JPS6351677B2

JPS6351677B2 -

Info

Publication number: JPS6351677B2
Application number: JP58156273A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Kobayashi; Takashi Okemoto; Keiji Kainuma; Hitoshi Hashimoto; Kozo Hara
Original assignee: Ensuiko Seito Kk; NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
Current assignee: Ensuiko Seito Kk; NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
Priority date: 1983-08-29
Filing date: 1983-08-29
Publication date: 1988-10-14
Also published as: JPS6054679A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なマルトペンタオース合成酵素お
よびその製造方法に関する。近年、マルトオリゴ糖に関する研究がすすめら
れているが、現在工業的に大量生産されているも
のはマルトースのみである。マルトース以外には
マルトトリオースが試薬用として、またマルトペ
ンタオースがアミラーゼ活性測定用としてそれぞ
れ少量生産されているにすぎない。しかし、最近マルトトリオース〜マルトヘキサ
オースのマルトオリゴ糖を特異的に生産する微生
物起源のアミラーゼが次々に発見され、澱粉から
各種オリゴ糖の生産が容易に行なえるようになつ
てきた。たとえばマルトペンタオースに関しては
Arch.Biochem.Biophys.，155，290（1973）およ
び日本農芸化学会昭和57年度大会要旨集178頁に
記載の酵素が知られている。ところが、これらの
酵素は反応初期からマルトペンタオース以外の各
種糖を生成するものであり、マルトペンタオース
のみを生成するアミラーゼは未だ知られていな
い。本発明者らはマルトペンタオースを効率よく合
成し得る酵素を検索すべく研究を重ねた。その過
程でアルカリゲネス属に属する微生物を培養する
ことにより目的とするマルトペンタオース合成酵
素が得られるこを見出し、本発明を完成するに至
つた。本発明は、第１に以下に示す性質を有する新規
なマルトペンタオース合成酵素に関する。 (1) 本酵素はアミロース，可溶性澱粉，馬鈴薯澱
粉，甘藷澱粉，米澱粉，タピオカ澱粉，トウモ
ロコシ澱粉，モチトウモロコシ澱粉，サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
5.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.0において至適温度は45℃であ
り、55℃以上の温度で15分間放置すると失活す
る。 (4) 本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀
およびモノヨードアセトアミド溶液中で阻害を
受けるが、阻害率は10〜20％である。 (5) 本酵素の分子量は約82000（デイスクゲル電気
泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH5.2（アンフオライン電気
泳動法による）である。第２に本発明は、アルカリゲネス属に属し、上
記の性質を有する新規なマルトペンタオース合成
酵素の生産能を有する微生物を培養し、培養物中
に該酵素を蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする新規なマルトペンタオース合成酵素の製
造方法である。本発明の新規なマルトペンタオース合成酵素は
微生物を用いて生産され、その生産菌としてはア
ルカリゲネス属に属し、上記性質を有する酵素を
生産する能力を有するものであればよく、たとえ
ばアルカリゲネス・フエカリスIAM―1015など
がある。これらは生産能に強弱の差異はあるが、
いずれも目的とするマルトペンタオース合成酵素
を産生する。なお、アクロモバクター属やモラキ
シダ属の微生物は運動性、カタラーゼ・テストな
どにアルカリゲネス属の微生物と差異が認められ
るのみであり、アルカリゲネス属に類縁の微生物
であると考えられるので、これらに属する菌株の
中にも本発明の酵素の生産能を有するものが存在
するものと推測される。上記の如く、本発明に用いる微生物はアルカリ
ゲネス属に属し、上記性質を有する酵素の生産能
力を有するものであればよく、前記した菌株とそ
の変種，変異株に制限されるものではない。ここ
で変異手段としては常法のものでよく、たとえば
ラジオアイソトープ（RI），紫外線（UV），ニト
ロソグアニジンなどを用いて行なえばよい。本発明の新規なマルトペンタオース合成酵素を
生産するための微生物の培養条件について検討し
た。まず、基本培地として肉エキス，ポリペプト
ン，食塩および炭素源を含むものを用い、炭素源
については第１表に示した各種物質を１％使用し
た。この培地に後記する実施例２の示した菌株を
植菌し、40℃で３日間振とう培養を行なつた。こ
のときの活性比率（マルトースを100としたとき
の値）を第１表に示す。表から明らかなように、
炭素源してはマルトースが最良であり、澱粉の中
では米澱粉、甘藷澱粉を用いたときにかなり高い
活性が得られた。また、各種粉アメを用いたとき
の活性比率はDEが高くなると共に高くなり、ハ
イマルトースシロツプではマルトースと同程度の
活性が得られた。

【表】次に、窒素源について検討するため、肉エキス
0.7％，マルトース１％，食塩0.3％を含む培地に
各種物質１％を添加し、40℃で３日間振とう培養
を行なつた。このときの活性比率（硫酸アンモニ
ウムを100としたときの値）を第２表に示す。表
から明らかなように、硫酸アンモニウムまたは硝
酸アンモニウムを用いたときに著しく高い活性が
得られた。

【表】

【表】さらに、マルトース，硫酸アンモニウムおよび
肉エキスのそれぞれの濃度について検討した結
果、最適の培地組成はマルトース0.8％，硫酸ア
ンモニウム１％および肉エキス0.8％を含むもの
であることが判明した。したがつて、培養に用い
る培地としては、上記知見を参考にして、供試菌
株が良好な活性にて目的とする酵素を生産し得る
組成のものを選定すべきである。次に、培養日数による活性変化について検討し
たところ、第１図に示すような結果が得られた。
図示した如く、培養１日で70％以上の活性が得ら
れ、３日目まで徐々に活性は上昇する。しかし、
その後は活性が減少する。したがつて、酵素の生
産には１〜３日間の培養が適当であり、通常は３
日間培養した後、培養液中の不溶分等を遠沈除去
して得た上澄を粗酵素として用いればよい。な
お、培養条件については使用する菌株などによつ
て異なるが、目的とする酵素の生産量が最大とな
るように選定すべきである。また、培養液から酵
素を採取・精製するには既知の方法を適当に組合
せて行なえばよい。酵素の精製は各種の方法により行なうことが出
来るが、その１例を示すと、次の通りである。酵素の精製方法としては湿熱処理澱粉を用いた
澱粉吸着法が効果的である。すなわち、粗酵素液
に湿熱処理澱粉を加えて４℃以下の低温で１夜撹
拌するのみで約80％の活性が吸着する。次に、該
酵素吸着澱粉を集めて氷水にて洗浄することによ
り容易に部分精製酵素が得られる。吸着酵素はこ
のままでも液化澱粉に作用させることができ、実
用的には本酵素剤をマルトペンタオースの生産用
とすることが有利である。吸着酵素は45℃の温水中で15分間撹拌すること
によつて脱着するので、この脱着酵素をさらに
DEAE―セルロースカラムクロマトグラフイー，
ゲル濾過クロマトグラフイーなどにより精製して
デイスクゲル電気泳動的に単一バンドを示す標品
を得ることができる。このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の
性質を検討した。結果を以下に示す。 (1) 作用本酵素を可溶性澱粉に作用させたときの反応経
過は第２図および第３図に示したとおりである。
図から明らかなように、本酵素は反応初期にマル
トペンタオースを生成し、その後時間の経過と共
にマルトースとマルトトリオースに水解される。したがつて、マルトペンタオースを効率的に生
産するには、本酵素を、たとえばメンブランリア
クターのような容器中で液化澱粉に作用させ、生
成糖を限外濾過膜を用いて反応系外に取り出す方
法を採用することが望ましい。本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下
のオリゴ糖を基質にした場合、次の通りである。
なお、略号はG₁：グルコース， G₂：マルトース，G₃：マルトトリオース‐‐
G₅：マルトペンタオース，‐‐G₃：マルトオク
タオースを示す。 G₈：〇―〇―〇―〇―〇―〇―〇―○／→G₅＋G₃ G₇：〇―〇―〇―〇―〇―〇○／ →G₅＋G₂ G₆：〇―〇―〇―〇―〇○／ →G₅＋G₁ G₅：〇―〇―〇―〇○／ →G₃＋G₂ G₄：〇―〇―〇―○／ →G₂＋G₂ G₃，G₂：作用しないこの作用形式から、G₂とG₃の混合物を生産し、
酵母によりG₂を消化させてG₃を製品としたり、
またG₂とG₃の混合物を製品とすることもできる。このように、重合度が小さい基質を用いた場
合、本酵素はいわゆるExo型のアミラーゼとして
の作用を示すが、重合度の大きいデキストリンに
はEndo型のアミラーゼとして作用する。したが
つて、澱粉は本酵素の作用によつて切り残しは大
部分がG₅またはG₂とG₃に変換する。この際、プ
ルラナーゼ等の枝切り酵素を共存させれば、G₅
の収率を向上させることができる。 (2) 作用至適PHおよびPH安定性反応液組成を基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 各種のPHの緩衝液（100mM） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、45℃で30分間反応させて還元力を測定し、
最高値を100として表わしたときの結果を第４図
に示す。図から明らかなように、本酵素の至適PH
は６〜７である。また、PH安定性については、本酵素液１mlに各
種PHの100mM緩衝液（PH４〜６：酢酸緩衝液，
PH６〜８：リン酸緩衝液，PH８〜９：トリス―塩
酸緩衝液，PH９〜10：炭酸ソーダ緩衝液）0.1ml
を加え、45℃で60分間静置した後、各0.1mlずつ
を採り100mM酢酸緩衝液（PH6.0）0.4mlおよび２
％基質液0.5mlを加えて45℃にて30分間反応させ、
残存酵素活性を測定した。結果を第５図に示す。
第５図に示したように、本酵素はPH5.5〜9.0の範
囲で安定である。 (3) 酵素力価の測定法酵素の活性は、可溶性澱粉（メルク社製，分析
用）を還元して基質として用い、ソモジー・ネル
ソン法により還元力を測定し、45℃で１分間に１
マイクロモル等量のグルコシド結合を切断する酵
素量を1IU（国際単位）とした。 (4) 作用至適温度と温度安定性反応液組成を基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 100mM酢酸緩衝液（PH6.0） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、各種の温度で30分間反応させて還元力を測
定し、最高値を100として表わしたときの結果を
第６図に示す。図から明らかなように、本酵素の
作用至適温度は45℃である。またPH6.0で各種温度に15分間静置した後、45
℃で反応を行ない、残存活性を測定した。結果を
第７図に示す。第７図から明らかなように、55℃
以上では急激に失活する。 (5) 阻害，活性化および安定化本酵素は1mMパラクロロ安息香酸第二水銀お
よびモノヨードアセトアミド溶液中では阻害を受
けるが、阻害率は10〜20％であり高くはない。次に、各種金属イオン（1mM濃度）の影響は
水銀および銀による阻害率が80％以上という高い
値を示すが、マンガン，コバルト，亜鉛，アルミ
ニウムは50％以下、バリウム，マグネシウム，
鉄，リチウム，銅は20〜30％である。また、カル
シウムイオンは本酵素の耐熱性を２〜３℃高め
る。 (6) 分子量デイスクゲル電気泳動法によつて得られた本酵
素の分子量は約82000である。 (7) 等電点アンフオライン電気泳動法によつて求められた
等電点はPH5.2である。 (8) 結晶構造および元素分析本酵素については未だ結晶標品が得られていな
いが、電気泳動で単一バンドを示す精製標品につ
いてアミノ酸分析を行なつた。アミノ酸分析は常法により試料に６規定の塩酸
を加えて減圧，封かんし、110℃で22時間分解し
た後、アミノ酸自動分析計（日立835型）を用い
て行なつた。なお、トリプトフアンはSpies氏の
比色定量法，システインは過ギ酸酸化法により定
量した。結果を第３表に示す。第３表アミノ酸モル数アラニン 48 バリン 42 ロイシン 53 イソロイシン 36 プロリン 38 フエニルアラニン 18 トリプトフアン 29 メチオニン 24 グリシン 78 セリン 41 スレオニン 45 システイン５チロシン 39 アスパラギン酸 82 グルタミン酸 65 リジン 42 アルギニン 28 ヒスチジン 20 以上に示した性質を有する本酵素は従来の酵素
と全く異なる作用を示し、マルトペンタオースを
大量に生成する新規な酵素である。本発明者ら
は、本酵素を１，４―α―Ｄ―グルカンマルトペ
ンタオハイドロラーゼと命名した。前述したように、本酵素はアミロース，可溶性
澱粉、各種澱粉に作用してマルトペンタオースを
生成する。したがつて、澱粉、澱粉の組成画分お
よび澱粉の分解反応生成物のうちの少なくとも１
種の物質に本酵素を作用させることにより、マル
トペンタオースが生成・蓄積する。反応を行なう
にあたり、本酵素の性質を考慮してマルトペンタ
オースの生成量が最大となるような条件を選定す
べきである。ここで澱粉としては、たとえば馬鈴
薯，甘藷，トウモロコシ，モチトウモロコシ，大
麦，小麦，米，タピオカ，サゴなどの任意の原料
から得られるものを使用することができる。ま
た、澱粉の組成画分としては、たとえばアミロー
ス，アミロペクチンなどがあり、澱粉の分解反応
生成物としては、たとえば白色デキストリン、黄
色デキストリン，プリテイツシユガムなどの焙焼
デキストリン；酸化澱粉，低粘性変性（酵素，
酸，機械高速撹拌等の処理による）澱粉などの化
工澱粉；リン酸澱粉，酢酸澱粉などで代表される
澱粉エーテル，澱粉エステルなどの澱粉誘導体；
放射線や中性子線を照射したり高周波処理あるい
は湿熱処理した澱粉などの物理的処理澱粉；α―
澱粉などを挙げることができる。これらの澱粉類
は単独もしくは２種以上を組合せて用いる。反応終了後、加熱して酵素を失活させて反応を
停止し、反応液から常法によつてマルトペンタオ
ースを得ることができる。マルトペンタオースは現在、α―アミラーゼ活
性測定用基質として診断薬，試薬などへの用途が
あり、本酵素が本発明によつて安価に生産されれ
ば、食品をはじめ各種用途も拓けるものと期待さ
れる。マルトペンタオースは溶解性に優れ、甘味
がなく、ボデイ感があるので製菓用材料として有
用であり、また消化・吸収性が良いので幼児，老
人，患者用の慈養食としての利用も可能である。次に、実施例により本発明を説明する。実施例１アルカリゲネス・フエカリスIAM―1015株を
肉エキス0.8％，硫酸アンモニウム１％，マルト
ース0.8％の斜面寒天培地に接種し、40℃で２日
間培養した後、その１白金耳をとり、同じ組成の
液体培地（100ml培地／500ml三角フラスコ）に移
し、45℃で３日間通気振とう培養を行なつた。培養終了後、低温で培養物中の菌体および不溶
物を遠沈除去して上澄を得、これを粗酵素とし
た。この粗酵素液の活性は0.01IU／mlであつた。実施例２アルカリゲネス・フエカリスIAM―1015株の
培養液を少量とり、常法によりRI，UV，ニトロ
ソグアニジンで処理した後、平板培養を行ないア
ミラーゼ活性の高いコロニーをとつた。これを肉
エキス0.8％，硫酸アンモニウム１％，マルトー
ス0.8％の培地で45℃にて３日間培養し、その後
の操作は実施例１と同様にした。本粗酵素液の活
性は0.64IU／mlであつた。応用例１馬鈴薯澱粉を細菌液化型酵素（BLA）により
液化し、ヨウ素―澱粉反応が青色で失活処理し、
基質濃度10％，マルトペンタオース合成酵素（実
施例２の粗酵素液）1IU／ｇ基質，PH6.0，45℃で
６時間撹拌しながら反応せしめマルトペンタオー
スを30％含む反応液を得た。応用例２応用例１のようにして液化馬鈴薯澱粉液を作
り、基質濃度20％，マルトペンタオース合成酵素
（実施例２の粗酵素液）1IU／ｇ基質，PH6.0，45
℃で限外過器〔東洋紙(株)製、UHP―76（膜は
UK―10）〕中で窒素ガスで圧力をかけながら反
応させてマルトペンタオースを80％以上含む糖液
を得た。収率は12時間反応で出発基質の60％であ
り、得られた糖液は逆浸透膜で20％にまで濃縮す
ることができた。応用例３プルラナーゼを1IU／５ｇ基質に加えたこと以
外は応用例２と同様に操作し、12時間の反応でマ
ルトペンタオースを80％以上含む糖液を収率65％
で得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は培養日数による活性変化とPH変化を示
すグラフ、第２図はマルトペンタオース合成酵素
の反応経過（1IU／ｇ基質）を示すグラフ、第３
図は本酵素の反応経過（1IU／10mg基質）を示す
グラフ、第４図は本酵素の至適PHを示すグラフ、
第５図は本酵素のPH安定性を示すグラフ、第６図
は本酵素の至適温度を示すグラフ、第７図は本酵
素の温度安定性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の性質を有する新規なマルトペンタオー
ス合成酵素。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
5.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.0において至適温度は45℃であ
り、55℃以上の温度で15分間放置すると失活す
る。 (4) 本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀
およびモノヨードアセトアミド溶液中で阻害を
受けるが、阻害率は10〜20％である。 (5) 本酵素の分子量は約82000（デイスクゲル電気
泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH5.2（アンフオライン電気
泳動法による）である。２アルカリゲネス属に属し、下記の性質を有す
る新規なマルトペンタオース合成酵素の生産性を
有する微生物を培養し、培養物中に該酵素を蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする新規な
マルトペンタオース合成酵素の製造方法。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
5.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.0において至適温度は45℃であ
り、55℃以上の温度で15分間放置すると失活す
る。 (4) 本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀
およびモノヨードアセトアミド溶液中で阻害を
受けるが、阻害率は10〜20％である。 (5) 本酵素の分子量は約82000（デイスクゲル電気
泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH5.2（アンフオライン電気
泳動法による）である。３アルカリゲネス属に属する新規なマルトペン
タオース合成酵素の生産菌がアルカリゲネス・フ
エカリスである特許請求の範囲第２項記載の製造
方法。４アルカリゲネス属に属する新規なマルトペン
タオース合成酵素の生産菌を、炭素源としてマル
トース、マルトースを含む水アメ、澱粉および可
溶性澱粉のいずれかを含む培地に培養する特許請
求の範囲第２項記載の製造方法。