JPS6352896A - リパ−ゼ酵素反応の実施方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リパーゼ酵素加水分解反応を行なうための改
良された方法に関する。

〔発明の背景〕

脂肪からのエステル基を加水分解するリパーゼエステラ
ーゼ酵素を使用することのほかに、ある種のリパーゼ酵
素を用いて異性体の一方を立体特異的に加水分解するこ
とによって立体異性体を分割することもできる。例えば
、ＤＬ−オクチル−２−クロロプロピオネートは、カン
ジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　　ｃ　１ｉｎ
ｄｒａｃｅａ）からの立体特異的リパーゼを用いてラセ
ミ体を加水分解することによって分解することができる
。その際、Ｄ異性体酸が等量の生成アルコールと共に形
成される。

このようにして形成された酸は基質エステルから容易に
分離することができる〔リパーゼーカタライズド・プロ
ダクション・オヴ・オプショナリー・アクティグ・アシ
ッズ・ヴイア・アシメトリック・ハイトロリシス・オヴ
・エステルズ（Ｌｉｐａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　０ｐｔｉｏｎａｌｌｙ　Ａ
ｃｔｉｖｅＡｃｉｄｓ　Ｖｉａ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ
　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｓｔｅｒｓ）、アプ
ライド・バイオケミストリー・アンド・パイ。

オテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ、９
、患３．２５５〜２６０頁、１９８４年〕。

多くのリパーゼ触媒反応において、反応から得られる水
溶性のアルコールは酵素の活性を阻害する。この理由の
ため、このようなリパーゼ加水分解反応は、反応の生成
物として形成されるアルコールを稀釈するのに十分な量
の水を用いてバッチ法で実施しなければならない。水対
基質の比はエステルの分子量に依存している。典型的に
は、メチル２−クロロプロピオネートについてのその比
は約４：１である。アルコール濃度の漸増にともなって
酵素活性が低下する。効果的方法に対しては、生成アル
コールによる酵素活性の損失を補うために過剰の水およ
び過剰のリパーゼが必要となる。多量の水の要件は反応
バッチ当りに加水分解され得る反応体の量を制限し、従
って収量が制限される。稀釈バッチ反応の要件、過剰の
水および過剰の酵素は低収率と共にプロセスの経済性を
複雑にする。

さらに、酵素の立体選択性は基質の溶解性によって影響
され得る。前記のように、本質的に水不溶性である２−
クロロプロピオン酸のオクチルエステルは、カンジダ・
シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａｃ　１ｉｎｄｒａｃｅ
ａ）からのリパーゼ酵素によって鏡像異性体的に分割さ
れ得る。同じ論文は、より水溶性であるメチルエステル
はそのように分割することができない旨を述べている。

酵素反応は水性系において好都合であるが、水不混和性
基質は反応を触媒する酵素の能力に制限を課す、基質に
対して水混和性溶媒、例えば、アルコールは望ましくな
い。なぜならば、それらの溶媒は酵素に変性作用を及ぼ
すからである。米国特許第３．９２６．７２６号におい
て、゛２相溶媒系が用いられている。この２相溶媒系と
は、酵素反応に対する水性相、および酵素活性の阻害を
回避するため水性相から反応生成物を連続的に抽出する
ためのおよび基質のための貯留体として働く水不混和性
有機溶媒相である。

２相の水性／水不混和性溶媒系の使用は水不混和性基質
について酵素反応を行なうのに有効であるが、酵素反応
が水性相中で行なわれるために水溶性の反応生成物によ
る酵素失活および酵素阻害の問題が残る。酵素または酵
素活性を犠牲にして水性相と共に生成物を取り出すのは
酵素の高いコストからみて経済的に不都合となり得る。

〔発明の概要〕

基質のエステル基のリパーゼ加水分解は、反応の結果と
して形成されるアルコールによる酵素活性の広い阻害な
しに良好な反応速度で多量の水および過剰のリパーゼの
不存在下に実施し得ることが見い出された。

本発明の方法に従って、リパーゼ酵素反応は、水性相中
に基質含有有機相を、水溶性の非固定化リパーゼ酵素の
存在において有機相が水性相と混和しないような条件下
に十分に分散させて実質的にすべての酵素を界面で基質
に結合させ、そして反応の進行に伴って水性洗浄媒体を
連続的に添加しかつアルコールまたは他の酵素阻害剤ま
たは生成物は含むが実質量の酵素は含まない水性相の実
質的に等しい容量を連続的に取り出すことによって実施
することができる。これらの条件下にリパーゼ酵素反応
を実施することによって、反応混合物中の酵素濃度を実
質的に減することなく、水溶性のアルコール生成物を含
有する水性相の部分を反応混合物から連続的に取り出す
ことができる。

本発明は、異性体フェノキシプロピオネート除草剤の製
造に有用であることが知られているＬ−２−ハロプロピ
オン酸のアルキルエステルの製造においてとりわけ好都
合であることが見い出された。

〔発明の詳細な記載〕

本発明の方法は、水不混和性有機相と水性相との間の界
面で酵素を基質に結合させるようにした反応条件下で、
水性相と混和しない基質を非固定化リパーゼ酵素と酵素
的に反応させることを含んでなり、水溶性リパーゼ酵素
の実質的損失なしに有機相からの水性相の分離を可能と
するものである。

本明細占中で用いる「基質」とはリパーゼ酵素が作用す
る物質をいう。特定の酵素が作用し得ない物質はその酵
素に対する基質ではない。

「実質的にすべての酵素が結合している」とは、平衡時
に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％のリ
パーゼ酵素がなんらかの方法で水不混和性有機基質相に
結合していることをいう。

基質は、エステル基がリパーゼ酵素の触媒的作用下に加
水分解されるエステルである。基質はさらに、反応の温
度において水性媒体、すなわち、液体中に分散有機相を
形成することができるか、または酵素と適合性のある有
機溶媒（両方ともまさに実質的に水不混和性である）中
で可溶性でなければならない。適当な基質として、酸部
分が約１〜約２２個の炭素原子を有しておりかつアルコ
ール部分が約１〜約４個の炭素原子を有している脂肪酸
エステルを挙げることができる。アルコール部分からの
アルコールは、生成アルコールが水性相と共に分離し得
るように水溶性である。脂肪酸エステルは飽和または不
飽和のいずれであってもよい。

加水分解は、光学的活性化合物のラセミ混合物を立体特
異的に分割するように実施することもできる。本発明に
従って分割することができるキラルエステル基質の１群
は下記式（Ｉ）：Ｒ，０ Ｒ−−Ｃ−−Ｃ−−ＯＲ１（１） 〔上式中、ＲおよびＲ，は水素およびＣ１−〜ＣＩｌ＋
アルキルであることができ、 Ｒ２はＣＩ””　Ｃａアルキルであることができ、そし
て Ｘはハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）、脂
肪族基または芳香族基およびそれらの置換誘導体である
ことができ、Ｒ、ＲＩおよびＸは相異なっている〕によ
って表わすことができる。

好ましくは、ＲおよびＲ２は独立してｃ、−Ｃ，、より
好ましくはＣ６である。Ｒ１は好ましくは水素である。

Ｘは好ましくはハロゲンでありそしてより好ましくは塩
素または臭素のハロゲンである。

脂肪族基および芳香族基およびそれらの置換誘導体とし
て、フェニル、ヒドロキシフェニル、フェノキシ、ヒド
ロフエノキシ、メチル、エチル、クロロメチルおよびヒ
ドロキシエチル等を挙げることができる。

加水分解することができるキラル化合物の例を以下に示
す。

メチル−２−クロロプロピオネート メチル−２−ブロモプロピオネート １−−ｌ−ルー２−クロロプロピオネートエチル−２−
ブロモプロピオネート ブチル−２−クロロブチレート メチル−２−フェノキシプロピオネート臭素化化合物は
対応する塩素化化合物より溶解性が小さい。メチル２−
（ｐ−クロロフェノキシ）プロピオネートのような化合
物は水中で十分に不溶性であり一層の処理を行なわずに
酵素的に加水分解され得るが、他の置換化合物、例えば
、メチル２−（ｐ−ヒドロキシフェノキシ）プロピオネ
ートおよびメチル２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオネートは十分に水溶性であり加水分解を実施するた
めには水不溶化が必要である。

水性相と不混和性であるような条件下で用いられる有機
基質相は、水不混和性基質単独、または基質に対する溶
媒である水不混和性不活性有機材料中の基質からなって
いることができる。水不混和性基質相は、例えば、高い
塩濃度を用いることによりまたは低温を用いることによ
り有＠溶媒によって水不混和性にされた基質も含んでい
る。本明細書中で「水不混和性」という場合、水不混和
性であるまたは水不混和性にされ得る化合物が含まれる
。

「水不混和性」とは、エステルが２５℃において水中約
５０ミリモル以下まで可溶性であることをいう。エステ
ルは好ましくは、水不混和性であり、またはエステルの
化学的組成を変化させることなく実質的に水不混和性に
することができる。

エステルは、水不混和性である有機相中で可溶性である
かまたは水中不溶化にする、すなわち、水中に５０ミリ
モル以下までの可溶性にすることができるものでなけれ
ばならない。

不溶化は、水不混和性である有ｆａｔｔ’Ｊ媒をエステ
ルに対して用いることによって、塩および緩衝剤を用い
ることによって、または酵素的加水分解の量水性成分に
対してエステルを不溶化する任意の他の手段によって達
成することができる。不溶化は、温度操作によって影響
を与えまたは増進することもできる。

「水不混和性溶媒」とは、反応の条件下に、有機溶媒が
約１０％以下まで、好ましくは１％以下まで水中に混和
することをいう。有機溶媒は、基質、反応生成物および
酵素と非反応性であるかまたは反応の条件下で酵素活性
に実質的に阻害作用を及ぼさないいかなる水不混和性有
機溶媒であってもよい。この溶媒は水より重くても軽く
てもよい。好ましい溶媒は加水分解される基質および酵
素に最も適したものである。この溶媒は当業者によって
容易に決定され得る。例えば、四塩化炭素が、メチル２
ハロプロピオネートのような基質に対して好ましい溶媒
である。有機溶媒の例として、トルエン、ペルクロロエ
チレン、クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素およ
びシクロヘキサノン等を挙げることができる。特定の溶
媒が特定の酵素または基質に悪影響を与えるかどうかは
当業者によって容易に決定され得る。溶媒対水の容積比
は約５：１〜約１：１０の範囲にあることができる。そ
の際、約２：１〜約１：２の比が好ましい。反応開始時
の有機相の基質含有量は重量／容量基準で約１００％〜
約５％の範囲であることができ、約１００％〜約２５％
が好ましい。

溶媒、例えば、四塩化炭素、ペルクロロエチレンおよび
クロロホルムは、これらの溶媒が酵素活性を阻害し得る
場合でさえ本発明において使用することができる。分散
の際に界面でリパーゼ酵素を基質に結合することによっ
て、酵素活性への溶媒の作用が減じられまたは除去され
る。四塩化炭素およびペルクロロエチレンは制限なしに
有効に使用し得るが、クロロホルムは多量で使用する場
合酵素を失活させる傾向にあることがある。使用し得る
溶媒の量は当業者によって容易に決定することができる
。酵素に占って加水分解され得るエステル溶媒または酵
素を失活させ得る水溶性アルコール溶媒は避けるべきで
ある。

エステルは、水中の基質の溶解度を５０ミリモル以下ま
で低下させるのに十分な量の塩によって水溶液中で一時
的に不溶化することもできる。有効な塩の代表例として
、アルカリ金属およびアルカリ土類金属のハロゲン化物
、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩およ
びそれらの混合物を挙げることができる。塩は少なくと
も部分的に水溶性でなければならない。適当な塩の例と
して、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリ
ウムおよび硫酸ナトリウム等を挙げることができる。

本発明において使用することができる酵素は、基質の加
水分解を触媒することができ、そして立体特異性が望ま
しい場合には立体特異的加水分解によって基質を分割す
ることができる酵素である。

これらのリパーゼ酵素の供給源の例として、リゾプス（
ｕ互並用）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アスペルギ
ルス（船和見１１ｕ互り一属、カンシタ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ属、シェードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、
アルカリゲネス（紅組旦■岨ｕ属、アクロモバクタ−（
Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属およびバシラス（Ｆｌａ
ｃｉｌｌｕｓ）属を挙げることができる。特定のリパー
ゼ酵素として、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）　、シュードモ
ナスＰ皿吋虹ｍｏｎａｓ）、アクロモバクタ−（Ａｃｒ
ｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉ
　ｅｎｅｓ）およびリゾプス（ハ旦並…）の種々の特定
でない種からのもの、な、らびにアスペルギルス・ニガ
ー（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ−社［ａ、カンジダ・シリ
ンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ■１ｉｎｄｒａｃｅａ）、
カンジダ・バラリボリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ　　匹胆
旦匹江旦■）、リゾプス・ジャボニカス（肋ｎ並旦口似
旦皿蛙、リゾプス・二ヴエウス（ハ豆並旦　ｎ１ｖｅｕ
ｓ）　、リゾプス・デレマー（ｉ　　ｄｅｌｅｍａｒ）
　、バシラス・サプチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕ
ｂｔｉｌｌｕｓ）からのものおよび動物の消化リパーゼ
、例えば、ブタ膵臓か、匂のもの等およびそれらの混合
物を挙げることができる。

本発明のキラルエステルの分割に用いるリパーゼは好ま
しくは酵母カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ
　　リ１頂可工妊旦い−から得る。この酵素は、本発明
の方法において高収率の分割異性体を生じさせることが
見い出された。従って、この酵素は商業的方法に対して
最も望ましいと考えられる。

リパーゼ酵素のタイプは基質に応じて変化し得る。ラセ
ミ体を分割することが望ましい場合には、酵素は、任意
の特定の基質の異性体の１つに対して立体選択的でなけ
ればならない。酵素は粗製生成物としてまたは純粋な形
で用いることができるが、経済的理由に対しては粗製生
成物が好ましい。

水中で溶解性を保持している、化学的変形によって安定
化された酵素は、本発明の方法の特別な性質を利用する
こともできる。

リパーゼ酵素は、その分子構造によって、界面で基質に
付着している。最良の結果に対しては、全酵素の約２０
％以下、好ましくは全酵素の５％以下が平衡時に水性相
中に存在している。

酵素／基質は、該酵素に好都合な条件下で反応させる。

酵素、例えば、カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉ
ｄａ　　リ１力司工耗旦り−リパーゼに対しては、約り
℃〜約４５℃の範囲内の温度および約３〜約８の範囲内
のｐ）Ｉが好ましい。酵素量は当業者によって容易に決
定される。

反応は、必要な分散を形成するのに十分な攪拌手段を備
えた常用の容器内で実施することができる。はぼ定常流
で反応混合物を連続的に洗浄して酵素阻害物質または酵
素失活物質を除去する手段が設けられている。酵素反応
はｐＨ感受性でありそして反応の間に酸が生成されるの
で、適当な中和剤を添加して洗浄を行なうことができる
。反応器はｐＨモニター、例えば、ｐＨプローブを具備
しており該プローブからのデータに基づいて中和剤の添
加を開始する。好ましくは、反応器は、自動的に溶液へ
中和剤を供給することによって必要に応じて反応のｐＨ
を制御するｐＨ作動性制御装置を備えている。このよう
な中和剤の例として、アルカリ金属およびアルカリ土類
金属の水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩ならびに水酸
化アンモニウムの水溶液（これらに限定されるものでは
ない）を挙げることができるが、炭酸水素ナトリウムお
よび水酸化アンモニウムが好ましい中和剤である。

本発明の方法の臨界的な面は、反応器内に酵素を保持し
ながら反応混合物からアルコールおよび他の水溶性阻害
生成物を除去することである。アルコールは水溶性であ
るので、水性相を水不混和性有機相から分離する必要が
ある。水性相の分離の間反応混合物からの酵素の除去を
制限するために、水溶液は、酵素が２相間の界面に集め
られるような分散条件下に水不混和性有機相から分離し
なければならない。この目的を達成する便利な方法は、
反応器において静止状態で分散液を単離させ得る反応器
内の大口径沈降管または分離管を使用することによる。

静止状態において、水性相は有機相から分離する。酵素
は分離有機相に付着したままの状態であり、アルコール
は水性相中に見い出される。水性相は、酵素の部分を取
り出すことなく、アルコールの部分と共に取り出すこと
ができる。溶媒が水より重い場合には、分離管は上部か
らの水性相の取り出しを可能とする。水性相を底部から
取り出す場合には、水より軽い溶媒を使用することがで
きる。

本発明の方法は、反応混合物の容量を低レベルに保ちな
がら実質量の酵素を洗い流すことなく、酵素阻害物質を
、反応系から洗浄し得るように操作することができる。

このことを達成するために、阻害物質を含有する水性相
の量を、添加される中和剤または洗浄水の量と実質的に
等しい量で取り出す。好ましくは、反応混合物の量は、
最初の反応混合物量より約±２０％以上までは変化しな
い。

等しい量を添加しおよび取り出す同時作動性ポンプを用
いることができる。大きな系においては、外部分離を用
いて有機相を反応器に再循環することができる。反応混
合物の部分を反応器から分離装置、例えば、有機相から
水性相を分離する低速遠心機にポンプ輸送することがで
きる。次いで、反応器内のレベルを一定に保つように十
分な部分の水性相または水と共に有機相を再循環させる
ことができる。

加水分解生成物、すなわち、酸の部分を、それが水溶性
である場合には、水性相から連続的に回収することもで
きる。未反応の異性体エステルが所望生成物である場合
には、望ましい程度の反応の終了時に反応混合物の最終
的遠心分離によってこれを回収することができる。有機
溶媒を用いる場合に、未反応のエステル生成物は蒸留に
よって回収する。未反応の異性体エステルが所望生成物
である場合には、当業者に公知の技法によって、形成さ
れた異性体の酸をラセミ化し、再エステル化しそして分
割のために戻すことができる。

本発明の方法は、酵素の実質的損失を伴わずに反応の間
に生じた反応生成物または酵素阻害物質を洗い流しなが
ら連続的酵素反応の実施を可能とするものである。従来
技術による酵素の固定化を必要とすることなく、水溶性
の酵素を連続反応において用いることができる。

本発明を、以下に示す例によってより十分に説明する。

■−上 各々１００ミリリツトルの３つの反応を、本発明の方法
を従来の技法と比較するためにそれぞれ独立に実施した
。反応（ａ）は本発明に従って実施した。反応（ｂ）お
よび反応（Ｃ）はバッチ反応として実施した。

（ａ）５０ミリリツトルのＤＬ−メチル−２−ブロモプ
ロピオネート（ＤＬ　−ＭＢＰ）、５０ミリリツトルの
水、０．１ｇのＣａＣ１ｚ　、２．５　ｇのＮａＨＣＯ
３および約２３００国際単位の活性を有するカンジダ・
シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　　ｃ　１ｉｎｄｒａ
ｃｅａ）からのリパーゼ酵素１００ミリグラム（ＤＬ−
ＭＢＰ　１ミリリットル当り２ミリグラムのリパーゼ）
を第１図に示した型の反応器内で混合した。反応器はｐ
ｎモニターおよびｐｌ！作動性制御装置、５％のＮａＨ
ＣＯ，溶液を反応器に添加するための入口管、大口径の
相分離出口管およびマグネチソクスターラーを備えてい
た。

出口管は反応混合物の液体レベルより下に位置しており
該管内で相分離を起こさせた。基質ＤＬ　−ＭＢＰは、
水性相が管内で上層として分離するように水より重い。

入口管および出口管は両方とも、同時に作動する等しい
流量のポンプに接続した。反応器のｐＨが６．２以下に
落ちると、ＮａＨＣＯｓ溶液が自動的に添加されそして
相分離管中で分離した水性相の等しい容量分が取り出さ
れた。

強攪拌下および約２２℃の温度での２４時間の反応の後
、反応器を分解して生成物を回収した。

この反応によって、１５ミリリツトルのＬ−（−）−Ｍ
ＢＰおよび９６ミリリツトルの水溶液が得られた。生成
物の旋光度は−６８，７であった。この結果は約７０％
の反応の程度および約９４％の生成物の光学純度に対応
している。

さらに、３７８ミリリツトルの水溶液を出ロボンブから
集めた。この３７８ミリリツトルは、反応に添加した酵
素の最初の量の約３５ミリグラムすなわち約３５％を含
んでいた。酵素が連続的洗浄下で水溶液中に存在してい
る攪拌（完全バックミキシング）反応器について、計算
ではこの反応の時間にわたって酵素の９８％が反応器か
ら洗い流されることが予測される。従って、この反応時
間にわたる酵素の３５％のみの損失は、水性画分と共に
取り出されるべき水溶性の酵素が反応系に固定されてい
ることを示すものである。基質と水性相との間の界面に
おいて酵素が基質に引き付けられる能力は、基質−水性
相界面が維持されている間は酵素を涸渇させることなく
水性相をそこから分離することを可能とする。

（ｂ）５０ミリリツトルのＤＬ−ＭＢＰ　、　５０ミリ
リツトルの水、０．１ｇのＣａＣＩ！　２．２３．３８
ｇのＮａＨＣＯｓおよび２３００国際単位の活性を有す
るカンジダ・シリンドラセア旦旦…ム　Ω上ｌ紅酊１吐
がらの゛リパーゼ酵素１００ミリグラム（１ミリリツト
ルのＤＬ　−ＭＢＰ当り２ミリグラムのリパーゼ）を用
いてバッチ反応を行なった。反応体を一諸に混合し室温
で連続的に攪拌した０反応はｐＨ８，０で開始し迅速に
７．２まで落ちた。

反応器を、２４時間後の加水分解の程度および生成物純
度について試験した。この試験は、反応混合物の１０ミ
リリツトルを取り出しそして遠心分離して反応混合物か
らＤ　−ＭＢＰ生成物相を分離することによって行なっ
た。約３．５ミリリツトルのＬ−ＭＢＰ　＆　１０ミリ
リツトルの反応混合物から分離した。Ｌ　−ＭＢＰ生成
物の旋光度は−２８，３７であった。これは、反応の程
度が３０％であり生成物の光学純度が６８％であること
に相当する。

追加の７２時間の反応時間の後、２５ミリリツトルの試
料を取り出し前記のように分析を行なうことによって反
応を再度評価した。反応の程度は４４％でありそして光
学純度は７３％であることが見い出された。

従って、この反応は９６時間の反応後でさえ９０％また
はより良好な純度の生成物を生じ得なかった。

（Ｃ）２０ミリリツトルのＤＬ−メチル−２−ブロモプ
ロピオネート、８０ミリリツトルの水、０．１ｇのＣａ
Ｃｊ！ｚ　、９．３５ｇのＮａＨＣＱ：＋および前記特
定したカンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａｃ　
ｌ１ｎｄｒａｃｅａ）リパーゼ酵素４０ミリグラム（１
ミリリツトルのＤＬ　−ＭＢＰ当り２ミリグラムのリパ
ーゼ）を混合しそして室温で連続的に撹拌した。反応混
合物の初期ｐＨは８．０であったが迅速に約７．２まで
落ちた。その後、反応の進行に伴ってｐ’Ｈは徐々に約
５．５まで落ちた。２４時間後、反応混合物を加水分解
の程度および生成物純度について試験した。反応の程度
は６７％であり生成物（Ｌ−（−）　−ＭＢＰ　）の光
学純度は９３％であった。この反応は１００ミリリツト
ルの反応混合物中に６．６ミリリツトルの最終生成物を
生成した。

本発明の方法は、約１００〜１１０　ミリリットルの一
定容量の反応媒体中に１５ミリリツトルの生成物を与え
た。２４時間後の反応の程度は、９４％の光学純度で７
０％であった。バッチ反応（ｂ）においては、１：１の
水対基質比でバッチ（ａ）におけると同容量および同量
の基質を用いて、２４時間後の反応の程度は約６８％の
光学純度でわずか３０％であり、また９６時間後でも反
応の程度は７３％の光学純度でわずか４４％であった。

バッチ反応（Ｃ）においては、４：１の水対基質比（従
来技術において容認されている方法）を用いて、２４時
間後の反応の程度は約９３％の光学純度で約６７％であ
った。しかしながら、この反応は１００ミリリツトルの
反応混合物光りわずか６．６ミリリツトルの生成物を与
えたに過ぎないが、本発明は１１１ミリリツトルの最終
反応混合物容量中１５ミリリットルの生成物を与えた。

この一連の例は、高い反応程度および光学純度をバッチ
反応において得ようとする場合に４：１の水対基質比を
用いる要件を示しており、また１：１の比では不十分な
結果が得られることを示している。本発明は、低反応器
容量で高い反応程度、良好な光学純度および良好な収率
を得るものである。

■−１ ５０ミリリツトルのＤＬ−メチル−２−クロロプロピオ
ネート（ＯＬ　−ＭＣＰ）を５０ミリリツトルの四塩化
炭素中に溶解した（ＣＣｆｆｉ　４中４．４モルのＭＣ
Ｐ）。この１００ミリリツトルの有機相を、１００ミリ
リツトルの水、０．１ｇのＣａＣｊ！ｚ　、５　ｇのＮ
ａＨＣＯ＊および１００ミリグラムのカンジダ・シリン
ドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　　ｃ　１ｉｎｄｒａｃｅａ
）リパーゼ酵素と混合し、自動的ｐ）Ｉ制御装置を用い
ないで第１図および例１に記載のように反応器内での反
応に付した。温度は１３℃に制御した。ｐＨが８．０の
初期ｐＨから６．２まで落ちたとき、０．６１モルＮＨ
，ＯＨの溶液を反応器内にポンプ輸送した。等しい量の
水性相を例１の場合と同様にして取り出した。自動的ｐ
Ｈ制御装置を使用しなかったので、ＮＨ４，ＯＨ溶液を
、約４．０〜７．０の範囲内のｐＨを維持するのに十分
な量で反応混合中にポンプ輸送して加えた。

２２時間の反応後、塩基の添加を中止した。最終ｐＨは
約４．０であった。水性相を有機相から分離し、そして
６３ミリリツトルの有１（ｃｃｌオ）相を得た。有機相
中の生成物（Ｌ−（−）　−ＭＣＰ　）の濃度は２．５
３モルであった。ＣＣ１，生成物溶液について測定され
た旋光度は−６，２６であった。この情報から、反応が
６４％まで完了したことおよび生成物の光学純度が８４
％であることが示された。

総量で３７０ミリリツトルのＮＨ，ＯＨ溶液を反応器を
介してポンプ輸送した。

例３ ５０ミリリツトルのＤＬ−メチル−２−ブロモプロピオ
ネートを丸底フラスコに入れ、そして０．２％の塩化カ
ルシウムおよび２３００国際単位の活性を有するカンジ
ダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａｃ　ｌ１ｎｄｒａ
ｃｅａ）からのリパーゼ１００ミリグラムを含有する５
％炭酸水素ナトリウム５０ミリリツトル中に分散させた
。フラスコは例１　（ａ）と同じように装備した。

酵素反応が１９゛Ｃで進行するのに伴っ−て、初期ｐｉ
（８は６．２に落ちた。その後は、５％炭炭酸水素ナト
リウム溶液液用いてｐ）Ｉを６．２に制御卸する自動ｐ
Ｈ制御が開始された。添加される中和剤に等しい容量の
水性相を出口管から取り出した。約１１時間の反応時間
の後、４２５ミリリツトルの５％炭酸水素ナトリウム溶
液を添加した。反応の終了時には、３７８ミリリツトル
の水性相が取り出されており、９６ミリリツトルの水性
相および１４．５ミリリツトルの有機相が反応器内に残
っていた。装入したミリリットルを基準にして、Ｌ−（
−）−メチル−２−ブロモプロピオネートの収率は９４
％純度で２９％であった。

集めた水性相３７８ミリリツトル中の全リパーゼをアッ
セイしたところ、３４．６５ミリグラムすなわち３４．
６５％であった。炭酸水素ナトリウム消費により、反応
は６３．４％まで進んだ。

■−１ ７０ミリリツトルのＤＬ−メチル−２−ブロモプロピオ
ネート、および０．２％の塩化カルシウムおよび１４０
ミリグラムのリパーゼを含有する５％炭酸水素ナトリウ
ム溶液７０ミリリツトルを例１（ａ）の場合と同様に反
応させた。

２時間の反応後、反応混合物の全容量が約１１０′ミリ
リツトルになるように水性相を選択的に減少させた。−
夜間にわたる反応の間、容量が増した。

最終的に回収した容量は水性相１１０ミリリツトルおよ
びＬ−（−）、−メチル−２−ブロモプロピオネート生
成物２１ミリリツトルであった。２５時間の反応時間に
わたって集めた全水性相は６６３ミリリツトルであった
。使用した中和剤の全容量は４５９ミリリツトルであっ
た。生成物収率は９４％純度で約３０％であった。使用
した炭素水素ナトリウムにより、反応は６２％まで終了
した。

反応は、四塩化炭素中に溶解したＤＬ−メチル−２−ク
ロロプロピオネートを用いて同様に等し〈実施すること
ができる。炭酸水素ナトリウム中和によるＣ０２の形成
は反応器内の容量を増大させることがある。この問題を
克服するために、水酸化アンモニウムを中和剤として用
いるのがより好ましい場合がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法に使用する装置を表わす図である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リパーゼ酵素反応の実施方法であって、リパーゼ酵
   素の存在において水性相中に水不混和性有機基質含有相
   を分散させ、その際該分散は水性相と有機相との間の界
   面で実質的にすべてのリパーゼ酵素を結合するのに十分
   なものであり、前記結合の間リパーゼ酵素を基質と反応
   させ、分散相を水溶液で洗浄しそして前記反応の間有機
   相から水性相の部分を分離することを含んでなる方法。 ２、前記リパーゼ酵素がカンジダ・シリンドラセア（￥
   Ｃａｎｄｉｄａ￥　￥ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ￥）リパ
   ーゼである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記酵素反応がラセミ体の立体選択的分割である、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記酵素が基質に対する立体選択的リパーゼである
   、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記基質含有相が、基質に対する溶媒である水不混
   和性溶媒を含んでいる、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ６、前記溶媒が四塩化炭素である、特許請求の範囲第５
   項記載の方法。 ７、前記酵素反応が酸を生じさせ、そして該酸を反応進
   行時に中和剤によって中和する、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ８、前記酸をその発生時に連続的に中和する、特許請求
   の範囲第７項記載の方法。 ９、前記中和剤を添加する際、添加する中和剤に実質的
   に等しい水性相の部分を取り出す、特許請求の範囲第７
   項記載の方法。 １０、水性相対基質相の比が約５：１〜約１：１０の範
   囲にある、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、水性相を、反応に対して外部で基質相から分離す
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、ＲおよびＲ＿１は水素およびＣ＿１〜Ｃ＿１
   ＿８アルキルを表わし、Ｒ＿２はＣ＿１〜Ｃ＿４アルキ
   ルを表わしそしてＸはハロゲン、脂肪族基または芳香族
   基およびそれらの置換誘導体を表わし、Ｒ、Ｒ＿１およ
   びＸは連続反応において相異なっている〕によって定義
   される光学的に活性なキラルエステル物質のラセミ混合
   物を連続反応によって立体選択的に分割する方法であっ
   て、 （ａ）基質含有相を、該基質を立体選択的に加水分解す
   ることができるリパーゼ酵素の存在において水性相中に
   分散させ、その際該分散は水性相と基質相との間の界面
   で実質的にすべての酵素を基質に結合させるのに十分な
   ものである； （ｂ）前記結合の間酵素を基質と反応させ；そして （ｃ）中和剤の添加量に実質的に等しい量の水性相を取
   り出しながら中和剤で分散相を連続的に中和すること を含んでなる方法。 １３、水性相対基質相の比が約５：１〜約１：１０の範
   囲にある、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、水性相を、反応に対して外部において基質相から
   分離する、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １５、基質が２−ハロプロピオン酸のアルキルエステル
   である、特許請求の範囲第１２項記載の方法。