JPS6352879A - 組織性プラスミノ−ゲンアクチベ−タ前駆体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＭｉ織性プラスミノーゲンアクチヘータ前駆体
（以下、ｐｒｏ−ｔ−ＰＡと略記する）に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

プラスミノーゲンアクチベータ（以下、Ｐ　、Ａと略記
する）は、動物の組織、体液中に広く分布しており、血
中のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化させる作用
を有するものである。このプラスミンは、血栓等の主成
分であるフィブリンを分解することからＰＡは医薬上、
血栓溶解酵素として研究開発がなされてきた。

ＰＡには、ヒト尿およびヒト腎細胞培養液から精製され
るウロキナーゼ（以下、ＵＫと略記する）が著聞であり
、既に臨床応用されている。しかしながら、ｔＪＫは大
量投与の際にフィブリンのみならず、フィブリンの前駆
物質であるフィブリノーゲンをも分解することから、凝
固系のバランスを崩し、その結果として出血傾向を招く
という重大な副作用のあることが指摘されている。一方
、これに対してヒト腎細胞培養液中から発見されたＵＫ
の前駆体（以下、ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫと略記する）や、血
管内皮細胞等が産生ずる免疫学的にＵＫとは全く異なる
組織性ＰＡ（以下、ｔ−ＰＡと略記する）は、フィブリ
ンに対して高い親和性を有するため、フィブリンという
固相上でのみ線溶活性が発現されることから、ＵＫにみ
られる副作用が全くない、より証栓溶解特性の優れた酵
素として、盛んに研究開発が進められている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ｐｒｏ−ｔ−ＰＡの単離、精製ならびにその性質の同定
は、従来報告されてはいないが、本発明者はｔ−ＰＡの
前駆体であるｐｒｏ−ｔ−ＰＡについて鋭意研究を重ね
て来た結果、ヒト子宮筋肉組織等の培養株化細胞の培養
液から、新規なｐｒｏ−ｔ−ＰＡを単離、精製すること
に成功し、本発明の完成に至った。

本発明に係るｔ−ＰＡは前駆体の型で得られ、プラスミ
ン等による限定分解処理によって、−本鎮構造の前駆体
から二本鎖構造に変換するとともに、活性が発現、増強
されるものである。即ち、本発明はヒト正常組織由来の
培養株化細胞の培養培地に産生される次の（１）〜ＱＱ
Ｉの特徴を有するｐｒｏ−ｔ−ＰＡに関する。

ｆｌｌＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り単一の蛋白質バンドを示し、分子量が約７０　、００
０±２，０００である。また、ゲル濾過法によれば、分
子量が約６７　、０００±５，０００である。

（２）　　還元剤の存在によっても、みかけの分子量は
変化しない。

（３）　　プラスミン処理などによって、分子量が約３
２　、０００と約３８．０００のサブユニットがＳ−Ｓ
結合により結合している二本鎖構造に変換すると共に、
酵素活性が発現、増強されるプラスミノ−′ゲンアクチ
ベータの前駆体である。

（４）抗ウロキナーゼ抗体とは反応せず、抗組織性プラ
スミノーゲンアクチベータ抗体と反応する免疫学的性質
を有する。

（５）合成基質Ｓ−２２８８を合成基質Ｓ−２４４４よ
り、より特異的に分解する。

（６）　　フィブリンに対する親和性を有する。

（７）　　リジンに対する親和性が組織性プラスミノー
ゲンアクチベータよりも強い。

（８）等電点を５〜８の範囲に有する。

（９）至適ｐｔ＋を９〜１０の範囲に有する。

００４５℃で１０時間以上安定である。

（生産母体の調製） 本発明に係るｐ　ｒ　ｏ　−ｔ−ＰＡの供給手段として
は、たとえば、ヒト子宮筋肉細胞が用いられる。

このヒト子宮筋肉細胞としては、たとえば子宮摘出の際
に得られた子宮のうち、正常な筋肉Ｍｉ織を分離して初
代培養を行い、継代培養を繰り返すうちに、増殖性に冨
み、際限なく分裂可能な、ｐｒｏ−ｔ−ＰＡを高産生す
る培養株化細胞が生起するので、これを選抜し利用する
。かかる株化細胞としては、ヒト子宮筋肉正常細胞由来
樹立化細胞ＫＷ株（以下、ＫＷ株ともいう）が好適であ
る。

当該ＫＷ株は本発明者が取得したものであり、公知のも
のである。その取得方法、細胞学的性質等は、「細胞培
養研究」、第５巻、第１号、日本＆Ｕ織培養学会第５９
会大会講演抄録集（１９８６年）、第１９７頁に開示が
あり、また本発明者らの発明に係わる特願昭６０−２９
２４８１号明細書にもその開示があり、当該刊行物に開
示の方法によって反復再現性をもって当該株を取得する
ことができる。なお、特願昭６０−２９２４８１号の出
願の際、当該株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託申請を行ったが寄託受託拒否の旨通知を受けている。

ＫＷ株の取得方法は、たとえば次の通りである。

＜ＫＷ株取得実験〉 手術により摘出したヒト子宮から正常部層部を取り出し
、イーグル最少必須培地（以下ＭＥＭと略称する）で洗
浄後、鋏で１〜２ｍｍに細切し、ＭＥＭで洗い遠心分離
（８００〜１．ＯＯＯｒｐｍ、５分）してＵ織を集めた
。

このＭｉ織に約５倍重量の酵素ｔｉ、（コラゲナーゼ２
００単位／ｌｌ１１．　　）リプシン０．０５〜０．１
％）を加えて３７℃で攪拌し、消化の様子を見ながら２
〜４時間時間消化後口イロンメツシュり未消化組織を除
去し、濾液を遠心分離して細胞を集めた。

この細胞をＭＥＭで数回洗浄後、φ６０１プラスチック
ディツシュに植え込み、１０％牛脂児血清を含むＭＥＭ
を加え、３７℃で５％ＣＯ２−９５％空気中で培養した
。細胞が充分に増殖した後、前述の酵素液で処理して細
胞を培養基からはがして集め、その２Ｘ１０”個を２５
０１１プラスチツクシヤーレに植え込み、１０９＜牛胎
児血清を含むＭＥＭｌｏＩｌｌｌを加えて、３７℃で５
％ＣＯｚ　　９５％空気中で培養した。この継代培養を
数十回繰り返し、増殖性に冨んだ細胞を分取した。

ヒト正常細胞は、通常有限分裂回数が最高５０±１０分
裂とされているが、分取した細胞は５００回以上の分裂
を経ても良好な増殖能を示し、限り無い継代培養の期待
出来る自然形質転換法であることが判明した。

また、この細胞の培養上清にはＵＫと免疫化学的に異な
るｔ−ＰＡが分泌されていることも確認されノこ。

なお、このＫＷ株は保護剤として１０％ジメチルスルホ
キサイドおよび１０％牛脂児血清を含むＭＥＭを用い、
１分間に温度を１〜１，５℃下げる緩速凍結法により凍
結して、液体窒素中で長期保存することができる。

かくして取得した本発明ＫＷ株は次の細胞学的性質を示
す。

（ＫＷ株の細胞学的性質） 物質生産能　ＵＫとは免疫化学的に異なるｔ−ＰＡおよ
び当８亥ＰＡの前駆体であ る本発明のｐｒｏ−ｔ−ＰＡを産 生ずる。

リセプター　子宮筋肉細胞に特徴的なエストロジェンリ
セプターを有し、その数 は細胞周期により異なる。

細胞増殖期：約２．７Ｘ１０５／細胞 定　常　！１１！：約］、０Ｘ１０４／細胞継代培養　
　際限なく継代培養可能である。

培加時間　　１．４〜１．６日。（１０％ウシ胎児血清
を含むＭＥＭ中） （ｐｒｏ−ｔ−ＰＡを産生せしめるための培養条件） 培地には、たとえばイーグルＭ　Ｅ　Ｍ、ハンクス１９
９、ドウルベッコ、ハム等の基礎培地にグルタミン２ｍ
Ｍおよび生胎児血＋’ｎ　（Ｇ　Ｉ　Ｂ　ＣＯ社製）５
〜１０％を添加したものを細胞の増殖用に用いる。ｐｒ
ｏ−ｔ−ＰＡ産生時には無血清培地を用いる。好ましく
は、各種蛋白分解物、たとえばラクトアルブミン氷解物
、プロテオースベプトン、あるいは肉エキス、各種アミ
ノ酸等を添加した無血清培地を用いる。

培養に際しては、通常平板培養用に、培養フラスコ、ペ
トリディフシュ（いずれもＣ０ＲＮ　Ｉ　ＮＧ社！り等
を用いるが、プラスチック製でもガラス製でも３上い。

夕′）゛ルトレイ（１，２００ａｄ、　Ｎ　Ｕ　Ｎ　Ｃ
社製）を用いて大量に培養できる。また、マイクロビー
ズ（Ｃｙｔｏｄｅｘ−１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を
用いた高密度培養も可能で、ｐｒｏ−ｔ−ＰＡの大量生
産に好適である。いずれも３７℃、５％ＣＯ２分圧下で
培養されるのが好ましい。

（ｐｒｏ−ｔ−ＰＡの回収） 培地からのｐｒｏ−ｔ−ＰＡの回収は、ライケン（Ｄ、
　Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ）およびコレン（Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ
）らの方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）剣６　、７０３５−７０４
１　、（１９８１））を一部改良して実施される。すな
わち、亜鉛キレート・セファロース、コンカナバリンＡ
・セファロース、リジン・セファロース等の各種アフィ
ニティクロマトグラフィーおよびゲル濾過（たとえば、
セファクリルＳ−２００）を適宜組み合わせて行う。こ
の精製の全工程は、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤の
存在下で実施される０以上の方法により、ｐｒｏ−を−
ＰＡは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔ネ
ーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２２７．６８０〜６８
５（１９７０）　）で単一の蛋白バンドを示すまでに精
製される。

（活性測定法） ｐｒｏ−ｔ−ＰＡは、例えば、プラスミン・セファロー
スに接触させる方法等により活性化され、活性値はフィ
ブリン平板法〔アクタ・ヘマトロジカ０ジャポニカ（Ａ
ｃｔａ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ　Ｊａｐｏｎｉｃ
ａ）、皿、２９８−３０５　　（１９７６）　’）　、
および合成基質を用いた方法〔ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・ラボラトリ−・インベスティゲーション（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆＣＩｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　）　１６２＋　３
６８−３７４　（１９８２）　）で測定することができ
る。活性値の単位には、ｔ−ＰＡ国際単位を用いた。

（ｐｒｏ−ｔ−ＰＡの特性） 以上の如くして得られるｐｒｏ−ｔＰＡは以下に述べる
特徴を有する。

ｆｌｌｓＤｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ネ
ーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、皿、６８０〜６８５　（
１９７０））により単一の蛋白質バンドを示し、それに
よって求めた分子量が約７０，０００±２，０００であ
る。また、セファデックス・Ｇ　　１５０　（Ｐｂａｒ
ｍａｃｉａ社）を用いたゲル濾過法により求めた分子量
は約６７．０００±５，０００である。

（２）５％ＳＤＳおよび２．５％２−メルカプトエタノ
ール存在下、１００℃、５分間処理の条件で還元処理を
行ったところ、みかけの分子量は変化しなかった。

（３）　　プラスミン処理等によって分子量が約３２，
０００と約３８．０００のサブユニットがＳ−８結合に
より結合している三木鎖構造に変換すると共に４．酵素
活性が発現、増強されるプラスミノーゲンアクチヘータ
の前駆体である。その確認は次のようにして行った。即
ち、ＣＮＢ　ｒ活性化・セファロース（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）にヒトプラスミノーゲンをカンプリングさせた
後、ＵＫを接触させてプラスミン・セファロースカラム
を調製した。ｐｒｏ−ｔ−ＰＡは、このカラムに３７℃
で接触させ、活性化させ、通過液にｐｒｏ−ｔ−ＰＡの
活性型酵素を得た。活性化前後のｐｒｏ−ｔ−ＰＡの活
性は、合成基質Ｓ−２４４４およびＳ−２２８８を用い
て測定した。

（４）抗ＵＫ抗体とは反応せず、抗ｍ織性ｔ−ＰＡ抗体
と反応する免疫学的性質を有する。

−すなわち、家兎に各々、ＵＫ、メラノーマ細胞（Ｂｏ
ｗｅｓ）の培養液から精製されたｔ−ＰＡを免疫させて
得られた抗ＵＫ抗体、及び抗ｔ−ＰＡ抗体を用いて、ｐ
ｒｏ−ｔ−ＰＡと反応させ、エンザイモグラフィー〔ア
ナリティカル・バイオケミストリー　（Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１２２　、１６
４−１７２　（１９Ｂ２））により上記抗原性を明らか
にした。

（５）合成基質Ｓ−２２８８を合成基質Ｓ−２４４４よ
り、より特異的に分解する。

即ち、合成基質Ｓ−２４４４およびＳ−２２８８各々０
〜５ｍＭの濃度範囲で、一定のｐｒｏ−Ｌ−ＰＡ量を用
いて反応させ、結果をラインウェーバ−およびパーク（
Ｌｉｎｅｗｅａｂｅｒ−Ｂｕｒｋ）プロットにより、基
質特異性および反応速度定数を求めた。

（６）　　フィブリンに対する親和性を有する。

すなわち、ＣＮＢ　ｒ活性化・セファロースにヒトフィ
ブリノーゲンをカンプリングさせた後、トロンビンヲ接
触させ、フィブリン・セファロースカラムを１周整した
。ｐｒｏ−ｔ−ＰＡは、０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ！含有
０．１　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ。

７．５）で平衡化した零カラムに流し、通過分画および
０．２　Ｍアルギニンと２Ｍ　ＫＳＣＮで溶出させた分
画の活性を測定し、フィブリン・セファロースカラムに
対する吸着・未吸着によってフィブリンに対する親和性
を調べた。

（７）　　リジンに対する親和性が組織性ｔ−ＰＡより
も強い。即ち、リジン−５ＰＷ［５ＰＷは東洋曹達工業
社製の支持体であり（ジャーナル　オブクロマトグラフ
イ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｔ＋ｙ）二　５１１．　（１９８６）　）にもその記
載がある］を用いた高速液体クロマトグラフィからアル
ギニンによる直線的濃度勾配０〜０．３Ｍにより溶出さ
せ、溶出に必要なアルギニン濃度から、リジン親和性の
強度を明らかにした。

（８）等電点を５〜８の範囲に有する。等電点は、ｍｏ
ｎｏ−Ｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いたクロ
マトフオーカシングを行い、ファースト・プロティン・
リキッド・クロマトグラフィーにより解析した。

（９）　　至適ｐＨを９〜１０の範囲に有する。至適ｐ
＋ｉの測定は次のようにして行った。各ｐｏの緩衝液を
用いて、合成基質Ｓ−２２８８の反応系のｐｉｆを調整
し、一定量の本酵素を加え、反応させた後、反応液のｐ
ｉｆは７．０に調整、酵素活性を測定することにより、
至適ｐＨを求めた。

Ｏｌｌ　　リン酸緩街ｌ夜（ｐＨ９，０）中で、４℃〜
９０℃の温度範囲で熱安定性を調べた。その結果ｐｒ。

−ｔ−ＰＡは４５℃で１０時間以上安定である。

〔作用・効果〕

上述の如く、本酵素はｐｒｏ−ｔ−ＰＡであり、−末鎖
の分子構造をとり、プラスミン処理等によって特定部位
のペプチド結合が切断され、二本鎖の分子構造に変換さ
れ、活性が発現、増強されるものと推定される。ｐｒｏ
−ｔ−ＰＡは、ｐｒ。

−１ＪＫとは異なり、ｐｒｏ型でも活性型でも、フィブ
リンに対する高い親和性を有している。また、リジンに
対する親和性が、ヒトメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ）の
培養液から精製されたｔ−ＰＡ、（以下、メラノーマｔ
−ＰＡと略記する）よりも強かったことから、ｐｒｏ−
ｔ−ＰＡのフィブリン親和性はメラノーマＬ−ＰＡより
も強いと考えられる。

メラノーマｔ−ＰＡにはこのようなプラスミン処理によ
る活性の発現、増強という現象は殆ど認められず、ｐｒ
ｏ−ｔ−ＰＡは、新規なＰＡである。

合成基質Ｓ−２４４４および合成基質Ｓ−２２８８を用
いた酵素反応速度定数の解析をメラノーマｔ−ＰＡと比
較し、表１に示した。活性化後のｐｒｏ−ｔ−ｐ、６．
の反応速度定数は、メラノーマｔ−Ｐへのそれと類似し
ているが、実際に血中に投与する場合、ｐｒｏ−ｔ−Ｐ
ＡＯ型であれば活性部位がマスクされているため、血栓
（フィブリン）という固相上に到達、活性発現されるま
での過程で、種々の血中に存在するＰＡベインビター等
による失活がなく、より効果的な血栓溶解作用を実現し
得るものと考えられる。

以上のように、本酵素はｐｒｏ−ｔ−ＰＡであり、従来
の活性型であるメラノーマｔ−ＰＡ等に比べて、より安
定で特異的な血栓溶解作用を発揮できる可能性のあるこ
とから、新しいＭｉ織性のＰＡとして大いに期待される
。

〔実施例〕

実施例１ ヒト子宮筋肉Ｍｉ織由来の培養株化細胞ＫＷ株の無血清
培養土清液を集め、アプロチニンを最終濃度１０隼位／
　ｍ　ｌ　、ツイーン８０を最終濃度０．０１％加え、
出発材料（約５０国際単位／　ｍ　］、　）とした。

出発材料は、ｐｉｆ　８．０に調整し、亜鉛キレート・
セファロースに接触せしめた後、１〜Ｉ　　ＮａＣ１４
有０．１　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐｉｆ　５．５　
）にて吸着したｐｒｏ−ｔ−ＰＡを溶出させた。ｐｒｏ
−Ｌ−ＰＡを含む溶出画分を集め、ｐｉｔ　７．５に調
整し、コンカナバリンＡ・セファロースに吸着せしめた
後、２Ｍ　　ＫＳＣＮ及び０．４Ｍメチル・α−り一マ
ンノピラノシドを含むＬＭ　　ＮａＣ１含有０．１Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐｉｆ　７．５　）によってｐｒ。

−ｔ−ＰＡを溶出させた。溶出液は、限外濾過によりＣ
Ｍし、これをセファクリルＳ−２００でゲル濾過した。

ゲルｉＩす過により分画されたｐｒｏ−Ｌ−ＰＡは、リ
ジン・セファロースに接触せしめ、吸着したｐ　ｒ　ｏ
　−ｔ−ＰＡを０．３Ｍアルギニンを含むＩＭ　　Ｎａ
Ｃ１含有０．１　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐｉｆ　７
．５　’）によって溶出させた。溶出液は、脱塩、？；
縮を行い、比活性が少な（とも１，３６５，０００国際
単位／ｍｇの高度精製された本酵素を、回収率４０％以
上で得ることができた。なお、この精製品は５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量約７０．００
０±２，０００に単一の蛋白バンドを示した。

実験例１ ｐｒｏ−ｔ−ＰＡのプラスミン処理による構造変化 ｐｒｏ−ｔ−ＰＡをプラスミンセファロースに通過させ
、通過前後のサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により、分子量解析を行った。プラスミン
セファロース処理前のｐｒｏ−ｔ−ＰＡは、非還元条件
および還元条件下共に、単一の蛋白質バンドを示し、分
子量は７０，０００であった。プラスミン処理後のサン
プルは、非還元条件下では、分子量７０，０００の単一
な蛋白質バンドを示したが、還元条件下（例えば、２−
メルカプトエタノールと反応させる）では、分子量が約
３２、０００と約３８．０００のサブユニットがＳ−Ｓ
結合により結合している二本鎖構造に変換した。従って
、ｐｒｏ−ｔＰＡは、プラスミンによる蛋白質限定分解
を受け、ペプチド結合が１ケ所切断され、それぞれがＳ
−８結合により結合している二本鎖構造に変換されるも
のと思われる。

実験例２ ｐｒｏ−ｔ−ＰＡが、プラスミン処理によって活性型の
ｔ−ＰＡになることは、合成基質Ｓ−２４４４あるいは
Ｓ−２２８８の分解度の増強として証明された。

ｐｒｏ−ｔ−ＰＡ、あるいはコントロールとしてメラノ
ーマｔ−ＰＡを、プラスミンセファロースにより活性化
させ、その活性化前後のサンプル５０Ｐ１を各種濃度（
０〜５ｍＭ）のＳ−２４４４あるいはＳ−２２８８溶液
５０μ、および５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
４）　　（０，１Ｍ　　ＮａＣ１を含む）１００．Ｊと
９６穴プレート内で反応させた。酵素の作用によりＳ−
２４４４あるいはＳ−２２８８から遊離するｐＮＡを４
０５ｎｓの吸光度で測定した。その結果をラインウェー
バ−およびパーク（Ｌｉｎｅｗｅａｂｅｒ−Ｂｅｒｋ）
プロットにより解析し、基質特異性および反応速度定数
を求め、その結果を表１に示した。

（以下余白） その結果、メラノーマｔ−ＰＡはプラスミン処理前後で
酵素作用はほとんど変化しなかった。従って、Ｋｍおよ
びＫｃａｔ値も、プラスミン処理前後でほぼ同一であっ
た。これに対して、ｐｒ。

−ｔ−ＰＡは、プラスミン処理前後で酵素作用は著しく
亢進した。すなわち、Ｓ−２４４４を基質とした場合、
ｐｒｏ−ｔＰＡのにｃａｔ値はプラスミン処理前の０．
６３（Ｓ−１）からプラスミン処理後の３．７０（Ｓ−
１）と、約６倍増強した（表１）、また、Ｓ−２２８８
を基質とした場合、プラスミン処理前の１．４５（Ｓ−
１）からプラスミン処理後の５．１０（Ｓ−１）と、約
４倍増強した。このように、ｐｒｏ−ｔ−ＰＡはプラス
ミン処理により活性が著聞に増強することから、酵素の
前駆体と断定される。また、ｐｒｏ−ｔ−ＰＡのＳ−２
４４４あるいはＳ−２２８８に対するＫｍ値の差から、
ｐｒｏ−ｔ−ＰＡおよびその活性型酵素もＳ−２２８８
に親和性が強い。

実験例３ ｐｒｏ−ｔ−ＰＡがプラスミンによって活性型ＰＡとな
ることは、トリチウムラベルしたジイソプロピルフルオ
ロフォスフェート（以下、〔３■（〕ＤＦＰと略記する
）の取り込みによって証明された。（３Ｆ日ＤＦＰはセ
リン酵素の活性部位に特異的に取り込まれることから、
ｐｒｏ体から活性型へ変換される際に取り込みが起きる
。

プラスミン処理前後のｐｒｏ−ｔ−ＰＡに対して、（３
Ｈ）ＤＦＰ番加え、十分反応させた後、未反応の（３Ｈ
）ＤＦＰを脱塩操作で除去し、本酵素の５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行った。このゲルを泳動方
向にスライスし、各スライスしたゲル中に含まれる放射
活性をシンチレーションカウンターで測定し、どの分子
量位置で取り込みが起きたかを明らかにした。その結果
を第１図に示した。

第１図に示す如く、ｐｒｏ−ｔ−ＰＡは分子量約７０．
０００であり、活性化後において、同分子量位置でのみ
（３）１）ＤＦＰ取り込みの増強が認められたことから
、明らかにｐｒｏ−ｔ−ＰＡ自体が活性化され、活性部
位が出現したことを裏付けている。第１図からも明らか
なように活性化前にも分子量約７０，０００に（３Ｈ）
ＤＦＰ取り込みがみられ、このことは、最終精製された
ｐｒｏ−ｔ−ＰＡ分画が一部活性化されたｔ−ＰＡと混
在していると考えられる。

実験例４ リジンに対する親和性 リジン−５ＰＷを用いた高速液体クロマトグラフィによ
り、リジンに対する親和性を調べた。まず、サンプルを
リジン−５ＰＷにアプライした後、アルギニンによる溶
出を０〜０．３Ｍの直線的？；度勾配により行い、溶出
に必要なアルギニン濃度を求めた。ｐｒｏ−ｔ−ＰＡを
アプライした場合、０、２８　Ｍのアルギニンにより溶
出され、またピークは一つであった。ｐｒｏ−ｔ−ＰＡ
をプラスミン処理した後リジン−５ＰＷにアプライした
場合、二つのピークとして溶出され、それぞれのアルギ
ニン濃度は０．２３　Ｍおよび０．０８Ｍであった。メ
ラノーマｔ−ＰＡをアプライした場合、二つのピークを
もった溶出パターンが得られ、それぞれのアルギニン濃
度は０．２Ｍおよび０．１３Ｍであった。

このように、ｐｒｏ−ｔ−ＰＡのリジンに対する親和性
は、メラノーマｔ−ＰＡよりも強く、従ってフィブリン
にたいする親和性もｐｒｏ−ｔ−ＰＡの方がメラノーマ
ｔ−ＰＡよりも強いと見なされる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素のプラスミン処理前後の分子量の位置
による（３ＨＩＤＦＰの取り込みを示したものである。 ム−＝−・−ムはプラスミン未処理のもの、・□・はプ
ラスミン処理後のものを示す。 特許出顎人　松　尾　　　理

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ヒト正常組織由来の培養株化細胞の培養培地に産生され
   る次の特徴を有する組織性プラスミノーゲンアクチベー
   タ前駆体。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
   り単一の蛋白質バンドを示し、分子量が約７０，０００
   ±２，０００である。また、ゲル濾過法による分子量が
   約６７，０００±５，０００である。 （２）還元剤の存在によっても、みかけの分子量は変化
   しない。 （３）プラスミン処理などによって、分子量が約３２，
   ０００と約３８，０００のサブユニットがＳ−Ｓ結合に
   より結合している二本鎖構造に変換すると共に、酵素活
   性が発現、増強されるプラスミノーゲンアクチベータの
   前駆体である。 （４）抗ウロキナーゼ抗体とは反応せず、抗組織性プラ
   スミノーゲンアクチベータ抗体と反応する免疫学的性質
   を有する。 （５）合成基質Ｓ−２２８８を合成基質Ｓ−２４４４よ
   り、より特異的に分解する。 （６）フィブリンに対する親和性を有する。 （７）リジンに対する親和性が組織性プラスミノーゲン
   アクチベータよりも強い。 （８）等電点を５〜８の範囲に有する。 （９）至適ｐＨを９〜１０の範囲に有する。 （１０）４５℃で１０時間以上安定である。