JPS63503545A - ワクチン及び診断マーカーとして有用なネイセリア・ゴナリーア・レクチン及びこのレクチンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン及び診断マーカーとして有用なネイセリア・ゴナリーア・レクチン及び このレクチンの製法（関連出願の引用文献） この出願は、１９８６年６月１８日提出の米国特許出願番号第８７５．４７７号 の一部継続出願である。

（技術分野） 本発明は、ネイセリア・ゴナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ ａｅ）に対する接種物又はワクチンに用いるのに適するレクチン、そのレクチン を含むワクチン及び淋病の診断法に関するものである。さらに特に、この発明は 、淋菌から得られるネイセリア・ゴナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ ｒｈｏｅａｅ）のレクチン、そのレクチンの単離法、それらから調製した接種物 、そして、又はワクチン及びそのようなレクチンの製法に関連している。

（技術的背景） ネイセリア・ゴナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）　（ Ｎ　、　ｇ　、　）による報告された感染の年間の発生率は、約２百分件である と見積られている０通常男性への淋菌感染は、比較的単純な性尿器怒染である。

普及した淋菌感染は淋病を者の１〜３％の率で発生すると報告されており、一方 、現在の治療によりこの病気の症状は軽いものである。

一方、淋病に感染した女性において、卵管炎が１０〜２０％の割で発生し、そし て、うまく処理したときでさえ、卵管炎再発、異所性妊娠及び不妊などをもたら す。アメリカにおいて卵管炎は毎年１８０万件の医師の診療があり、２２万件の 病院収容がある。

今日までの公的健康診断による淋病の管理は、難かしい点がある。

死んだ淋菌の全菌体を含むワクチンは有効である。グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎ ｂｕｒｇ）等、（１９７１年）、プレチン、オン、ワールド、ヘルス、オーガニ ゼーション（［１ｕ１１．ｌ１ｌｄ、　１１１ｔｈ、　Ｏｒｇ、＞４５巻、５３ １頁“淋菌ワクチンの開発の予備研究”。

淋菌のペニシリン及びテトラサイクリン耐性病も発生している。

淋菌感染は、その細菌による粘膜のコロニー化、その表面膜へのコロニー化細胞 の粘着に仲介される過程を含んでいる。“粘着”という語は、表面への細菌の比 較的安定した付着を意味している。そのような粘着活性に寄与する構造を、アト へシンと呼ぶ。

淋菌のピリは、反復する同一サブユニット（ビリン）を含む繊維状構造を有する アトへシンである。Ｎ、　ｇ、０Ｍ５ＩＩ株において、各ピリンは、およそ１８ ．０００ダルトンの分子量をもつ。淋菌の上皮表面への付着は、抗ピリ抗体で防 ぐことができる。細胞付着の防止に加えて、ビリタンパク質に対して生じた抗体 もオンソニン性である。

すなわち、それらは、血液中の食細胞により、侵入細菌を死滅することを仲介す る。しかし、ワクチンとして、ビリ免疫原を用いることは、異種株のＮ、ｇ、で 作られたピリの血清学的交差反応性の欠除のために、実際的ではない。

我々は、真核細胞表面のスフィンゴ糖脂質、例えば、ラクトシルセラミド、イソ グロボトリオシルセラミド、ガングリオトリオシルセラミド及びガングリオトリ オシルセラミドは、Ｎ、ｇ、の認識及び粘着に関連し、そして、細菌のタンパク 質が、特異的な糖配列（炭水化物構造）を認識し、そしてこれに結合する能力を 有することから、糖脂質指向認識は、これまで報告されていない細菌性レクチン により仲介されていることを発見した。接種物、ワクチンの構成物として又は診 断法において、この細菌性レクチンを用いると、ビリ免疫原のこれまで述べられ てきた短所は考えなくて済む。

（発明の概要） 本発明は、ＧＣ＞１と命名した、細菌性レクチン単離物を考えている。このレク チンは淋菌から得られ、真核性炭水化物に結合し、そして、約２２．４００ダル トンの相対分子量を有している。このレクチンの等電点は、約６．１から約６． ４の範囲にある。このレクチンは、ガングリオテトラシルセラミドに特異的に結 合する能力を有し、そして、淋病に対する接種物もしくはワクチンの構成物とし ても有用である。このレクチンは、単離された形もしくは、薬学的に許容された その塩として用いることができる。

さらに、本発明は、先に述べた単離レクチン又は、薬学的に許容されたその塩及 びそれらのための薬学的に許容されたキャリヤーから構成される接種物及びワク チンについても考えている。また、薬学的に許容されたキャリヤー又は希釈物中 の効果的量の単離レクチン又はその先に述べた塩を、患者に投与することによる 淋菌感染に対する免疫法についても考えている。

さらに、本発明は、ＧＣＬ−ルクチンをコードする単離されたＤＮＡ断片、生物 学的宿主内に存在する同ＤＮＡ断片、前述生物学的宿主が発現ベクター中に存在 するＧＣＬ−１コード遺伝子の発現に適した生育培地に存在するか、適当な発現 培地中に含まれる培養物について考えている。

（図面の簡単な説明） 本発明の公開の一部は図式で行っている。

図１は、分子量マーカータンパク質の位置及びその右に１０００ダルトン単位で 示した各々のそれらの相対的分子ｆｆｉを付けた、銀染色した１２％５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥゲルの写真である。

レーンＡは、約１８．０００ダルトンの相対分子量をもつ、精製したピリンタン パク質を含んでいる。

レーンＢは、実施例１で生じた粗ＧＣＬ−１抽出物から、本発明のレクチン（Ｇ ＣＬ−１）でアフィニティー吸着した後に残るタンパク質の試料を含んでいる。

ＧＣＬ−１は検出法の限界内のレベルで存在しないことが示されている。しかし 、ピリンタンパク質は、１８．０００の分子量位置に見ることができる。

レーンＣは、２２．４００ダルトンの位置に存在するアフィニティーで単離した ＧＣＬ−１を含んでいる。ピリン又はピリン関連のタンパク質は実質的に存在し なかった。

レーンＤは、実施例１に述べられているように、グロボシド・アフィニティー、 ＃離にかけた粗ＧＣＬ−１抽出溶液の溶出液を含んでいる。この溶液は、糖脂質 アフィニティー・マトリクスへの非特異的結合を検出する、コントロールとして 用いた。本レーンに、ＧＣＬ−１の有意な量が存在しなかったことは、ガングリ オテトラシルセラミド・アフィニティー・マトリクスへのＧＣＬ−１の結合は、 特異的なレクチン・リガンド相互作用であることを示している。

レーンＥは、次の分子量マーカータンパク質を含んでいる。α−ラクトアルブミ ン、１４；ソイビーン・トリプシン・インヒビター、２０；トリプシノーゲン、 ２４；カルボニック　アンバイトラーゼ、２９；グリセルアルデヒド−３−ホス フェート・デヒドロゲナーゼ、３６；エフグ・アルブミン、４５；及びウシ・ア ルブミン、６６（１０００ダルトン単位で示しである）。

図２は、アフィニティー単離したＧＣＬ−１で生じた、ウサギ抗ＧＣＬ−１抗体 を用いた、ＧＣＬ−１含有溶液のウェスタン・プロット分析の写真である。指示 した相対分子量を有する（１０００ダルトン単位で示した）タンパク質の予想位 置をプロントの左に示した。

レーンＡは、実施例１で生した粗ＧＣＬ−１抽出物の試料を含んでいる。ＧＣＬ −１は、約２２，４００ダルトンの相対分子量を有する主要タンパク質バンドで ある。ピリン関連レクチンであると考えられている、２つのマイナータンパク質 バンドは、約２９，０００ダルトン及び約３６．０００ダルトンの位置にあるよ うだ。

レーンＢは、実施例１で作られたビリンクンバク質含有ベレントの試料を含んで いる。ＧＣＬ−１は、実質的に存在する一方、他のピリン及びピリン関連タンパ ク質も実質的に存在する。

レーンＣは、他のピリン関連タンパク質を実質的に含まない、アフィニティー単 離したＧＣＬ−１を含んでいる。

図３は、ウサギの抗ＧＣＬ−１抗体が、Ｎ、ｇ、により生じたＧＣＬ−１と同じ 相対的分子量をもつモレゼラ・ボビス（Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ　ｂｏνｉｓ）によ り生産されたタンパク質と交差反応することを示すウェスタンプロットの写真で ある。レーンＡは、Ｎ、ｇ。

ＭＳＩＩ株ピリなし変異体Ｂ２の実施例１に従って調製した粗ＧＣＬ−１抽出物 を含んでいる。レーンＢは、モノゼラ・ボビス（Ｍｏｒｅｘ−ｅｌｌａ　ｂｏν ｉｓ）から同様の方法で二層製した抽出物を含んでいる。

図４は、ｐＨ勾配を応用したモノＰクロマトフオーカシングカラムからの溶出に よる実施例の粗ＧｃＬ−１抽出物の精製を説明するグラフである。その溶出液を 、線型減少ｐＨ勾配で溶出してきた画分の、２８０ナノメーターの吸光度での光 学密度（０，Ｄ、２８０）での測定により、タンパク質をモニターした。ＧＣＬ −１を含むピーク画分は、約６．１から６．４よりわずかに高いｐＨ範囲でクロ マトフオーカシングカラムから溶出して来た。これを矢印で示す。

図５は、クロマトフオーカシングカラムで単離したＧＣＬ−１で生じたウサギの 抗ＧＣＬ−抗体を用いた、ＧＣＬ−１含有溶液のウェスタンプロット分析の写真 である。指示した相対分子量を有する（１０００ダルトン単位で示した）タンパ ク質の予想される位置をプロットの左に示した。

レーンＡは、実施例５で述べるプラスミドｐＨ３ｓ６を含むが、淋菌ＤＮＡ挿入 物を欠いている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の培養試料を含ん でいる。この試料は、実施例５で述べるように、５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファ 中で分解し、電気泳動及びウェスタンプロットにかけた。

レーンＢは、実施例１で生じ、レーンＡで述べたように分析した粗ＧＣＬ−１抽 出物の試料を含んでいる。ＧＣＬ−１は、約２２．４００ダルトンの相対分子量 をもつ主要タンパク質バンドである。

レーンＣは、次に示す再染色した分子量マーカータンパク質（ＭＤ州、ゲイサー スバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）　、ヘセスダ・リサーチ８ラボラドリー ス（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｎｉｓ））を含ん でいる。ミオシン、２００；ホスホリラーゼｂ、９７．４；ウシ血清アルブミン 、６８；オバルブミン、４３；モモトリブシンノーゲン、２５．７．β−ラクト グロブリン、１Ｂ、４；リゾチーム、１４．３（すべて１０００ダルトン単位で 示した）。

レーンＤから０は、実施例５で述べるように、その中に淋菌ＤＮＡを挿入したプ ラスミドｐＨ３ｓ６を含む大腸菌の各培養物由来の試料を含み、それらは、レー ンＡで述べたように分析した。

（発明の詳細な記述） （定　義） ここで用いている、種々の文法型の“抗体”という語は、抗原を特異的に結合す る生物学的に活性のある抗体結合部位を含む、免疫グロブリン又は、その断片を 指す。

ここで用いている“複合体”という語は、レクチンがリガンドに特異的に結合し たときに形成される生産物を指す。

ここで用いている“免疫反応物”という語は、免疫学的反応の生産物、すなわち 、抗原が抗体と免疫学的に結合したときに生じる実体を指す。

レクチンに関し、ここで用いられている“単離（された）″という語句は、他の 淋菌タンパク質を実質的に含まないレクチンを指す。

この語句が本発明の抗体調製物に関して用いられたときは、この語句は他の抗淋 菌タンパク質抗体を実質的に含まない抗ＧＣＬ−１抗体を指している。

“リガンド”という語は、レクチンと特異的に結合する炭水化物構造を存する分 子を指している。

ここで用いている“薬学的に許容された塩”とは、単離されたレクチンの無毒性 のアルカリ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム塩を指している。このよう な塩は一般に薬学的工業で用いられており、当分野でよく知られている方法で調 製される、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム及びア ンモニウム及びそれに類するものを含んでいる。またこの語は、−ｉに、本発明 のレクチンを、適当な有機又は無機酸と反応させることにより調製する、無毒の 酸付加塩も含んでいる。代表的塩には塩酸塩、臭酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、酢 酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリル酸塩、ホウ酸塩、安息香 酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、 フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩及びそれに類するものが含まれる。

本発明で考えられている単離された淋菌炭水化物結合タンパク質又はレクチンは 、比較分子量標準物質としてα−ラクトアルブミン、ソイビーン・トリプシン・ インヒビター、トリプシノーゲン、カーボニック・アンバイトラーゼ、グリセル アルデヒド−３−ホスフェート・デバイドロゲナーゼ、エラグ・アルブミン及び ウシ・アルブミンを用いた、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　によ、７測定され、約２２，４００ダルトン の相対分子量を有していた。すなわち、本発明のレクチン（ＣＧＬ−１）の電気 泳動移動度は、ソイビーン・トリプシン・インヒビターとトリプシノーゲンの間 である。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量決定の技術及び信頼性は当業者にはよく 知られている。

ウニバー（Ｗｅｂｅｒ）等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー （Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２４４巻、４４０６−４４１２頁（１９６ ９年）、ズワーン（Ｚｗａａｎ）、ジャーナル・オン・アナリティカル・バイオ ケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、）　２１巻、１５５−１６８頁 （１９６７年）。

ＧＣＬ−１は、約６．１から約６．４の等電ｐＨ値をもっと特性づけられている 。タンパク質の等電ｐｎ又は等電点は、そのタンパク等が正味の電荷をもたない ｐ）Ｉ値のことである。このように、等電点においては、そのタンパク質は、電 場で移動しない。ポリアクリルアミドゲルを用いた、タンパク質の等１ｉｐＨ値 の測定法は、この分野ではよく知られている。アレン（ＡＩｉｅｎ）　Ｒ、Ｃ、 及びマウラー（Ｍａｎｒｅｒ）Ｈ，Ｒ，、（１９８４年）、ニューヨーク、ウオ ルター・デ・グルイタ−（Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ）、′ポリアク リルアミドゲル中の電気泳動と等霊的フォーカシング；アーバスノフト（Ａｒｂ ｕｔｈｎｏｔ）Ｊ、Ｐ、及びビーリー（Ｂｅｃｌｅｙ）　、Ｊ、Ａ、（１９７５ 年）ロンドン、バターワース（Ｂｕｔｔｅｒ　ｗｏｒｔｈｓ）　、“等霊的フォ カシング。

ＧＣＬ−１もスフィンゴ糖脂質、ガングリオトリオシルセラミド及びガングリオ トリオシルセラミドに特異的に結合する。

レクチンが炭水化物リガンドに特異的に結合する能力を測定する方法は、この分 野では、よく知られている。これらの方法は、関係するレクチンによる、赤血球 細胞凝集の結合阻害研究又は、多Ｉ！類の沈殿化を含んでいる。アフィニティー 吸着剤としてレクチン又は、炭水化物リガンドを用いた、アフィニティー・クロ マトグラフィーも本目的に使用することができる。

典型的には、既知量のＧＣＬ−１を、予め既知量のスフィンゴ糖脂質と混合する 。その混合物を、ＧＣＬ−１が、そのスフィンゴ糖脂質リガンドと複合体を形成 するのに十分な時間である、約１０分から約１６−２０時間までの、分から時間 に及ぶ予め決められた時間、生物学的検定条件下に維持する。

生物学的検定条件は、本発明の単離されたレクチン及びその目標リガンドの生物 学的活性を維持する条件である。そのような検定条件には、約４℃から約４５℃ の温度範囲、約５から約９のｐＨ値範囲、及び蒸留水から、約１モル濃度の塩化 ナトリウムの範囲のイオン強度を含んでいる。これらの条件を至適化する方法は 、この分野では、よく知られている。

形成したＧＣＬ−１含有複合体の存在を、この分野でよく知られている検定技術 により直接的又は間接的に検定した。ＧＣＬ−１が特異的に結合するスフィンゴ 糖脂質を提供する方法は、この分野では、よく知られている。たとえば、ハンソ ン（Ｈａｎｓｏｎ）等、ＦＥＢＳ。

１７０巻、１５−１８頁（１９８４年）、ブルイマ−（Ｂｒｅｉｍｅｒ）等、ジ ャーナル・オン・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、）　９０巻 、５８９−６０９頁（１９８１年）、カールソン（Ｍａｒｌｓｓｏｎ）及びラー ソン（Ｌａｒｓｏｎ）　、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（ Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２５７巻、５５７−５６８頁（１９８２年） ；フ″レイマー（Ｂｒｅｉｍｅｒ　）等、バイオメディカル・マス・スペクトロ メトリー（Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｍａｓｓ、Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、　）　６巻、２３１ −２４１頁（１９７９年）、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）等、バイオケム・バイオ フィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　７５０巻 、２１４−２１６頁（１９８３年）。

本発明の他の特長はＧＣＬ−１を単離する方法に関するものである。この方法は 、上述の性質を利用した、このレクチンを含む溶液の分画を特徴とする 特に、ＧＣＬ−１を含む溶液を、まず、Ｎ、ｇ、からの表面タンパク質の抽出で 得られる。最後は、−Ｓ的には、等張、非変性バッファ溶液中で、Ｎ、ｇ、を撹 拌することにより、その表面タンパク質をＮ、ｇ、から切り離す。残香細胞及び 分解物を、遠心により、得られた溶液から分離した。生じた上清液は、ＧＣＬ− １を含み、そこからこのタンパク質を回収する。

タンパク質の分画に知られているゲル口過、ゲルクロマトグラフィー、クロマト フオーカシング、限外口過、電気泳動移動度、イオン交換及びそれに類するもの の種々の方法を、存在する他のタンパク質から、上述の特性をもつタンパク質を 分離するのに用いることができる。

たとえば、２種の異なる電気泳動技術を含む二次元ポリアクリルアミドゲル電気 泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）法を、複雑な生物学的物質から再現的にタンパク質をｊ １１離することができることは、この分野ではよく知られている。溶液中のタン パク質は、１次元目の等電フォーカシング（ＩＥＦ）により、各等電点に従って 分離され、そしてさらに、二次元口で、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量に従って 分離される。そのタンパク質の分離は、各次元で、無関係の特性に基づいている ので、二つの次元のゲルにわたり、別々のタンパク質スボフトの実質的に均一な 分布が得られる。先に述べた、等電点及び分子量をもつ１つのタンパク質に対応 する分離スポフトは、レクチンＧＣＬ−１として単離され、従来法によりそのゲ ルから回収される。

別に、ＧＣＬ−１は、液体クロマトグラフィー・クロマトフオーカシングにより 、先に述べた上滑液中に存在する他のタンパク質から分離される。この方法は、 それらの等電点の差に従ってタンパク質の分離を行う。カラムを通して流れるｐ ＋＋勾配により、それらのタンパク質は、フォーカスされ、それらの等電点の順 に溶出してくる。

先に述べた等電点範囲に対応する両分を採集し、そしてそのＧＣＬ−１を、従来 の方法により、採取した両分から回収した。

また、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー吸着及びそれに類す るもののような、あるリガンドを特異的に吸着することができるタンパク質を単 離するための１つ以上の方法に、このタンパク質を含む溶液を適用することによ り、ＧＣＬ−１を単離した。単離のための、この方法を用いるとき、ＧＣＬ−１ を含む溶液を、ガンクリオテトラオシルセラミドのような固体マトリックス固定 リガンドと混合する。得られた混合物を、ＧＣＬ−１が固体マトリックス固定リ ガンドと特異的に結合し、固相複合体を形成するのに十分な時間、生物学的検定 条件に維持する。それから、非特異的に結合したタンパク質を、通常、バッファ で洗浄することにより、固相複合体から分離する。その後、ＧＣＬ−１を固相固 定リガンドから解離し、単離型として溶出する。

加えて、レクチンを含む溶液から、ＧＣＩ−１を単離するのに、以下に示すよう に抗体を用いた免疫学的な方法を使うこきができる。

たとえば、免疫アフィニティー、免疫吸着及びそれに類するもののような方法は 、糖脂質リガンドに基づくアフィニティー精製に対して先に述べられたのき同様 の方法で行なわれた。

またＧＣＩ、−１は、よく知られている組換えＤＮＡ技１ホｉを用いて、その単 離型を生成することができる。簡単に言うと、Ｎ、ｇ、がらＤＮＡを単離し、そ れを剪断応力又は制限酵素により断片化する。

その断片をｐＨｓｓ６又はファージベクター・ラノ、ダのようなプラスミドベク ターに挿入する。挿入物を含むそのベクターを、適合宿主に導入し、そこで増殖 させる。つづいて、そのベクター含有宿主をクローン化し、そのクローンについ て、ＧＣＬ−ｆｉｌ伝子を含むプラスミドの存在を検定する。

それから、ＧＣＬ−１遺伝子を含むクローン化ベクターを、直接ＧＣＬ−１遺伝 子産物を発現する、１つの発現ベクターとして用いることができる。ある場合に は、さらに、別のベクター又は、別の生物学的宿主中での発現を可能にするＧＣ Ｌ−１遺伝子の処理が望ましい。

さらに、そのＧＣＬ−１遺伝子を、その遺伝子を含むプラスミドから単離し、適 当なヌクレオチド配列と組換え、転写−翻訳発現ベクターを形成する。それから 、そのＧＣＬ−１発現ベクターを、細菌宿主のような１つの適当な転写−翻訳原 核性発現媒体、イースト又は哺乳類宿主のような真核性発現媒体〔例えば、チャ イニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞〕、又はデブリース（ＤｃＶｒ 　１ｅｓ）及びズバイ　（Ｚｕｈａｙ）により、プロシーディンゲス・イン・ナ ショナル・アカデミー−ｉブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、５７巻：２６７頁（１９６７年）に報告されたようなイ ンヒ）　口（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の媒体に導入した。

本発明の別の待はとして、本発明のレクチン又はその塩は、薬学的に許容された 希釈剤又はキャリヤーと共に、その効果量患者に投与したとき、Ｎ、ｇ、の表面 上のＧＣＩ、−１と免疫反応を起こし、それにより、表面の膜に付着する抗体を 誘導することができる、接種物又はワクチンを作るのに用いられる。

種々の文法型で用いられている“接種物”という語はＧＣＩ−１に対する抗体の 誘導に用いる活性成分としての本発明のレクチンを含む組成物のことを示しでい る。

接種物は、ＧＣＬ−１を発現するＮ、　ｇ、細胞を検出する診断法に使用するた めに、マウス、ウサギ、ヤギ、馬及びそれに類するもののような哺乳類における 抗体の産生に用いることができる。また接種物は、本発明のレクチンの効果的量 を含むワクチンとして、淋菌による感染をワクチン化した人を予防し、そして淋 菌感染を防ぐのに用いることができる。もし必要なら二次接種も行なわれる。

種々の文法型の“ワクチン”という語は、ヒトの予防に関してここでは用いてい る。またここで用いている種々の文法型の“接種物”止いう語は、淋菌ＧＣＩ、 −１に免疫学的に結合する抗体の生成のために用いる活性成分としての、本発明 のタンパク質を含む組成物を示している。このように、ワクチン及び接種物は、 同一の成分を含んでいる。しかし、最終的な用途として異なるものが意図されて いる。

単位投与当りの単離されたＧＣＬ−１の効果量は、他の事項の中で、接種された 動物種、その動物の体重及び選ばれた接種法に依存することが、この分野ではよ く知られている。典型的には、接種物は、接種（投与）当り、約１０マイクログ ラムから約５００ミリグラム、好ましくは、接種当り約１００マイクログラムか ら約１００ミリグラムのＧＣＬ、−１を含んでいる。

“単位投与”という語は、動物に対する単一投与に適した物理的に分備の単位を 示し、各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち、キャリヤー又は媒介物と共に 、望ましい治療効果を生ずるのに必要であると計算された活性物質の予め決定さ れた量を含む。本発明の新しい単位投与に対する説明は、（ａ）その活性物質の 独自の特性及び遂行される特別な免疫学的効果、及び（ｂ）明細書に詳しく公開 されているヒトへの免疫学的使用のための、そのような活性物質をユ１ｊ合する ための、この分野において基本的な制限、により示され、そしてこれらに直接依 存しており、これらは、本発明の特徴にもなっている。

典型的には、接種物は、レクチンを、水、食塩水又は、リン酸パンフ１食塩水（ ＰＢＳ）のような、生理的に許容される希釈剤中にサスペンドすることにより、 本発明の単離された細菌性レクチンから調製する。もし必要なら、ワクチン又は 、接種物中に通常用いられている添加剤も用いる。そのような添加剤の実例とし ては、ラクトース又はソルビトールなどのような安定化剤、及び水酸化、硫酸又 はリン酸アルミニウム、ミョウバン又は、アルギン酸塩などのような補助剤など がある。沈殿化リン酸アルミニウム（ＡＮＰＯ４）は、ワクチンに対しては、特 に適した補助剤であり、一方、完全フロイント・補助剤（ＣＦＡ）及び完全フロ イント・補助剤（ＩＦＡ）は、接種物に用いるのが望ましい。

本発明のワクチン及び接種物は、通常、腹膜内又は、静脈内、腸用カプセル又は 錠剤、生薬として、鼻スプレーとして、経口的注入により、そして、その他の経 路の投与法により投与される。

単離型の本発明の細菌性レクチンで誘導された抗体は、本発明のまた別のＢ様を 構成している９本発明の単離された抗体調製物は、ＧＣＬ−１に対する実質的な 抗淋菌活性を示すのみである。

単離型のＧＣＬ−１に対する抗体は、これまでに述べてきた接種物を用いた免疫 化により、ウサギ、ヤギ、馬及びそれに類するもののような哺乳類に生ずる。ま た単離された抗体調製物は、この分野でよく知られている方法により、本発明の 単離された細菌性レクチンを用いた免疫アフィニティー精製により作ることがで きる。

単離した抗ＧＣＬ−１抗体調製物も、参考文献に組み込んである、ナイマン（Ｎ ｉｍａｎ）等のプロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サ イエンス（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｈ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ。

７９２４−７９２８頁（１９８５年）に述べられている、ハイプリドーマ技術を 用いて調製できる。

モノクローナル抗体が生ずるハイブリドーマを作るために、ミエローマ又は、自 己増殖細胞系列を、ＧＣＬ−１で高度免疫化したホ乳類の腹水から得たリンパ細 胞と融合する。

そのミエローマ細胞系列は、リンパ細胞と同じ種由来のものが望ましい、１２９ ＧｆｉＸ”株のマウスは好ましい哺乳類である６本発明で用いるのに通したマウ ス・ミエローマには、ハイポキサンチン・アミノプテリン・チミジン−感受性（ ＨＡＴ）細胞系列Ｐ３Ｘ６３−−Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５０８ ０）及びＳｐ２１０Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）がある。

典型的に、肺細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いて、ミエ ローマ細胞と融合する、融合したハイブリッドを、ＨＡＴ感受性により選択する ０本発明の抗体を生産するハイブリドーマを、ここで述べる抗ＧＣＬ−１酵素結 合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて同定した。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清からのみでなく、望ましいハイ プリドーマが導入される哺乳類の腹水液からも、−ｍ的により高濃度な形で得る ことができる。腹水液を用いたモノクローナル抗体の産生は、この分野ではよく 知られており、ここでさらに説明する必要はない。

本発明の単離された細菌性レクチンは、血液、血清又は血孕中の抗ＧＣＬ−１抗 体の存在及び量を測定するのに特に有用である。

１つの態様において、本発明は、次のステップを含む生体試料中の抗ＧＣＬ−１ 抗体の存在を確認する方法も考えている。

（ａｌ　検定する生体試料を準備する。典型的な試料としては、既知量の血液、 及びより好ましくは、血清又は血漿として提供される。

血液、血清及び血漿試料を提供する方法は、この分野では、よく知られている。

山）次に、予め測定された量の本発明の単離された細菌性レクチンを準備する。

（Ｃ１その後、その生体試料を、単離された細菌性レクチンと混合し、免疫反応 混合物を作る。

ｆｄ＋　得られた混合物を、分から時間の予め決められた時間、生物学的検定条 件に維持する。試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗体が、免疫学的にレクチンに結 合し、免疫反応物を作るのに、通常、約１０分から約１６〜２０時間で十分であ る。

免疫反応のための生物学的検定条件とは、レクチン−リガンド結合検定法に述べ られているものと同じである。

ｔｅｌ　それから、その生物学的検定条件に維持した混合物について先に述べた 維持時間に形成した免疫反応物の存在を検定した。免疫反応物の存在は、抗ＧＣ Ｉ−１抗体が試料中に存在することを示している。

抗ＧＣＬ−１抗体を含む免疫反応物の存在を検定は、直接的に、あるいは間接的 に、この分野でよく知られている検定法を用いて行なった。例えば、米国特許１ １ｈ　４，５３６，４７９．隘４，２３３，４０１゜ＮＱ　４，２３３，４０２ ．隘３，９９６，３４５で述べられている均一検定システムが用いられた。

好ましい態様において、レクチンに結合した抗ＧＣＬ−１抗体の存在は、次に示 すステップで検定された。

（ｉ）生体試料を、生体中に存在するヒト免疫グロブリンと結合し、免疫反応物 を作る、生物学的に活性な、標識抗体と混合する。その標識抗体は、免疫反応物 中に、その抗体が存在するという信号を発することができる。

（ｉｉ　＞そのように作った標識抗体／生体液試料混合物を、その抗体が、第１ の免疫反応物として存在する抗ＧＣＬ−１抗体との免疫反応物を作るのに十分な 、予め決められた時間、生物学的検定条件に維持する。免疫反応は、ステップ（ ｄ）に述べた方法と同様に行なわれる。

特に好ましい検定法において、本発明のレクチン及び標識抗体は生体液体試料中 に存在する抗ＧＣＬ−１抗体と免疫学的に結合し、その一部に結合した標識を含 むサンドインチ免疫反応物を形成する。すなわち、標識を含むサンドインチ免疫 反応物は、抗ＧＣＬ−１抗体１分子が、（１１抗体として、本発明のレクチンと 、（２）抗原として標識抗体と免疫反応を起こしたとき形成する。好ましい態様 において、その免疫反応物の一部を形成しない標識抗体（すなわち、抗ＧＣＬ− １抗体と免疫的に結合しないもの）は、１３ｉＴｈ抗体の存在を検定する前に、 好ましくは、洗浄により、免疫反応物から分離される。

（ｉｉｉ　）それから、抗ＧＣＬ−１抗体を含む免疫反応物の一部として結合し ている標識抗体の存在を検定した。これは、生体試料における抗ＧＣＬ−１抗体 の存在の検定である。免疫反応物の一部として結合した標識抗体量を測定し、そ して、その測定は、その試料中の抗ＧＣＬ−１抗体量を定量するのに用いた。そ の量がゼロのこともあり、もちろん、それは、検出限界内で、その試料中に抗Ｇ ＣＬ−１抗体が存在しないことを示している。標識した第２の抗体の存在及びそ の量の検定方法は、用いられるｉｉｉに依存し、その標識及び方法は、この分野 ではよく知られているものである。

タンパク質性抗体の標識法もよく知られている。たとえば、ハイブリドーマによ り産生された抗体は、その組織培養培地中の一成分として提供された放射性同位 元素を含むアミノ酸の代謝的取込みにより１にすることができる０例えば、ガル フレ（Ｇａｌｆｒｅ）　、Ｇ及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　ｃ、ｌ　 メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　７３巻 、３−４６頁（１９８１年）参照、活性官能基を介してのタンパク質結合技術も 特に有効である。例えば、オーラミース（Ａｕｒａｍｅａｓ）等、スカンジナビ アン・ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｓ＋ｍｕｎｏ １．）　８巻、付録７　：　７−２３頁（１９７８年）及び米国特許Ｉｔ　４， ４９３，７９５　（両方とも参考文献に掲げである）参照。

加えて、部位特異的結合反応も行なわれ、それによって、その標識は、第２の抗 体と、その目標抗原との免疫反応は、実質的に妨害されることはない。例えば、 ロッドウェル（Ｒｏ’ｄｗｅ１１）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ、 ）　３を１８９−８９４頁（１９８５年）参照。

標識手段には、それらを変性することなく、抗体又は抗原に化学的に結合し、有 効な免疫蛍光性トレーサーとなる蛍光団（色素）を形成する蛍光標識試薬がある 。適当な蛍光標識試薬には、フルオレセイン・イソシアネート（Ｆ　Ｉ　Ｃ”） 　、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミノ− １−ナフタレンスルホニルクロライド（ＤＡＮＳＣ）　、テトラメチルローダミ ン・イソチオシアネー）（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホ ニル　クロライド（ＲＢ２００ＳＣ）及びそれに類する蛍光色素がある。免疫蛍 光分析技術の説明は、参考文献に掲げた、デル力（ＤｅＬｕｃａ）の“免疫蛍光 分析”、道具としての抗体、マーカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ　）等編、 　Ｎ、Ｙ、ニーニーヨーク、ウィリーアンド・サン刊（Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ ｓ　Ｌｔｄ、）　、　（１９８２年）、１８９−２３１頁にみることができる。

好ましい態様において、指示団は、ホースラディツシュ・パーオキシダーゼ（Ｈ ＲＰ）、グルコース・オキシダーゼ又はそれに類するものである。基本的な指示 団がホースラディツシュ・バーオキシダーゼ（ＨＲＰ）又は、グルコース・オキ シダーゼである場合、抗体リガンド複合体（免疫反応物）が生成した事実を視覚 化するのに、付加的試薬が必要である。ＨＲＰに対する、そのような付加的試薬 には、過酸化水素及び、ジアミノベンジジンのような酸化色素前駆体が含まれる 、グルコース・オキシダーゼに有効な付加的試薬は、２．２′−アジノージ−（ ３−エチルーヘンズチアジンンーＧ−スルホニンクアシンド）　（ＡＢＴＳ）で ある。

放射性元素も有用な標識試薬となる。

代表的放射性標識試薬は、ガンマ線放出を行なう放射性元素である。　＋２Ｊ、 ＋２５■、＋２Ｊ、ＩＩＩ　ｌ、＋３Ｊ及び５１（ｒのような、それ自身、ガン マ線を放出する元素は、ガンマ線放出性放射活性元素指示団の１つを代表する。

特にＩｆＪは好ましい。別の有効な指示団には、それ自身、陽電子を放出するＩ ’Ｃ，”Ｆ、ＩＳＯ及び１３Ｎのような元素がある。放出した陽電子は、動物の 体に存在する電子と衝突して、ガンマ線を生ずる。ＩＩ＋インジウムのようなベ ータ線放出を行うものも有効である。

本発明の検定法及びシステムは、固体マトリックスに固定し、固体サポートを形 成している本発明のレクチン又は、抗レクチン抗体を利用することができる。

典型的には、レクチン又は抗レクチン抗体は、他のモードの固定と同様、当業者 にはよく知られている、いくつかのモードの吸着が用いられているけれども、水 性媒体からの吸着により固体マトリックスに固定している。典型的なモードは、 網状デキストロース又はセルロースのようなグルコース含有マトリックスと、シ アノゲンブロマイドとの反応で生成した反応性カルボニル官能基と、レクチンも しくは、抗レクチン抗体との反応である。

結合体としてのグルタルアルデヒドは、ラテックス粒子及びそれに類するものと 共に、後に議論される。

有効な固体マトリックスは、この分野においてよく知られている。

それらの物質には、ＮＪ州、ビス力タウエイ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）ファ ルマシア・ファインケミカル社から、登録商標セファデックスとして市販されて いる網状デキストラン、アガロース、ＩＬ州、北シカゴのアボット・ラボラトリ −（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販されている直径約１ミ クロンから約５ミリメートルのポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチ レン、網状ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、膜、片又はヘラ状のナイロ ン織物、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルでできたマイクロプレートのウェル、 チューブ、板、及びそれに類するものが含まれる。

凝集型検定法に有用なラテックス粒子も固体マトリクスとして有効である。その ような物質は、日本・東京の日本合成ゴム社から市販されており、アニオン住方 ケン中に分散されたカルボキシ官能性粒子として説明されている。これらの粒子 の典型的ロフトは、０．３０８ミクロンの平均直径をもっており、またカルボキ シ基当り、約１５から約３０オングストローム角の、平均カルボキシ官能基の分 布をもっている。

使用前に、粒子を、１．３−ジアミノ−２−プロパツールのようなジアミンと反 応させ、フリーのアミノ基を維持したまま、粒子のカルボキシ基との多くのアミ ド結合を形成する。その後、フリーのアミンを、グルタルアルデヒドのようなジ アルデヒド及び抗体又は抗原と反応させ、シッフ塩基反応生成物を作る。その後 、そのシッフ塩基反応生成物をホウ素化水素ナトリウノ・のような水溶性還元剤 で還元し、有用な固体サポートを作る。

当業者は、ここで利用できる、多くの固相免疫検定法があることが理解できるで あろう。典型的な有効固相検定法には、酵素増ｒＩＪ免疫検定技術（ＥＭＩＴ） 及び蛍光免疫検定法などが、特に議論したＥＬＩＳＡのほかに含まれる。しかし 、本発明のレクチンと、抗ＧＣＬ−１抗体との反応で与えられる信号を示す方法 なら、どれでもよい。これらの検定法の各々は、その免疫反応、及びそれによる 本発明のレクチンと、検定すべき抗体との結合を合図するのに１つの指示手段を 用いた、単−又は２つの抗体技術を採用できる０代表的な技術は、マジオ（Ｍａ ｇｇｉｏ）の、ＯＨ州、クリーブランド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ）、ＣＲＣプレス （Ｐｒｅｓｓ）版、“酵素イムノアフセイゝ（１９８１年）、及びゴールドマン （Ｇｏｌｄｍａｎ）の、ＮＹ州、ニューヨーク、アカデミツク・プレス（Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）版、′蛍光抗体法”に説明されている。

抗ＧＣＬ−１抗体について生体液体試料を検定する特異的方法の１つの態様は、 免疫反応を連続して行なう非競合イライザ法である。

その検定法においては、本発明のレクチンの部分標本（例えば、一般に約１から 約５００μｇ）を、マイクロプレートのウェルの内壁に固定し、固体サポートを 作る。

提供された生体試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗体を、固相レクチンと免疫反応 させる。これは、マイクロプレートのウェル中の血′清又は血景のような試料（ 予め希釈したもの）約１０から約２００−の部分標本を、固相固定レクチンと混 合し、固／液相混合物を作ることにより行う。その混合物を、試料中に存在する 抗ＧＣＬ−１抗体が免疫学的にレクチン分子と結合し、そして、固相免疫反応物 を作るのに十分な、予め決められた時間維持する。さらに、その固及び液相を洗 浄し、非特異的に結合した物質を除去する。

固相免疫反応物として存在する抗ＧＣＬ−１抗体（すなわち、固相固定レクチン に結合した抗（１，ＣＬ−１）を、酵素標識第二抗体と免疫反応させる。このこ とは、例えば水性バッファ溶液中、酵素標識第二抗体、約０．１から約１０μｇ 等の部分標本、好ましくはＨＲＰ−標識ヤギ抗ヒト１ｇ抗体を混合し、第二の固 ／液混合物を作ることにより行なわれる。この第２の混合物を、上述のとおり維 持し、レクチン、抗ＧＣＬ−１抗体、及び酵素標識抗体からなる固相免疫反応物 “サンドイッチ”を形成させる。

先に述べたように、固相から液相を分離した後、ＨＲＰに対する過酸化水素の存 在化、０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）のような色素原的な基質の部分標本を 、固相免疫反応物を含むマイクロプレートのウェル中に加え、第三の固／液混合 物を作った。この混合物を免疫反応物として存在する酵素が、基質の相対量を生 産物に転換するのに十分な、予め決められた時間維持する。それから、生成した 発色液の光学濃度を測定し、そして、既知量の試薬を含む溶液を用いて得られた 結果と比較した。

好ましくは、キット型の、本発明の抗ＧＣＬ−１抗体法を実行するのに有用な診 断システムは、別に包装しであるが組合せて用いる、（８１本発明の単離された レクチン及びｆｂｌ抗ＧＣＬ、−１抗体とレクチンとの免疫反応を知らせる標識 抗体を含んでいる。好ましくは、標識抗体は、酵素に抗体そのものが結合したも のである。

好ましい態様において、そのシステムは、レクチンが固定し、固体サポートを作 る固体マトリックスを含んでいる。有用な固体マトリックスはすでに述べてきた 。しかし、好ましくは、その固体マトリックスとして、マイクロプレートのウェ ルが適している。

さらに好ましい態様において、そのシステムは、ポジティブ　コントロールとし て、本発明のレクチンに対して生しる抗体も含んでいる。

既知量のレクチン及び標識抗体を準備する。この量は少なくとも１回の検定を行 うのに十分なものである。典型的には、そのレクチン及び標識抗体は、この分野 ではよく知られているように、水、食塩水又は、バッフ１で、決った体積に希釈 するよう設計された型及び量で与えられる。

そのシステムには、その他にもパッケージが含まれている。それらのパッケージ には、（ｉ）乾燥状態もしくは、液状のバッファ塩、（ｉｉ）Ｏ−フェニレンジ アミンのような酵素基質及びそれに類するものが含まれている。

生体試料中のＧ　ＣＬ　−１の存在を検定する方法もここでは考えられている。

一般に、頚管又は性尿器の試料のような、検定すべき生体試料を準備し、それを 、本発明のレクチンにより誘導される抗体結合部位を含む抗体と混合する。その 混合物を、その抗体分子が、生体試料中に存在するＧＣＬ−１と免疫反応するの に十分な、予め決めた時間、生物学的検定条件に維持する。それから、その免疫 反応量を、その検定生体試料中の、ＧＣＬ−１分子の存否を決定することで測定 する。

その１つの典型的態様は、頚管又は性尿器試料を平板な顕微鏡スライド′にアセ トンで固定する、免疫蛍光検定法である。本発明に従って、例えばウサギ中で生 じた、一般的には、約１０マイクログラムから約５０００マイクログラムの抗体 の部分標本を、よく知られた方法により、そのスライド上で、インキュベートし た。

未免疫反応の抗体を洗いおとし、そして、スライド上の非特異的結合部位を、Ｂ ＳＡのようなりンバク質でブロックした後、ヤギの抗ウサギ抗体のような第２の 抗体を、そのテストスライド上でインキュベートする。その第２の抗体は、フル オレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のような蛍光色素に結合させるこ とにより、標識化する。

この第２のインキュベージタン後、このテストスライド上の第１の抗体に結合し ７た、ＦＩＴＣ標ｍしたヤギの抗ウサギ抗体とはそのままに、過剰の第２の抗体 を洗いおとず。ＦＩＴＣ標識した抗体の存在を、蛍光顕微鏡を用いて検出し、そ れにより、Ｎ、ゴナ−リア（Ｎ、　Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）感染の存在を知 ることができる。

この指示手段は、本発明の抗体に直接結合していない場合は、抗体とは別に包装 される。アセトン固定した頚管又は性尿器試料のような生体試料と混合したとき 、その抗体は、ＧＣＬ−１と免疫反応を起こし、免疫反応物を作る。そして、そ こに存在する指示手段が免疫反応産物の形成を知らせる。

さらに本発明を、次に掲げる実施例により説明する。

実施例Ｉ　ＧＣＬ−１の生成と単離 Ｎ、ｇ、の０９株同ｆｉＮ、ｇ、ＭＳ　１１株のビリ化透明及び非ビリ化透明変 異体を、ＧＣＢＣリプレート上育させた（２９ｇ　ＧＣメディアム・ベース（デ ィフコ）、１ｇバタトアガー（ディフコ）、８−サブルメントＡ（４００ｇグル コース、１０ｇＬ−グルタミン、２０■コカルポキシラーゼ／リフドル）、及び ０．８　Ｗ１１サブルメントＢ　（１，２５ｇ　Ｆｅ（ＮＯ３／　２５０＋ｄ） 　／総体積ｓｏｏ震ｇ）、ビリ化及び透明の発現型は、ジェームス（Ｊａｍｅｓ ）等〔インフエクト・イムノ・（Ｊｎｆｅｃｔ、　７ｍｍｕｎ、　）　１９巻８ ３３２−３４０頁（１９７８））及びスワンソン（Ｓｗａｎｓｏｎ）、（Ｊ、イ ンフエクト・イムノ（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、）　１９巻、３２０−３３１頁（１９７８年）〕により述べられた システムで区別される。

プレートに接種し、それを３５℃で５％ＣＯ，雰囲気下で１８時間インキュベー トする。得られた細菌層を、まず、各プレートに１．２５Ｍ１の５０ｍＭ）リス バッファ　〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＭＯ州、セントルイス 、シグマ・ケミカル社（ｐＨ９、５＞　）を加えることにより収穫した。それか ら、収穫した層中の細胞を分散させ、パスツールピペットを用いて、５０ｍ１の ポリカーボネート製遠心管に移し、０℃で保存した。

つづいて、その保存株を３分間ミキザーで撹拌し、細菌の表面タンパク質を切り 離した。さらに、生じたリスベンジョンを、ベックマンＪＡ−２０Ｄ−ターを用 い、１０．０００ｒｐｍ　、　４℃、２０分間の遠心を行ない、ビリンタンパク 質含有ペレット及びＧ　ＣＬ、　−１含有上清を作った。その上清を、タンパク 質を凝集及び沈殿化するために、６．０００からａ、　ｏｏｏ分子量排除透析膜 を用い（ＮＪ州、スプリングフィールド、フィッシャー・サイエンティフィック 社（Ｆｉｓｃｈｅｒ　５ｃｅｎｔｉｆｉｃ　（：Ｏ，、）　、スペクトロボア（ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ＞　）、４℃で２４時間、ビリ・バッファ（１５０ｍＭ） リス、１５０　ｍＭＮａＣ！、ｐＨ７，５）に対し、透析した。その沈殿したタ ンパク質を先に述べたように遠心後のベレットとして収穫した。そのペレットを 、１０ｍＮの５０ｍＭ）リス（ｐｌ＋９．５　）に懸濁し、これにより、粗ＧＣ ｉ−−１抽出物を得た。この粗ＧＣＬ−１抽出物は、−２０℃で保存した。

ＧＣＬ−１を精製するだめのアフィニティー吸着体は、ガングリオテトラオシル セラミドを固体マトリックスに固定して調製した。

ポリ塩化ビニル製の９６穴マイクロプレートの各ウェルに、２００ナノグラムの ガングリオテトラオシルセラミド（ＰＡ州、ベルホンテ（Ｂｅｌｌｅ　ｆｏｎｔ ｅ）　、スペルコ社（５ｕｐｅｌｃｏ　ｌｎｅ、））を含むメタノール５０マイ クロリツトルを加えた、それからそのメタノールを蒸散させ、各ウェルにガング リオテトラオシルセラミドのたい積物を残した。ウェル中の非特異的結合部位は 、各ウェルに、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５０マイクロリツトルを加 え、その混合物を室温で４時間維持し、それから、逆さにして振るこきにより、 過剰のブロッキング溶液を除くことにより、ブロックを行った。

固定したガングリオテトラオシルセラミドを有するマイクロプレートのウェルに 、５０マイクロリツトルの粗抽出物を導入することにより、上述の粗抽出物から アフィニティー吸着によって、ＧＣＬ−１を単離した。生成した調製物を約８時 間維持し、それにより、粗抽出物中に存在するＧＣＬ−１をガングリオテトラオ シルセラミドに結合した。未結合のタンパク質はウェルを逆さにし、振ることに より取除いた。それからそのウェルを５０マイクロリットルづつのＰＢＳで５回 洗浄した。

特異的に結合したＧＣＬ−１は、各ウェルに５０マイクロリツトルの２％ラウリ ル硫酸ソーダ（ＳＤＳ）を含むＰＢＳを加えて溶出した。このようにしてできた 調製物を室温に３０分維持し、それにより、存在するＧＣＬ−１を溶解した。そ れから、得られたＧＣＬ−１含有溶液をウェルから取り出し、そして、−２０℃ で保存した。

アフィニティーで単離したＧＣＬ−１およそ１マイクログラムが各マイクロプレ ートのウェルから得られる。

加えて、Ｇ　ＣＬ　−１は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ　 Ｌ　Ｃ）によっても上述の粗抽出液から単離された。非ピリ化Ｎ、ｇ、ＭＳ１１ 株Ｂ２変異体から生成した粗ＧＣＬ−１抽出物を、まず、クロマトフオーカシン グのためのＧＣＬ−１抽出物を調製するため、前述の透析膜を用い、４℃で２４ 時間、ＦＰＬＣ平衡バッファ（２５ｍＭアミジゾール、ｐＨ７，４＞に対して透 析した。透析したＧＣＬ−１抽出物をＦＰＬＣ平衡バッファで予め平衡化したモ ノＰクロマトフオーカシングカラム（ＮＪ州、ビス力タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ）　、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）　Ｆ　Ｐ　Ｌ　 Ｃシステム〕にかけ、そして１対８に滅菌水で希釈し、ｐＨ４，０に調整した、 ポリバッフ７７４（ＭＯ州、セントルイス、シグスケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅ＋Ｒ３ｃａｌ　Ｃｏ−＋）　）で溶出した。

そのよ゛うなりロマ１−フォーカシングカラムでの、粗Ｇ　ＣＬ−１７＋ｔ＋出 物の典型的運転の溶出曲線を図４に示す。溶出画分は、２８０ナノメータでの溶 出物の光学密度（０，０，２８０）を測定することにより、タンパク質をモニタ ーし、またそのρ１１を測定した。タンパク質を含む、ＰＩ（約６．１から６． ４までの間で溶出してきた両分を回収し、それを−２０℃で保存した。

実施例２　５ＤＳ−ＰＡＧＥによる単離された細菌性レクチンの分子量測定 実施例１で生成した、精製細菌性レクチンの相対分子量を、リムリ　（Ｌａｅｍ ｍｌｉ）、υ、Ｋ、、〔ネイチ十−（Ｎａｔｕｒｅン、２２７巻、６８０−６８ ４頁（１９７０年）〕ノ方法に従ッテ、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。最終 的に、１２％及び１５％ポリアクリルアミドゲルを鋳込み、そして、レーン当り の全タンパク質をおよそ、２５がら２００マイクログラムで運転した。次に掲げ る分子量マーカータンパク質及びダルトン（ｄ）で表したおよその分子量は、コ ントロール又は標準１ノーンに示した：α−ラクトアルブミン、１４．２００； ソイビーン　トリプシン・インヒビター、２０．１００　；　）リブシノーゲン 、２４、０００　；カーボニック　アンバイトラーゼ、２９．０００　；グリセ ルアルデヒド−３−ホスフェ−１−デヒドロゲナーゼ、３６．０００　；−Ｔツ ブ・７　）Ｉｚブミ：’　；　４５．０００　；　’）　シ・”ｒＪ＋ｚブミン 、６６．０００　（スヘｒＭＯ州、セントルイス、シグマケミカルがら入手した ）。電気泳動後、タンパク質のバンドを、コマージブリリアント・ブルー（シグ マ）による染色、又は、ＣΔ州、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　、バイオラ ドから入手した、シルバースティンを用い、メリル（ＭｒＨｒｒｉり等〔（アナ リティカル・バイオケミストリー（八〇ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、月（］５＠、 ３６】頁（１９８０年）〕の銀染色法により、視覚化した。

ゲルの分析により、試料レーン中に、トリプシノーゲンよりも人きいが、ソイビ ーン・トリプトシン・インヒビターよりも小すい移動度で、相対分子Ｍ２２．４ ００ダルトンを有する１つの主要バンドが明らかになった。図１に示し７たよう に、このバンドは、アフィンティー精製した細菌性レクチンＧＣＬ−１であった 。

ある場合には、染色する前にこのタンパク質バンドを、電気泳動的にニトロセル ロース（ＮＨ州キーン（Ｋｅｅｎｅ）　＊　シュレイチャー・アンド・シュエル （Ｓｅｈｌｅｉｅｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）、カタログ番号、ＢＡ８５〕に 固定し、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等〔プロシーディンゲス・イン・ナショナル ・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｈ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、７６巻、４３５０−４３５４頁（１９７ ９年））で述べられているような、ウェスタンプロットを作った。ニトロセルロ ースに固定したＧＣＬ−１タンパク質は、まず、そのプロットを、実施例１で述 べた粗Ｇ　ＣＬ　−Ｉ抽出物でウサギを免疫化することにより調製したウザギ抗 ＧＣＬ−１抗体と免疫反応を起こさせることにより検出した。ニトロセルロース に固定化したＧＣＬ−１に免疫学的に結合したウサギ抗ＧＣＬ−１抗体を、アル カリ・ホスファターゼ標識したヤギ抗つサギ抗Ｉｇと免疫反応させ、た、標識の 存在、及びそれによるＧＣＬ−１の存在は、ｗｒ州、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ ）、プロメガ・バイオチク、（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製（カタロ グ番号Ｐ３９３０）のプロトプロット（ＰｒｏｔｏＢｌｏｔ）免疫プロンティン グシステムを用いて視覚化した。

実施例１に述べたアフィニティー操作の種々の単離ステップから得られた生産物 のウェスタンプロットを図２に示す。これらのプロットの解析は、アフィニティ ー単離したＧＣＬ−１は実質的に他の淋菌ビリン関連タンパク質を含まないこと を明らかにしている。

実施例１で述べたＮ、ｇ、粗抽出物と同様にして調製した、モレクセラ・ボビス （Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ　）の粗タンパク質抽出物のウェスタンプロ ットを図３に示す、そのプロットの解析で、モレクセラ・ボビス（Ｍｏｒｅｘｅ ｌｌａ　ｂｏｖｉｓ　）は、抗ＧＣＬ−１抗体と免疫反応を起こし、そして、約 ２２．４００ダルトンの見が番ノ上の相対分子量をもつことが分った。

実施例３　２ＤＰＡＣ；Ｅによる、単離と特性化実施例１で生成したＧＣＬ−１ を含む、粗、非アフィニティー・精製化細菌表面タンパク質抽出物を、ＣＡ州、 ザンフランシスコのボーファー・サイエンティフィノクィンスッルメント（Ｈｏ ｅｆｅｒＳｃｔｅｎｔｉｆｉｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のシステム２−Ｄ二 次元ゲルシステムを用いた２Ｄ−ＰＡＧＥにより単離、特性化を行った。６３５ ％ポリアクリルアミドと、１つは３から１０のｐＨ勾配を作ることができるもの と、他の１つは、４から６．５のｐＨ勾配を作ることができる２組のアンホライ ト（ＭＤ州、ガイサースバーグ（Ｇａ　ｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＬＫＢイン スッルメント社〕を含む、アイソエレクトリンク・フォーカシング（ＩＥＦ）ゲ ルを１３０ｘ３ミリメーターの酸洗浄ガラス管内に調製した。そのゲルに、およ そ２５マイクログラムのタンパク質を含むＧＣＬ−１含有溶液又は、実施例２で 述べた分子量マーカータンパク質を含むコントロール溶液を重層した。さらに、 ゲル上に、試料重層溶液［９Ｍウレア、２％の両アンフオライト及び１０％のポ リエチレン（９）オクチル　フェニルエーテル（ノニデフトＰ４０））を重層し た。つづいて、そのタンパク質を、４００ボルト定圧で１２時間及び８００ボル ト定圧で１時間電気泳動した。

チューブからフォカスしたゲルを取り出し、処理バッファ（０，０６２５Ｍ）！ ／Ｘ塩は、ｐＨ６，８，２％ＳＯＳ、１０％グＴＪ　セリン、５％２メルカプト エタノール）で３０分間２度洗浄し、それにより、その等電ｐＨ値に従って分離 したタンパク質を含むＩＥＦゲルができる。

アイソエレクトリック・フォーカシングしたタンパク質を、５ＤＳ−ＰＡＧＥに より、その相対分子量に従って分離する。Ｉ　Ｅ　１”ゲルを１５％５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥゲルの先端に固定し、０．１％フェノールレッドをトラッキング色素とし て用い、約３０ミリアンペア定電流で運転した。トラッキング色素がゲルの底に ついたとき、電気泳動を止めた。つづいてそのゲルを、コ７ツシー・ブリリアン ト・ブルー又は、実施例２で述べた銀染色で染色するか、又は先に述べたように 、タンパク質をゲルから、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等が述べたニトロセルロー スに移した。

ゲルの解析は、約２２．４００ダルトンの相対分子量、すなわち、ＧＣＬ−１の 相対分子量をもつタンパク質に対応する単一のタンパク質スポットを明らかにし た。この２２．４００ダルトンのタンパク質の等電ｐＨ値は約６．１から約６． ４である。

実施例４　マウス小腸からの純粋なガングリオテトラオシルセラミドの調製 マウス小腸からの純粋なガングリオテトラオシルセラミドの調製のため、次のよ うな一連の抽出及びクロマトグラフィー分離が行なわれた。溶媒は使用前に乾煙 及び再蒸留したものを使用した。

（抽　出） 小腸をマウスから外科的に取り出し、小片に切ったのら、乾燈するまで凍結乾怪 する。凍結乾燥物質約１３０グラムを、この分野でよく知られているソックスレ ー装置を用い、２ステツプの抽出にかけた。第１に、２リツトル丸瓶中、約１リ ツトルのクロロホルム／メタノール（２対１、体積比）と凍結乾燥物質とを混合 し、約２４時間、アスベスト絶縁した電熱装置中７０℃に加熱した。溶媒をデカ ンテーションした後、１．５リツトルのクロロホルム／メタノール（１対９、体 積比）を用いて、その物質の第２回目の抽出を同様に行った。そして、その溶媒 をデカンテーションし、第１回目のものと合せた。合せた溶媒抽出物を窒素気流 下、乾燥するまで蒸発させた。

（アルカリ分解） その後、乾燥した腸抽出物を、５００ミリリフドルの０．２　ＭＫＯ）Ｉメタノ ール溶液に溶かすことによりアルカリ分解した。そして、その溶解抽出物を、時 々振とうして、乾燥抽出物を分散させる５個のガラスピーズを含むガラス瓶中、 室温に３時間維持した。その後、得られた混合物を氷酢酸１０ミリリツトルで中 和し、１リツトルのクロロホルム／水（３：　２．体積比）を加え、そして、流 水に対し、４日間透析した。それからアルカリ分解抽出物は、それにまず５００ ミリリツトルのトルエンを加え、それからロータリーエバポレーターを用い、得 られた混合物を乾燥することにより、７０’Ｃで蒸発した。その乾燥試料を約５ ００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（２対１、体積比）に再溶解し、 濾過して、不溶物質を取り除いた。濾過装置は約５００ミリリツトルのメタノー ルを用い、残存する抽出物を洗い出した。それから濾液を合せ、窒素気流中で蒸 発し、それから約５０ミリリツトルのクロロホルムに再溶解した。

（ケイ酸クロマトグラフィー） アルカリ分解腸抽出を、ケイ酸カラムでクロマトグラフし、糖脂質及びアルカリ 耐性リン脂質から、コレステロール及び脂肪酸メチルエステルを除いた。

１００メツシユ、試薬級のケイａ　（ＭＯ州、セントルイス、マリンクＯ，ト・ ケム・ワークス（Ｍａｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｃｈｅｗ、　Ｗｏｒｋｓ））を三種 の粒子サイズに分けた二級４４ミクロン以下、約４４〜７４μｍ１及び約７４μ ｍ以上。約４４μｍ以下の画分をメタノールに懸濁（３１に１ｋｇ）Ｌ、ついで 、３０分後メタノール層を吸引して、次の操作で使うカラムの底の焼結ガラスフ ィルターを通る非常に小さい粒子を除くことにより洗浄した。

約４４から約７４μｍのサイズに分画されたケイ酸粒子を、クロロホルムを用い 、５０グラムカラムに充填した。そして、先にクロロホルムに溶解した、アルカ リ分解抽出物をそのカラムにかけた。

そのカラムに、５００ミリリツトルのクロロホルム、ついで５００ミリリツトル のクロロホルム／メタノール（９８：２　体積比）を加え、ｉ！遇させた。それ から、５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（１：３　体積比）、つ いで５００ミリリツトルのメタノールを加え、その２つの添加からの溶出液を集 め、その合せた溶出液の液体部分を窒素気流中で蒸発し、乾燥抽出物を作った。

（イオン交換クロマトグラフィー） ケイ酸カラムからの乾燥抽出物を約１０ミリリツトルのクロロホルム／メタノー ル（２：　ｌ、体積比）に溶解し、クロロホルム／メタノール（２：１、体積比 ）を用いて、酢酸型でパンクした２０グラムのＤＥＡＥセルロース（ＮＪ州、ク リフトン（Ｃ１１ｆｔｏｎ）、ワットマン（Ｗｈａｔ＋＋＋ａｎ　Ｉｎｃ、）＋ 　Ｄ　Ｅ　２３　）のカラムにかけた。室温における約１日から２日のカラム平 衡時間の後、その試料を、４００ミリリンドルのクロロホルム／メタノール（２ ：１、体積比）、ついで４００ミリリツトルのメタノールで溶出した。その２つ の溶出液を合わせ、その液体部分を窒素気流中で蒸発し、乾燥抽出物を得た。

（アセチル化） ＤＥＡＥカラム溶出及び乾燥した抽出物を１０ミリリツトルのクロロホルムに溶 かし、各１０ミリリツトルのピリジン及び酢酸無水物をそれに加え、その混合物 を、暗所、室温に約１２から１８時間維持することにより、アセチル化を行った 。アセチル化反応の後、各２５ミリリツトルのメタノール及びトルエンを加え、 その試料をまず窒素気流中で、約６０℃に維持しながらエバポレートし、ついで ロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発し、アセチル化した腸抽出 物を作った。

（アセチル化抽出物のケイ酸クロマトグラフィー）アセチル化膿抽出物を約５０ ミリリツトルのクロロホルムに溶がし、約４４μｍ以下のサイズに分別され、ク ロロホルム／メタノール（９８：２、体積比）でパンクした５０グラムのケイ酸 粒子を含むカラムにかけた。５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（ ９５：５、体積比）、ついで５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（ ９０：１０、体積比）をカラムに加え、そして、溶出液を集め、その液体部分を 窒素気流中で蒸発し、乾燥したアセチル化抽出物を得た。

（脱アセチル化） ケイ酸クロマトグラフ及びアセチル化した抽出物を約２０ミリリツトルのトルエ ン／メタノール／　０．２　Ｍ　Ｋ　ＯＨメタノール溶液（］：１：２、体積比 ）に溶解し、脱アセチル化を行うため、室温に３０分間、時々振り混ぜながら維 持した。反応時間の後、それに２ミリリツトルの氷酢酸を加え、そして、生じた 混合物を８０ミリリフドルのクロロホルム／水（１：１、体積比）中に移し、流 水に対し、４日間透析した。その後、脱アセチル化した抽出物を、まず、約１０ ０ミリリツトルのトルエンを加え、その混合物をロータリーエバポレーターを用 いて乾燥することにより、７０℃で蒸発し、脱アセチル化乾燥抽出物を得る。

（ＤＥＡＥセルロースカラムを用いたクロマトグラフィー）アセチル化乾燥抽出 物を約１０ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（２：１体積比）に溶かし 、ＤＥＡＥセルロースの１０グラムカラムにかけ、そして、先に述べたように平 衡化させた。そのカラムに２５０ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（２ ：１、体積比）、ついで、２５０ミリリツトルのメタノールを加えた。

生じた溶出液を合わせ、その液体部分を窒素気流中でエバポレートし、糖脂質含 有残香を得た。

（ケイ酸クロマトグラフィー） 上で生成した残香の部分標本を５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール （９８：２、体積比）に溶解し、同溶媒でパンクした、ケイ酸の２５グラムカラ ムにかけた。５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（９８：２、体積 比）をそのカラムに加え、通過させた。それから、２５０ミリリツトルのクロロ ホルム／メタノール（１：３、体積比）、ついで２５０ミリリツトルのメタノー ルをそのカラムに加え、その溶出液を合せて、そして、その液体部分を窒素気流 中でエバポレートした。生じた乾燥物質は実質的に純粋なガングリオテトラオシ ルセラミドである〔ハンソン（Ｈａｎｓｓｏ、ｎ）等、ＦＥＢＳレターズ、１３ ９巻、２９１頁（１９８２年）〕。

実施例５ ＧＣＬ−１コード遺伝子をクローニングすることによる単離されたＧＣＬ−１の 産生及び組換えＤＮＡベクターにおける発現Ｎ、ｇ、０Ｍ５ＩＩ株の非ビリ化Ｂ ２変異体由来の淋菌ＤＮＡ中に含まれるＧＣＬ−１をコードする遺伝子を当分野 でよく知られており、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等のモレキュラー・クロ ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ニラボラトリーマニュアル 、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 ）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）　（１９８２年）により詳しく 述べられている操作を用い、発現ベクター中にクローニング化した。

最終的に、上述のＮ、ｇ、変異体由来のＤＮＡを羊離し、Ｍｂｏｌで部分的に制 限切断し、セイファート（Ｓｅｉｆｅｒｔ）等のプロシーディング・イン・ナシ ョナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、８３巻、７３５頁（１９８６年 ）に述べられている、クローニングベクターｐ）Ｉｓ　Ｓ　６のＢａｇ　ＨＩ部 位に挿入した。生じた組換えプラスミドを生物学的宿主としての大腸菌Ｈ８１０ １株［ＭＤ州、ゲイサースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　）、ベセスダ　 リザーチ、ラボラトリーズ〕中で増殖した９種々のプラスミド含有大腸菌の大部 分を、ＧＣＬ−１遺伝子を含むプラスミドを含んでいるそれらの細菌に対するラ イブラリーとしてスクリーニングした。

挿入されたＧＣＬ−１遺伝子をもつプラスミドを含む細菌を同定するスクリーニ ング法は、発現のためのＧＣＬ−１遺伝子自身の天然のプロモーターを用いて、 大腸菌中で、Ｃ，ＣＬ−１遺伝子産物が発現できることを利用して行なわれる。

発現したＧＣＬ−１は、Ｇ　ＣＬ−１遺伝子をもつプラスミドを含むそれらの細 菌コロニーにおいて、実施例１で述べたようにクロマトフオーカシングにより単 離したＧＣＬ−１に対し、ウサギ中で生じた抗匍清を用いた細菌コロニーのライ ブラリーのイムノスクリーニングにより検出した。

この抗血清の産生のために、１０〜２０マイクログラムの単離されたＧＣＬ−１ を、ウサギの首に皮下接種した。第１の接種は完全フロイント補助剤、ついで２ 週間隔で２回、同様の接種を不完全フロイント補助剤で行った。陽性反応抗血清 は、実施例２で述べたように、ウェスタン・ブロンｌ−における粗抽出物中のＧ 　Ｃ１，、−１を認識する能力により同定した。

ＧＣＬ−１を発現するライブラリー中のこれらの大腸菌を同定するためのイムノ スクリーニング操作は、下にリストしたいくつかの例外とともに参考文献に組込 んだ、ヘルツマン（１ｅ１ｆｍａｎ）等のフズーーカス（Ｆｏｃｕｓ）　６巻、 １−５頁（１９８４年）の操作に従って行った。これらの例外としては、これも 参考文献に組込んであるが、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）等の、ジーン・アナ リティカル・チク二フク（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈｎ、）　１巻、３− ８頁（１９８４）に述べられている、ブロッキング試薬としてのウシ血清アルブ ミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）の代りに脱脂粉乳への置換及び指示手段としての１２Ｊ標識 第二抗体の代りに、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗つザギ免疫グロブリンへ の置換がある。標識の存在及び、それによるＧ　ＣＬ−１の存在は、Ｗｌ州、マ ジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、プロメガ　バイオチク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅ ｅｈ）、（カタログ番号、Ｐ３９３０）のプロトプロット・イムノブロッティン グ・システムを用いて視覚化した。

先に述べたイムノスクリーニング操作によりＧＣＬ−１を含むと決定された個々 の陽性反応細菌コロニーを、独立して回収し、均一性を保証するため、少なくと も１回コロニー精製を行った。それから、各単離物について、実施例１で述べた ウェスタン・プロットによるＧ　Ｃ１，、−１の発現を分析した。最終的に、個 々の細菌単離物の小規模培養を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料パフファ中で直接分解し 、クロマトフオーカシングにより単離したＧＣＬ−１に対して生じた、先に述べ た抗血清を用いて展開した、ウェスタン・プロットについて解析した。そのよう に分析し、ＧＣＬ−１を発現する代表的細菌培養物を、図５に示す。

大腸菌において発現したＧ　ＣＬ　−１の見かけの移動度は、Ｎ、ｇ。

培養抽出物から直接単離したレクチンよりわずかに大きい相対分子量に対応して いる。大腸菌宿主内の発現媒体は、発現タンパク質由来のリーダー配列をプロセ ッシング及び切断せず、それにより、本来の起源、すなわちＮ、ｇ、宿主でみら れるものより、相対的に大きいタンパク質産物が生ずると考えられている。

さらに、これらの代表的な培養物を分析し、酵素Ｎｏｔ　Ｉでの制限酵素消化を 含む、よく知られている技術による、存在するプラスミドベクター内に含まれる ＧＣＬ−１発現ＤＮＡ挿入物のおよそのサイズを測定した。約２．８から約４． ０キロベース（ｋｂ）のサイズの挿入物が検出された。

観測されたデータから、生成した非染色体プラスミドベクターの多くの構造配列 特性の存在がこの分野でよく知られている構造配列の一般的性質であることから ＩＦすることができる。例えば、レウィン（Ｌｅｗｉｎ）、ジーンズ（Ｇｅｎｅ ｓ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏ ｎｓ、　Ｌｔｄ、＋）Ｎ　Ｙ州、ニューヨーク（１９８３）参照。より特別な場 合には、原核性細菌タンパク質は、間にある非コード配列（すなわち、イントロ ン）のような、真核生物中でみられる中断以外、その同族ヌクレオチド配列とコ リニア−である。それ故、ＧＣＬ−１をコードするヌクレオチド塩基対数のラフ な見積りは、アミノ酸残基当り、約１１０ダルトン及びアミノ酸残基当り、３個 のヌクレオチド塩基対の転換因子を用いることにより、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用い て解析したそのレクチンのみがけ上の分子量から直接行うことができる。この転 換により、約２２．４００ダルトンのサイズをもつ、ＧＣＬ−１は約２０４個の アミノ酸を含み、そして、約６１２ヌクレオチド塩基対によりコードされる。

細菌中の遺伝子の発現は、転写及び翻訳の開始及び停止信号に依存している。こ れらの信号も、それらが、タンパク質コード配列の発現を制限する、その配列内 に含まれる信号であることがら、発現制御信号と呼ばれる。それらの信号は、プ ラスミドベクターｐａｓｓ６のＢａＩＩＨＩクローニング部位のまわりには存在 しないことがら、これらの配列は、ＧＣＬ−１をコードする領域の末端部又は付 近の、それらの通常の位置内のＤＮＡ挿入により提供される。このように、その 挿入ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ挿入物のための生物学的宿主に対し、外来のものであ る、細菌性レクチンの発現のためのコード領域に通ずる、上流及び下流（隣接） 領域と機能的に結合した発現制御信号同様、コード領域を含む。

膜と会合するタンパク質又は、分泌されるタンパク質に対して、通常みられるリ ーダーペプチドの存在は、本来の生物学的宿主の代りの大腸菌中で発現したとき 、わずかに長い、みかけ」−のＧＣＬ−１の分子量により証明された。

加えて、その発現制御信号の特異的要素はＧＣＬ−１遺伝子の転写の開始に必要 なプロモーターである。このプロモーター配列は、通常、コード配列の始めの５ ′側に位置する。そのプロモーター配列は、他の細菌遺伝子において特徴づけら れているので、そのＧＣＬ−１プロモーターも、コード配列の５′末端位置のリ ーダー配列に相対的に近接して結しており、リーダー配列から約６１２ヌクレオ チド塩基対内に存在すると考えられている。

従って、先に特徴づけられた、代表的ＧＣＬ−１遺伝子挿入物は、約２．８から 約４．Ｏｋｂのサイズ範囲をもち、約２２．４００ダルトンのレクチンタンパク 質をコードするコード配列を含んでいる一方、そのような挿入物は、より大きな もの、例えば約１０ｋｂのオーダー、好ましくは、約６ｋｂのものであろう。リ ーダー配列、プロモーターを含む適当な開始及び停止信号、及び種々の■”の、 その遺伝子の各両末端に位置する付加的で余分な隣接配列が、本発明で考えられ ているクローン化され、そして単離されたＤＮＡ断片中、ＧＣＬ−１遺伝子その ものに加えて、存在する。

挿入されたＧＣＬ−１遺伝子をもつ、発現ベクターとしてのｐｌ（５５６ブラス ミドを含む代表的大腸菌単離物及び図５に示したようなＧＣＬ−１を発現するも のを参照のためｐｃｃｔ、−ｉと命名した。

この細菌培養物をＡＴＣＣ受理番号６７．１９８号として、メリーランド（Ｍａ ｒｙｌａｎｄ）　、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）　、アメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に保管した。

その保管期間は、保管期日から３０年間又は、保管所における保管の要請後５年 間、又は、米国特許の出願からの存効期間のなかのより長いものでなければなら ないというプダベスト・トリーティー・必要事項に従かい保管がなされた。組換 えプラスミド含有細胞は、保管所で生育不能となったとき、補充されるであろう 。

従って、−面において、本発明は、単離された形の、又は先に述べたような細菌 性レクチンをコードする、生物学的宿主中、その宿主に対しては外来性のもので ある複製可能ＤＮＡ断片としての、ＤＮＡ断片を考えている。このＤＮＡ断片は 、そのＤＮＡ断片中に存在するレクチンをコードする領域に機能的に結合した、 その考案された細菌レクチンの発現に必要な制御信号を含みうる。これらの発現 制御信号が生物学的宿主にとって外来性ではあるが、その信号は、その宿主によ り認識される。本発明のこの特別な特色の、好ましい態様において、このコード 領域は、Ｎ、ｇ、に存在するレクチンをコードする天然の領域である。より好ま しくは、そのＤＮＡ断片中に存在する、その発現制御信号又は信号塩基対配列は 、レクチンに対するＮ、ｇ、のコード領域に関連している天然のＮ、ｇ、発現制 御信号である。

ここで考えられている細菌性レクチンのコード領域は約６５０塩基対しか含んで おらず、そして、その両端に結合する隣接領域と会合している。コード領域とと もに、その隣接領域は、約１０ｋｂ、好ましくは、約６ｋｂＬか含んでいない。

さらに本発明の方法的局面は、適当な条件下、転写−翻訳培地中でのＤＮＡの増 殖に対して先に述べた非染色体プラスミドベクターを含有するバクテリアを含む 細菌培養及びその後の、よく知られたタンパク質収穫技術を利用した培養物から の発現された細菌性レクチンの収穫のステップを利用した、細菌性レクチンの生 産方法を考えている。

特別な態様を含むこれまでの説明は本発明を説明するためのものであり、それを 制限するものではない。多くの、その他の変化や修正は、本発明の真の精神及び 範囲から逸脱することなしに行うことが可能である。

ＡＳ ０．０．、、。ｘｌｏ−３１−１ 】 手続補正書（方式） ％式％ ３、補正をする者 事件との関係　出願人 ６、補正の対象　明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告 ＦＣＴ／じ５Ｅ７／ｚＨム９０ ｐ（τ／Ｉ；５８７１０！４９０ ＰＣＴ１０５８７１０１４９０ エエＬ　ＣＬａ工！ｌｌｓ　１４−２３　ｄｒａｗｎ　ｔＯｐｒｃｄｕｃ釦ｇ　 ｂａｃｔｅ；工ａＩＬ＠１ｃｔｌｎ　ＶＬ＆　ｇｅｎｅｔ＝ｃ　ｅｎｇｘｒ＋ｅ ｅｒｉｈｇ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．淋菌から得られ、ラウリル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳 動により約２２，４００ダルトンの相対分子量をもつと測定され、そして、約６ ．１から約６．４の範囲の等電ｐＨ値を有し、特異的にガングリオテトラオシル セラミドに結合することができる単離された細菌性レクチン。 ２．薬学的に許容できる塩の形の請求項１の細菌性レクチン。 ３．薬学的に許容できるキャリヤーとともに請求項１記載の単離された細菌性レ クチンを含む接種物。 ４．請求項３記載の、かつ、レクチンが約１０マイクログラムから約５００ミリ グラム存在する単位投与型の接種物。 ５．請求項３記載の、かつ、そのレクチンが約１００マイクログラムから約５０ ０ミリグラム存在する単位投与型の接種物。 ６．薬学的に許容できるキャリヤー中の、請求項１記載の、効果量のレクチンを ヒトに投与することを含む、淋菌に対するヒトの免疫化方法。 ７．レクチンの約１００マイクログラムから約１００ミリグラムをヒトに投与す る、請求項６記載の方法。 ８．（ａ）ヒトから生体試料を得ること、（ｂ）免疫反応混合物を形成するため に、その得られた生体試料を、ＧＣＬ−１に対する抗体と合せること、（ｃ）そ の抗ＧＣＬ−１抗体が、上記生体試料中に存在するＧＣＬ−１と結合するのに十 分な時間、生物学的検定条件にその形成された免疫反応混合物を維持し、それに より、免疫反応物を形成すること、 （ｄ）その維持した混合物について、免疫反応物の存在を検定すること、 の（ａ）〜（ｄ）のステップを含むヒト生体試料中のレクチンＧＣＬ−１の存在 を測定する方法。 ９．（ａ）ヒトから生体試料を得ること、（ｂ）免疫反応混合物を形成するため に、その得られた生体試料を、請求項１で定義した単離された細菌性レクチンの 部分標本と合せること、 （ｃ）その単離された細菌性レクチンが、生体試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗 体に結合するのに十分な時間、生物学的検定条件に形成された混合物を維持し、 それにより免疫反応物を形成すること、 （ｄ）その維持された混合物について、免疫反応物の存在を検定すること、 の（ａ）〜（ｄ）のステップを含むヒトの生体試料中の抗ＧＣＬ−１抗体の存在 を測定する方法。 １０（ａ）請求項１記載のレクチンＧＣＬ−１に対する抗体及び（ｂ）上記抗体 と上記レクチンＧＣＬ−１の免疫反応を知らせることができる指示手段を組合せ て含む、ネイセリア・ゴナーリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ ｅ）レクチンＧＣＬ−１を検定するのに適した診断システム。 １１（ａ）請求項１記載の、単離された細菌性レクチン、（ｂ）そのレクチンと の、上記抗体の免疫反応を知らせることができる指示手段、 を組合せて含む生体試料中の抗ＧＣＬ−１抗体の存在を測定するのに適した診断 検定システム。 １２．薬学的に許容できるキャリヤー中の、効果量の上記レクチンを含む接種物 を、動物に投与することを含む、請求項１記載の、レクチンＧＣＬ−１と免疫反 応を起こす抗体の産生を、温血動物中で誘導する方法。 １３．接種物が補助剤も含む請求項１２記載の方法。 １４．発現ベクター中に含まれるとき請求項１の細菌性レクチンを発現できる単 離されたＤＮＡ断片で、約６５０塩基対ほどの、上記レクチンコード領域と、そ の両端に結合した隣接領域をもち、その隣接領域とコード領域が合せて１０キロ 塩基対程度のものであるもの。 １５．請求項１４記載の、かつ、約６ｋ塩基対程度の単離されたＤＮＡ断片。 １６．請求項１記載の細菌性レクチンをコードする複製可能なＤＮＡ断片を含み 、かつ、この断片が外来性のものである生物学的宿主。 １７．上記ＤＮＡ断片がさらに、上記コード領域に隣接する、上記レクチンの発 現のための制御信号を含み、その制御信号が、その生物学的宿主にとって外来性 のものであるが、その生物学的宿主により認識されるものである、請求項１６記 載の生物学的宿主。 １８．上記コード領域の上記レクチンに対する、ネイセリアゴナーリア（Ｎｅｉ ｓｓｅｒｉａ　Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の天然のコード領域である、請求項１ 記載の生物学的宿主。 １９．上記ＤＮＡ断片がさらに、上記天然のコード領域に隣接して、上記レクチ ンの発現のための、天然のネイセリアゴナーリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　Ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅ）の発現制御信号を含む、請求項１６記載の生物学的宿主。 ２０．請求項１記載の細菌性レクチンを発現できるＤＮＡ断片で、そのＤＮＡ断 片の複製及び発現を制御する塩基対配列に機能的に結合したもの含み、かつ、そ の断片が、約６５０塩基対程度の上記レクチンコード領域と、それに結合した隣 接領域を有し、両方合せても約１０キロ塩基程度しかないものである、転写−翻 訳培地中でＤＮＡを複製するための非染色体プラスミドベクター。 ２１．請求項２０記載のプラスミド・ベクターを含む細菌、及びそこに含まれる ＤＮＡ断片によりコードされるレクチンの発現に適した培地を含む細菌培養物。 ２２．上記細菌培養物が、ＡＴＣＣ受理番号６７，１９８号と同一のものである 、請求項２１記載の細菌培養物。 ２３（１）培養により、細菌性レクチンを発現するのに適した生育条件下、複製 及び発現を制御する塩基対配列と機能的に結合している、細菌性レクチンを発現 することができるＤＮＡ断片を含む、転写−翻訳培地中で、ＤＮＡを増殖させる ための非染色体プラスミドベクターを含む細菌を含む細菌培養物を生育させるこ と、（２）その細菌培養物から、発現した細菌性レクチンを収穫すること、 の（１）、（２）のステップを含む細菌性レクチンの産生方法。