JPS6119486A - 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−、その製法及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組織プラス三ノーゲシ　アクチベーターの新
規製造方法及び該方法によシ得られる組織プラス三ノー
グン　アクチベーターに関する。

従来の技術 プラス三ノーゲン　アクチベーターは・プラス三ノーゲ
シからづラス三シへの変換に際し触媒として働く酵素で
ある。この様にして形成されたづラス三ンは、血液流中
のインしビターがプラスミンを中和しない場合に、フィ
ブリンを抑制する　ことができる。公知の如く、血栓症
において生ずるフィブリンの凝塊はは、特定の酵素、即
ちトロンじンの作用下に、血液流中のフィブリノーゲン
がフィブリンに変換されることによシ生ずる。正常な血
液は、プラス三ノーゲン　アクチベーターを含んでおシ
、該プラス三ノーゲン　アクチベーターは主としてフィ
ブリンの凝塊を分解させ、除去し得る。しかしながら、
実際には血液中のプラス三ノーゲシ　アクチベーターの
存在量は、十分ではなく、血管内の凝塊を除去する為に
は、血栓崩壊を促進する外因性の薬剤に依存しなければ
ならない。

この様な理由から、フィブリン溶解現象に関与する酵素
に関する研究は、盛んに行なわれているｎ即ち、この種
酵素は、ヒトにおける血栓閉栓症及びとシわけ閉塞性血
栓による血管障害（これ等は、現在西ヨーロッパ及び化
アメリカにおける主要死因である）の治療に特に適した
血栓溶解剤の発達に極めて重要である。

現在治療に使用されている主なものは、以下の通りであ
る。

ヒトの尿及びヒトの腎臓の培養細胞から分離されるプラ
ス三ノーゲン　アクチベーターであるウロ牛ナーゼ、及
び連鎖球菌属から抽出されるプラス三ノーゲン　アクチ
ベーターであるストレプト牛ナーゼ。しかしながら、こ
れ等のプラス三ノー　　　゛ゲン　アクチベーターは、
フィブリンに対する特異的親和性を欠く点において、組
織プラス二ノーゲン　アクチベーターとは、異なってい
る。事実、づラスミノーゲシアクチベーターから生成さ
れるプラスミンは、フィブリノーゲン及びフィブリンに
無差別に作用するので、血流中のフイプリノーゲυの大
巾な減少という犠牲を払ってようやく凝塊が溶解され、
この様な減少によシ惹起される副作用（フィブリノーゲ
シ溶解及び内出血）の危険を伴う。

これが、血液プラス三ノーゲンの組織由来アクチベータ
ーの構造と同タイプのプラスミノーゲンアクチベーター
を得る方向に、現在研究が進められている理由である。

この組織由来アクチベーターは、フィブリンに対する特
異的親和性を有しておシ、従って血液流中のフィブリノ
ーゲンを分解することはない。

つ０＋ナーぜは、生理的条件下ではフィブリンに吸着さ
れないが、器官組織（特にブタの心臓及び妊娠中の雌ブ
タの卵巣）から得られたプラス三ノーゲン　アクチベー
ターは、特異的にフィブリンに固定され、フィブリン溶
解に大きな生理学的影響を及ぼす〔例えば、Ｔｋｏｒｔ
ｔｎ　ｔｔ　ａｔ、。

ＴＨＥＯＭＢＯ５，ＤＩＡＴＩＩＥＳ、ＨＡＥＭＯＲＲ
Ｈ，（ＳＴＵＴＴＧ、）。

１９７２．２８．６５〜７４〕。トールセン等の研究を
基礎として、フイづリシに特異的親和性を有するプラス
三ノーゲシ　アクチベーターを提供し得る組織のリスト
が作成されている：リーケン等（Ｒ１１４ｔｎ　ｚｌ　
ａｌ、　　）は、ヒトの子宮組織から、分子量６９００
０．２つに分割したフラクションとしての夫々の分子量
３１０００及び３８０００゜比活性度１６０００〜６０
０００７Ｕ／ダ蛋白（試験方法によシ異なる）という組
織プラス三ノーゲン　アクチベーターを得た（　Ｂｉｏ
ｔｋｉｍｉｔａ　ａｔノーゲン　アクチベーターを得て
いる（　Ｃｅ１ｌＢｉ０１０ｆｆ　ＩＲｌｔｒＲｅｌｔ
ｉｔｊＰｌａｌ　Ｒｌｐｅｌｒｌｌ、Ｖａｔ、　４　、
　Ａ　８　。

Ａｕｙｕｚｔ　１９８０　　）　’他の研究者も、正常
ヒト上皮培養細胞の上清又は動物（七ル七ット）のそれ
からプラス三ノーゲン　アクチベーターを得ている（　
ＶＥＴＴＥＲＬＥＩＮ　ｔｌ　ａｌ、　、　ＴＨＥ　Ｊ
ＯＵＲＮＡＬＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩ
ＳＴＲＹ、　　Ｖｏｌ、　２５４゜４３　＋’　１０ｔ
ｈ　Ｆｌｂｒｔｌｌｌｒｆ　１９７９．　Ｉｆｉ５７５
〜５７．８１４ＴＫＩＮＳＯＮ　ｔｌ　ａｔ、　、　Ｔ
ＨＥ　ＬＡＮＣＲＴ、　（７ｔｋＪｕｌＷ　１９８２．
．１１，１’１３２〜１３３）。ベーテルラ（、（ＶＥ
ＴＴＥＲＬＥＩＮ）　等ハ、分子［７３００００組織プ
ラス三ノーゲン　アクチベーターの存在を報告している
が、比活性度は示していない。

更に、フランス特許第２４５４８０９号（旭化成（株）
）は、組織アクチ牛ターではないが、成人の腎臓又は肺
の細胞ラインに由来するプラス三ノーゲｙ　アクチベー
ターの製造を開示している。

このプラス三ノーゲン　アクチベーターは、４５０００
〜６８０００のオーターの分子量を有しておシ、出発物
質及びその分子量から判断して、タイプｌのつ０牛ナー
セであると思われる。

更に、種々のヒト腫瘍組織が正常表組織よシも高濃度で
プラス三ノーゲン　アクチベーターを含有しているとい
う多数の研究者の観察に基いて、黒色腫培養細胞及び他
のヒト又は動物の新生物の培養細胞の上清から、種々の
プラスミノーゲンアクチベーターが採取されている〔特
にＷＩＬＳＯＮｔｔ　ａｔ、　、　ＣＡＮＣＥＲＲＥＳ
ＥＡＲＣＨ，４Ｑ、　９３３〜９３３　、　Ｍａｒｃｈ
　ｌ　９８Ｑ　ＮＤＡ７ｖ７ａｎｄ　ＲＥＩＣＨ，ＴＨ
ＥＪＯＵＲＮｉＬ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴｉＬ　
ＭＥｎｌＣＩＮＥＶａｌ、　　Ｉ　４７．　Ｉ　９７８
　；ＤＡＮＯｔｔ　ａｌ、　。

ＢＩＯＣＩｉｌＭＩＣＡ　Ｉｔ　ＥＩＯＰＨＹＳＩＣＡ
　ＡＣＴＡ、　６１３（１９８０）、５４２〜５５５；
及び欧州特許出願公開筒０．０４１，７６６号（ＬＥＵ
ＶＥＮ　ＲＥＳＥＡＲＣＨＡＮＤ　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥ
ＮＴ　Ｖ、Ｚ、Ｗ　　）　）。しかしながら、ヒトの転
移黒色腫の培養物から得られたラインは、培養上清中に
いわゆる“ヒユーマン　トランスフォーミンク　クロー
ス　ファクター”を放を 出することがあることが判明した〔例えば、ＭＡＲＱＵ
ＡＲＤＴ　ｚｔ　ｍｌ、　、　ＴＨＥ　ＪＯＵｌ？ＮＡ
Ｌ　０ＦＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
、Ｖｏｌ、２５７．Ａ９゜１０ｔｈ　　Ｍａｙ　　１９
８２．／１５２２０〜５２２５）。

このしニーマン　トランスフォーミンク　６ｏ−ス　フ
ァクターは、インじト０で正常線維芽細胞に、もとの腫
瘍細胞の転移表現型を与える。この様な事実が観察され
たことから、研究者は、腫瘍組織の培養物をプラス三ノ
ーゲン　アクチベーター源として使用することを差控え
る様になっている０ 更に、豚腎臓上皮細胞の培養物に毒性を生じない量のコ
ンカナバリ：／Ａを加え、そのプラス三ノーゲン　アク
チベーター生産能を刺激することが提案されている〔例
えば、ＭＯＣＨＡＮ、　ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡｔｔ　Ｂ
ＩＯＰＨＹＳＩＣＡ　ＡＣＴＡ、　　５８ｇ　（１９７
９）。

２７３〜２７８〕。

最後に、欧州特許出願公開筒０．０４１，７６６号がす
でに上記のことに言及していることを指摘しておく。即
ち、該公開は、ヒトの黒色腫細胞の培養物上清から分離
されたプラス三ノーゲシ　アクチベーターの生産を述べ
ており、更に、培養工程並びに培養物上清の精製工程を
、必要ならば、アプロチニンの存在下に行なってこれ等
の工程中のアクチベーター分子の分解を防止することが
できるとも記載されている。

脂質を除いた正常な豚の心臓組織から分離され、フィブ
リンに対する親和吸着を利用する精製法によシ精製して
プラス三ノーゲン　アクチベーターを得る方法において
アプロチニン及び６−アミノカブ０ン酸からなるプロテ
アーセインしじターを使用することも、文献に記載され
ている〔Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　、　
Ｖａｌ、　９８．　ｌ　９８３．　ｐａｇｅ１９９．２
１５１Ｘ）。しかしながら、本発明者の行なった実験に
よれば、これ等のプロテアーセインヒじターを使用して
も、組織プラス！ノーゲンアクチベーターは得られない
ことが明らかとなった。

最近の雑文（ＧＲＯＮＯＷ　ｚｔ　ａｌ、　、　〃Ｔｒ
ｔｙｔｄｘ　１ｎＢｉｏｔｔｃｈｎｏｔｏｙｙ　　’　
　＋　　Ｖａｔ、　　１．ｍｌ、　　ｔ　　９８３１　
　／１／＞２６〜２９及びＫＡＤＯＵＲＩ　ｚｔ　ｔｘ
ｌ、　、　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ、ＯＧＹ。

ＩＮＰＩＩ　１９８３．　／’／’３５４〜３５８〕は
、ヒトの肺の胚細胞からプラスミノーゲン　アクチベー
ターを製造する可能性を論じている。しかしながらこの
うち、前者は、ヒトの肺の胚細胞は組織プラスミノーゲ
ン　アクチベーターを産生じないと結論している。また
一方、後者の内容はウロ＋ナーぜに関連するものの様で
ある。

従って、これまでのところ、形質転換された細胞又は肺
癌細胞を使用することによってのみ、十分な量の組織プ
ラスミノーゲン　アクチ″ベーターを得ることが可能で
あるが、いずれも上述の問題点を含んでいる。

発明の構成 本発明の主な目的は、公知方法以上に実用的要件を充足
する組織プラスミノーゲン　アクチベーターの独特の製
造方法を提供することにある。この目的を達成する為に
、本発明では、プラスミノーゲン　アクチベーターの源
として、容易に大量に入手することが出来、培養時の生
育が比較的早く、フィブリンに対する高い特異的親和性
を有するアクチペーターを産生ずる非腫瘍組繊細胞を利
用する。更に、本発明によれば、工業的規模での実施に
適した条件下に当初に使用する細胞数に対して比較的高
く且つ公知方法に比して非常に高い収率で、組織プラス
ミノーゲン　アクチベーターを製造し得る。又、得られ
たアクチベーターは、フイづリンに対する親和性を有す
る組織アクチベーターのみから実質的になっている。

本発明は、非朧瘍性組織の培養物から組織プラスミノー
ゲン　アクチベーターを製造する方法にご 関し、該方法は、以下の工程からなっている：特定のカ
テゴリーの細胞、即ち肝組織の細胞、よシ好ましくはヒ
ト肺の胚細胞を、適切な培養媒体中且つコンカナバリ：
ＪＡの如き刺激物質及びアプロチニン及び／又はベンズ
アミジンの如きプロテアーゼインヒビターの存在下に培
養及びイン士１ベートする；組織プラスミノーゲン　ア
クチベーターを含む上清を分離する；並びに該アクチベ
ーターを精製し、必要ならば、濃縮する〇 本発明の好ましい実施態様において杜、ヒト肺の胚細胞
の培養及びイン牛ユベーションは、コンカナバリンＡ及
びカルシウムイオンを含む刺激システムとアプロチニン
及び／又はベンズアミジンの如き″ｊＯテアーゼインし
ビターの存在下に行なわれる。

コンカナバリンＡ及びカルシウムイオンを含む刺激シス
テムμ、処理される細胞を損傷させる度合が低い。更に
、このシステムによれば、フィブリンに対する親和性を
有する組織アクチベーターを選択的に得ることが可能と
なる。

上記の好ましい実施態様の改良剤においては、カルシウ
ムイオンは、５〜□　ｍｍｏ　ｌ　／　Ｉｔ　、（Ｄ割
合で使用される。

本発明の他の好ましい実施態様においては、肺の胚細胞
は、ウシ胎児血清又はウマ血清の如き培養アジュバント
又はこれ等と同等のアジュバントを含む適切な培地中で
、必要ならば、細胞外マトリックス乃至は細胞外成分の
精製物の存在下に培養され、次いで、ウシ胎児血清を含
まない点を除けば上記と同一の培地であって、インシュ
リン、トランスフェリン及びセレン、フンカナバリ、Ａ
の如き刺激物質並びにアプロチニン又はベンオア、ニシ
ンの如きプ０テアーセインしビターによ多処理された培
養媒体中でイン士ユベートされる。

本発明の更に他の好ましい実施態様においては、培地中
に、コンカッバリンＡは、約５〜２０μｇ／ｍｌの最適
濃度で存在し、アプロチニン又は同効のインしじターは
、アプロチニンとして約２０〜５０　Ｋ　Ｉ　Ｕ　／　
ｍｅ又はこれと等側蓋の最適濃度で存在する。

更に、フン力すバリンｌで処理された正常細胞は、非常
に損傷を受けやすいが、本発明によれば、該処理細胞の
組織プラス三ノーゲン　アクチベーターの生産誘発能を
再度回復させる条件を決定することができる。

本発明方法の好ましい実施態様においては、上記条件は
、組織プラス三ノーゲン　アクチベーターの生産誘発の
第１回目の操作においてコンカナバリ：、／Ａで処理さ
れた細胞を、組織プラス三ノーゲン　アクチベーターの
生産誘発の少なくとも第２回目の操作のために再使用で
きるものとするために、コンカナバリンＡで損傷された
培養細胞を、培養上清の分離後、ウシ胎児血清を含む適
当な培地で、細胞が完全に回復するのに充分な時間再度
イン士ユベートし、次いでウシ胎児血清を含まず、イン
スリン・トランスフェリン及びｔレジを含有する上記培
地での、アプロチニン存在下におけるコンカナバリンｌ
利用による誘発操作を・繰返し、組織プラスエノーゲシ
　アクチベーターを含有する新たな培養上清を分取する
。上記により細胞の回復及び連続して数回、少　なくと
も３回の再誘発が行ない得る。

上記方法は、冗長で高価な操作を伴わないものであり、
本発明目的物の工業的製造に非常に有利である。

本発明方法の更に他の好ましい実施態様においては、培
養上清は、該上清中に存在するアクチベーターの反応容
器壁への付着を防止可能な適当な界面活性剤で処理され
る。

更に他の好ましい実施態様においては、上記培養上清は
培養物よシ分離され、組織プラス三ノーゲン　アクチベ
ーターを高い親和性をもって選択的に吸着し得る、ｔラ
イトタイプのけいこう土か　　　　６らなる固体マトリ
ックス上に吸着されたフィブリンを用いた親和性り０マ
ドタラフイーによシ精製される。上記アクチベーターは
、アル手ニンを含む適当な緩衝液を用いて吸着カラムよ
シ溶離される。

上記態様の有利な変法においては、フィブリン／ｌライ
トで精製された組織プラスミノーゲンアクチベーターは
限外濾過によシ濃縮され、次いでゲル濾過による付加的
精製を行なわれる。このゲル濾過による付加的精製は、
アガロース（ｔファデワクスタイプ）又はアクリルア三
ドーアガ０−ス（ウルト０ゲルタイプ）カラムを用いて
実施される。

上記態様の他の有利な変法においては、得られた目的物
は限外濾過膜を用いて濃縮され、次いで適当な緩衝液を
用いて透析される。

本発明方法は以下の如くして行なわれる。

ヒト肺の胚細胞ラインの培養及び確立 年令３〜４ケ月のヒト胎児よシ肺をとシ、小力で約１〜
２　ｗａｓ３の小片に切る。小片を、血清を除いた培地
で洗浄し、新生ウシ血清１０％を加えた培地を入れたプ
ラスチック製容器に入れる。８〜ＩＯ日後、上記小片よ
シ生ずる細胞は融合する。

次いで該細胞をトリプシン溶液でバラバラにした後ｌフ
ラスコ当シ２フラスコとなる割合で二次培養する０づラ
ス三ノーゲン　アクチベーターの製造のために、上記細
胞ラインは１０代乃至３０代二次＃ｊ養する。

上記細胞ラインの特徴 染色体の分析を行なった（　Ｈｘｔｔ　ｉｐｔ　Ｔｉｓ
ｓｕｅＣｍｌｌｓｔｒｚ　、　Ｍｔｔｌｔａｄｚ　ｔｔ
ｎｄ　Ａ戸ｆｉｌｉｃａｔｉｏｎｚ　、　ＫｒｗｚｔＰ
、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｐａｔｔｔｒｘａｎ　Ｍ、ｆ、　（
Ｅｄｓ　）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　Ｉｇｃ、　、
　ＮｔｔａｙａｒＡ　１９７３．　Ｐ、　７６４）。カ
リオタイプは倍数であｐ、４ｃ染色体−を有している。

螢魅素（ＨＯＥＣＨ５Ｔ　　３３２６８　）を用いた染
色法によシマイコプラズマが存在しないことを確認した
（　ＬａｂｅｒａｌＯｒｙ　Ｔｔｃｋｐｔｉｑｕｔｘ　
ｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｂｉａｌｏｆｙ　、　Ｖｔｐｌ、８゜Ｔ、　　
Ｓ、　　Ｗｏｒｋ　ａｎｄ　Ｒ，Ｈ，Ｂｕｒｄｏｎ　（
Ｅｄｓ）　Ｅｌｚｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａ
ｎｄ　　１９８０．Ｐ、　　１３２　　）。

ヒトトランスフォー、：、ｌ、タ　グ、０−ス　ファク
ターが存在しないことは、以下の文献記載の方法によシ
確認された（　Ｊ、　Ｅ、　ＤＥ　ＬＡＲＣＯｔｔ　／
、　Ｇ、　ＴＯＤＡＲＯｉｎ　Ｆｒｅｔ、　Ｈａｌｌ、
　Ａｔａｊ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖａｌ、　７５゜
Ａ８．／’、４００１−４００５．Ａａｔｙｕｌｔ　２
９７８）。

組織プラスミノーゲシ　アクチベーター製造の第１変法 ヒト肺の胚細胞を、プラスチック容器内で、好ましくは
４〜５日で融合が起るように１０４細胞／ｄの最小濃度
で、ダルベツコ改質イークルス３０分加熱して不活性化
させたウシ胎児血清（Ｆｅ２）１０％、ヘペス（Ｈｅａ
ｔｔン１０ｊＰＪ解０１／解反１／ｌタマイシシ４０μ
ｆ／Ｐ１ｇで処理する。

細胞が融合したら、更に３日間上記培地で保持ス“）：
′ｌＯμｆ　／　ｍｌ・トランスフェリン１０μｆ／ｍ
ｌ、ｔしｙ　２−５　Ｘ　１０−８”０’　／　ｌ　、
コンカナバリンＡ２０μｆ　／　ｍｌ及びアブ−０チニ
ン２０〜５０ＫＩＵ／厘１を含むＤＭＦ培地に上記細胞
をイシ牛ユベートする。イン牛ユベーショシ時間は、３
７℃±０．５℃下に１６〜１８時間とする。

培養上清を集め、遠心分離し、次いで例えばツウイーン
８０、トリトンＸ１００等の界面活性剤０、Ｏ１％ＣＶ
／Ｖ）　　で処理する。得られた粗製物は、その特異活
性−を失うことなく一２５°Ｃで保存される。該活性は
サクｔう（５ＡＫＳＥＬＡ　）の方法（Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏｔｋｔｍ、　　（１９８１）　！　１１．２７６−２
８２）に従う放射性力でイン分解法により２Ｏ−４０Ｃ
ＴＡ　　ユニット／ゴである。また上記活性はプローグ
ら（ＰＬＯＵＣｒＨａｔ　ａｌ　）ノ方法（ＢＩＯ，Ｃ
ＭＩＮ。

ＢＩＯＰＨＹＳ、　ＡＣＴＡ（１９５７）２４．２７８
−２８２）に従うフィブリンディスク上で、又はじ−テ
ィら（ＢＥＡＴＴＩＥ　ｔｌ　ａ（）　Ｏ方法（Ｅｒ、
　／、　Ｈａｔｍａｔｅｌ。

（１９７６）３２，１３５−１４３）によっても測定さ
れる。

コンカナバリンＡは培養中の細胞に損傷作用を有するの
で、この細胞を組織プラス三ノ・−ゲンアクチベーター
の製造のための”Ｊ（き続く操作に直接再使用すること
はできず、従って更に１０％ＦＣ５を含むＤＭＦ培地で
再度７〜１０日間インキュベートする必要がある。ｍ胞
が再度融合点に達したら、アプロチニン存在下でのコン
カナバリンＡを利用した前記誘導サイクルを繰返すこと
ができる。

同一培養物につき行なって同様の収率を奏し得る誘導面
数社はぼ３回である。

組織プラス三ノーゲン　アクチベーター製造の第２変法 ヒト肺の胚細胞を上記第１変法と同様にして、同容量の
ＤＭＦとＨａｍ　Ｆ　Ｉ　２とからなシ、ヘペス１５　
’ｍ＝ｔｐｌ　／　ｌ及び炭俄水素ナトリウムト＋１１
／！を含む培地ＣＩＫ７．４）を用いて、多量培養面積
（１７５ｄ）を有し、上記培地６０ｍ１を含有するファ
ルコン（ＦＡＬＣＯＮ　）フラスコ内で培養する。

融合後、前記したインスリン、トランスフェリン及びｔ
ウシと共にコンカナバリンＡ２０μｇ／ゴ、カルシウム
塩、好ましくは塩化カルシウム５〜６ｆｐｔｍＣｌ／Ｉ
ｌ及びアブ０チニ：／２０〜５０ＫＩＵ／ｓ／を含む培
地を用いて、第１変法と同様にして培養を続ける。

カルシウムイオンの存在は、培養細胞のコシカナバリ：
ＪＡによる損傷をかなシ減少させ得る。同一培養物につ
き同様の収率をもって誘導できる回数は５回を越える。

更に培地内力ルシウムイオンの存在は、アクチベーター
産生の限界現象を見ることなく、各フラスコ内培地容量
を２倍とすることができる。このフラスコ・当シの培地
容量の倍量は、フラスコ当シの組織プラス三ノーゲン　
アクチベーター産生量の倍化を可能とする。

精　　製 上記いずれの変法を用いるかに拘らず、誘導操作又は各
誘導操作の後に得られる上清をフィブリン／セライト上
親和性り０マドクラフイー（ＨＵＳＡＩＮ　ａｔ　ａｔ
、　、　ＰＲＯＣ，ＮＡＴ、　ＡＣＡＤ、　ＳＣＩ。

ＵＳＡ　、Ｖａｔ、７８．Ａ７．ｌ’今２６５−４２６
９．Ｊｕｌｙ１９８１）によシ精製する。

プラス三ノーゲン　アクチベーターは、アプロチニンを
含むリシ酸塩−アル千ニン（又はリジン）緩衝液を用い
て溶離させることによシ取得される。

総活性は、力じ社（ＫＡＥＩ）　　製５２２８８着色基
質上で測定され、培薯上清！４当シ２，５μ澹ａｔ　　
（カタール）である。

５２２８８基質上つ０十ナーで換算での総活性は、培養
上清１１当シ約２５０００００ＣＴＡＩＵＴｈｒｏｍｂ
ｔｐｌｙｔｉｃ　Ａｔｔｉｖｉｔｙ　）　ＫＭ　”ｊ−
Ｊ−ル。

つ０十ナーゼと交差しない抗−ＴＰＡ　（組織プラス三
ノーゲン　アクチベーター）抗体を用いた本発明者らに
よるＥＬＩＳＡ　法の進展法によって、ＣＴＡユニット
で示される上記活性の正確な測定が可能である　上記方
法は組織づラスミノーゲシアクチベーターに特異的なも
のであシ、この活性は他のいかなるウロ牛ナーゼ活性と
も区別でき、総活性をフィブリン上で測定できる５ 上記精製は、組織プラス三ノ〜ゲン　アクチベーターを
単離するものであシ、更にｔファデックスＧ１５０又は
ウルト０ゲルＡｔＡ４４　　上ゲル濾過り０マドタラフ
イーを追加することができ、これによシ３００００ＣＴ
ＡＩＵ／η蛋白（フィブリンディスク上での分析）以上
の特異活性を得ることができる。

得られた精製アクチベーターは、次いで実質的に蛋白を
段着しない膜（アミコｙＰＭ１０又はポリスルホン三す
ポリマー又はア三コシ中空繊維）上限外濾過によシ濃縮
される。この濃縮操作も亦必要に応じてｔファデックス
ＧＩ５０又はウルト０ゲルＡｔＡ　　４４のカラムを通
過させる付加的操作を追加できる。

各工程において、組織プラス三ノーゲン　アクチベータ
ーはまずフィブリン上で分析され、次いでカセイン上で
分析される。

精製及び濃縮後、上清８００　ｙｉｌから得られる濃縮
物の容積は５１ｔｇｌとなる。

蛋白含量は１０μｆ　／　ｘｉ以下である。

フィブリンディスク上の活性は３５　Ｑ　ＣＴＡＩ　Ｕ
　／　耐であシ、即ち特異活性は３５０００　ＣＴＡＩ
Ｕ／、ｔｇ蛋白以上である。

５２２８８着色基質上の活性は１１．２５　ｐ　Ｋａｔ
　／ｌである。

つ０十す一セに相当する５２２Ｆ３８着色基質上の活性
は、１２０００１　Ｕ／　ａｔであシ、これは特異活性
１２０００００１Ｕ／Ｗ蛋白以上に相当する。

精製品性、抗−ウ０＋す−−ＱＩｇＧ　抗体の存在によ
っても阻害されず、このことよ＃）ｍかに組織アクチベ
ーターであ夛、づ口中ナーゼ乃至はそれと同様の酵素で
はないことが判る。

精製品の凍結乾燥は、その活性を阻害しない。

本発明によシ得られるアクチベーターの分子量を、電気
泳動によシ同時に沈析させた対照品を用いて得られたフ
ィブリン溶解バンドと対比してポリアクリルアミドゲル
上酵素法により測定した。

上記によシ分子量が３５０００〜＋０５０００の範囲に
数種の分子量種の存在が認められ、該分子単種の大部分
は”Ｆ５００００〜１０００００の間にあシ、主な三つ
のスポットは７８θ°００．６６０００及び５５０００
であシ、分子量５５０００に相当するスポットが主であ
った。１、本発明によシ得られる１組−プラス三ノーゲ
シアクチベーターはまた以下の特徴を有している。

−そのフィブリンに対する親和性、 −そのプラス三ノーゲン性活性（フィブリン依存性）、 一５ＤＳＰＡＧＥ及び酵素法並びに所望によシゲル沖過
により決定されるその分子量、 ・　−ウＤ＋す−ゼに特異的な８２２４今基質上での非
常に低い活性、 一特異的な抗−ウ０士ナーゼ抗体によって阻害されない
、 一フィブリンディスク上の活性、 一５２２８８基質上の活性。

上記した最初の２つの性質は、バイＩル（ｙＶｉｌＲＥ
Ｌ　）の試験（Ｐｒｇｒｚｚｓ　ｉｓ　ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｆｉｂｒｉｎｏｔｙｔｉｚ　ａｎｄ　ｔｋｒｏｍｂａ
ｌｙｔｉｓ　、　Ｖｔｙｌ、　−１。

Ａ２７　＋−２８０，Ｅｄ、　ｉｆ　Ｊ、Ｆ、ＤＡＶＩ
ＤＳＯＮ、Ｍ、Ｍ。

ＳＡＭＡＭＡ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｃ，ＤＢＳＮＯＹＥＲ５
，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　。

Ｎｅｗ　Ｙａｒｄ　、　　］　９７５　）によシ確かめ
られる。

本発明はまた上述した事項に加え、以下の記載から明ら
かな事項をも提供する。以下の記載は本発明目的を達成
するだめの方法を実施例として示すものであるが、本発
明は２等実施例によシ何ら限定されるものではない。

実　　　施　　　例 実施例　ｌ ヒト肺の胚細胞を、１５０ｄ面積のづラスチック容器内
で、４　ルベラ：］−（ＲｏＤｕｌｂｔｅｃｏ　ａｎｄ
Ｇ、Ｆｒｅｅｍａｎ　、　ＶｉｒｏｌｐｙＷ　８．３９
６．１９５９　）改質イーグルズＭＥＮ（最小必要培地
）３部及び１１ａｍ　Ｆ　ｌ　’ｌ培地（Ｒ，Ｇ、Ｈａ
ｍ　、　Ｐｒ１Ｃ，Ｎａｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｔｉ、ＵＳ、５３，２８８．１９６５）　　１部から
なるＤＭＦ培地５０ｄ′中で、１０４細胞／ｄ　の濃度
に接種する。培地は５６℃で３０分不活性化したウシ胎
児血清１０％、ヘペス（Ｈｔｐｔｔ　）　１０ｍｍｏ　
ｌ　　　　　　。

／ｌ及びゲシタマイシン４０μｆ　／　ｍｌで処理する
。

細胞が融合したら、これを更に３日間その状態で保持す
る。

次いで培地を除去し、細胞を生理食塩り：Ｊ酸緩衝液で
３回洗浄する。

得られる細胞を、インスリ：／１０μｆｌ／ｍｌ・トラ
ンスフェリン１０μ’ｆ／ゴ、バリン２．５　Ｘ　１０
−８ｍｅ　／　／　ｌ及びアづロチ：ン（ａｐｒａｔｉ
、ｎｉｎ　）　２０Ｋ　Ｉ　Ｕ　／　ｍｌを含有するＤ
ＭＦ培地（０，７ｍｌ／　１０５細胞）で、３６．５〜
３７．５℃の温度下に１８時間イン＋ユベートする。

上記によシ得られる粗生成物の力価は１ＣＴＡユニツト
／　ｍｅである。

実施例　２ 実施例１と同一条件下に細胞培養を行なう。生理食塩リ
ン酸緩衝液で３回洗浄後、得られる細胞を、インスリ：
／１０μｆ／ｗｌ、トランスフェリン１０　＃　９部ｍ
１Ｓｔし：／　２−５　Ｘ　１０　　ｍｅ’７　ｇ　、
アプロチニン２０ＫＩＵ／ｍｌ及びコンカナバリンＡ２
０μｇ／胃ｌを含むＤＭＦ＠地（，０，７ｇｔ／１０’
細胞）で、３６１５〜３７．５°Ｃの温度下に１．８時
間イン＋１ベートする。

上記により３ＱＣＴＡユニツト／　ｍｅの力価の粗生成
物を得る。

実施例　３ 実施例１と同一条件下に細胞を接種し、融合後、生理食
塩リン酸緩衝液で３回洗浄する。ｍ胞をイ　　・ンスリ
ン■０μｆ　／　ｍｌ・トランスフェリ：Ｊ１０μｆ／
　ｍｌ　Ｎセレ、／　２−５　Ｘ　１０−８ｍｏｌ　／
　Ｊ　、アプロチニン２０ＫＩＵ／ｄ及びコンカナバリ
ンＡ２０μｆ／ｍｌを含むＤＭＦ培地（０，７ｚｔ／　
３０５細胞）で、３６．５〜３７，５°Ｃの温度下に・
１８時間イン＋ユベートし、その後培養物を集める。

培養細胞を次いでｌＯ％ウシ胎児血清で処理したＤＭＦ
培地で７〜１０日間再度イン士ユベードして、コンカナ
バリンｌによる損傷作用活性の後再度融合点に達せしめ
る。

融合後、アプロチニン存在下でのコンカナバリンＡを用
いた第２回目の誘導を実施例２と同様にして行なう。

第２回目の培養細胞を集める。これを再度上記したよう
に１０％ウシ胎児血清で処理したＤＭＥ培地で７〜ｌＯ
日間イン＋ユベー゛卜する。

次いでアプロチニン存在下でのコンカナバリンｌを用い
た第３回目の誘導を行なって、第３回目の細胞を得る。

力価は次の通シである。

第１回目培養細胞：　３ＱＣＴＡユニット／耐第２回目
培養細胞：　４ＱＣＴＡユニット／ｄ第３回目培養細胞
：　３ＱＣＴＡユニット／ｄ実施例　４ マルチトレー（６０００ｄ）上培養物起源の、アプロチ
ニン２０ＫＩＵ／ｍｌ含有培養上清８００ゴ力価：１Ｑ
Ｃ７’Ａ　ＩＵ／ｙｄ（フィブリンディスク）４０ＣＴ
Ａ　ＩＵ７／ｄ’（カゼインダイスフ）蛋白含量：３９
μｆ／Ｉ！ １、　フィブリン／ｌライト上りＤマドシラフィー培養
上清８００　ｗｅを、リン酸塩緩衝液５　Ｑ　ｍｍｏｌ
／　ｌ　、　ＮａＣ４３ＱＱｍｍｏ　ｌ／　ｌ、アブ０
チニ、’１０に’ｌ　Ｕ　／ＨＩＳＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　
ｌ　ｍｍａ　ｌ　／ｌ及びアジド０．０２　　％（７＃
７．４）で平衡化したフィブリン／ｌライトカラム（８
Ｘ１８１に通す。

アルギニン０．２七ル及びトウイーン８０の０．０１％
を含有する同一緩衝液を用いて展開を行なう。

二つのフラクションが得られ之等はフィブリンディスク
上で及び５２２８８色素生成基質で分析された。

第１フラクション：９００鮮ｌ ＠２３６３’Ｕ／ｍｌ−２１２６７００ＩＵ第２フラク
ション：９００露ｔ ＠５００１Ｕ／ｍｌ−４５００００１Ｕ（５２２８８着
色基質上での活性は、ウロ牛テーゼに対応する。） ２、濃縮 ！リポアー膜上、ＰＴＧＣＱＱＯＩカットオフ＋０００
０を対照として限外沖過する。

クラクシヨシ１：５０ ／胃１−１７２２０００１Ｕ フラクション２：１６ｇ＋／容積＠ｌｌ５５０１Ｕ／篤
ｔ−＠８４０００１Ｕ 蛋白含量： フラクション１　　２０μｆ／譚ｌ以下、声縮後フラク
ション２　２０μｆｌ／ｍｌ以下１，，１ｍ縮後溶液中
のアプロチニンの存在によシ、５２２８８上での分析を
除く他の分析往行ない得ない。

３、　ウルトＯゲルＡｔＡ　４４上でのり０マトタラフ
イ 濃縮したフラクション１の沈殿０ツウイーン０、０１　
　％を含み、アプロチニンを含まない１ｈｉ−ＮＨ４Ｈ
ＣＯ”、溶液（　７　Ｈ　７．４）を用いたり０マドグ
ラフイによる展開。フィブリンディスク上の検査及び分
析。容積−２７０ｍ１。

４、濃縮 上記２に同じ。

濃縮容積ニア８ｙｔ１ ５２２８８／ＵＫ活性：１２０００７Ｕ／ｇ／合計ＩＵ
：９３６０００１Ｕ フイづリンディスク上活性：　３　５　０ＣＴＡ　ＩＵ
／ｍｌ蛋白含ｍ：　１０μｆ　／　ｍｌ以下 フフィブリンディスク上異活性：蛋白１１ｊｖ当シ３　
５　０　０　０　ＣｒＡＩｃｙ以上−プラス三ン溶解活
性テスト（従属）：矛盾しない −５２２４４（ウロ牛ナーで特異）テスト：影響なし 一フィブリン親和テスト：矛盾しない 一電気泳動：ザイｔクラフ、３活性バンド：５５０００
、６６０００及び７８０００、主バシドは約５５０００
である 一抗つ０牛ナーで血清とは反応しない。

５、凍結乾燥 目的物を、安定化剤例えばアルジミン又はヘパリンの存
在下に凍結乾燥する。

実施例　５ 細胞を、１７５ｄ面積のファルコン（ＦＡＬＣＯＮ　）
フラスコ内で、ＤＭＦとＨａｍ　Ｆ　Ｉ　２との等容積
からな、る培地（ヘペスｌ　５　ｍｅｎＯｌ　／　ｊｌ
及び炭酸水素ナトリウム１．４ｆ／ｌ含有、／＃　７．
４　）　６０ｇｌ中で、１０４細胞／ｄ濃度に接種する
。

細胞融合後、更に３日間数合状態に維持し、次いで培養
培地を除去し、細胞を生理食塩リン酸緩衝液で３回洗浄
する。

得られる細胞を、インスリン１０μｆ　／　ｍｌ　、ト
ランスフェリンｌＯμＩ　／　ｗｌ、セレ：Ｊ２．５　
Ｘ　１０−８ｍａｌ　／　ｌ、フン、カナバリ：／　Ａ
　２０　ｉｔ　ｆ　／　ｍｌ、゛塩化カルシウム（５ｍ
ｍｅｒ　ｌ／　ｌ　及びアづ０チニン２０ＫＩＵ／耐を
含むＤＭＦ培地（０，７ゴ／１０５細胞）で、３６．５
〜３７．５℃下１８時間インキュベートする。

ヒト肺の胚細胞によって天然に得られるプラスミノーゲ
ン　アクチベーター、の収量はＱ、４ＣＴＡユニツト／
　ｍｌであるのに対し、コンカナバリンＡによって及ぼ
される刺激作用によって該アクチベーターの収量は２０
〜４０倍に増加され、これによって、精製及び濃縮後、
蛋白ＩＮｇ当Ｄ３５０００ＣＴＡ　　ＩＵ以上の特異活
性を有する組織アクチベーターが収得できる。またアプ
ロチニンの添加は得られるアクチベーターを安定化させ
る。アプロチニン不存在下で該アクチベーターは非常に
急速に失活する。本発明では組織プラス！ノーゲンアク
チベーターの製造を誘導するために、系内にカルシウム
イオンを導入するが、以下のテストに示されるように、
これは総ＣＴＡ活性に何ら悪影響を与えず、ウロ＋ナー
ゼ活性（ＵＫ）に対応する特異ＴＰＡ活性を顕著に増大
させ得る。

上記実施例５の方法において、以下の物質を培地に添加
する。

一無添加 一コンカナバリンＡ２０μｇ／譚ｌ −コンカナバリンＡ２０μｆ／露ｌ＋アブＯチニン２０
　Ｋ　Ｉ　Ｕ　／　１１１ 一コンカナバリンＡ２０μｍ１　／　ｄ＋アプロチニン
２０　Ｋ　Ｉ’　Ｕ　／　ｄ＋　ＣａＣ１２６ｍｍｅｒ
　／　／ｌ−アブＯチニン２０ＫＩＵ／１ｓｌ単誌−Ｃ
ａＣＩＩ２６ｍｍｏ　／　／ｌ単独　・本発明の組織プ
ラスミノーゲン　アクチベーターにつき、精製及び濃縮
後、フイプリンゲイスク上の総括性及び上記抗−ＴＰＡ
抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＴＰＡ活性の夫々を調
べた。

得られた結果を下表に示す。

誘導系内へのカルシウムイオンの添加は、つ０牛ナーで
活性に関連する本発明の粗織プラスミノーゲン　アクチ
ベーターの生成を増加させ、これに伴って該生成物のフ
ィブリンに対する特異的親相性を増加させ、且つつ０牛
ナーゼ活性に関連する副作用の危険をかなシ減少させる
かもしくは除去させ得る。

本発明方法によれば、フィブリンに対する親和性の高い
組織づラスミノーゲン　ア′クチベーターを提供できる
。これは循環中フイプ　リノーゲンの崩壊を惹起せず、
従って治療投薬量において生体内の凝血溶解効果を奏す
る。この治療投薬量はウロ＋ナーでのそれに比しかな）
少量（約３０倍も低い）である。更に上記組織アクチベ
ーターは高収率で得られ、工業的規模で充分経済的に実
施できるものである。

本発明方法によシ得られる組織プラス三ノーゲン　アク
チベーターの凝血溶解活性化作用を、ウロ十ナーゼのそ
れと対比して、生体外で薬理試験した。その方法及び結
果を次に示す。

本発明組織プラス三ノーゲン　アクチベーター及°　　
　　−ぜの凝血溶解活性化に対する生体外薬理試験 実施例２で得た生成物及びつＯ牛ナーゼの夫々を、前述
したバイレル（Ｅ、ＶＡＩＲＥｒ、　）の方法に　従う
凝血溶解試験に供した。用いた凝血は、テストチューブ
への良好な付着を確保するため、予め血小板を除去した
。

試験方法は次の通シ′″Ｃ，ある。

Ａ、つｏ牛す−せについての第１試験 １、血小板を除去した凝血の調製と、膝皿の洗浄による
プラス三ノーゲン痕跡の除去０ ２、つ０＋ナーで含有液の通過Ｏプラス三ノーゲンは存
在しないので溶血は観察されない。

３、洗　浄。

今、純粋なプラス三ノーゲン溶液の通過。溶血は認めら
れない。事実、つ０＋ナーではフィブリンに固定せず、
先の洗浄により除去される。　　　　　　。

Ｂ０組織アクチベーターについての第２試験上記と同一
条件下に第２試験を行なう。上記工程２におけるウロ＋
ナーゼを、実施例２で得た組織プラス三ノーゲン　アク
チベーター溶液に代替する。工程性におけるフィブリン
凝血の溶解〃Ｉ見られる。事実、組織アクチベーターは
フィブリンに固定され、プラス三ノーゲンが凝血を通過
する際、これを活性化させる。

上述したように、一般に組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター中の「シト　　トランスフォーミンク　タＯ−ス
　ファクター（ＨＴＧＦ）Ｊの存在は、該アクチベータ
ーの血栓溶解剤としての利用に制約を与えるという障害
がある。本発明の組織アク″　チベーターのひとつの利
点は、これが非形質転換細胞由来のものであるため、上
記ＨＴ　Ｇ　Ｆを含有しない点にある。このＨＴＧＦを
含有しない点を、５　ＪＬ、−１（Ｊ、　Ｅ、　ＤＥ　
ＬＡＲＣＯ）及び’ｐｆｉｏ＜Ｇ、Ｊ−ＴＯＩＭＲｏ　
）の方法（Ｒｒｏｃ、Ｎａ１ｌ、　Ａｔａｄ、Ｓｅｉ、
　ＵＳＡ。

Ｖｔｙｌ、　７５．　Ａ８．　／’戸４００１−４００
５．１９７８年８月りによシ調べた。

この試験結果は次の通シである。

０ヒト肺の胚細胞の培養物由来の−Ｆ澄に二ｐけるテス
ト 無応答、トランスフォーミンク　タロースフアクタ−は
認められない。

０実施例２に従うアブＯチニン存在下でのコンカナバリ
ンｌの作用により得た粗生成物におけるテスト： 無応答、トランスフォーミンク　タロースフアクタ−は
認められない。

０７づ０チニン存在下でコンカナバリンＡを導入する第
３回目の方法後に実施例３で得た粗生成物におけるテス
ト　： 無応答、トランスフォーミンク　タロースフアクタ−は
認められない。　　一 本発明の組織プラス三ノーゲン　アクチベーターは、フ
ィブリンに対する強い親和性を有しておシ、トランスフ
ォーミンク　グロース　ファクタ−を欠いておシ、３５
０００ＣＴＡユニツト／ダ乃至はそれ以上の特異活性を
有している。従ってこれはフイプリノーゲ：、Ｉｊｃの
崩壊作用を有さない非常に価値ある血栓溶解剤である。

（以　上）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）非腫瘍性組織の培養物から組織プラスミノーゲン
   アクチベーターを製造する方法であって、胚組織細胞を
   培地中、刺激物質及びプロテアーゼインヒビターの存在
   下に培養及びインキュベートする、 組織プラスミノーゲンアクチベーターを含 む培養上清を分離する、 該組織プラスミノーゲンアクチベーターを 精製し、必要に応じて濃縮する ことを特徴とする組織プラスミノーゲンアクチベーター
   の製造法。
2. （２）胚組織細胞が、ヒト肺の胚細胞であり、刺激物質
   がコンカナバリンＡであり、プロテアーゼインヒビター
   がアプロチニン及び／又はベンズアミジンである特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）刺激物質としてのコンカナバリンＡと共にカルシ
   ウムイオンを用いる特許請求の範囲第２項に記載の方法
   。
4. （４）ヒト肺の胚細胞を、ウシ胎児血清又はウマ血清の
   如き培養アジュバント又はこれと同等のアジュバントを
   含む培地中、必要に応じて細胞外マトリックス又は細胞
   外成分の精製物の存在下に、培養し、次いでウシ胎児血
   清を除き且つ、インスリン、トランスフェリン、セレン
   、刺激物質例えばコンカナバリンＡ及びカルシウムイオ
   ン並びにプロテアーゼインヒビター例えばアプロチニン
   又はベンズアミジンを含む上記と同一培地でインキュベ
   ートする特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記
   載の方法。
5. （５）培地中にコンカナバリンＡが約５〜２０μｇ／ｍ
   ｌの最適濃度で存在し、アプロチニン又は同効のインヒ
   ビターがアプロチニンとして約２０〜５０ＫＩＵ／ｍｌ
   の最適濃度で存在する特許請求の範囲第１項〜第４項の
   いずれかに記載の方法。
6. （６）培地中にカルシウムイオンが５〜６ｍｍｏｌ／ｌ
   の割合で存在する特許請求の範囲第３項に記載の方法。
7. （７）組織プラスミノーゲンアクチベーター生産誘発の
   第１回目の操作において、コンカナバリンＡで処理され
   た組胞を、組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造
   の少なくとも第２回目の操作に再使用するために、コン
   カナバリンＡで損傷された培養細胞を、培養上清の分離
   後にウシ胎児血清を含む培地で細胞が完全に回復するの
   に充分な時間再度インキュベートし、次いでウシ胎児血
   清を含まず、インスリン、トランスフェリン及びセレン
   を含む上記培地中で、アプロチニン存在下にコンカナバ
   リンＡを用いて上記生産誘発操作を繰返し、プラスミノ
   ーゲンアクチベーターを含有する新たな培養上清を分離
   し、上記細胞の回復及び再誘発を少なくとも３回行なう
   特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の方法
   。
8. （８）培養上清を、該上清中に存在するアクチベーター
   の反応容器壁への付着を防止可能な界面活性剤で処理す
   る特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の方
   法。
9. （９）培養物から分離された培養上清を、組織プススミ
   ノーゲンアクチベーターを高い親和性をもって選択的に
   吸着できる、セライトタイプのけいこう土からなる固体
   マトリックス上に吸着されたフイブリンを用いた親和性
   クロマトグラフィーにかけ、組織プラスミノーゲンアク
   チベーターをアルギニン又はリジンを含む緩衝液で吸着
   カラムより溶離させて精製する特許請求の範囲１項〜第
   ８項のいずれかに記載の方法。
10. （１０）フイブリン／セライトで精製されたプラスミノ
    ーゲンアクチベーターを限外ろ過し、次いでゲルろ過に
    よる付加的精製を行なう特許請求の範囲第９項に記載の
    方法。
11. （１１）トランスフォーミンググロースファクターを包
    含せず、分子量が３５０００〜１０５０００ダルトンの
    範囲の多数の分子量種からなり、該分子量種の大部分は
    ５００００〜８００００ダルトンの範囲にあり、そのう
    ち主な三種は ５５０００、６６０００及び７８０００の分子量を有し
    、抗−ウロキナーゼ抗体に対する親和性を有さず、ウロ
    キナーゼに特異的な分析用蛋白基質に対する活性を示さ
    ず、フイブリンに対する高い親和性を有し、且つ３５０
    ００ＣＴＡユニット／ｍｇ蛋白もしくはそれ以上の特異
    活性を有することを特徴とする組織プラスミノーゲンア
    クチベーター。
12. （１２）トランスフォーミンググロースファクターを包
    含せず、分子量が３５０００〜１０５０００ダルトンの
    範囲の多数の分子量種からなり、該分子量種の大部分は
    ５００００〜８００００ダルトンの範囲にあり、そのう
    ち主な三種は ５５０００、６６０００及び７８０００の分子量を有し
    、抗−ウロキナーゼ抗体に対する親和性を有さず、ウロ
    キナーゼに特異的な分析用蛋白基質に対する活性を示さ
    ず、フイブリンに対する高い親和性を有し、且つ３５０
    ００ＣＴＡユニット／ｍｇ蛋白もしくはそれ以上の特異
    活性を有する組織プラスミノーゲンアクチベーターの有
    効量を、薬理担体と共に含有することを特徴とする血栓
    溶解剤。