JPS63501983A - 試験物質の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 試験物質の測定 発明の背景 本発明は、物質についての、具体的には″アッセイ”による、更に具体的には１ ′イムノアツセイ″による試験に関する。

アッセイとは、試験物質が存在又は非存在であるか否かについて調べ、更に必要 であればその量について調べる操作法のことである。

“イムノアッセイ″の場合において、試験は、生体の免疫系によって産生される か又は免疫系において応答を引き起こす“免疫学的″試剤を必要とする。免疫系 によって産生される試剤は″抗体″である。それらはウィルスのような外来物質 に対する生体の応答に起因するか、あるいは妊娠のような生体化学による身体的 変化に応答して生ぜしぬられる。゛′抗体”は“抗原”の存在に対する応答であ る。例えば、妊娠期間中生体はヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）として知ら れるホルモンを高レベルで産生ずるが、そのホルモンの名称はそれが生殖器で産 生されることからそのように称せられている。非ヒト生体は、抗ＨＣＧとして知 られる抗体を産生ずることにより、　ＨＣＧの接触に対して応答する。もう１つ のサンプルは、淋病として知られる性病を引き起こす淋菌（ＧＣ）細菌である。

生体は抗ＧＣとして知られる抗体を産生ずることにより応答する。

抗原に対する応答が抗体であることから、いずれかの測定は標識補体を用いて行 なわれ得ることが受け入れられている。したがって、妊娠抗原（ＨＣＧホルモン ）を検出することが望まれる場合には、対応抗体は指示薬で標識され得る。標識 抗体は次いで対応抗原を含有しているかもしれない試験サンプルと接触せしめら れる。抗原が存在する場合には、標識抗体は抗原と結合し、抗原に結合した標識 又は指示薬は様々な方法によって検出することができる。

これらの方法では免疫系に関与する抗体及び抗原を用いることから、それらはイ ムノアッセイとして知られる。

元来、標識指示薬は放射性及び／又は蛍光物質であった。

したがって、抗原、及び放射性もしくは蛍光物質で標識された抗体が同時に存在 している場合には、標識の存在は抗体及び抗原間の結合反応の検出を可能ならし めることができた。

ラジオイムノアッセイは、それらが放射性物質の潜在的危険性を伴う点において 好ましいものではない。更には、フルオロイムノアッセイは蛍光染料（フルオレ セイン及びローダミンのような蛍光色素）を必要とすることに難点がある。これ らは、高価でかつ広い利用可能のない蛍光顕微鏡によってのみでしか検出できな い。

このように、ラジオ及びフルオロイムノアッセイは主に研究所向けであり、家庭 的診断には不適であった。かかる困難を克服するために、酵素が標識物質として 使用されてきた。検出されるべき抗体又は抗原は、その標識された一方の相手と 一緒に使用される。検出が抗原に関して行なわれる場合には、標識される相手側 は酵素標識抗体である。必要なことは、いずれにしても、酵素と反応しかつその 存在を指示し得る指示薬を用いることである。

典型的な酵素イムノアッセイの場合、試験抗原に対し特異的な抗体は最初にプラ スチック製チューブのような固体表面の上に過剰に吸着せしめられる。抗原含有 の試験溶液がしかる後扉えられ、抗原が抗体と結合する。抗体と結合したすべて の物質を含有する゛固相″は、次いで未結合成分を除去するために完全に洗浄さ れる。しがる後試験において結合抗原を確認する。

サンドインチ抗体ＥＬＩＳＡ法においては１例えば、好ましくは第一抗体のもの とは異なる結合部位を有する酵素標識第二抗体が加えられ、それは結合抗原の特 異的決定部位と反応する。酵素標識第二抗体は、同相中の及び第一抗体に結合し たすべての抗原が酵素標識第二抗体と確実に結合するように、過剰に加えられる 。酵素標識第二抗体分子は、抗原上の利用可能な特異的結合部位に応じて一定の 比率で各抗原分子と結合する。固相は、過剰の第二抗体及び他のすべての未結合 成分を除去するために再び洗浄される。酵素′″基質、即ち酵素と反応する物質 は、次いで結合同相と接触するように、過剰量で溶液中に加えられる。ペルオキ シダーゼ酵素の場合、基質は過酸化水素及び発色物質の溶液である。

上記のような酵素イムノアッセイの典型的試験操作では、過剰の物質を除去する ために、別々の洗浄段階を必要とすることが明らかである。　゛ しかも、通常過酸化水素及び発色物質である指示薬物質の成分は、試験開示時間 まで別個に保存されねばならない。指示薬物質が事前に混合された場合には、効 果が減退してしまい、得られる溶液はしばらく時間を経た後には使用に適さなく なる。実際に、発色試薬及び過酸化水素は、それらが１時間はどの短時間で貯蔵 された場合に酸化しかつ自然に発色しがちであることから、各々の使用直前に新 しいバッチ中で混合されねばならない。

したがって、試験物質の測定及び試験物質に関するアッセイを容易化することが 、本発明の目的である。関連目的は、イムノアッセイ、特に酵素イムノアッセイ の操作を容易化することである。

本発明のもう１つの目的は、従来技術で必要な洗浄を簡易化することである。関 連目的は、試験″サンドイッチ”の形成後における洗浄を完全に不要とすること である。

本発明の更に別の目的は、酵素アッセイに要する時間を減少させることである。

本発明のもう１つの目的は、過酸化水素のような活性化剤に発色剤を結合させる 必要性を解消することである。

関連目的は、発色剤ケ活性化剤との事前の結合に起因するあらゆる悪影響を解消 することである。

発明の要旨 前記及び関連の目的を達成するため、本発明は、試験物質が存在するか否かを、 試験物質含有サンプルを第一標識物質と混合することにより調べる方法を提供す る。

この混合物は次いで第二標識物質と混合され、物質はそれらの標識物質のうちの １種と反応した後、他種の標識物質と反応し得る試薬を生じる。

本発明の一面によると、指示薬は試薬及び変色性標識のうちの１種と反応する。

指示薬はロイコ染料、好ましくはテトラメチルベンジジン又はその誘導体であり 、標識は別種の異なる酵素である。酵素の１つはグルコース又はコレステロール 等の物質と反応するオキシダーゼあって、過酸化物を生じる。他の酵素は過酸化 物及びテトラメチルベンジジンと反応するペルオキシダーゼであって、色の変化 を生じさせる。

本発明のもう１面によると、第二標識物質は多孔質支持体に結合している。試験 物質が存在する場合、それは第−標識物質及び第二標識物質と結合する。標識の １種により生じる過酸化物は、他の標識及びテトラメチルベンジジン等の指示薬 と反応して、試験物質の存在を示す変色を起こす。第一標識物質が未結合、即ち 試験物質が存在しない場合には、試薬、指示薬及び第二標識の量は未結合第一試 薬が変色を呈する前に除去されるように予め調整される。

本発明の他の面によれば、第一標識物質、第二標識物質、第一物質試験サンプル の第一反応を可能にする手段、第二物質と第一反応の生成物との反応を可能にす る手段、及び指示薬を更に反応に供するための手段を収納した試験キットが提供 される。このキットにより、試験物質が存在する場合には変色を生じさせること ができる。第一物質は望ましくは第一酵素で標識され、第二物質は望ましくは第 二酵素で標識される。指示薬は望ましくはベンジジン又はベンジジンの誘導体で ある。第一物質は第一容器により担持され、第二物質は第二容器により担持され る。実際には、第一容器は試験管であって、その中に第一物質は液体又は凍結乾 燥品として存在しており、一方第二容器は第二物質用の多孔質支持体たる容器で ある。

結果的に、第二物質の補体が試験サンプル中に存在する場合には、これは支持体 上の第二物質と結合することができる。これは第一標識補体と一緒に支持体に結 合していることから、支持体上で生じる変色等の反応は試験物質が存在するか否 の指示を与えることができる。この目的のためには、支持体は第二容器又は収納 器の外側から目で見えることが重要である。

本発明の別の面によれば、試験物質の存在又は非存在を示す構造体は、収納器を 用意し、収納器内に多孔質膜を入れ、標識物質を担持するために多孔質膜を用い 、かつ多孔質物体上に多孔質膜を載せることによって製造される。標識物質は望 ましくはグルコースオキシダーゼのようなオキシダーゼたる酵素標識を有する。

多孔質膜は収納器の開口部に装備され、試験物質が存在する際に変色を呈するよ うに開口部が蓋で覆われていない場合には目で見ることができる。標識物質を担 持する多孔質膜は、膜を支える多孔質物体よりも低い気孔度であることが望まし い。その理由は、試験物質が存在せず、第一標識が膜からその下のより気孔度の 高い物体中に洗い落とされ、変色が多孔質層中で観察されないようにするためで ある。

図面の説明 本発明のその他の面は、下記図面とともにいくつかの実施態様を考慮すれば明ら かとなる： 第１図は本発明の試験収納器である。

第２図は、第１図の試験収納器及び補助試験部品を利用した本発明の試験アッセ イの説明図である。

詳細な説明 図面において、第１図は３つの基本的部品、即ち試験収納器２０、予備混合バイ アル３０及び指示薬バイアル４０からなる試験キット１０を示す。試験収納器は 、それぞれ多孔質支持体及びその上の多孔質膜にそれぞれ相当する内部部品２１ 及び２２の関係を示すためにその側壁の一部が切欠かれた形で示されている。

下部多孔質支持体２１及び上部膜２２の特定の関係は第２図の断面図でより詳し く記載されている。収納器２ｏは、膜２２の表面の実質的部分を露出させかつ収 納器２１に液体を導入させ得る開口部２３を有している。

かかる目的のために、収納器の上部には基礎容器２５の上に装備された保持壁２ １−４〜２４−４を有している。

混合バイアル３０は、酵素標識抗体のような第一標識物質で覆われる内部壁３１ を有する。便宜上、酵素標識抗体はＡＢ−Ｅｌと示されている。

キット１ｏの残りの部品は指示薬バイアル４０である。

これは、第２図に関して以下で詳細に説明される如く指示薬液が試験収納器に加 えられた場合に変色を呈する発色剤等の物質を含有している。指示薬バイアル４ ０はテトラメチルベンジジンもしくはその誘導体の１種のような発色剤、及び酵 素用の゛基質″を含有している。６基質″は、それが酵素標識と反応することか ら、このように呼ばれる。第１図の場合において、問題の酵素は多孔質膜２２上 の抗体に結合せしめられる。便宜上、酵素標識抗体はＡＢ−Ｅ、と示されている 。

本発明の試験操作は第２図で説明される。抗原（ＡＧ）等の試験物質を含有して いる可能性がある試験サンプルはバイアル３１に加えられる。抗原が試験サンプ ル中に存在する場合には、これは式（１）： ％式％（：） のようにバイアル３０中で酵素標識抗体と結合する。

この第一段階の結果として、試験物質が存在する場合には対応抗原と結合した酵 素結合抗体を試験サンプル中で生じることになる。次いでバイアル３０の内容物 は次いで、第二酵素結合抗体含有の膜１２上に、矢印２で示される如く加えられ る。試験抗原が式１のように第一抗体と結合している場合には、膜２２上におけ るかかる物質と酵素結合抗体との共存により、下記式（２）：％式％（２） で示される反応を生じる。

次の段階では、矢印３で示されるように指示薬バイアル４０の内容物を加える。

指示薬バイアルが酵Ｍ　Ｅ　２　と反応する“基質″を含有しているため、これ によって式（３）： ％式％（） で示されるように例えば過酸化水素等の試薬を発生する。

式（３）の生成物は次いで式（４）： Ｈ，Ｏ，＋　Ｉ　＋Ｅ１−−→変色　（４）で示されるように第一酵素Ｅ工と反 応する。

本発明のもう一面は以下に記載されている。膜２２において、様々な濃度のグル コースオキシダーゼが、−緒に固定される抗体のレベルを一定に保ちながら、固 定される。この操作は通常滴定と呼ばれる。モノクローナル抗体（ＬＨ２６２０ ９Ｈ１０）１．４ｍｇ／ｍａＱの貯蔵液で３０■／ｍＱから１．８μｇ／ｍＱま での濃度に数回にわたり希釈される。グルコースオキシダーゼ（Ｇｏ）及びＡＢ 金含有貯蔵液は、ＰＢＳ緩衝液中においてＰＨ７，２である。グルコースオキシ ダーゼの正確な量は、３０，１５゜７．５，３．７及び１．８　ｐｇ／ｍｌｌ　 テアル。

同時に、デキストロースがｐＨ５，０のクエン酸リン酸緩衝液中で希釈される。

この物質の濃度は、　５０゜１２．５．３．１２，０．７８及び０．１９５ｇ／ ｆｌ　である。更に、イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）　ＣＡ７２０　０．９ｍｇが各 々の溶液に加えられ、１４．９ｍＱに調整される。

前記固定化操作は、腰当たりＡＢ−Ｇｏ混合物３．０ＬＩＩＱ　を加えかつ１０ 秒間乾燥することによって着手される。ブロッキング相は、カーネーションミラ ーにＰＢＳ緩衝液を減圧下で通過させかつデシケータ−中で膜を乾燥させること によって得られる。

アッセイ段階は下記のとおりである： 凍結乾燥複合体０．２５ｍｆｉがＬＨホルモン含有試料０．２５１１ＩＱで再生 される。凍結乾燥物質の溶解後、液体は複合試験装置中の固定ＡＢ及びＧｏ含有 膜上に注がれる。この装置は上から下にかけて順次、膜、半固体多孔質板及び吸 着マトリックスからなる。

本発明のその他の面は、当業者であれば明らかとなるであろう。

手続補正書 昭和６２年ｌＯ月　２日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２６８１ 、発明の名称 試験物質の測定 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　デニソン　マニュファクチュアリング　カムパニー４、代理人 住所〒１００ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試験物質が存在するか否かを測定するための方法であって、 （１）試験物質を含有しているかもしれないサンプルを第一標識物質と混合する ； （２）段階（１）の生成物を第二標識物質と混合する；（３）別の標識物質と反 応し得る試薬を生じさせるために、段階（２）の生成物に１種の標識物質と反応 する物質を加える； 段階からなる方法。 ２．指示薬が変色を起こすように試薬及び１種の標識物質の標識と反応する、請 求の範囲第１項記載の方法。 ３．指示薬がテトラメチルベンジジン又はその誘導体のようなロイコ染料であり 、標識がペルオキシダーゼのような別種の異なる酵素である、請求の範囲第２項 記載の方法。 ４．酵素の１種が過酸化物を生成する物質と反応するオキシダーゼである、請求 の範囲第３項記載の方法。 ５．別の酵素が変色を起こすように過酸化物及びテトラメチルベンジジンと反応 するペルオキシダーゼである、請求の範囲第４項記載の方法。 ６．第二標識物質が多孔質支持体に結合せしめられる、請求の範囲第５項記載の 方法。 ７．試験物質が、存在している場合には、第一標識物質及び第二標識物質と結合 し、しかも１種の標識によって生ぜしめられた過酸化物が上記試験物質の存在を 示す変色を起こすように別の標識及び指示薬と反応する、請求の範囲第６項記載 の方法。 ８．第一標識物質が、試験物質が存在しない場合には結合せず、試薬が第一標識 によって生ぜしめられず、しかも第二標識及び指示薬の反応が発生し得ない、請 求の範囲第６項記載の方法。 ９．変色が生じ得る前に支持体から指示薬による未結合第一変色体を洗浄除去す る段階を含む、請求の範囲第６項記載の方法。 １０．第一標識物質； 第二標識物質； 第一物質と試験サンプルとの第一反応を可能にする手段； 第二物質と上記第一反応の生成物との反応を可能にする手段；及び 試験物質が存在する場合に変色を起こすように指示薬を更なる反応に供するため の手段； からなる試験キット。 １１．第一物質が第一酵素で標識されており；第二物質が第二酵素で標識されて おり；かつ指示薬がベンジジンである、 請求の範囲第１０項記載の試験キット。 １２．第一物質が第一容器によって担持されており；かつ 第二物質が第二容器によって担持されている、請求の範囲第１０項記載の試験キ ット。 １３．第二容器が第二物質用の多孔質膜を有しており、もって第一物質、試験サ ンプル及び第二物質の複合体であるサンドイッチが上記膜上で形成され得る、請 求の範囲第１２項記載の試験キット。 １４．多孔質膜が第二容器の外部から目で見ることができる、請求の範囲第１３ 項記載の試験キット。 １５．試験物質の存在又は非存在を示す構造体の製造方法であって、 （１）収納器を用意する； （２）上記収納器内に多孔質物体を入れる；（３）標識物質を担持するために多 孔質膜を用いる；及び （４）上記標識物質担持の上記多孔質膜を上記多孔質物体上に載せる； 段階からなる方法。 １６．物質が酵素標識を有する、請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．酵素がオキシダーゼである、請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである、請求の範囲第１７項記載 の方法。 １９．多孔質物体が収納器の開口部に装備され、該開口部が蓋をされていない場 合には知覚し得る、請求の範囲第１５項記載の方法。 ２０．物体の気孔度が膜の気孔度よりも大きい、請求の範囲第１５項記載の方法 。