手動およ び自動法により製造できる。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌａ）、Ｊ、　 Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５．２１４９（１９６４）に記載の固相法によ）合 成しうるが、他の当業者に公知の同等ング（Ｙｏｕｎｇ）　ノ”固相ペプチド合 成”、Ｗ、Ｈ，ＦｒｅｅｍａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、サンフ ランシスコツカリフォルニア（１９６９）を参照されたい。合成は手動によシ実 施できる。

別法として、所望配列のペプチドを合成すべくプログラムされたペックマン９９ ０自動合成機（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、パロアルト、カリ フォルニア、アメリカ）のような自動ペプチド合成機によシ合成しうる。

固相合成はリビｘル（Ｒｉｖｉｅｒ）、米国特許第４，２４４，９４６号明細書 （参照することにより本明細書に含まれる）に一般的に記載されるように、適当 な樹脂に保護アミノ酸をカップリングさせることによシＲゾチドのＣ−末端から 合成する。例えばカルボキシ末端アミノ酸がチロシンである場合、ポリスチレン 樹脂にカップリングする前にそのアミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯ Ｃ）で保護し、フェノール性水酸基を２，６−ジクロルベンジル（ＤＣＢ）また はｐ−ブロムインジルオキシカルボニル（４−Ｂｒ−Ｚ）で保護することができ る。

合成用の好適な樹脂はバイオラドラボラドリース社（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）、リッチモンド、カリフォルニア、アメリカ等 から入手できるクロルメチル化ポリスチレン樹脂である。

保護したカルボキシ−末端アミノ酸を樹脂にカップリングさせるには、ホリキ（ Ｈｏｒｉｋｉ）ら、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　ｌ　５５−１６８ （１９７８）　に記載の方法に従って、約６０℃の温度で２４時間攪拌しなから ジメチルホルムアミド”（ＤＭＦ）中のフン化カリウムを用いて行う。カルボキ シ−末端残基を樹脂支持体にカップリングした後、塩化メチレン中のトリフルオ ル酢酸（ＴＦＡ）、ＴＦＡ単独またはジオキサン中のＨＣ，ｌ　を用いてα−ア ミノ保護基を除去する。好ましくは塩化メチ９７９５０重量％のＴＦＡをＯ〜５ 重量重量１，２−エタンジチオールと共に用いる。脱保護は約０℃から室温（２ ０〜３０℃）の間の温度で行う。シュロダー（５ｃｈｒｏｄθｒ）およびリュプ ケ文（Ｌｕ、ｂｋｅ　）がｅ′ハプチド、第１巻、　７２−７５　（Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１９６５）に記載するように、特定のα−アミン保護基の除去には他の標準的開 裂剤および条件も使用できる。

支持体に結合したカルボキシ−末端アミノ酸のα−アミノ保護基を除去した後、 α−アミン基および反応性側鎖官能基の全てを保護した次のアミノ酸をカルボキ シ−末端アミノ酸のアミノ基にカップリングさせ、カップリング完了後にそのα −アミノ保護基を除去する。最終合成ペプチドの所望配列に示されるカルボキシ −末端からアミノ−末端への順序に従って、残る保護アミノ酸を用いて上記カッ プリング−α−アミン保護基除去の工程を行い、中間体ペプチドを得る。この中 間体ペプチドは上記したように、アミノ酸の側鎖にある反応性官能基が保護され ている点を除いて本発明の所望合成はプチドと同じ配列を有しておシ、このペプ チドは樹脂に結合している。

各アミノ酸を別個に付加していくかわシに、所望ペプチドの樹脂に結合したカル ボキシ側末端に付加する前にいくつかのアミノ酸を互いにカップリングしておく こともできる。

各アミノ酸またはイプチド断片は約４倍過剰で固相反応器に導入し、カップリン グはＤＭＦ：ＣＨ２Ｃｌ２（容量比１：１）、ＤＭＦ単独またはＣＨ２Ｃｌ２単 独の溶剤中で実施する。カップリングは好壕しくけ同相結合断片にカップリング すべきアミノ酸またはにプチト゛断片と同じモル濃度のジシクロへキシルカルボ ジイミド（ＤＣＣ）をカップリング試薬として用いて行う。カップリングを手動 法で実施する場合には、合成の各段階におけるカップリング反応の完了は、カイ ザー（Ｋａｉｓｅｒ）ら、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３４．　５９５　（１９７０）が記載するようにニンヒドリ ン反応によって監視する。不完全なカップリングが起きた場合には、次のアミノ 酸のカップリングに先立ちα−アミン保護基を除去する前にカップリング工程を 繰り返す。カップリング反応は例えばリビエルらがＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　１ ７．１９２７−１９３８（１９７８）に報告するプログラムを用いてペックマン ９９０自動合成機で自動的に実施することができる。

所望の最終ペプチドのアミノ酸配列を■する中間体にプチト゛（即ち、反応性側 鎖官能基および場合によＪＮ−末端α−アミノ基が保護されている）の合成が完 了した後、無水ＨＦのような試薬を用いる処理によシ中間体Ｒプチドを樹脂支持 体から切シ出すが、この試薬はにプチドを固定結合位置で樹脂から開裂するばか シでなく、Ｎ−末端α−アミノ基の保護基（かかる保護基が既に除去されていな い場合）および全ての側鎖保護基を除去する。この工程はカルボキシ−末端を有 する所望ペプチドのカルボキシル基を遊離酸の形にする。

上記したはプチド合成工程に適した保護基を列挙する。

α−アミン保護基は段階的にプチド合成において当業者に有用であると知られて いるものである。使用し、うるα−アミノ保護基の種類としては、 （１）　フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ベンジルオキシカ ルボニル（Ｚ）および置換２（例えばｐ−クロルベンジルオキシカルボニル、ｐ −ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロムベンジルオキシカルボニル、ｐ −メトキシベンジルオキシカルボニル）等の芳香族ウレタン型保糎基；（２）　 Ｂ　Ｏｃ、ジインプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル 、エトキシカルボニルおよびアリルオキシカルボニル等の脂肪族ウレタン型保護 基；および（３１シクロペンチルオキシカルボニル、アゲマンテルオキシカルボ ニルおよびシクロヘキシルオキシカルボニル等のシクロアルキルウレタン型保護 基、 がある。好適なα−アミン保護基はＢＯＣである。

Ｃのスルフヒドリル基のだめの保護基はベンジル（Ｂｚｌ）、置換Ｂｚｌ　（例 えば３，４−ジメチルベンジル、ｐ−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、Ｉ） −クロルベンジルおよびｐ−ニトロベンジル〕、トリチル％Ｌ置換Ｚ、チオエチ ルまたはベンゾイル（Ｂｚ）である。ＭｅＯＢｚｌが好ましい。

ＮまたはＱのアミン基のための保護基は好ましくはキサンチル（Ｘａｎ）である 。

ＴおよびＳの水酸基のための保護基は好ましくはアセチＡ・（Ａｃ）、Ｂｚｌｔ ｅｒｔ−ブチル、トリチル、テトラヒト９０ピラニル、ＢｚｌおよびＤＣＢから なる種類から選択される。最も好適なものはＢｚｉ　である。ＴおよびＳの水酸 基を保護することは絶対的条件ではないが好収量を得るためには好ましい。

Ｙのフェノール性水酸基のだめの保護基はテトラヒト５０ピラニル、ｔｅｒｔ− ブチル、トリチル、ＢＺ、Ｚ、４−Ｂｒ−Ｚ　およびＤＣＢからなる群から選択 される。

Ｒのグアニジウム基のだめの保護基は好ましくはニトロ、ｐ−トルエンスルホニ ル（Ｔｏｅ）、Ｚ、アダマンチルオキシカルボニルおよびＢＯＣからなる種類か ら選択される。

Ｈのイミダゾリウム基のだめの保護基はＴ　ｏ　ｓ　ｓ　Ｂ　Ｚ　ｌ！　ｓ　ト リチル、２，２．２−）リフルオルー１−ベンジルオキシーカルボニルアミノエ チルおよび２，４−ジニトロチオフェニルであにのε−アミン基のだめの好適な 保護基はＺ、２−クロル−Ｚ、Ｔｏｓ％ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ） 、ＢＯＣおよびα−アミノ保護基として先に記載した芳香族および脂肪族ウレタ ン型保護である。側鎖アミン保護基の選択は、合成過程におけるα−アミノ基の 脱係ｊ工程で除去されないものでなければならないという点を除けば絶対条件で はない。従りて、α−アミノ保護基と側鎖ε−アミン保護基とは同じものではあ シえない。

Ｄのβ−カルボキシル基またはＥのγ−カルボキシル基は好ましくはＢｚ１％Ｄ ＣＢ、メチル、エチルおよびｔ−ブチルからなる種類から選択される基とのエス テルを形成することによって保護される。

残シのアミノ酸であるＡ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＶおよびＷは保護を要しな い十分に非反応性の側鎖を持っている。

Ｒプチド合成で使用する特定の側鎖保護基の選択においては次の法則に従う。

ｆａ）　保護基は合成の各段階においてα−アミン保護基を除去する試薬および 条件下に安定でなければならない。

（′Ｄ）保護基はカップリング条件下にその保護性を保持しなければならず、脱 離するものでちってはならない。

（Ｃ）側鎖保護基は所望のアミノ酸配列を有するＲブチどの合成が完了した時に 、啄プチド鎖を変更しない反応条件下に除去しうるものでなければならない。

以上の記載よシ明らかなように、本発明はまず第１にその上ではゾチド合成を行 う固体支持体に固定するか或はＣ−末端アミノ酸のα−カルボギシ基をエステル 化した本発明の所望ペプチドのアミノ酸配列を有する中間体ペプチドを製造し、 そして第２に保護基を脱離してにプチドを樹脂支持体から切り出すかまたはＣ− 末端アミノ酸のα−カルポギシ基からエステル基を除去し、そして第３に所望な らば得られる本発明の合成ペプチドをその塩に転化することからなる本発明の合 成ペプチドの製造法を提供する。

樹脂から開裂した後、本発明のペプチドはセファデックスＧ−２５カラム、Ｃ− １８逆相高性能液体クロマトグラフィーまたは標準的手法を用いる他の全ての手 法、好ましくはクロマトグラフィーによシ精製される。

一定の使用目的のためには、本発明のペプチドを放射能標識することが望ましい 。１または複数のチロシン残基を有する本発明のペプチド９はペプチドをクロマ トグラフィーで精製する前まだは後で、エンザイモビーズ（Ｆ、ｎｚｙｍｏ’ｂ ｅａｄｓ　）およびエンザイモビーズ放射性ヨウ素化試薬（いずれもバイオラド ラボラドリース社、リッチモンド、カリフォルニア、アメリカよシ入手可能）を 製造者の指示に従って用いることによシチロシン基を１２５工で放射能標識する 。チロシンをヨウ素化するクロラミンＴ法も使用できる。

ペプチド合成において１または複数の標識アミノ酸を用いることによシ　Ｈ，Ｃ または　Ｓで標識したペプチドを製造することができる。

本発明の短いペプチド、例えば以下の配列：（Ｙ）１Ｃ，１ＣＤ　Ｉ　ＦＴＡ　 ６ＳＲＧＫＲＡＳＡ　ｌ４Ｇ（Ｙ）。

（ただし、１およびｊのいずれか一方は０で他方は１でｌ、Ａ−１はＳまだはＰ であシ、Ａ６はＮまたはＴでらシ、そしてＡ□４　はＮまたはＫである）を有す る好適なペプチドについて、Ａ６の位置にあるアミノ酸がＮであるペプチドは環 化する性質を有することを発見した。Ａ６がＮであるこのようなペプチドおよび これを含む本発明の合成タンパクはペプチド合成後約１０日以内、最も好ましく は３日以内に使用することが好ましい。これらのにプチドをキャリアタンパクに 接合することなく、ハイブリドーマ作製の準備としてＢ細胞をｉｎ　ｖｉｖｏ　 （例えば実施例■）またはｉｎ　ＶｉｔｒＯ（例えば以下に述べるＢＯθＢ工程 ）で免疫するために直接使用する場合には、Ａ６がＮであるペプチドは合成後（ 即ち、ｋブチどの側鎖の脱保護後）１２時間以内に使用することが好まｉ〜い。

本発明の合成タンパク質は、本発明の合成ペプチドと適切なデヒドまたはビスジ アゾ化（ンジジンのような二官能性結合剤を用いる標準的手法によって接合させ ることにより製造される。

既に述べた通り、本発明の合成ペプチドはそのアミノ−またはカルボキシ−末端 に１個のチロシン残基を有し、且つ合成ペプチドとキャリアタンパクとの接合は 、合成はプチドとキャリアタンパクとをＢＤＢの存在下に反応させることにより 実施することが好ましい。この接合反応は公知の方法〔）之ツシリ（Ｂａ５ｓｉ ｒｉ　）ら、放射性免疫検定の方法、ジー？７フｚ（Ｊａｆｆｅ）およびベール ？ン（Ｂｅｈｒｍａｎ　）編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　＝コ、　− ヨーク、４５−４７（１９７９））によシ実施できる。

この接合反応の結果、キャリアタン・ξり１分子当シ各々異なる分子数の合成に プチドが接合した本発明の合成タンパク質の混合物が得られるであろう。合成タ ンパク質は接合反応混合物のはプチドおよびＢＤＢから透析により分離できる。

本発明の合成タンパク質は各々異なる数の合成にプチドが接合した異なるタンパ ク質の混合物として用いることができ、またこの形で用いることが好ましい。

所望ならば、合成タンノξりは結合している合成ぼプチドの分子数に応じて分離 することができ、各型の合成タンパクを個別に使用することが可能でちる。結合 している合成にプチドの分子数に応じて本発明の合成タンパク質を分離するには 、高性能液体クロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーのようなタンパ ク精製における標準手法を用いうる。

ＢＳＡと５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹの配列を有する合成ペプチドとの 接合工程（実施例■参照）において、各Ｂ　Ｓ　Ａ分子れた。ＢＳＡのかわりに ＫＬＨを用いた場合には各ＫＬＨ分子に平均２００分子の合成にプチドが接合す ることが見い出された。

本発明の合成ペプチドおよび合成タンパク質は哺乳動物における狂犬病ウィルス に対する免疫応答を引き起こすことができる。

哺乳動物における狂犬病ウィルスに対する免疫応答に必然的に付随して哺乳動物 の血清中に抗狂犬病抗体が出現し、牌臓、リンパ球、血液およびその他の免疫系 に関連する組織中に抗狂犬病抗体分泌性血漿細胞（Ｂ細胞）が出現する。

本発明の合成ペプチドまたは合成タン・ξり質を哺乳動物に接種することによシ 引き起こされる抗狂犬病抗体は、１または複数の抗原決定基（ウィルスまたは膜 タンパクのＡＣｈ　結合部位におけるＡＣｈＲへの結合に含壕れる）において狂 犬病ウィルスまたは狂犬病ウィルス膜タン・ξりと結合するであろう。これは直 接または合成タン・モク質の一部分として哺乳動物に接種する本発明の合成ペプ チドが抗原決定基の配列と同じか或は抗原決定基配列と多数の中性アミノ酸置換 （この置換は遊離またはキャリアタンパクに接合した合成にプチドが、ウィルス 膜に埋めこまれた膜タンパク上の抗原決定基の少なくとも一部分の配位に実質的 に類似する配位に適合することを妨げない）を有する点において異なる配列を含 む配列を有しているためである。

従って、遊離または合成タンパクの一部分としての合成Ｒプチドに対する免疫応 答を哺乳動物に引き起こすために本発明の合成ペプチドまたは合成タンパク質を 接種された哺乳動物は、抗狂犬病抗血清を産生じ、該抗血清は狂犬病ウィルス（ ″または狂犬病ウィルス膜タンパク）が、その表面上にＡＣｈＲ受容体を有する が故にかかる結合を受けやすい細胞と結合することを阻止する抗体を含む。この 阻止は、抗体の結合部位とＡＣｈＲ上のＡＣｈ結合部位との間において狂犬病ウ ィルス膜タンパクの断片（狂犬病ウィルスの病因において通常は哺乳動物神経筋 接合部でＡＣｈＲにおけるＡＣｈ結合部位に結合する）への結合の競合が生じる ためである。レンツ（Ｌｅｎｔｚ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ２１５．１８２−１．８ ４（１９８２）は狂犬病ウィルスまたは狂犬病ウィルス膜タンパクがかかる結合 を受けやすいＡ　Ｃｈｒ（−フロセッシング細胞に結合するのを阻止する抗体ま たは抗体混合物の阻止能力を測定する検定系を記載する。

合成ペプチドまたはタンパクが狂犬病ウィルスに対する免疫応答を哺乳動物に生 じさせる能力がおるか否かを決定するための別の試験法は、合成ペプチド（適当 な免疫原性キャリアタン・ξりに結合させたもの）または合成タンパクを免疫原 として用いて哺乳動物中に抗血清を産生じ、次いで免疫学界で公知の標準的結合 検定法または中和検定法を用いて、前記抗血清（またはその免疫グロブリン分画 ）の狂犬病ウィルスに対する結合能または中和能を試験することによシ行う。例 えば、抗血清（またはその免疫グロブリン分画）は酵素標識免疫定量法（ＥＬＩ ＳＡ、）によって狂犬病ウィルス膜タンパクまたは不活化狂犬病ウィルスに対す る抗体の存在をアッセイすることができる。

合成にプチト９または合成タンパク質が抗狂犬病免疫応答を哺乳動物に生じさせ る能力があるか否かを決定するだめの更に別の方法は、狂犬病ウィルスに対して 免疫されていない哺乳動物群を用いて合成ペプチド（適渦な免疫原性キャリアタ ン／！！りに接合している）または合成タンパク質が該哺乳動物に狂犬病生ウィ ルスのチャレンジに対する防御を授けうるか否かを決定するためにペプチドまた はタンパクを試験することである。試験哺乳動物群を統計的に見て実質的に等し い２つのサブグループに分ける。一方のサブグループの全動物には試験すべき合 成ペプチド（適当な免疫原性キャリアタ／／ξりに結合し、ている）または合成 タンパク質（本明細書ではこれを゛試験ベゾチドまたはタンパク質”と称す）を 接種し、他方のサブグループの全動物には試験にゾチドまたはタンパク質を欠い ている以外は第１群に使用した組成物と同じ組成物を同じ方法で接種する。合成 タンパク質を試験する場合には、第２群には合成Ｒプチドに結合しないキャリア タンパクを与えてもよい。その他の点については両群は本質的に同様に処理され る。試験にプチドまたはタンパク質が抗狂犬病免疫応答を引き起こすのに有効で ある場合には、かかる応答を引き起こすと期待される実験計画に従って両群の全 動物に接種を雄した後、ウィルスに対する免疫応答を上昇させなかった試験哺乳 動物の少なくとも５０％がチャレンジ後一定期間内（”ＬＤ５ｏ期間”）に致死 に到ると予期される量の狂犬病生ウィルスでチャレンジする。ＬＤ５６期間後に 、試験はプチドまたはタン・ξり質を投与された群（第１群）の死亡数が他の群 （第２群）よりも有意に低い場合には、該試験にプチビまたはタンパク質は哺乳 動物に抗狂犬病免疫応答を生じさせることができるといえる。この方法を例示す る試験を実施例■に記載する。

狂犬病に対して哺乳動物にワクチン投与するだめの組成物は、本発明の合成タン パクとアジュバント（例えば完全または不完全フロイントアジ−パント、酸化ア ルミニウム、ミョウバンなど）および希釈剤（例えばＰＢＳ）とを組合せること により製造される。使用されるアジュバントおよび希釈剤はワクチン投与する哺 乳動物にとって生理学的に許容されるものである。このようなワクチンは本発明 の合成タンパク質を１種以上含有することができる。例えば、上記したように本 発明の合成タンパク質の製造の際には様々な分子数の合成イプチドがキャリアタ ンツク分子に接合する。ワクチン製造のためにはこれらの各種接合体を分離する 必要はない。また、本発明の特定のワクチン製造においては一種類の合成にブチ ｌ−ゞを使用することが好ましいが、本発明ワクチン中の合成タンパク質は本発 明の異なる合成にプチドを含んでいてもよい。

本発明の合成タン・ξり質を本質的成分として用いて本発明の抗狂犬病ワクチン を製造する方法は獣医およびヒトのワクチン界において公知である。

本発明の抗狂犬病ワクチンは３つの方法で使用することができる。第１に、もし も狂犬病ウィルスにさらされた場合に狂犬病を発症する危険を減じるためにウィ ルスにさらされる前に哺乳動物を免疫するために予防的に用いうる。第２に、い ったんる狂犬病を防止するために治療的に用いうる。第３に、本発明のワクチン は哺乳動物の体外での使用のだめの抗狂犬病抗血清、関連抗狂犬病抗体および抗 狂犬病抗体分泌Ｂ細胞を哺乳動物中に産生させるために用いうる。

上記の全ての場合において、ワクチンは好ましくは筋内内注射により投与する。

予防的に使用する場合、本発明のワクチンは一般には治療すべき哺乳動物に少な くとも２回投与し、２回目の投与は通常１回目の約１週間〜１０日後に行う。２ 回目投与の３週間〜２ケ月後に３回目の投与を行うことが好すしい。ブースター 投与を行う場合には、最初の一連の免疫後少なくとも６ケ月後に始めて少なくと も６ケ月の間隔をおいて行う。ブースター投与は哺乳動物血清中の抗狂犬病抗体 価が低すぎて哺乳動物が狂犬病ウィルスにさらされる危険という観点から防御で きないと信じるに足る理由がある場合にのみ実施される。最初の投与およびブー スター投与における各投与量はワクチン投与する哺乳動物の種、年令、体重、体 調および血清抗狂犬病抗体価、ワクチンの活性成分である合成タンパク質の免疫 原性キャリアタンパク部分の分子量ならびに各キャリアタンパク分子に接合した 合成にブチどの平均分子数に基いて、約ｏ、ｏｏｉｍｙ〜１００７ｆｆｊ７の量 の合成タンパク質を含有する。ワクチン１回分の容量はワクチン投与する哺乳動 物の種および大きさ、１回の投与で投与すべき合成タンパク質の量およびワクチ ン製剤中の該タンパク質の濃度に基いて約０．Ｏｌだｌ−１０ＷｔＪである。

治療用に使用する場合には、本発明のワクチンは予防的に使用する場合よりも早 くワクチン投与する動物の血清中に高力価の抗狂犬病抗体を生じさせるように使 用される。狂犬病ウィルスにさらされた哺乳動物は予防的にワクチン投与された 場合もされなかった場合も同じ治療計画に従って治療的にワクチン投与を行う。

この治療的ワクチン投与計画はウィルスにさらされた後出来る限ｐ早い時期に開 始する３〜１０回の投与を含む。

２回目の投与は１回目投与の約２〜５日後以内に行い、３回目の投与は２回目投 与の約３〜６日後以内に行う。４回目および５回目の投与は１回目投与の約１２ 〜１８日および２５〜３０日後に行い、それに続く約５回までの追加的投与は５ 回目投与後約１ケ月または２ケ月の間隔をおいて行う。獣医およびヒトのワクチ ン界における当業者であれば治療的ワクチン投与の強さおよび容量は予防的ワク チン投与の場合と同じ要因に基くことを理解するであろう。

哺乳動物が狂犬病ウィルスにさらされたと信するに足る理由がある場合、一般に は治療的ワクチン投与の開始を遅らせることは勧められないが、必要性がない場 合にはワクチン投与を避けることが望ましい。従って、哺乳動物に治療的ワクチ ン投与を施す場合には、狂犬病ウィルスと接触したと思われる部位の組織または 体液およびウィルス源と思われるものが動物である場合にはウィルス源と疑われ る動物の組織または唾液を採取し、狂犬病ウィルスの存在を検定することが好ま しい。更に、哺乳動物が生ウィルスにさらされ、そして治療的ワクチン投与を受 けた場合には、哺乳動物の血清中の抗狂犬病抗体価を定期的に検定することがで きる。力価が十分高くなった場合には治療的ワクチン投与計画における１または 複数のワクチン投与は不必要となろう。前記ＡＣＩＰ（１９８４年７月２０日） 参照。

本発明のワクチンは有効成分が不活化または弱毒化狂犬病ウィルスである抗狂犬 病ワクチンと共に予防的または治療的に使用することもできる。他のウィルスに 対する合成にプチドに基くワクチンに関して報告されてきたように、本発明のワ クチンは狂犬病生ウィルスにさらされた際または全、不活化または弱毒化狂犬病 ウィルスでワクチン接種した際に即座に有意に免疫応答を上昇させるべくワクチ ン接種を受ける者の免疫系を感作するのに使用できる。従って、例えば予防的ワ クチン投与計画においては、最初の２回のワクチンは本発明の合成ペプチドに基 くワクチンであ夛、ブースター投与を含むその後の投与は全狂犬病ウィルスに基 くワクチンであってもよい。

哺乳動物の体外使用のために抗狂犬病抗血清または抗体または抗狂犬病つィルス 抗体分泌Ｂ細胞を哺乳動物中に産生させるために使用する場合には、本発明のワ クチンは哺乳動物中に高力価の抗狂犬病ウィルス抗体を迅速に産生させるだめに も用いうる。一般に哺乳動物はワクチンで高度免疫される。従って、マウスの場 合、ワクチンは一般に刺激性の少ないアジュバントよりもフロイントの完全アジ −バントを含み、動物は２〜３ケ月の間約１週問おきに１回の割でワクチン投与 され、ワクチンの各投与における合成タンパクの量は約２５μ９〜約２００μｇ でちり、これは生ウィルスによるチャレンジからマウスを防御するのに必要なワ クチン投与量よシ多い。一般に、抗血清（および関・連抗体およびＢ細胞）はシ ゲル（Ｓｉｇｅｌ）らのＭｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、パートＥ “免疫学的手法”第９３巻、３−１２゜アカデミツクプレス（１９８３）に記載 の方法に従って、血清の産生に使用する哺乳動物の種によシ適宜変更して産生さ せることができる。例えばヒトを用いる場合には、７０インド完全または不完全 アジュバントよりもより刺激性の少ないアジュバント、例えばミョウバンを用い ることがよく、そして勿論ワクチン製剤中の合成タンパク質の量は小動物の場合 よりも多い。

既に上述したように、本発明の抗狂犬病抗血清若しくは、抗血清またはノ・イブ リドーマ培養物から得られる本発明の抗狂犬病抗体は、狂犬病ウィルスにさらさ れたために狂犬病にかかりたと疑われる哺乳動物に抗狂犬病受動免疫を授けるだ めに治療目的で用いられる。アナフィラキシ−の危険および異種間タンパクを融 合することに伴うその他の問題を最小にするために、かかる治療に用いられる抗 血清または抗体は治療すべき哺乳動物と同じ種の哺乳動物に由来することが好ま しい。ポリクローナル捷だけモノクローナル抗体を治療に用いる場合には、約− ７，２に緩衝化し７た等張食塩水（例えばＰＢＳ）のような適当な無責性希釈剤 に溶解して約０．１〜１０　ｍｑ／ｒｔｔｌの抗体濃度とする。

抗血清を使用する場合には、一般に公知の方法で精製し、精製したものを直接或 は約０．１〜１（１１νｍｌの抗体価に濃縮した後使用する。抗体製剤の投与容 量は哺乳動物の種、年令および体調および該製剤の抗狂犬病抗体価に基いて約０ ．１〜１０μｌ／９哺乳動物体重である。ヒトに用いる抗狂犬病免疫グロブリン の一般的投与量は約１３０μｌ／に９体重である。精製濃縮血清の一回の投与容 量は抗体製剤の投与容量を決定する際に考慮するのと同じ要因に基いて約０．１ 〜１０μｌ／ｙ治療すべき晴乳動物体与容量は２００ｐｌΔ９体重である。ヒト の治療用には抗体製剤はＷＨＯによるヒト狂犬病免疫グロブリ／！Ｒ剤を参考に して当業者に公知の手法により１ｍｌ当り］５０国際単位の抗狂犬病ウィルス抗 体価に調整することが好ましい。同様にヒトの治療用抗血清製剤はＷＨＯによる 抗血清製剤を参考にして公知の手法により１ｍｌ当り２００国際単位の抗狂犬病 ウィルス抗体価に調整される。

狂犬病ウィルスにさらされた哺乳動物を治療するだめの（抗血清由来の）抗体溶 液または抗血清製剤の製造および使用は、不活化または弱責化狂犬病ウィルスで 高度免疫した哺乳動物血漿から単離された狂犬病免疫グロブリン分画または同様 に高度免疫された哺乳動物から得られる抗狂犬病抗血清を用いて現在性われてい る手法に従う。・・イブリドーマ培養物から抗体を単離する方法は当業者に公知 でアリ、このような抗狂犬病抗体は狂犬病ウィルスで高度免疫された哺乳動物血 漿から単離される抗狂犬病免疫グロブリンと同じ方法で治療に用いられる。一般 に、治療法は投与量の約半分を筋肉内注射し、もし解剖学的に可能である場合に は残る半量をウィルスが侵入したと思われる傷（咬み傷またはかき協）の部位に 侵透させる。侵透は傷の周囲にハレが生じている部位および治療すべき哺乳動物 にとって痛みが激しくなっている部位に小容量の注射を多数行う。ウィルスが浸 入した部位への浸透が解剖学的に不可能である場合には全投与量を筋内内注射に より投与する。抗体溶液または抗血？１１ｊＪ！剤を用いる治療は狂犬病ウィル スにさらされた疑われた後できる限り早〈実施される。１回投与が行われる。

本発明の抗狂犬病ワクチンまたは合成ペプチドを接種しだ哺乳動物からのＢ細胞 、好ましくは牌細胞は、該ワクチンに使用された合成ペプチドの配列（または配 列の一部）を有するエピトープに特異的な抗体を産生ずるノ・イプリド−マを作 製するのに用いることができ、またキャリアタンノξりに接合することなく哺乳 動物に直接接種するために用いうる。このような牌細胞を用いるハイブリドーマ 培養物の調製は当業者に公知の方法に従う。例えばトロウブリソジ（Ｔｒｏｗｂ ｒｉｄｇｅ　）の米国特許第４．４３４，１５６号；シラ（Ｚｏｌａ）およびゾ ルマウス（Ｂｒｏｏｋｓ）　。

Ｊ、　Ｈｕｒｅｌ、１　、モノクローナル抗体：手法と応用、ＣＲＣプレス。

ポカ・ラドン、フロリダ（１９８２）、１−５７頁；クーラー（Ｋ１５ｈｌｅｒ 　）およびミルスタイン（Ｍｉｌｅｔｅｉｎ）、　Ｎａｔｕｒｅ　２５ｔ３゜４ ９５−５００（１９７５）；およびＨ，Ｅ、シーミツツ（Ｓｃｈｍｉｔｚ）ら、 Ｉｖｍｕｎｏｌ、　Ｃｏｍｍ。１２．１’６ｌ−１７５（１９８３）を参照され たい（これらの文献は全て参考として本明細書に含まれる）。また実施例■も参 照のこと。

一般的手法として、牌細胞は本発明のワクチンまたは合成ペプチドで高度免疫さ れ、その結果抗狂犬病免疫応答が上昇した哺乳動物の牌臓から得る。次いで牌細 胞を、該牌細胞と適合しうる（即ち牌細胞と生存）・イブリッドを形成しうる） 且つまたＢ細胞との融合時にＢ細胞により産生される抗体を発現し分泌すること のできる不死細胞で１、且つ牌細胞とのノ・イブリッドを選択し同定しうる選択 マーカーを有する不死細胞に融合する。融合後、不死の抗体−産生細胞の選択マ ーカーに対応する選択培地で細胞を培養し、生育した細胞を継代培養し、継代培 養物の抗体産生を検定する。次いで抗体産生継代培養物を更に検定し、（［）狂 犬病ウィルスまだは狂犬病ウィルス脱糖タン／ぐりに結合するか或いはこれを中 和する抗体または狂犬病ウィルスまたは狂犬病ウィルス膜抛タンパクと受容体を 有する細胞のＡＣｈＲとの結合を阻害する抗体であって、（１１）本発明の合成 ペプチド（またはＣ−末またはＮ−末のＹ残基金欠くその類似体）または本発明 の合成タンパク質に結合する抗体をアッセイする。

最後に限界希釈法によ）上記したスクリーニング試躾を通過した継代培養物を更 に継代培養し、単ハイブリッド細胞のクロ・−ン（即ち単ハイズリド−マ）を樹 立するが、これらの各クローンの培養物は、ＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位にあるタ ンパクの結合に含まれる断片の一部分であるかまたはこれに類似する狂犬病ウィ ルス脱糖タンパクの断片上にある単一のエピ゛トープと特異的に結合する抗体を 産生ずる。このような抗体は狂犬病ウィルスまたは狂犬病ウィルス脱糖タンパク がＡＣｈＲに結合するのを阻害することができる。限界希釈法における継代培養 物のスクｌＪ＝ングは限界希釈用の継代培養物を同定するのに用いたのと同じ検 定法による。

ウィルスまたはウィルスＭ糖タンノξりに結合する抗体捷たはこれを中和する抗 体およびウィルスまたはウィルス脱糖タンパクのＡＣｈＲへの結合を阻害する抗 体をアッセイするには、本発明の合成ペプチド゛または合成タンパク質が該合成 にプチドまたは合成タンパク質を接種した哺乳動物に抗狂犬病免疫応答を抗体ま たは培養物（または血清またはクロマトグラフィー精製によシ得られる他の抗体 含有溶液）中の抗体が狂犬病ウィルス、狂犬病ウィルス脱糖タンパク、本発明の 合成ペプチドまたは本発明の合成タンパク質に結合する能力をアッセイするには 、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡ法（酵素標識免疫定量法）等のような 標準的免疫検定法によシ実施できる。ウィルス（またはウィルス膜タンパク）と 合成Ｒプチド（または合成タンパク）との競合的検定法を用いてウィルス（また は膜タンツク）と合成ペプチド９（または合成タンパク）の両方に結合する抗体 の存在を決定することができる。

狂犬病ウィルスに結合性の抗体または抗体による狂犬病ウィルスのＡＣｈＲへの 結合阻害のアッセイにおいては、不活化ウィルスを使用することができる。不活 化ウィルスは当業者に公知であり、市販の全（不活化）ウィルス、抗狂犬病ウィ ルスワクチンから得ることができる。全ウィルスのかわシに狂犬病ウィルス脱糖 タンパクを用いるこのようなアッセイのためには、当業者に公知の如く〔ディエ ソショルド（Ｄ１θｔｚｓｃｈｏ］、ｄ　）ら、前掲〕膜タンパクを全ウィルス から単離するか或はゲノデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、欧州特許出願公開第０１１ ７６５７号に記載するような組換えＤＮＡ法によシ製造することができる。

各々のハイプリドーマのクローンを含むノ・イブリド−マ培養物を単離する前記 工程において、好適な牌細胞源はマウス、最も好適にはＢ　ａ　７３　ｂ／　ｃ またはＢａｄｂ／ｃＢｙＪ株でちる。Ｂａ１ｂ／　ｃ　マウスは当業者に公知で あり、業者からの入手も可能である。Ｂａ１ｂ／ｃＢｙＪマウスは当業者に公知 で１、ジャクソン轡ラボラトリーズ（Ｊａｅｋｅｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ、　Ｉｎｃ、　）　、バーハーバ−、マイン、米国から入手可能である。好適 な不死の抗体産生細胞株はそれ自体抗体を産生じないものである。当業者に公知 で入手可能なかかる多数の細胞株の例としては、５１９４１５．ＸＸＯ，ＢＵＩ 　およびＳｐ２１０−Ａｇ１４　ミエローマ細胞株（以後、各々“Ｓ　１９４　 ”および′″ｓｐ２”と略記する）が挙げられる。これら２種の細胞株およびそ の他の多数の細胞を用いるハイブリッドには、ノ・イブリドーマにおける当業者 に公知のＨＡ　’Ｉ’培地が選択に適している。

例えば８１９４株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビ ル、メリーランド、米国（ＡＴＣＣ）から入手可能である（ＡＴＣＣ寄託番号Ｃ ＲＬ　８８３７）。またｓｐ２も例えばＡＴＣＣから入手できる（ＡＴＣＣ寄託 番号　ＣＲＬ１５８１）。

本発明のハイズリド−マ培養物は、哺乳動物からのＢ細胞（例えばＢ　ａ　ｌ　 ｂ　／　ｃまたはＢａ１ｂ／ｃＢｙＪマウスの牌細胞）を本発明の合成ペプチド マたは合成タンパク質でｉｎ　ｖｉｔｒｏの免疫化を行うことからなる方法によ り製造することもできる。Ｎ−ア七チルムラミルーＬ−アラニル−Ｄ−イングル タミンのような大モル過剰（本発明の免疫原性タン・ξりまたはペプチドに対し て）のアジュバントペプチドの存在下に実施するｉｎ　ｖｉｔｒ。

免疫工程の１つはボス（Ｂｏｓｓ）　、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　２９ 　ｌ　。

１９３−１９６（１９８４）およびボス、米国特許出願筒５６７．５６１号（１ ９８４年１月３日出願、”　ｉｎ　ＶｉｔｒＯ免疫化細胞からのハイプリド−マ 製造”と題する出願でラシ、本発明の譲受人に譲渡された）に記載されておシ、 該文献および特許出願は参照することにより本明細書に含まれる。ボスのこの工 程で用いられる好適な免疫原はにプチドＳＣＤ工ＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹで ある。この工程においては、Ｂ細胞を１．ｎ　ｖｉｔｒｏで免疫化した後、本発 明のハイプリド−マ培養物の製造の際にｉｎ　ｖｊ、ｖｏ免疫した後に哺乳動物 から得たＢ細胞と本質的に同じ方法によシ処理する。

本発明のモノクローナルおよびポリクローナルハイブリド−マ培養物は１または 複数の本発明の抗体を産生ずる。かくしてこれらの培養物により産生される抗体 は、狂犬病ウィルスにさらされた哺乳動物の治療に使用した抗体に関して上述し たのと同様に治療目的に使用できる。

本明細書に記載する抗狂犬病抗体、特にハイブリドーマのクローンから産生され るモノクローナル抗体は動物が狂犬病であるか否かの決定および狂犬病ウィルス にさらされた疑いのある哺乳動物が実際にさらされたか否かの確認に診断的に使 用しうる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は多数の公知の免疫検定法 において、試験動物の唾液、唾液腺また脳組織中に狂犬病ウィルスが存在するか 否かの決定或はウィルスにさらされた疑いのある動物のさらされた部位に近い組 織または体液中に狂犬病ウィルスが存在するか否かの決定に用いられる。

ハイプリド−マから産生される抗体はハイブリド−マにおける画業者に公知の多 数の手法によシ大量生産されうる。例えば、ハイズＩＪ　１．’、、−マ細胞を 用いて適当な動物法に腹水腫瘍を樹立することができ、腫瘍の・・イズリド−マ 細胞が分泌する抗体を腹水から単離することができる。

本発明の抗狂犬病ワクチンは現在入手しうる抗狂犬病ワクチンよシも安全である ので、本発明のワクチンは狂犬病ウィルスにさらされる危険の高い状況にあるヒ トを含む哺乳動物の免疫実務を促進すると期待される。本発明のワクチンがとシ わけ意味を持つ経済的に重要な哺乳動物はネコ、イヌ、ウマおよび家実施例　Ｉ 配列：　５ＣＤＩＦＴＴＳＢＧＫＲＡＳＫＧＹおよびＳＣＤ工ＦＴＮＳＲＧＫＲ ＡＳＫ（、Ｙを有する合成ペプチドの合成 メリフイ−１・６の方法に従っ”で表題ペプチドを手動で合成した。

例えば前掲のスチュワードおよびヤング（１９６９）を参照されたい。出発樹脂 はＢＯＧ−Ｔｙｒ（４−Ｂｒ−Ｚ）で０．５４ミリモル／！ｑ置換したクロルメ チル化ポリスチレ／樹脂であった。合成に使用したＢＯＧ／Ｔｙｒ（４−Ｂｒ− Ｚ）−置換樹脂および各種保護アミノ酸は商業的に入手した。

使用した保護アミノ酸は以下の通ジである。

ＢＯＣ−Ａｌａ ＢＯＣ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ） ＢＯＣ−Ａｓｎ（Ｘａｎ） ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ） ・ＢＯＣ−Ｃｙｓ（ＭｅＯＢｚｌ） ＢＯＣ−Ｇｌｙ ＢＯＣ−ＩＩｓ（半水和物） ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｚ）（ジシクロヘキシルアミン塩）ＢＯＣニーＰｈｅ ＢＯＣニー５ｅｒ（Ｂｚｌ） ＢＯＣ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ） ＢＯＣ−Ｔｙｒ（４−Ｂｒ−ｚ） 各付加は以下のようにして実施した。

１、塩化メチレン中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオル酢酸で１５分間、１回洗浄 。排水。

２、塩化メチレンで各１分ずつ６回洗浄。各洗浄後に排水。

３、塩化メチレン中の１０％（ｖ／ｖ）：）イソプロピルエチルアミンで各１分 ずつ２回洗浄。各洗浄後に排水。

４　塩化メチレンで各１分ずつ６回洗浄。各洗浄後に排水。

５、合成開始前に樹脂に結合したＴｙｒの量に対して４当量の保護アミノ酸を加 えて５分間攪拌。

６．４当量のＤＣＣ（添加した保護アミノ酸と等モル量）加えて１時間攪拌。

７、ＤＭＦを加えて３０分間攪拌。排水。

８、塩化メチレンで各１分ずつ６回洗浄。各洗浄後に排水。

９、反応完了をニンヒドリン試験でチェック。

５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ　の合成においては、■、７位のＴおよび ９位のＲに二重カップリングが必要である。７位のＴの第２のカップリング後に 無水酢酸キャッピングを実施した。

５ＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ　の合成においては、工および完成した投 プチドを樹脂から開裂し、無水フッ化水素で脱保護し、次いでＣ−１８逆相高性 能液体クロマトグラフィーで精製した。

実施例　■ 合成ペプチドの放射能標識 はプチド５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ　は以下の方法によシクロラミン ＴによってＣ−末端チロジンをヨウ素化することにより放射能標識した。

ＮａＯＨで塩基性（ｐＨ７−１１）にした溶液１．６〜２．８Ｐｌ中のＮａ１２ Ｊ、１ミリキーリーを０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）　１０ｐ ｌ！に加えた。次いで０．１７ｎｆｌ　／　ｍｌのペプチド溶液１０μｌを加え た。溶液を３０秒間混合した。続いて水中０．１ｍグ／ｍｌのクロラミンＴＩＯ μｌを加えて、混合物を３０秒間混合した。次いで０．２５　ｍ９／ｍｌ；のＮ ａ２Ｓ２０５１０μｌを加えて再び３０秒間混合した。次いで０．０５Ｍ！Ｊン 酸緩衝液中１００ｍｇ／虹のＢＳＡ　１００μｌを那えて４０秒間混合した。ペ プチドを６ｍｌのＢｏｎｄ−ＥｌｕｔＴＭクロマトグラフィーカラム〔アナリテ ィケム・インターナショナル（Ａｎａｌｙｔｉｃｈｅｍ　Ｉｎｔｅｒｎａ−ｔｉ ｏｎａｌ）、ハーバ−シティ、カリフォルニア、米国〕上で非反応ヨウ素から分 離し、放射性ペプチドを更に高性能液体クロマトグラフィーで精製した。

実施例　■ 合成タン／ξり質 ペプチド５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ　を以下の方法でＢＤＢを含むＢ ＳＡ　に接合した。ペンジジンジヒドロクロリ）’　５　ｍｆ　ヲ０．２ＮＨＣ ｌ　１ｒｎｌ中に溶解し７、蒸留水０．１１ｉＪ中のＮ　ａ　Ｎ　Ｏ２３，９■ を加えることによｆｉＢＤＢ溶液を調製した。

Ｂ５Ａｌ０■、ペプチド１０■および新規調製したＢＤＢ溶液２００μｌをホウ 酸ナトリウム（ｐＨ９，０）中０．１６ＭおよびＮａＣｌ　中０．１３Ｍ溶液２ ｒｎｌ中に加えた。次いで十分量の０．５ＮＮａＯＨを加えて声を９．０に戻し た。混合物を氷上に２時間置き、４℃で蒸留水に一夜透析し、次いで４℃で０． １５　Ｍ　ＮａＣ１に更に２４時間透析した。

ペプチドを合成した１日後に、ｋプチド５ＣＤＩＦＴＮＳＦＩＧ沿情ＳＫＧＹ１ ０ｍｇを用いて同じ工程を実施した。

ＢＳＡのかわシにＫＬＨｌｃ）ｍｙを用いて同じ工程を行うことに、！：ｆｉＫ ＬＨとベプ−ＩＦ−１−”５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＩ？、Ｙ　、！：’ ＆接実施例　■ 抗狂犬病ワクチン組成物 実施ｆｌＪＩＩｌ　テＡう：ｈりＫＬＨ−Ｊフチ）’５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲ ＡＳＫＧＹ溶ｆｉ（０，１５ＭＮａＣ１）０．２６６ｍｌをＰＢＳ　で５．０ｍ ｇに希釈し、次いでこれを室温中ＯＭＮ　Ｉ　ＴＭミキサーを用いるホモゲナイ ズ化により完全７０インドアシユパン）５．０ｍｌ中に乳化させた。

最終ホモゲネートは１ｍｌ当、Ｄ２００μｙの結合体を含有していた。完全フロ イントアジュノくントのかわシに不完全フロイントアジ−パントを用いて同じ工 程を実施した。

ＢＳＡ−ぐプチト唱ＣＤ工ＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ接合体およびＢＳＡ−− ？プチドＳＣＤ　工ＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ接合体を用いて同じ工程を実施 した。

実施例　■ ウサギにおける抗狂犬病抗血清の産生 実施例■に記載のＢＳＡ−ペプチド５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ接合体 に基くワクチン組成物を用いてニーーシーラント雄つサギ中に以下の方法で抗狂 犬病抗血清を産生した。

三匹のウサギの各々一完全７０インドアジ・、バンド中に合成タン／ぐり質１５ ０μ９を含有するワクチン組成物を後肢の後膝窩リンパ節に注射した。同量の投 与量の筋内内免疫（完全フロイントアジ−パントではなく今度は不完全フロイン トアジ−パントに乳化させたもの）を更に２回最初の接種から１４日および２８ 日後に接種した。

最後の投与の２週間後にウサギの耳静脈から抗血清を回収した。

血清は各々１：１００，１：］０００および１：１００００の希釈で、ワクチン 組成物の合成タンノξりの１２５ニ一標識合成ペプチドとポリクローナル抗つサ ギＩｇＧ抗体調製物とを用いて免疫沈降法で検定し、各血清が（プチドと反応す る抗体を含臂していることを確認した。

実施例　■ 狂犬病ウィルスによる末梢チャレンジに対するマウスの防御ゼｏ日目に２００匹 のウィーンリング（ｗｅａｎｌｉｎｇ）ＣＤ　−１マウス（チャールス・リバー ・ラボラトリーズ、３〜４週令。

１５〜２０ｇ）を無作為に５０匹ずつの４群に分けた。第１群（Ａ群）の５０匹 にはブランク組成物を投与した。この組成物バク質または合成ペプチドを全く含 まないという点を除いては実施例■で記載したＫＬＨ−ペプチドＳＯＤ　Ｉ　Ｆ ＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ接合体に基くワクチン組成物と同じであった。他の群 （Ｂ群）の５０匹のマウスには実施例■記載のＫＬＨ−−＜プチド５ＣＤＩＦＴ ＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ接合体に基くワクチン組成物（２００μ９７ｍ１）を投 与した。第３群（０群）の５０匹のマウスには米国国立保健研究所（ＮＩＨ）よ り入手したＷＨＯ基準抗狂犬病ワクチン製剤の１：１０希釈物を投与した。第４ 群（Ｄ群）の５０匹のマウスにはブランク組成物もいかなるワクチン製剤も投与 しなかった。

Ａ群およびＢ群のマウスは以下のスケジー−ルに従ってブランク組成物（Ａ群） 捷たは合成ペプチドに基くワクチン組成物（Ｂ群）を各々投与した。

投与口　容量　アジ−パントおよび投与経路０　５０μｌ、　完全７０インド、 　皮下２１　５０μｌ、　不完全フロイント、腹腔内３５　５０μ！、　不完全 ７０インド、複腔内４９日目にＡ群の生存マウス４６匹のうちの２５匹およびＢ 群の生存マウス５０匹のうちの２５匹を無作為に選晶疫検定用の血清を得るため に目から採血した。各採血マウスは各々が選択された群に戻した。

０群の各マウスには以下のスケジュールに従ってＷＨＯ基準ワクチン製剤の１： １０希釈物を腹腔内注射によシ投与した：３５．３７，３９，４２．４４および ４６日目に各２５０ｐｌ投与。

４９日目にＤ群の生存マウス５０匹のうちの２５匹を無作為に選択し、免疫検定 用の血清を得るために目から採血した。採血マウスはＤ群に戻した。

４９日目に全４群の生存マウスの各々に−ξミスツールプロダクション犬病ウィ ルス生存種菌株製剤〔ジョーシア州、アトランタ、米国疾病コントロールセンタ ーのジョーク・バエル（Ｇｅｏｒｇｅ　Ｂａｅｒ）博士よシ恵与〕の１：５希釈 物１００μＡ？を末梢筋肉内注射することによシチャレンジした。末梢チャレン ジ後２１日間マウスを観察した。

２１日間のチャレンジ後の観察期間中に死亡した各群のチャレンジしたマウスの 数および死亡した各群のマウスの死に紋るまでの平均日数を表■に示す。

４９日目にＡ、ＢおよびＤ群の谷２５匹から得られた７５の血清試料について以 下の方法によって合成Ｒプチド５ＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹ　に対する 抗体をＥＬＩＳＡで分析した。

ＰＢＳ中１０　μ！；！／ｒｎｌ　の投プチド溶液５０ｐｌ！を標準９６ウエル のポリビニルクロリドゝマイクロタイタープレートの各ウェル中、４℃で一夜（ １５〜１８時間）インキュベートした。インキーベーション後（プチド溶液をウ ェルから除去しＰＢＳで２回洗浄した。

結合にプチドで占められていないウェル表面上の部位をブロックし、それによ仄 被験血清からの抗体および酵素標識抗−ＩｇＧの非特異的結合によるパックブラ ウンｌ−’を減少するために、ＰＢＳ中の５％（ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清溶液また はＰＢＳ中の１０％（ｖ／ｖ）ヒツジ血清、ｏ、１ｌｖｌリジン、０．０１％（ ｖ／ｖ）Ｎ　ａ　Ｎ　ａ溶液（好ましくはヒツジｍｍ溶液）５０μｌをウェル中 、室温で２時間インキ−−＜−２，、た。インキーベーション後、各ウェルから 血清浴液を除き、ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。

次いで、被験血清のＰＢＳ中１：１００希釈物５０μｌを各ウェルに加えてウェ ル中、４℃で一役インキユベートした。

次いでヒツジ抗マウスＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２とβ−ガラクトシダーゼとの結合 体を用いて標準法によシラニルを進展し、（セスダ・リザーチ・ラボラトリーズ 社、ガイタースバーグ、メリーランド、米国から得られる指示システム（β−ガ ラクトシダーゼＨｙＢＲＬ−Ｓｃｒｅｅｎ　キット、カタログ着力９５０２５Ａ ）を用い製造者の指示に従って使用した。

Ａ群のマウスからの２５血清検体およびＤ群のマウスからの２５血清検体のうち には、ＥＬＩＳＡで合成にプチドに対する抗体を有しているものは全く見られな かった。

Ｂ群のマウスからの２５血清検体のうちの４検体がＥＬＩＳＡで合成ペプチドに 対する抗体を有していることがわかった。

表■に示されるように、本発明ワクチンの投与は狂犬病ウィルスの末梢チャレン ジに対する防御を提供する。本実施例で記載した防御試験において防御された動 物の分画（８群５０匹のうち約１０匹）は合成にプチドに対する免疫応答を引き 起こしたＢ％中の動物数（５０匹巾約８匹）によく対応し、これは防御は本発明 の合成ペプチドに対する抗体の産生に関連することを示唆している。

実施例　■１ 抗狂犬病抗体産生ハイブリピーマ 合成ヘプ−ｙ−トａＳＣＤＩＦＴＴＳＲＧＫＲＡＳＫＧＹを含む補乳動物接種用 組成物はＲブチ１２ｍｙ（ＰＢＳ　１ｍ＃中に溶解）を完全フロイントアジ−パ ント１ｍｌ中に室温でＯＭＮ工ＴＭミキサーでホモゲナイズすることにより乳化 して調製した。

シュミッツら、前掲の方法に従い成体Ｂａ１ｂ／ｃＢｙＪマウス（体重約２０２ １ジヤクンンラボラトリース社、バーハーバ−。

メイン、アメリカ）７匹の各々にゼロ日間に完全フロインドアジュバント中のペ プチド溶液１００μ２（−＜ブチ）’　］、　ＯＯμｇ）を尾根部に経皮投与し た。７８目に生存マウス５匹の目から採血し、ＥＬＩＳＡでその血清中のにプチ ドに対する抗体の有無を実施例■に記載の方法で快定した。５血ｉ＝体のいずれ も有意な抗体価を示さなかった。】４６目に５匹のマウスに完全フロイントアジ −パント中のペプチド５組成物１００μｌ（ベプチｌ−ゝ１００／ｉ、ｙ）　を 尾根部にＭＦ！ｉ投与した。２１日目に５匹全ての目から再度採血を行い、ＥＬ ＴＳＡで血清中の抗−？プチド抗体を検定した。５検体全てが高力価の抗体を示 した。

３２日目にマウスから膵臓を摘出し、牌細胞とＳｐ２細胞株との融合を標準法に よシ実施した。生存ハイブリッド紬胞の培養物はＩ（ＡＴ培地での成育により同 定した。

培養物はまず培誉物上清のＥＬＩＳＡによシ合成ペプチドに対する抗体の存否を スクリーニングし、これは本質的には実施例■に記載のＥＬＩＳＡと同様に実泥 した。最初のスクリーニングを通過した培養物は再び本質的には実施例■に従い 、ＥＬＩＳＡ法により抗狂犬病ワクチン（ウェス・ラボラドリース、フィラデル フィア、にンシルバニア、米国、商標名ＷＹＶＡＣ）から得られる不活化狂犬病 ウィルスに結合する抗体の存否をスクリーニングする。

前節に記載の２つの検定法を用い、抗ウイルス抗体を検出するスクリーニングを 通過した培養物を用いる限界希釈法にょシ、はプテドと不活化狂犬病ウィルスの 両方に結合する抗体を産生ずるモノクローナルハイブリド−マ培養物を得た。

本発明は、その製造法および使用法を明細書および実施例により詳しく説明して きたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく多数の修飾が可能であるこ とは当業者には明らかであろう。このような修飾は本発明の範囲に含まれる。

国際！ＩＩ］査報告 １″″″″′”０″″ｌ　Ａａａｌ＋＋＋“１°　？覧：Ｔ／１．’５３Ｇ１０ １４２４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列：ＣＤＩＦＴＡ６ＳＲＧ （ただし、Ａ６はＮまたはＴである） を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、該ペプチドと哺乳動物に免 疫原性てあるキャリアタンパクとを接合させると該哺乳動物に狂犬病ウイルスに 対する免疫応答を引き起こしうるペプチド。 ２．配列：【配列があります】または 【配列があります】 （ただし、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） のうちの少なくとも１５アミノ酸の配列を含むアミノ酸配列を有する請求の範囲 第１項記載のペプチド。 ３．配列：【配列があります】 （ただし、Ａ＿１はＳまたはＰであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮま たはＫである） を含むアミノ酸配列を有する請求の範囲第２項記載のペプチド。 ４．アミノ酸配列：【配列があります】（ただし、ｉおよびｊのいずれか一方は ０で他方は１であり；Ａ＿１はＳまたはＰであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ １４はＮまたはＫである） を有する請求の範囲第３項記載のペプチド。 ５．アミノ酸配列：【配列があります】を有する請求の範囲第４項記載のペプチ ド。 ６．（１）配列：【配列があります】 （ただし、Ａ６はＮまたはＴである） を含むアミノ酸配列を有するペプチドと、（ｉｉ）哺乳動物に免疫原性であるキ ャリアタンパク、とが接合してなる合成タンパク質であって、該哺乳動物に狂犬 病ウイルスに対する免疫応答を引き起こしうる合成タンパク質。 ７．キャリアタンパクに接合したペプチドが１個のチロシンを有しており、キャ リアタンパクはＢＳＡまたはＫＬＨであり、そしてペプチドはＢＤＢを介してキ ャリアタンパクに接合している請求の範囲第６項記載のタンパク質。 ８．キャリアタンパクに接合したペプチドが配列：▲数式、化学式、表等があり ます▼または▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） のうちの少なくとも１５アミノ酸の配列を含むアミノ酸配列を有する請求の範囲 第６項記載のタンパク質。 ９．キャリアタンパクに接合したペプチドが配列：▲数式、化学式、表等があり ます▼ （ただし、Ａ＿１はＳまたはＰであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮま たはＫである） を含むアミノ酸配列を有する請求の範囲第８項記載のタンパク質。 １０．キャリアタンパクに接合したペプチドがアミノ酸配列：【配列があります 】 （ただし、ｉおよびｊのいずれか一方は０で他方は１であり；Ａ＿１はＳまたは Ｐであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） を有する請求の範囲第９項記載のタンパク質。 １１．キャリアタンパクに接合したペプチドがアミノ酸配列：【配列があります 】 を有する請求の範囲第１０項記載のタンパク質。 １２．キャリアタンパクに接合したペプチドがアミノ酸配列：【配列があります 】 （ただし、ｉかよびｊのいずれか一方は０で他方は１であり；Ａ＿１はＳまたは Ｐであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） を有する請求の範囲第７項記載のタンパク質。 １３．キャリアタンパクに接合したペプチドがアミノ酸配列：【配列があります 】 を有する請求の範囲第１２項記載のタンパク質。 １４（ｉ）配列：【配列があります】 （ただし、Ａ６はＮまたはＴである） を含むアミノ酸配列を有するペプチドと、（ｉｉ）哺乳動物に免疫原性であるキ ャリアタンパク、とが接合してなる合成タンパク質であって、該哺乳動物に狂犬 病ウイルスに対する免疫応答を引き起こしうる合成タンパク質を含む、狂犬病に 対する哺乳動物用ワクチン組成物。 １５．キャリアタンパクに接合したペプチドがアミノ酸配列：【配列があります 】 （ただし、ｉおよびｊのいずれか一方は０で他方は１であり；Ａ＿１はＳまたは Ｐであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） を有する請求の範囲第１４項記載の組成物。 １６．キャリアタンパクに接合したペプチドがアミノ酸配列：【配列があります 】 を有する請求の範囲第１５項記載の組成物。 １７．キャリアタンパクがＢＳＡまたはＫＬＨであり、ペプチドおよびキャリア タンパクがＢＤＢと接合する請求の範囲第１５項記載の組成物。 １８．キャリアタンパクがＢＳＡまたはＫＬＨであり、ペプチドおよびキャリア タンパクがＢＤＢと接合する請求の範囲第１６項記載の組成物。 １９．（ｉ）配列：【配列があります】（ただし、Ａ６はＮまたはＴである） を含むアミノ酸配列を有するペプチドと、（ｉｉ）哺乳動物に免疫原性であるキ ャリアタンパク、とが接合してなる合成タンパク質の免疫原性量を哺乳動物に注 射することからなる方法によって産生される抗狂犬病抗血清。 ２０．抗血清を産生する方法におけるキャリアタンパクに接合したペプチドがア ミノ酸配列： 【配列があります】 （ただし、ｉおよびｊのいずれか一方は０で他方は１であり；Ａ＿１はＳまたは Ｐてあり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） を有する請求の範囲第１９項記載の抗血清。 ２１．抗血清を産生する方法におけるキャリアタンパクに接合ししたペプチドが アミノ酸配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第２０項記載の抗血清。 ２２．抗血清を産生する方法におけるキャリアタンパクがＢＳＡまたはＫＬＨで あり、ペプチドおよびキャリアタンパクがＢＤＢと接合する請求の範囲第２０項 記載の抗血清。 ２３．抗血清を産生する方法におけるキャリアタンパクがＢＳＡまたはＫＬＨで あり、ペプチドおよびキャリアタンパクがＢＤＢと接合する請求の範囲第２１項 記載の抗血清。 ２４．抗血清を産生する方法における注射を受ける哺乳動物がマウス、ラット、 ウサギ、ウマまたはヒトであり、該哺乳動物は合成タンパク質で高度免疫される 請求の範囲第２２項記載の抗血清。 ２５．抗血清を産生する方法における注射を受ける哺乳動物がマウス、ラット、 ウサギ、ウマまたはヒトであり、該哺乳動物は合成タンパク質で高度免疫される 請求の範囲第２３項記載の抗血清。 ２６．組成物中の各抗体が （ｉ）配列：【配列があります】 （ただし、ｋは０または１であり、ｍは０または１であるがｋとｍの両方が１と なることはなく；Ａ＿１はＳまたはＰであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４ はＮまたはＫである）を有するペプチドと結合し得、且つ （ｉｉ）狂犬病ウイルスまたは狂犬病ウイルス膜糖タンパクと結合し得る、 １または複数の抗体を含む組成物。 ２７．各抗体が配列：【配列があります】（ただし、ｐは０または１であり、ｑ は０または１であるがＰとｑの両方が１となることはなく；Ａ６はＮまたはＴで ある） を有するペプチド上のエピトープに結合し得る請求の範囲第２６項記載の組成物 。 ２８（ｉ）（１）配列：【配列があります】（ただし、Ａ＿１はＳまたはＰであ り、Ａ６はまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチド、または（２）前記（ｉ）（１）に規 定する合成ペプチドと免疫原性キャリアタンパクとが接合してなる合成タンパク 質、を用いてｉｎｖｉｔｒｏ免疫するか或いはｉｎ　ｖｉｖｏ接種した哺乳動物 から得たＢ細胞より調製され、且つ（ｉｉ）（ａ）配列：【配列があります】（ ただし、ｋは０または１であり、ｍは０または１であるがｋとｍの両方が１とな ることはなく；Ａ＿１はＳまたはＰであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４は ＮまたはＫである）る有するペプチドと結合し得、且つ （ｂ）狂犬病ウイルスまたは狂犬病ウイルス膜糖タンパクと結合し得る、 抗体を分泌するハイブリッド細胞からなる、ハイブリドーマ培養物。 ２９．配列：【配列があります】 （ただし、ｉおよびｊのいずれか一方は０で他方は１であり；Ａ−１はＳまたは Ｐであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＮまたはＫである） を有するペプチドをｉｎ　ｖｉｖｏ接種した哺乳動物からＢ細胞を得る請求の範 囲第２８項記載のハイブリドーマ培養物。 ３０．哺乳動物に接種するペプチドが配列：【配列があります】 を有する請求の範囲第２９項記載のハイブリドーマ培養物。 ３１．Ｂ細胞がマウス、ラット、ウサギ、ウマまたはヒトからのものである請求 の範囲第２９項記載のハイブリドーマ培養物。 ３２．Ｂ細胞がマウス、ラット、ウサギ、ウマまたはヒトからのものである請求 の範囲第３０項記載のハイブリドーマ培養物。 ３３．Ｂ細胞がＢｌｂ／ｃまたはＢａｌｂ／ｃＢｙＪマウスからのものであり、 培養物製造の過程において該Ｂ細胞はＳ１９４またはＳｐ２ミエローマ細胞株の 細胞と融合される請求の範囲第３１項記載のハイブリドーマ培養物。 ３４．Ｂ細胞がＢａｌｂ／ｃまたはＢａｌｂ／ｃＢｙＪマウスからのものであり 、培養物製造の過程において該Ｂ細胞はＳ１９４またはＳｐ２ミエローマ細胞株 の細胞と融合される請求の範囲第３２項記載のハイブリドーマ培養物。 ３５．配列：【配列があります】または【配列があります】 （ただし、Ａ＿１はＳまたはＰであり、Ａ６はＮまたはＴであり、Ａ１４はＫま たはＫである） を有するペプチド。 ３６．放射性ヨウ素でＹ残基を放射能標識した請求の範囲第４項記載のペプチド 。 ３７．放射性ヨウ素でＹ残基を放射能標識した請求の範囲第５項記載のペプチド 。