JPS63301795A - マルトペンタオース合成酵素を用いてマルトペンタオースを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はマルトペンタオース合成酵素を用いてマルトペ
ンタオースを製造する方法に関し、詳しくは特定の微生
物が生産するマルトペンタオース合成酵素を用いて効率
よくマルトペンタオースを製造する方法に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕近
年、マルトオリゴ糖に関する研究がすすめられているが
、現在工業的に大量生産されているものはマルトースの
みである。マルトース以外にはマルトトリオースが試薬
用として、またマルトペンタオースがアミラーゼ活性測
定用としてそれぞれ少量生産されているにすぎない。

しかし、最近マルトトリオ−スルマルトヘキサオースの
マルトオリゴ糖を特異的に生産する微生物起源のアミラ
ーゼが次々に発見され、澱粉から各種オリゴ塘の生産が
容易に行なえるようになってきた。たとえばマルトペン
タオースに関してはＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅ曽、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、＋　１５５＋　２９０　（１９７３）お
よび日本農芸化学会昭和５７年度大会要旨集１７８頁に
記載の酵素が知られている。ところが、これらの酵素は
反応初期からマルトペンタオース以外の各種糖を生成す
るものであり、マルトペンタオースのみを生成するアミ
ラーゼは未だ知られておらず、マルトペンタオースの効
率的な製造方法も確立されていない。

〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明知者らは、マルトペンタオースを効率よく
製造する方法を検索すべく研究を重ねた。

その結果、アルカリ土類金属に属する微生物を培養する
ことにより目的とするマルトペンタオース合成酵素が得
られ、該酵素を用いれば効率的にマルトペンタオースを
製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、澱粉、澱粉の組成画分および澱粉の
分解反応生成物のうちの少なくとも１種の物質に下記の
性質を有するマルトペンタオース合成酵素を作用させる
ことを特徴とするマルトペンタオースの製造方法を提供
するものである。

（１１本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱粉、
甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモロコシ澱粉、
モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉などに作用してマルト
ペンタオースを生成する。

（２）本酵素は４５℃にてｐＨ６〜７が至適であり、Ｐ
Ｈ５，５〜９で安定である。

（３）本酵素はｐＨ６，０において至適温度は４５℃で
あり、５５℃以上の温度で１５分間放置すると失活する
。

（４）本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀およ
びモノヨードアセトアミド溶液中で阻害を受けるが、阻
害率は１０〜２０％である。

（５）本酵素の分子量は約８２０００　（ディスクゲル
電気泳動法による）である。

（６）本酵素の等電点はｐＨ５，２（アンフオライン電
気泳動法による）である。

本発明で用いるマルトペンタオース合成酵素は微生物を
用いて生産され、その生産菌としてはアルカリ土類金属
に属し、上記性質を有する酵素を生産する能力を有する
ものであればよく、たとえばアルカリゲネス・フェカリ
スＩＡＭ−１０１５などがある。これらは生産能に強弱
の差異はあるが、いずれも目的とするマルトペンタオー
ス合成酵素を産生ずる。なお、アクロモバクタ−属やモ
ラキシダ属の微生物は運動性、カタラーゼ・テストなど
にアルカリ土類金属の微生物と差異が認められるのみで
あり、アルカリ土類金属に類縁の微生物であると考えら
れるので、これらに属する菌株の中にも本発明の酵素の
生産能を有するものが存在するものと推測される。

上記の如く、本発明に用いる微生物はアルカリ土類金属
に属し、上記性質を有する酵素の生産能力を有するもの
であればよく、前記した菌株とその変種、変異株に制限
されるものではない。ここで変異手段としては常法のも
のでよく、たとえばラジオアイソトープ（Ｒ１）、紫外
線（ＵＶ）。

ニトロソグアニジンなどを用いて行なえばよい。

次に、本発明に用いるマルトペンタオース合成酵素を生
産するための微生物の培養条件について検討した。まず
、基本培地として肉エキス、ポリペプトン、食塩および
炭素源を含むものを用い、炭素源については第１表に示
した各種物質を１％使用した。この培地に後記する実施
例２に示した菌株を植菌し、４０’Ｃで３日間振とう培
養を行なった。このときの活性比率（マルトースを１０
０としたときの値）を第１表に示す６表から明らかなよ
うに、炭素源としてはマルトースが最良であり、澱粉の
中では米澱粉、甘藷澱粉を用いたときにかなり高い活性
が得られた。また、各種粉アメを用いたときの活性比率
はＤＥが高くなると共に高くなり、ハイマルトースシロ
ップではマルトースと同程度の活性が得られた。

】−」−一表 グ　　ル　　コ　　−　　ス　　　　　０．０１　　　
　　３．０フ　　ラ　　り　　ト　　−　　ス　　　　
　　０．０２　　　　　　６．１シ　　ュ　　り　　ロ
　　−　　ス　　　　　　０．０４　　　　１２．１マ
　　ル　　ト　　−　　ス　　　　　０．３３　　　　
１００八イマルトースシロフブ　　　０．３１　　　９
４アミロース（狂１００）　　　　　０．１７　　５１
．５可溶性澱粉　０．１８　５５．６ 馬鈴薯澱粉　０．０７　２１．２ 甘　　薯　　澱　　粉　　　　０．２０　　　６０．６
米　　　　澱　　　　粉　　　　０．２３　　　６８．
５タピオカ澱粉　０．０４　１２．１ トウモロコシ澱粉　　０．０４　　１２．１モチトウモ
ロコシ澱粉　　　０．０７　　２１．２小　　麦　　澱
　　粉　　　　００ サ　　　ゴ　　　澱　　　粉　　　　０．０７　　　　
２１．２サイク０］ストリン粉アメ　　　　０．１２　
　　３６．４コーンスチーブリカ−０，０４１２，１次
に、窒素源について検討するため、肉エキス０．７％、
マルトース１％１食塩０．３％を含む培地に各種物質１
％を添加し、４０℃で３日間振とう培養を行なった。こ
のときの活性比率（硫酸アンモニウムを１００としたと
きの値）を第２表に示す０表から明らかなように、硫酸
アンモニウムまたは硝酸アンモニウムを用いたときに著
しく高い活性が得られた。

ペ　　プ　　　ト　　　ン　　　　　　　　　０．３４
　　　　１６．７ポリペプトン　　　０．１８　　８．
９カ　　　ゼ　　　イ　　　ン　　　　　　　　　０．
２２　　　　１０．８カ　　ザ　　ミ　　ノ　　酸　　
　　　　　　　０．０９　　　　　　４．４ポテトプロ
テイン　　　　　　００ 酢酸アンモニウム　　　　　　００ 硫酸アンモニウム　　　　　２．０３　　１００硝酸ア
ンモニウム　　　　　１．５８　　７７．８尿　　　　
　　　　素　　　　　　　　ＯＯ無　　　添　　　加　
　　　　　　　００さらに、マルトース、硫酸アンモニ
ウムおよび肉エキスのそれぞれの濃度について検討した
結果、最適の培地組成はマルトース０．８％、硫酸アン
モニウム１％および肉エキス０．８％を含むものである
ことが判明した。したがって、培養に用いる培地として
は、上記知見を参考にして、供試菌株が良好な活性にて
目的とする酵素を生産し得る組成のものを選定すべきで
ある。

次に、培養日数による活性変化について検討したところ
、培養１日で７０％以上の活性が得られ、３日目まで徐
々に活性は上昇する。しかし、その後は活性が減少する
。したがって、酵素の生産には１〜３日間の培養が適当
であり、通常は３日間培養した後、培養液中の不溶分等
を遠沈除去して得た上澄を粗酵素として用いればよい、
なお、培養条件については使用する菌株などによって異
なるが、目的とする酵素の生産量が最大となるように選
定すべきである。また、培養液から酵素を採取・精製す
るには既知の方法を適当に組合せて行なえばよい。

酵素の精製は各種の方法により行なうことが出来るが、
その１例を示すと、次の通りである。

酵素の精製方法としては温熱処理澱粉を用いた澱粉吸着
法が効果的である。すなわち、粗酵素液に温熱処理澱粉
を加えて４℃以下の低温で１夜攪拌するのみで約８０％
の活性が吸着する０次に、該酵素吸着澱粉を集めて氷水
にて洗浄することにより容易に部分精製酵素が得られる
。吸着酵素はこのままでも液化澱粉に作用させることが
でき、実用的には本酵素剤をマルトペンタオースの生産
用とすることが有利である。

吸着酵素は４５℃の温水中で１５分間攪拌することによ
って脱着するので、この脱着酵素をさらにＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィーなどにより精製してディスクゲル電気泳動的
に単一バンドを示す標品を得ることができる。

このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の性質を検
討した。結果を以下に示す。

（１）　　作用 本酵素を可溶性澱粉に作用させたときの反応経過は第１
図および第２図に示したとおりである。

図から明らかなように、本酵素は反応初期にマルトペン
タオースを生成し、その後時間の経過と共にマルトース
とマルトトリオースに水解される。

したがって、マルトペンタオースを効率的に生産するに
は本酵素を、たとえばメンプランリアクターのような容
器中で液化澱粉に作用させ、生成域を限外濾過膜を用い
て反応系外に取り出す方法を採用することが望ましい。

本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下のオリゴ
糖を基質にした場合、次の通りである。

なお、略号はＧ１ニゲルコース、Ｇ２：マルトース。

Ｇ３＝マルトトリオース、−Ｇ、：マルトペンタオース
、−Ｇ、：マルトオクタオースを示す。

Ｇ、：　　　　　　　　　　　　　　　　　→　Ｇ　ｓ
　＋　Ｇ　ｓＧフ：　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　→　　Ｇ、＋Ｇ。

Ｇ６：　　　　　　　　　　　　　　　　　→　Ｇ、＋
Ｇ。

Ｇｓ：　　　　　　　　　　　　　　　　　→　Ｇ３＋
ＧｚＧ４：０−０−０−グ　　　　　　　　　→　Ｇ２
土Ｇ２Ｇ５．Ｇｚ：作用しない 二の作用形式から、Ｇ２と６３の混合物を生産し、酵母
によりＧ！を消化させてＧ３を製品としたり、またＧ２
とＧ３の混合物を製品とすることもできる。

このように、重合度が小さい基質を用いた場合、本酵素
はいわゆるＥｘａ型のアミラーゼとしての作用を示すが
、重合度の大きいデキストリンにはＥｎｄｏ型のアミラ
ーゼとして作用する。したがって、澱粉は本酵素の作用
によって切り残しはなく大部分がＧ、またはＧ！とＧ、
に変換する。この際、プルラナーゼ等の技切り酵素を共
存させれば、Ｇ、の収率を向上させることができる。

（２）作用至適ｐｎおよびｐＨ安定性 反応液組成を とし、４５℃で３０分間反応させて還元力を測定し、最
高値を１００として表わしたときの結果を第３図に示す
０図から明らかなように、本酵素の至適ｐＨは６〜７で
ある。

また、ｐＨ安定性については、本酵素液１１１１に各種
ｐＨの１００ｍＭ１ｌ衝液（ｐＨ４〜５Ｈ酢酸緩衝液。

ｐＨ６〜８ニリン酸緩衝液、ｐＨ８〜９ニドリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９〜１０：炭酸ソーダ緩衝液）０．１−を
加え、４５℃で６０分間静置した後、各０．１蔵ずつを
採り１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０＞０、４　ｄお
よび２％基質液０．５ｔａｌを加えて４５℃にて３０分
間反応させ、残存酵素活性を測定した。

結果を第４図に示す、第４図に示したように、本酵素は
ｐＨ５，５〜９．０の範囲で安定である。

（３）酵素力価の測定法 酵素の活性は、可溶性澱粉（メルク社製２分折用）を還
元して基質として用い、ソモジー・ネルラン法により還
元力を測定し、４５℃で１分間に１マイクロモル等量の
グルコシド結合を切断する酵素量を１１０（国際単位）
とした。

（４）作用至適温度と温度安定性 反応ａ、組成を ［酵素Ｍ（８１Ｕ／成）　　　　　　　　　　　０．１
ｍＭとし、各種の温度で３０分間反応させて還元力を測
定し、最高値を１００として表わしたときの結果を第５
図に示す。図から明らかなように、本酵素の作用至適温
度は４５℃である。

またｐＨ６，ｏで各種温度に１５分間静置した後、４５
℃で反応を行ない、残存活性を測定した。結果を第６図
に示す、第６図から明らかなように、５５℃以上では急
激に失活する。

（５）阻害、活性化および安定化 本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀およびモノ
ヨードアセトアミド溶液中では阻害を受けるが、阻害率
は１０〜２０％であり高くはない。

次に、各種金属イオン（１ｍＭ濃度）の影響は水銀およ
び銀による阻害率が８０％以上という高い値ヲ示すが、
マンガン、コバルト、亜鉛、アルミニウムは５０％以下
、バリウム、マグネシウム１鉄、リチウム、銅は２０〜
３０％である。また、カルシウムイオンは本酵素の耐熱
性を２〜３℃高める。

（６）分子量 ディスクゲル電気泳動法によって得られた本酵素の分子
量は約８２０００である。

（７）　　等電点 アンフオライン電気泳動法によって求められた等電点は
ＰＨ５，２である。

（８）結晶構造および元素分析 本酵素については未だ結晶標品が得られていないが、電
気泳動で単一バンドを示す精製標品についてアミノ酸分
析を行なった。

アミノ酸分析は常法により試料に６規定の塩酸を加えて
減圧、封かんし、１１０℃で２２時間分解した後、アミ
ノ酸自動分析計（日立８３５型）を用いて行なった。な
お、トリプトファンは５ｐｉｅｓ氏の比色定量法、シス
ティンは過ギ酸酸化法により定量した。結果を第３表に
示す。

メー」Ｌ−表 アラニン　　　　　　　　　　　４８ バリン　　　　　　　　　　　４２ ０イシン　　　　　　　　　　　５３ イソロイシン　　　　　　　　　３６ プロリン　　　　　　　　　　　　３８フエニルアラニ
ン　　　　　　　１日 トリプトファン　　　　　　　　　２９メチオニン　　
　　　　　　　　２４ グリシン　　　　　　　　　　　７８ セリン　　　　　　　　　　　４１ スレオニン　　　　　　　　　　４５ システイン　　　　　　　　　　　５ チロシン　　　　　　　　　　　３９ アスパラギン酸　　　　　　　　８２ グルタミン酸　　　　　　　　　　６５リジン　　　　
　　　　　　　　４２ アルギニン　　　　　　　　　　２８ ヒスチジン　　　　　　　　　　２０ 以上に示した性質を有する本酵素は従来の酵素と全く異
なる作用を示し、マルトペンタオースを大量に生成する
新規な酵素である。本発明者らは、本酵素を１．４−α
−Ｄ−グルカンマルトペンタオハイドロラーゼと命名し
た。

前述したように、本酵素はアミロース、可溶性澱粉、各
種澱粉に作用してマルトペンタオースを生成する。した
がって、澱粉、澱粉の組成画分および澱粉の分解反応生
成物のうちの少なくとも１種の物質に本酵素を作用させ
ることにより、マルトペンタオースが生成・蓄積する０
反応を行なうにあたり、本酵素の性質を考慮してマルト
ペンタオースの生成量が最大となるような条件を選定す
べきである。ここで澱粉としては、たとえば馬鈴　　（
薯、甘藷、トウモロコシ、モチトウモロコシ、大麦、小
麦、米、タピオカ、サゴなどの任意の原料から得られる
ものを使用することができる。また、澱粉の組成画分と
しては、たとえばアミロース。

アミロペクチンなどがあり、澱粉の分解反応生成物とし
ては、たとえば白色デキストリン、黄色デキストリン、
ブリティッシュガムなどの焙焼デキストリン；酸化澱粉
、低粘性変性（酵素、酸１機械高速攪拌等の処理による
）澱粉などの化工澱粉；リン酸澱粉、酢酸澱粉などで代
表される澱粉エーテル、澱粉エステルなどの澱粉誘導体
；放射線や中性子線を照射したり高周波処理あるいは温
熱処理した澱粉などの汁理的処理澱粉；α−澱粉などを
挙げることができる。これらの澱粉類は単独もしくは２
種以上を組合せて用いる。

本発明では、上記澱粉類に前記マルトペンタオース合成
酵素を作用させた後、加熱して酵素を失活させて反応を
停止し、反応液から常法によってマルトペンタオースを
得ることができる。

実施例〕 次に、実施例により本発明を説明する。

製造例１ アルカリゲネス・フェカリスＩＡＭ−１０１５株を肉エ
キス０．８％、硫酸アンモニウム１％。

マルトース０．８％の斜面寒天培地に接種し、４０℃で
２日間培養した後、その１白金耳をとり、同じ組成の液
体培地（１００ｍ培地１５００−三角フラスコ）に移し
、４５℃で３日間通気振とう培養を行なった。

培養終了後、低温で培養物中の菌体および不溶物を遠沈
除去して上澄を得、これを粗酵素とした。

この粗酵素液の活性は０．０１１Ｕ／ｄであった。

製造例２ アルカリゲネス・フェカリスＩＡＭ−１０１５株の培養
液を少量とり、常法によりＲ１，ＵＶ。

ニトロソグアニジンで処理した後、平板培養を行ないア
ミラーゼ活性の高いコロニーをとった。これを肉エキス
０．８％、硫酸アンモニウム１％。

マルトース０．８％の培地で４５℃にて３日間培養し、
その後の操作は製造例１と同様にした０本粗酵素液の活
性は０．６４１Ｕ／ｄであった。

実施例１ 馬鈴薯澱粉を細菌液化型酵素（ＢＬＡ）により液化し、
ヨウ素−澱粉反応が青色で失活処理し、基質濃度１０％
、マルトペンタオース合成酵素（製造例２の粗酵素液）
１１０７ｇ基質、ｐＨ６，０゜４５℃で６時間撹拌しな
がら反応せしめマルトペンタオースを３０％含む反応液
を得た。

実施例２ 実施例１のようにして液化馬鈴薯澱粉液を作り、基質濃
度２０％、マルトペンタオース合成酵素（製造例２の粗
酵素液）１１０７ｇ基質、ｐＨ６．０゜４５℃で限外濾
過器〔東洋濾紙■製、ＵＨＰ−７６（膜はＵＫ−１０）
）中で窒素ガスで圧力をかけながら反応させてマルトペ
ンタオースを８０％以上含む糖液を得た。収率は１２時
間反応で出発基質の６０％であり、得られた糖液は逆浸
透膜で２０％にまで濃縮することができた。

実施例３ プルラナーゼを１．ＩＵ１５ｇ基質に加えたこと以外は
実施例２と同様に操作し、１２時間の反応でマルトペン
タオースを８０％以上含む糖液を収率６５％で得た。

〔発明の効果〕

マルトペンタオースは現在、α−アミラーゼ活性測定用
基質として診断薬、試薬などへの用途があり、本酵素が
本発明によって安価で効率よく生産されれば、食品をは
じめ各種用途も拓けるものと期待される。マルトペンタ
オースは溶解性に優れ、甘味がなく、ボディー感がある
ので製菓用材料として有用であり、また消化・吸収性が
良いので幼児、老人、患者用の滋養食としての利用も可
能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はマルトペンタオース合成酵素の反応経過（１１
０７ｇ基質）を示すグラフ、第２図は本酵素の反応経過
（ＩＩＵ／ｉｏ＋ａｇ基質）を示すグラフ、第３図は本
酵素の至適ｐＨを示すグラフ、第４図は本酵素のｐＨ安
定性を示すグラフ、第５図は本酵素の至適温度を示すグ
ラフ、第６図は本酵素の温度安定性を示すグラフである
。 特許出願人　農林水産省食品総合研究所長Ｈ 図面の浄書（内容に変更１）（ＩＨ，２Ｊｚ、１１１）
第１図 Ｇ、・　　１０Ｉ Ｇ２・　　　　　　　　　＠　　　６２Ｓｔ　　０　５
　１０　１５　２０３０４５　６０　ＧＯｆ２０ＳｔＬ
撤時閲Ｃ＋λ 第２図 ！；ｔ　　Ｏｆ　　２　５　１０　３０　６０１２０１
８０３６０　Ｅａｔ民］１時間　ｌ骨Ｊ 第５図 ヱＬ（’ｃ） １、事件の表示 特願昭６２−２５３７８７ ２、発明の名称 マルトペンタオース合成酵素を用いてマルトペンタオー
スを製造する方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　茨城系つくば市観音台２丁目１−２名称　農林水
産省食品総合研究所長 １）村　眞へ部 住所　神奈川県横浜市鶴見区大黒町１３番４６号５、補
正命令の日付 昭和６３年２月　３日 昭和６３年２月２３日（発送日） ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 願書に最初に添付した図面の第１図および第２図の浄書
・別紙のとおり（内容に変更なし）。 （以上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）、澱粉、澱粉の組成画分および澱粉の分解反応生成
   物のうちの少なくとも１種の物質に下記の性質を有する
   マルトペンタオース合成酵素を作用させることを特徴と
   するマルトペンタオースの製造方法。 （１）本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱粉、
   甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモロコシ澱粉、
   モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉などに作用してマルト
   ペンタオースを生成する。 （２）本酵素は４５℃にてｐＨ６〜７が至適であり、ｐ
   Ｈ５．５〜９で安定である。 （３）本酵素はｐＨ６．０において至適温度は４５℃で
   あり、５５℃以上の温度で１５分間放置すると失活する
   。 （４）本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀およ
   びモノヨードアセトアミド溶液中で阻害を受けるが、阻
   害率は１０〜２０％である。 （５）本酵素の分子量は約８２０００（ディスクゲル電
   気泳動法による）である。 （６）本酵素の等電点はｐＨ５．２（アンフォライン電
   気泳動法による）である。 ２）、澱粉の組成画分がアミロースまたはアミロペクチ
   ンである特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３）、澱粉の分解反応生成物が化工澱粉である特許請求
   の範囲第１項記載の製造方法。