JPS6353961B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は角膜移植用眼球保存液に関する。さら
に詳しくは、本発明は角膜移植手術において用い
る眼球（死亡後のヒトの献体から摘出される）を
その機能を維持した状態で長時間保存することを
可能とした角膜移植用眼球保存液に関する。 ヒトにおける角膜移植手術は、臓器移植手術の
うちでは歴史が古く、またきわめて成功率の高い
移植手術であり、眼科領域ではその適応が増々拡
大されてきている。さらに近年、該手術の進歩と
普及に伴ない、角膜をその機能を失なうことなく
長期保存しうる方法の開発が切望されてきてい
る。すなわち、死亡直後の献体からその眼球をそ
の機能を保つた状態で長時間保存することができ
れば、手術を受ける患者や手術を行なう医師およ
び看護婦の側にも充分な準備を行なう時間的余裕
を持たせることができ、さらには角膜移植を受け
た眼球の質を向上させることも可能となる。 角膜移植手術を成功させるためには、保存角膜
に活力（vitality）が保持されていることが強く
要求されるが、当初当該技術分野において用いら
れていた保存液（たとえば生理食塩水、グリセリ
ン溶液、ハンクス溶液など）はいずれも角膜を長
期間保存することができず、極端なばあいには数
時間（３〜５時間）で角膜に混濁が生じてしま
い、移植手術に用いることができなくなるという
問題があつた。そのため長期間角膜を保存する方
法を開発するための研究が近年活発に行なわれて
きている。 かかる従来例についてつぎに簡単に説明する。 たとえば水川らにより、組織培養液（アミノ
酸、ビタミン、核酸構成成分、中間代謝物、補助
的増殖因子などを含有）、炭酸水素ナトリウム、
コンドロイチン硫酸ナトリウム、イノシン、アデ
ノシン、アデニンおよび抗菌性物質の適量を蒸留
水に溶解し、必要があればこれに酸素と炭酸ガス
の混合ガス（95：５）を導入飽和し、PH6.5〜8.0
とした眼球保存液が開発されている（特公昭46−
2036号公報参照）。該眼球保存液は、今日も広く
使用されているが、それでも有効性を発揮しうる
のが２〜３日という短期間に限られているため、
処置が迅速に行なわれないと移植手術時にはすで
に眼球の機能が低下してしまつていることがしば
しば起る。そのため全眼球を保存液中に入れて低
温下に保存するいわゆるアイ・バンク（Eye
Bank）式保存法に似た方法に該保存液を利用す
ることが一般に行なわれている。 切り取つた角膜を保存するための潅流液も種々
開発されている。エデルハウザー（Edelhauser）
らは家兎角膜内皮を、潅流温度37℃、前房圧15mm
Hgの条件下で生理食塩水、乳酸リンゲル液、バ
ランスド・ソルト・ソリユーシヨン（Balanced
salt solution、以下、BSSという）またはグルタ
チオン・ビカーボネート・リンゲル（Glutathion
Bicarbonate Ringer、以下、GBRという）を用
いて４時間潅流したところ、角膜の膨潤率はそれ
ぞれ98μｍ／hr、39μｍ／hr、24μｍ／hr、０〜4μ
ｍ／hrであつたと報告しており、GBRの角膜保
存における有用性を示唆している（Edelhauser
H.F.、Van Horn D.L.、Hyndiuk N.A.and
Schulz R.O.、Amer.J.Ophthalmol.、93、643
（1975）参照）。さらにマツクエナネイ
（McEnerney）らは同様の実験をGBRからその
成分であるグルタチオンおよび（または）アデノ
シンを除いた液で行ない、角膜の膨潤率を測定し
たところ、角膜内皮に対する障害は認められなか
つたと報告している（McEnerney J.K.and
Peyman G.A.、Invest.Opthalmol.、16、657
（1977）参照）。 しかし叙上のごとき潅流液は、角膜移植手術に
適用されるばあいにおいてせいぜい数時間角膜の
機能を保持できれば満足されるものである。しか
しそれらの潅流液は、眼球保存液として使用され
るばあい、それらの処方中に含まれている炭酸水
素イオン（HCO^- ₃）が角膜内皮のポンプ作用を活
発にさせる作用（K.R.Mayes、M.V.graham
and S.Hodson、Exp.Eye Research、26、555〜
560（1978）参照）があり、その結果角膜が速やか
に膨潤、混濁されてしまい、眼球保存液としての
目的を果さなくなる。 該ポンプ効果を回避するために、炭酸水素イオ
ンの加えられていない眼球に適用できうる溶液も
いくつか提案されてきている。たとえば米国アル
コン（Alcon）社は炭酸水素イオンフリーのBSS
を開発しているが、それはエネルギー源となりか
つ膨潤防止効果を有するグルコースが含まれてお
らず、また通常の房水成分にくらべてK⁺が約２
倍量、Ca²⁺が約３倍量も多く配合されており、
さらには緩衝化のための酢酸塩およびクエン酸塩
が非常に多量に使用されているが、そのことは生
体組成製剤としてふさわしくない。炭酸水素イオ
ンフリーのものとして理想的な組成を有するもの
にグルコース・ホスフエート・リンゲル
（Glucose Phosphate Ringer、すなわち
Bicarbonate free medium、以下GPRという）
がある。しかしGPRには、Ca²⁺やMg²⁺が処方さ
れており、それが同時に処方されている
Na₂HPO₄によつて不溶性の塩（白濁沈殿）を形
成し、また加熱滅菌時にも白色沈殿が発生するた
め、実際上、製剤化は困難である。 本発明はかかる従来の現状に鑑みなされたもの
であり、角膜のポンプ効果を休止させ、角膜の膨
潤、混濁化が長期間抑えられ、製剤時における安
定性および製剤後の保存安定性が改善され、さら
には眼球の長期間保存を可能とした角膜移植用眼
球保存液を提供することを目的とする。 本発明者らは、かかる目的に沿つて鋭意研究を
行なつた結果、 (a) 房水成分として必須成分である電解質のナト
リウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイ
オン、マグネシウムイオンならびに塩素イオン
などの一定濃度を含有し、リン酸緩衝液にて緩
衝化し、角膜膨潤防止剤としてデキストラン
（好ましくは分子量４万〜15万のもの）の１種
または２種以上を１〜10％（Ｗ／Ｖ）用いるこ
とにより、角膜水和制御効果をもたらし、かつ
溶血抑制効果および細胞賦活効果を発現せし
め、 (b) グルコースを、好ましくは0.5〜15ｍＭ加え
ることにより、角膜を手術直前の体温に復元す
る際の細胞賦活効果と膨潤防止効果をはかり、 (c) さらにクエン酸イオンおよび（または）酢酸
イオンを、好ましくは0.5〜５ｍＭ加えること
により、角膜膨潤の防止およびカルシウムイオ
ンやマグネシウムイオンによる白色沈殿生成の
防止効果をはかり、 (d) 炭酸水素イオンを加えないことによつてポン
プ効果の休止をはかつたところ、前記目的を達
成せしめうることを見出し、本発明を完成する
にいたつた。 すなわち本発明は、陽イオンとしてナトリウム
イオン（Na⁺）、カリウムイオン（K⁺）、カルシ
ウムイオン（Ca²⁺）ならびにマグネシウムイオ
ン（Mg²⁺）および陰イオンとして塩素イオン
（Cl^-）、リン酸イオン（PO₄ ^3-）、硫酸イオン
（SO₄ ^2-）、クエン酸イオンおよび（または）酢酸
イオンを含有し、炭酸水素イオンを含有しない眼
球保存液において、 デキストランおよびグルコースが添加されてな
ることを特徴とする角膜移植用眼球保存液に関す
る。 本発明の眼球保存液に用いるデキストランとし
ては、分子量４万〜15万のものが好ましく、市販
品としては、たとえば分子量４万のデキストラン
40（米国フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社
製）または分子量７万のデキストラン70（名糖産
業(株)製）などがあげられる。 本発明の眼球保存液に用いられる各成分の好ま
しい濃度範囲およびとくに好ましい濃度範囲をつ
ぎの第１表にまとめて示す。

【表】 第１表に示したクエン酸ナトリウムと酢酸ナト
リウムは、本発明の眼球保存液の製造時において
白色沈殿生成がみられるばあい、それを防止する
ために適宜添加されるものである。またデキスト
ラン40とデキストラン70はそれらのいずれか一
方、または両者を適当量（好ましくは１〜10％
（Ｗ／Ｖ））配合する。 第１表に示したNa⁺成分の濃度範囲は、クエン
酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、Na₂HPO₄、
NaH₂PO₄として加えられるほか、食塩（NaCl）
を適当量加えて調節される。またK⁺は塩化カリ
ウム（KCl）として、Ca²⁺は塩化カルシウム
（CaCl₂）として、Mg²⁺は硫酸マグネシウム
（MgSO₄）としてそれぞれ添加されるのが好まし
い。 本発明の眼球保存液は当該技術分野における通
常の方法によつて製造（処方）でき、かつ多くの
点において利点がある。かかる製造法の一実施態
様についてつぎに簡単に説明する。 まずNaCl、KCl、CaCl₂（・2H₂O）、MgSO₄
（・7H₂O）を室温ないし60℃以下で滅菌精製水
に溶解せしめる。つぎにグルコース、クエン酸ナ
トリウム、デキストラン、NaH₂PO₄（・H₂O）、
Na₂HPO₄をその順でそれぞれ添加溶解させ、最
後に滅菌する。かくしてえられる眼球保存液は、
通常PHが6.5〜7.8、浸透圧が270〜350ｍOsM、相
対粘度が約２〜3cPsの液性を有する。また滅菌
は、加圧による加熱滅菌法を採用することが可能
である。 従来の眼球保存液にくらべたばあいの本発明の
眼球保存液の製造時または保存時における長所と
してはつぎの(i)〜(vi)などがあげられる。 (i) 前記した水川らの眼球保存液の製造の際に必
要とされた酸素と炭酸ガスの混合ガス（95：
５）によるバブリングの必要がない。また調製
時における氷冷も不要である。 (ii) NaOH水溶液またはHCl水溶液などを用いて
PHを調節する必要がない。 (iii) 滅菌、たとえば115℃で10分間の加圧滅菌に
供したばあい、冷却後は澄明な液となる。 (iv) (i)〜(iii)に示したごとく、従来多くみられた製
造時の問題が解消されているため、製造に要す
る時間がかなり短縮される。 (v) 保存時における環境の変化（たとえば温度が
40〜60℃）によつて液の外観が変わることがな
い。 (vi) 加圧加熱滅菌が可能であり、組織培養液など
も含まれていないため雑菌繁殖の危険が少な
く、開封しないかぎり長期間、使用に供される
まで安定に保存できる。 つぎに処方例をあげて本発明の角膜移植用眼球
保存液をより詳細に説明するが、本発明はそれら
の処方例のみに限定されるものではない。 処方例 １ ２フラスコ中にNaCl7.5ｇ、KCl0.41ｇ、
CaCl₂・2H₂Oの0.172ｇおよびMgSO₄・7H₂Oの
0.217ｇを採り、滅菌精製水を加え、常温ないし
約60℃以下で撹拌して溶解させた。つぎにグルコ
ース0.404ｇを加えて溶かし、さらにクエン酸ナ
トリウム二水塩0.4ｇ、デキストラン40の10.0ｇ、
NaH₂PO₄・H₂Oの0.2ｇおよびNa₂HPO₄の1.0ｇ
をその順でそれぞれ添加溶解させ全量を１とし
た。このものを100〜500ml容アンプルまたはバイ
アル瓶に分注・封入し、ついで115℃で10分間加
熱して滅菌した。 えられた眼球保存液は無色ないし微黄色の澄明
液であり、液の物理的性質は、PH7.09、浸透圧
295ｍOsM、相対粘度1.94cPsであつた。 処方例 ２〜７ 処方に供される成分および（または）その量を
第２表に示すごとく代えたほかは処方例１と同様
にして実験を行なつた。えられた眼球保存液の物
理的性質を第２表に併記する。

【表】

【表】 以上述べた従来の溶液（ただし、Ｍ−Ｋ・メデ
イウムについては後述する）と本発明の眼球保存
液の違いを比較するため、それぞれの主要組成を
まとめて第３表に示す。

【表】 つぎに本発明の眼球保存液の有用性を調べた眼
球保存試験例について述べる。なお以下の試験例
において用いた保存液は前記処方例３または５で
えたものと、第４表に示す組成を有するGBR、
GPRならびにコンドロイチン硫酸ナトリウムを
含有する眼球保存液（科研薬化工(株)製）および
「人癌細胞の培養」（大野章一、菅野晴夫著、朝倉
書店出版、20〜21頁）に示されている組成および
調製法によつてえられるＭ−Ｋ・メデイウム
（McCarey−Kaufman medium）である。

【表】 ＊３ 科研薬化工(株)製、商品名：眼球保存液
（試験方法） 強角膜片は体重約３Kgを有する白色家兎から摘
出したものを使用した。 まず摘出した全眼球から切り取つた強角膜片を
前述のそれぞれの眼球保存液中、温度４℃で一定
期間（最長14日間）保存した。 次に強角膜片をプラスチツク製のチヤムバーに
マウントし、内皮側チヤムバーに炭酸水素イオン
を含むGBRを入れて水柱15cmの眼圧がかかるよ
うにし、ついでチヤムバー全体をGBRを入れた
ビーカーの中に入れ、そのビーカーを37℃の恒温
槽上に１時間浸した。すなわち低温保存した強角
膜をGBRの中で１時間かけて能動輸送の回復
（temperature reversal）を行なつた。そののち
角膜内皮の構造をスペキユラー・マイクロスコー
プ（specular microscope）および電子顕微鏡に
よつて観察した。 （試験結果） 第５表に強角膜片を各溶液中に５日間、９日間
または12日間保存したときの内皮構造をスペキユ
ラー・マイクロスコープで観察した結果を簡単に
示す。なお観察するに際し、摘出したばかりの眼
球の強角膜片（以下、ノーマルという）を対照例
として用いた。 なお本発明の眼球保存液は強角膜のみならず全
眼球のばあいにも充分に使用に供しうるものであ
る。

【表】 した。
第１図にノーマルのスペキユラー・マイクロス
コープ写真（倍率：約30倍、以下同様）を示す。
細胞は一様に明るく、モザイク模様がはつきりと
見られる。第２図、第３図にGPR（デキストラン
無添加）中またはデキストラン70を５％含有する
GPR中で５日間保存したのちのスペキユラー・
マイクロスコープ写真を示す。デキストランが添
加されていないばあい、内皮細胞に膨潤がみられ
るのに対し、デキストランが添加されているばあ
い、内皮細胞の膨潤はなく、細胞間の境界も明瞭
であることがわかる。第４〜２０図に第５表のそ
れぞれの観察結果に対応するスペキユラー・マイ
クロスコープ写真を示す。第４〜７図からわかる
ように、本発明の眼球保存液（処方例３でえたも
の）中に３〜12日間保存した強角膜内皮はいずれ
も異常がなく、良く保存されていることがわか
る。また本発明の特徴であるデキストランの添加
をほかの溶液についても検討したところ、その効
果がある程度認められ、とくにＭ−Ｋ・メデイア
ムや炭酸水素イオンフリーであるGPRについて
は顕著な効果が認められた（第８〜１８図参照）。
しかし眼球保存液として従来から一般に使用され
ているコンドロイチン硫酸ナトリウム眼球保存液
は、第２０図からわかるように、細胞の膨潤やジ
ヤンクシヨナル・コンプレツクスの破錠による細
胞の変形、分離、脱落が観察されるものであつ
た。 第２１図はノーマルの電子顕微鏡写真（倍率：
３万倍、以下同様）、第２２図はデキストラン70
を５％含有するコンドロイチン硫酸ナトリウム眼
球保存液中に５日間保存した角膜内皮の電子顕微
鏡写真、第２３図はデキストラン70を５％含有す
るGPR中に８日間保存した角膜内皮の電子顕微
鏡写真、第２４図は処方例５でえた眼球保存液中
に８日間保存した角膜内皮の電子顕微鏡写真であ
る。第２１図と第２２〜２４図とを比較してわか
るように、コンドロイチン硫酸ナトリウム眼球保
存液中に５日間保存した角膜内皮は細胞内に空胞
化がみられ、またミトコンドリア粗面小胞体の破
片がみられ、内皮細胞の障害の大きいものであつ
た。一方、デキストラン70を５％含有するGPR
中または処方例５でえた眼球保存液中に８日間保
存した角膜内皮は、核や核膜がよく保存され、そ
の中にクロマチンがみられる。また細胞内空隙
（Intercellular space）はよく保存されており、
さらに粗面小胞体およびミトコンドリアもよく保
存されていた。さらにまた内皮細胞とデスメ膜と
の接着も良好であつた。したがつてそれらの保存
液は内皮細胞を殆んど損傷しないものであるとい
える。 以上の試験結果からわかるように、本発明の眼
球保存液はデキストランが添加されたGPRやＭ
−Ｋ・メデイアムと同等またはそれ以上の眼球保
存効果を有するものであつた。なおGPRは前述
した製剤時における問題があり、またＭ−Ｋ・メ
デイアムは60種類以上の成分からなる複雑な組成
を有しているため、コスト高であり、グルタチオ
ンなどの不安定成分が多く配合されているため加
熱無菌化処理ができず、安定性もわるいため、必
要に応じてその都度調合しなければならず、実用
的ではない。さらにＭ−Ｋ・メデイアムは組織培
養液であるため、たとえば10日間の長期にわたつ
て眼球を保存している間に雑菌が繁殖する怖れが
ある。 これに対し、本発明の眼球保存液は製剤化が容
易であり、かつ安定であるため、眼球保存液とし
てきわめてすぐれたものであるといえる。

【図面の簡単な説明】

第１図はノーマルのスペキユラー・マイクロス
コープ写真、第２〜２０図は各種溶液中に３〜12
日間保存した強角膜内皮のそれぞれのスペキユラ
ー・マイクロスコープ写真、第２１図はノーマル
の電子顕微鏡写真、第２２〜２４図はそれぞれコ
ンドロイチン硫酸ナトリウム眼球保存液中に５日
間、デキストラン70を５％含有するGPRに８日
間、処方例５でえた眼球保存液中に８日間保存し
た角膜内皮の電子顕微鏡写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 陽イオンとしてナトリウムイオン、カリウム
   イオン、カルシウムイオンならびにマグネシウム
   イオンおよび陰イオンとして塩素イオン、リン酸
   イオンならびに硫酸イオンを含有し、炭酸水素イ
   オンを含有しない眼球保存液において、 デキストランおよびグルコースが添加されてな
   ることを特徴とする角膜移植用眼球保存液。 ２ クエン酸イオンおよび（または）酢酸イオン
   が添加されている特許請求の範囲第１項記載の眼
   球保存液。 ３ リン酸塩緩衝剤が添加されてPHが6.5〜7.8と
   されている特許請求の範囲第１項または第２項記
   載の眼球保存液。 ４ 前記デキストランが分子量４万〜15万のもの
   であり、その濃度が１〜10％（重量／体積）であ
   る特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記
   載の眼球保存液。 ５ 前記クエン酸イオンおよび（または）酢酸イ
   オンの濃度が0.5〜５ミリモル／である特許請
   求の範囲第２項、第３項または第４項記載の眼球
   保存液。 ６ 浸透圧が270〜350ｍOsMとされている特許
   請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項また
   は第５項記載の眼球保存液。