JPS6356501B2 - - Google Patents
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- JPS6356501B2 JPS6356501B2 JP57053946A JP5394682A JPS6356501B2 JP S6356501 B2 JPS6356501 B2 JP S6356501B2 JP 57053946 A JP57053946 A JP 57053946A JP 5394682 A JP5394682 A JP 5394682A JP S6356501 B2 JPS6356501 B2 JP S6356501B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は言わゆる外因性凝固システムの血液凝
固反応の光学測定用試薬に関する（クイツク試
験）。 凝固生理学的検査は病院、医院及び研究所にお
いて広く使用されている、特に例えば手術前の検
査に、出血又は血栓生成の危険性を知るために、
血栓生成患者の抗凝固治療の監視のために及び多
くの疾患、例えば重い伝染病、肝機能欠陥及び悪
性疾患の経過コントロールの際に使用されてい
る。 最も頻繁に実施される凝固テストは、凝固過程
に関与する多くの成分の機能を同時に測定する全
体的試験である。最も重要な全体的試験としては
言わゆるプロトロンビン−時間試験（クイツク試
験、A.J.Quick著、Am.J.Physiol.第118巻、第
260頁（1937年））及び言わゆる活性化部分トロン
ボプラスチン−時間試験（PTT）である。以後、
“クイツク試験”とは外因性凝固システムの血液
凝固反応の測定を表わす。このシステムは損なわ
れた組識からのトロンボプラスチンの遊離により
開始する。クイツク試験は言わゆる外因性凝固シ
ステムに関与する成分の機能状態に関する情報を
与え、PTT試験は因子XIIの接触活性化により惹
起される内因性凝固システムに関与する成分の機
能状態をもたらす。これら試験の病理学的欠落に
おいては先ずこの欠陥を一定の成分に関係ずける
ことができないことである。このことは引き続く
固々の凝固因子に関する測定により行なわれなけ
ればならず、このためには同様に好適なテストシ
ステムが公知である。 凝固生理学試験の実施の際、通常の測定尺度は
多くの場合凝固時間である。この際、試験を検査
溶液に加えた後、凝固物の形成までに経過する時
間を記録する。公知のテストは、測定すべき凝固
因子の種類に無関係に、結局酵素トロンビンによ
りフイブリノーゲンのフイブリンへの変換が惹起
されるように計画されている。従つて、フイブリ
ノーゲン（可溶性）のフイブリン（不溶性）への
変換は、フイブリノーゲン自体を測定する時以外
は指示反応として利用されている。 凝固開始の測定のためには多くの方法が公知で
ある。凝固配合物中に、凝固物の形成の際にフイ
ブリン繊維をこの溶液から取り出す白金鉤を週期
的に入れるという方法が最もしばしば行なわれ
る。この時点を凝固終点として記録する。記録過
程はストツプウオツチを用いて手で、又は小さな
白金鉤が電極として設計されている時、接点の作
動により電気的に行なわれる。常用の臨床化学分
析において自動化はこのシステムにおいて不可能
である。なぜならば試料の連続的混合は不可能で
あり、凝固物は自動的に洗浄することはできず、
かつこの鉤を分析の間に十分にきれいにすること
はできないからである。 凝固時間の記録のためのもう１つの可能性は、
不溶性フイブリンの形成によりひき起こされる、
凝固形成の際に生じる混濁である。この原理によ
り作動する光学的に記録される凝固メーターが公
知である。しかし、実際にはこの原理には限界が
ある。それというのも多くの血漿は高い自己混濁
を有し、使用試薬も一部自体濁つており、かつ病
理学的実験材料において凝固が、明らかなシグナ
ルが生じない程ゆつくりと行なわれることもある
ためである。 混濁の問題を回避するための最も簡単な可能性
は、より高い希釈度において作業することであろ
う。しかしながら、希釈と同時に凝固試験の反応
時間も著しく長くなり、自動化の利点も長くなつ
た反応時間により再び相殺されてしまうので、希
釈ということは公知の方法において容易に可能で
はない。更に、ある一定以上の希釈から、試料中
に含有されるフイブリノーゲンは、フイブリノー
ゲンからフイブリンへの変換からなる指示反応に
とつてもはや十分ではなくなる。１：10希釈血漿
は、例えば未希釈の血漿に比較してクイツク試験
において約３〜５倍に長い凝固時間を有する。希
釈による凝固時間の延長の程度は定量的に特にビ
ツグス（Biggs）、プロシーデイングス・オブ・
ザ・ロイヤル・ソサイアテイー（Proceedings
of the Royal Society）、英国、第173巻、421〜
441頁（1969年）及びジロラミイー（Girolami）、
ブルート（Blut）、第28巻、第351〜360頁（1974
年）により記載されている。 試料の希釈だけでなく付加的に試薬を希釈する
場合、特に強く反応時間が長くなる（ビツグス参
照）。しかしながら試薬希釈は同様に、混濁問題
を有さない凝固過程の光学的測定にとつての前提
としてみなされている。つまり、凝固診断に使用
される試薬はその機能と直結する自己混濁を有し
ている。クイツク試験の実施のために使用されて
組織トロンボプラスチンは哺乳動物組織、例えば
家兎の脳からの乳状混濁懸濁液である。 希釈媒体中での全体的凝固試験の実施に好適な
方法及び試薬はすでに記載されている。これらの
方法及び試薬は、すでに記載したように希釈の際
に試料のフイブリノーゲン含量がもはや十分でな
いので、指示反応を実施するために、合成色原体
ペプチド基質を使用することに基づく。この際、
合成色原体基質は天然基質、フイブリノーゲンの
代わりである。この光学的シグナルは、光学的に
測定可能なフラグメントを遊離する、トロンビン
による基質の分解の際に生じる（Paulsen等著、
Clinica Chimica Acta第92巻、第465〜468頁
（1979年）、山田等著、Thrombosis Research第
15巻、第351〜358頁（1979年）及びEP−OS第
0014039号明細書参照）。 光学的クイツク試験のための合成基質及びトロ
ンボプラスチンを使用する方法の欠点は、この試
験を実施するための物質すべてを含有する、予め
混合した１−成分−試薬を作ることが不可能であ
るという事である。つまりトロンボプラスチンは
蛋白質融解作用を示し、この作用は基質の分解に
導びき、かつこのことにより、生じたトロンビン
による基質分解が誤差を有する値を示す。更に、
この種の試薬は貯蔵可能ではない。 従つて、本発明の課題は、この問題を解決し、
この試験に実施に必要な物質全部を予め混合して
含有し、貯蔵可能であり、正しい結果を提供する
試薬をつくることである。 このことはトロンボプラスチン、合成トロンビ
ン基質及び緩衝剤を含有する血液凝固反応の光学
的測定（クイツク試験）のための試薬で、蛋白質
融解作用を有さないトロンボプラスチンを含有す
ることを特徴とする試薬により達成される。 本発明による試薬に使用される蛋白質非融解性
トロンボプラスチンは、哺乳動物の脳からアセト
ン乾燥粉末を製造し、アセトン乾燥粉末の中性水
溶液を25〜40℃で恒温保持し、この際生じた不溶
性フラクシヨンを単離し、希塩溶液中に懸濁さ
せ、蟻酸塩の存在下に表面活性剤で処理し、かつ
最後に不溶性の成分を除去した溶液を乾燥させる
ことにより得られる。 哺乳動物の脳からのアセトン乾燥粉末のすべて
の製造はアセトン乾燥粉末製造のために公知の方
法で行なうことができる。好適な方法は例えばビ
ツグス（R.Biggs）著、“ヒユーマン・ブラツ
ド・コアグレイシヨン、ヘモスタシス・アンド・
トロンボシス（Human Blood Coagulation、
Haemostasis and Thrombosis）”、ブラツクウ
エル・サイエンテイフイツク・パブリケイシヨ
ン・オツクスフオード（Blachwell Scientific
Publication Oxford）、1976年、第663頁に記載
されている。 このアセトン乾燥粉末を中性水溶液に懸濁さ
せ、撹拌下に記載した温度で恒温保持する、35〜
40℃の間の温度が有利である。この条件下にこの
恒温保持を約30分間続ける。この際PH値は6.0〜
8.0、有利に6.7〜7.3であつてよい。好適な緩衝剤
によりPH値を一定に保つのが有利である。不溶性
のフラクシヨンを遠心分離により、例えば2500ｇ
で分離する。遠心分離の際に得られた沈澱を新た
に希塩溶液中に懸濁させ、有利にコール酸グルー
プの界面活性剤を用いて蟻酸塩の存在下に処理す
る。塩溶液のためには食塩が有利である。好適な
濃度は0.2〜２の間、有利に0.5〜１％である。界
面活性剤の濃度は有利に0.01〜0.2％の間であり、
特に有利なコレートを使用する時はそうである。
しかしながら、他の界面活性剤を使用することも
できる。 蟻酸塩としてはアルカリ金属蟻酸塩及びアルカ
リ土類金属蟻酸塩が先ず考慮される。特に有利で
あるのは蟻酸カルシウムである。濃度は有利に
0.005〜0.05モル／の間である。この処理は同
様に25〜40℃の間の温度範囲で実施され、時間は
乾燥粉末の恒温保持の時間に相当する。最後に、
例えば2500×ｇで遠心分離し、得られたもはや蛋
白質融解作用を有さないトロンボプラスチンの懸
濁液を、場合により本発明による試薬の他の成分
をあらかじめ添加した後凍結乾燥させる。しかし
ながら、この試薬は固体乾燥物質から所望の量比
で混合してもよい。 合成トロンビン基質としては原則的にすべての
公知の合成トロンビン基質を使用することができ
る。多くのこの種のトロンビン基質は市販のもの
である。基質Tos−Gly−Pro−Arg−pNA並び
に記号Ｓ−2238で売られているＨ−Ｄ−Phe−
Pip−Arg−pNAが有利である。これらの基質は
酵素による分解の際に、容易に光学的に定量する
ことのできる着色分解生成物を提供する。 本発明による試薬は例１に記載するような活性
を有するトロンボプラスチンを３〜20容量％、有
利に６〜10容量％の濃度で含有する。合成トロン
ビン基質を２×10-5〜20×10-5モル／の量で、
並びに緩衝剤PH7.2〜8.5を含有する。緩衝剤の濃
度は0.05〜0.25モル／の間である。原則的には
記載されたPH範囲で作用するすべての緩衝剤が好
適であるが、特に有利であるのはトリス緩衝剤で
ある。最適な結果は緩衝剤PH8.1 0.1モル／で
得られる。特に有利な基質濃度は約５×10-5モ
ル／である。 本発明による試薬は更にCa塩を、前記のもの
と同様、それぞれ完成試薬溶液に関して、２〜10
ミリモル／の濃度で含有する。 Ca−塩としてすべて水易溶性Ca−塩、例えば
ハロゲン化物、アセテート等が好適である。塩化
カルシウムは有利である。 有利にこの試薬は更に尿素0.5〜３重量％含有
する。1.4〜1.6重量％が特に有利である。 前記組成における本発明による試薬は調整済溶
液の形で希釈システムを表わすが、この反応時間
は公知の未希釈システムでの試験に対し僅かに長
くなるにすぎない。この測定は通常の血漿におい
ては約30秒であり、経口抗凝固剤を用いる血栓生
成予防を行なつている人の血漿においては約60〜
120秒である。前記欠点を有する公知の未希釈ク
イツク試験において通常の血漿での相応する時間
は約15秒、前記のような病理学的血漿では約30〜
60秒である。これに対して公知の、希釈に関して
本発明による試薬と比較可能なテストは約５倍の
反応時間を必要とする。 本発明による試薬は与えられた波長で一定の吸
収が達成されるまでの時間を測定するというよう
に利用するのが有利である。しかしながら動力学
的に評価することも可能であり、この際、評価の
較正曲線を基礎とするのが有利である。合成基質
を基礎とする公知光学的クイツク試験に対し著し
く短かくなつた測定時間は生理学的な範囲以外に
存在するイオン強度及びPH−値及びKMより下に
ある基質濃度の共同の作用に起因する。 次に実施例につき本発明をより詳細に説明す
る： 例 １ Ａ 蛋白質融解性を有さないトロンボプラスチン
の製造： 新らしく得られた家兎の脳からR.Biggs
“Human Blood Coagulation、Haemostatis
and Thrombosis”Blackwell Scientific
Publications、オツクスフオード、1976年、第
663頁の方法によりアセトン処理を行ない乾燥
粉末を製造し、恒量まで乾燥させた。 前記粉末2.5ｇを0.1モル／酢酸ナトリウム
緩衝剤、PH７、50ml中に懸濁させ、30分間37℃
で撹拌する。その後、15分間2500ｇで遠心分離
し、沈殿を0.05％デスオキシコール酸ナトリウ
ムを含有し、蟻酸カルシウム0.0125モル／で
ある、0.7％NaCl溶液50ml中で沈殿を新たに30
分間７℃で撹拌する。次いで2500ｇで15分間遠
心分離する。 この上澄液は蛋白質融解活性を有さないトロ
ンボプラスチンを含有する。 トロンボプラスチン懸濁液の活性はクイツク
試験を用いて、DIN58910により実施して測定
する。DIN58910により製造した正規の標準血
漿は12±２秒の凝固時間を示した。 Ｂ 光学的クイツク試験を実施するための試薬混
合物の製造： 溶液１：0.1モルトリス／HCl、PH8.1、２％
グリシン含有 溶液２：Tos−Gly−Pro−Arg−pNA−ア
セテートの水溶液497mg／dl 溶液３：Ａにより製造したトロンボプラスチ
ン懸濁液。 溶液１ 10容量部を溶液３ ４容量部及び溶
液２ １容量部と混合し、３ml分割量で凍結乾
燥させる。 例 ２ 光学的クイツク試験の実施： 試験の実施のために例1Bによる凍結乾燥物３
mlを付加的に尿素1.5％及びCaCl26ミリモル／
を含有するトリス／HCl−緩衝剤、PH8.1、30ml
中に溶かす。反応混合物を37℃とする。測光器評
価：測定温度37℃、波長405nm。 それぞれ試料50μ（クエン酸血漿もしくは生
理NaCl溶液中のクエン酸血漿の希釈物）を装入
し、この反応を反応混合物750μを用いて開始
する。同時に記録計（10cm／分）を作動させる。 順次、未希釈の、もしくは１：２、１：４及び
１：10で前希釈した血漿を使用する時、添付図面
の第１図に示した曲線が得られる。 例 ３ 例２により得られた曲線から、開始吸光に対し
約30mE高い吸光を達成するまでの時間を読みと
る。この時間を逆の血漿希釈に対して記載する。
直線が得られる。前記の30mEの吸光は広い範
囲、例えば10〜150mEで変えることができる。
常に直線が得られる。 例 ４ 例２と同様にして、経口血液凝固治療下にある
患者の血漿60個の未希釈で試験し、出発値に対し
約30mEまでが達せられるまでの時間を記録す
る。この同じ血漿を従来のクイツク試験を用いて
てシユニツトカー及びグロス（Schnitker、
Gross）による凝固メーターの使用下に試験し、
凝固時間を記録する。両方のシステムで得られた
データを直線回帰分析を行なう。相関係数ｒ＝
0.96が得られた。 例 ５ 例1Aにより製造した蛋白質非融解性トロンボ
プラスチン並びに市販のトロンボプラスチン（ト
ロンボプラスチンa.ベーリンガ−マンハイム）を
使用して例1Bと相応して反応混合物を製造する。
この反応混合物をトリス／HCl−緩衝剤、PH8.1
で例２と同様に希釈し完成反応混合とし、これを
室温（約20℃）で貯蔵する。一定の時間後、反応
混合物の自己吸光を405nmで測定する。この結果
を第２表に示す。市販のトロンボプラスチンにお
いて、添加した色原体ペプチド基質の分解に起因
する迅速な吸光上昇がみられる。 【表】
固反応の光学測定用試薬に関する（クイツク試
験）。 凝固生理学的検査は病院、医院及び研究所にお
いて広く使用されている、特に例えば手術前の検
査に、出血又は血栓生成の危険性を知るために、
血栓生成患者の抗凝固治療の監視のために及び多
くの疾患、例えば重い伝染病、肝機能欠陥及び悪
性疾患の経過コントロールの際に使用されてい
る。 最も頻繁に実施される凝固テストは、凝固過程
に関与する多くの成分の機能を同時に測定する全
体的試験である。最も重要な全体的試験としては
言わゆるプロトロンビン−時間試験（クイツク試
験、A.J.Quick著、Am.J.Physiol.第118巻、第
260頁（1937年））及び言わゆる活性化部分トロン
ボプラスチン−時間試験（PTT）である。以後、
“クイツク試験”とは外因性凝固システムの血液
凝固反応の測定を表わす。このシステムは損なわ
れた組識からのトロンボプラスチンの遊離により
開始する。クイツク試験は言わゆる外因性凝固シ
ステムに関与する成分の機能状態に関する情報を
与え、PTT試験は因子XIIの接触活性化により惹
起される内因性凝固システムに関与する成分の機
能状態をもたらす。これら試験の病理学的欠落に
おいては先ずこの欠陥を一定の成分に関係ずける
ことができないことである。このことは引き続く
固々の凝固因子に関する測定により行なわれなけ
ればならず、このためには同様に好適なテストシ
ステムが公知である。 凝固生理学試験の実施の際、通常の測定尺度は
多くの場合凝固時間である。この際、試験を検査
溶液に加えた後、凝固物の形成までに経過する時
間を記録する。公知のテストは、測定すべき凝固
因子の種類に無関係に、結局酵素トロンビンによ
りフイブリノーゲンのフイブリンへの変換が惹起
されるように計画されている。従つて、フイブリ
ノーゲン（可溶性）のフイブリン（不溶性）への
変換は、フイブリノーゲン自体を測定する時以外
は指示反応として利用されている。 凝固開始の測定のためには多くの方法が公知で
ある。凝固配合物中に、凝固物の形成の際にフイ
ブリン繊維をこの溶液から取り出す白金鉤を週期
的に入れるという方法が最もしばしば行なわれ
る。この時点を凝固終点として記録する。記録過
程はストツプウオツチを用いて手で、又は小さな
白金鉤が電極として設計されている時、接点の作
動により電気的に行なわれる。常用の臨床化学分
析において自動化はこのシステムにおいて不可能
である。なぜならば試料の連続的混合は不可能で
あり、凝固物は自動的に洗浄することはできず、
かつこの鉤を分析の間に十分にきれいにすること
はできないからである。 凝固時間の記録のためのもう１つの可能性は、
不溶性フイブリンの形成によりひき起こされる、
凝固形成の際に生じる混濁である。この原理によ
り作動する光学的に記録される凝固メーターが公
知である。しかし、実際にはこの原理には限界が
ある。それというのも多くの血漿は高い自己混濁
を有し、使用試薬も一部自体濁つており、かつ病
理学的実験材料において凝固が、明らかなシグナ
ルが生じない程ゆつくりと行なわれることもある
ためである。 混濁の問題を回避するための最も簡単な可能性
は、より高い希釈度において作業することであろ
う。しかしながら、希釈と同時に凝固試験の反応
時間も著しく長くなり、自動化の利点も長くなつ
た反応時間により再び相殺されてしまうので、希
釈ということは公知の方法において容易に可能で
はない。更に、ある一定以上の希釈から、試料中
に含有されるフイブリノーゲンは、フイブリノー
ゲンからフイブリンへの変換からなる指示反応に
とつてもはや十分ではなくなる。１：10希釈血漿
は、例えば未希釈の血漿に比較してクイツク試験
において約３〜５倍に長い凝固時間を有する。希
釈による凝固時間の延長の程度は定量的に特にビ
ツグス（Biggs）、プロシーデイングス・オブ・
ザ・ロイヤル・ソサイアテイー（Proceedings
of the Royal Society）、英国、第173巻、421〜
441頁（1969年）及びジロラミイー（Girolami）、
ブルート（Blut）、第28巻、第351〜360頁（1974
年）により記載されている。 試料の希釈だけでなく付加的に試薬を希釈する
場合、特に強く反応時間が長くなる（ビツグス参
照）。しかしながら試薬希釈は同様に、混濁問題
を有さない凝固過程の光学的測定にとつての前提
としてみなされている。つまり、凝固診断に使用
される試薬はその機能と直結する自己混濁を有し
ている。クイツク試験の実施のために使用されて
組織トロンボプラスチンは哺乳動物組織、例えば
家兎の脳からの乳状混濁懸濁液である。 希釈媒体中での全体的凝固試験の実施に好適な
方法及び試薬はすでに記載されている。これらの
方法及び試薬は、すでに記載したように希釈の際
に試料のフイブリノーゲン含量がもはや十分でな
いので、指示反応を実施するために、合成色原体
ペプチド基質を使用することに基づく。この際、
合成色原体基質は天然基質、フイブリノーゲンの
代わりである。この光学的シグナルは、光学的に
測定可能なフラグメントを遊離する、トロンビン
による基質の分解の際に生じる（Paulsen等著、
Clinica Chimica Acta第92巻、第465〜468頁
（1979年）、山田等著、Thrombosis Research第
15巻、第351〜358頁（1979年）及びEP−OS第
0014039号明細書参照）。 光学的クイツク試験のための合成基質及びトロ
ンボプラスチンを使用する方法の欠点は、この試
験を実施するための物質すべてを含有する、予め
混合した１−成分−試薬を作ることが不可能であ
るという事である。つまりトロンボプラスチンは
蛋白質融解作用を示し、この作用は基質の分解に
導びき、かつこのことにより、生じたトロンビン
による基質分解が誤差を有する値を示す。更に、
この種の試薬は貯蔵可能ではない。 従つて、本発明の課題は、この問題を解決し、
この試験に実施に必要な物質全部を予め混合して
含有し、貯蔵可能であり、正しい結果を提供する
試薬をつくることである。 このことはトロンボプラスチン、合成トロンビ
ン基質及び緩衝剤を含有する血液凝固反応の光学
的測定（クイツク試験）のための試薬で、蛋白質
融解作用を有さないトロンボプラスチンを含有す
ることを特徴とする試薬により達成される。 本発明による試薬に使用される蛋白質非融解性
トロンボプラスチンは、哺乳動物の脳からアセト
ン乾燥粉末を製造し、アセトン乾燥粉末の中性水
溶液を25〜40℃で恒温保持し、この際生じた不溶
性フラクシヨンを単離し、希塩溶液中に懸濁さ
せ、蟻酸塩の存在下に表面活性剤で処理し、かつ
最後に不溶性の成分を除去した溶液を乾燥させる
ことにより得られる。 哺乳動物の脳からのアセトン乾燥粉末のすべて
の製造はアセトン乾燥粉末製造のために公知の方
法で行なうことができる。好適な方法は例えばビ
ツグス（R.Biggs）著、“ヒユーマン・ブラツ
ド・コアグレイシヨン、ヘモスタシス・アンド・
トロンボシス（Human Blood Coagulation、
Haemostasis and Thrombosis）”、ブラツクウ
エル・サイエンテイフイツク・パブリケイシヨ
ン・オツクスフオード（Blachwell Scientific
Publication Oxford）、1976年、第663頁に記載
されている。 このアセトン乾燥粉末を中性水溶液に懸濁さ
せ、撹拌下に記載した温度で恒温保持する、35〜
40℃の間の温度が有利である。この条件下にこの
恒温保持を約30分間続ける。この際PH値は6.0〜
8.0、有利に6.7〜7.3であつてよい。好適な緩衝剤
によりPH値を一定に保つのが有利である。不溶性
のフラクシヨンを遠心分離により、例えば2500ｇ
で分離する。遠心分離の際に得られた沈澱を新た
に希塩溶液中に懸濁させ、有利にコール酸グルー
プの界面活性剤を用いて蟻酸塩の存在下に処理す
る。塩溶液のためには食塩が有利である。好適な
濃度は0.2〜２の間、有利に0.5〜１％である。界
面活性剤の濃度は有利に0.01〜0.2％の間であり、
特に有利なコレートを使用する時はそうである。
しかしながら、他の界面活性剤を使用することも
できる。 蟻酸塩としてはアルカリ金属蟻酸塩及びアルカ
リ土類金属蟻酸塩が先ず考慮される。特に有利で
あるのは蟻酸カルシウムである。濃度は有利に
0.005〜0.05モル／の間である。この処理は同
様に25〜40℃の間の温度範囲で実施され、時間は
乾燥粉末の恒温保持の時間に相当する。最後に、
例えば2500×ｇで遠心分離し、得られたもはや蛋
白質融解作用を有さないトロンボプラスチンの懸
濁液を、場合により本発明による試薬の他の成分
をあらかじめ添加した後凍結乾燥させる。しかし
ながら、この試薬は固体乾燥物質から所望の量比
で混合してもよい。 合成トロンビン基質としては原則的にすべての
公知の合成トロンビン基質を使用することができ
る。多くのこの種のトロンビン基質は市販のもの
である。基質Tos−Gly−Pro−Arg−pNA並び
に記号Ｓ−2238で売られているＨ−Ｄ−Phe−
Pip−Arg−pNAが有利である。これらの基質は
酵素による分解の際に、容易に光学的に定量する
ことのできる着色分解生成物を提供する。 本発明による試薬は例１に記載するような活性
を有するトロンボプラスチンを３〜20容量％、有
利に６〜10容量％の濃度で含有する。合成トロン
ビン基質を２×10-5〜20×10-5モル／の量で、
並びに緩衝剤PH7.2〜8.5を含有する。緩衝剤の濃
度は0.05〜0.25モル／の間である。原則的には
記載されたPH範囲で作用するすべての緩衝剤が好
適であるが、特に有利であるのはトリス緩衝剤で
ある。最適な結果は緩衝剤PH8.1 0.1モル／で
得られる。特に有利な基質濃度は約５×10-5モ
ル／である。 本発明による試薬は更にCa塩を、前記のもの
と同様、それぞれ完成試薬溶液に関して、２〜10
ミリモル／の濃度で含有する。 Ca−塩としてすべて水易溶性Ca−塩、例えば
ハロゲン化物、アセテート等が好適である。塩化
カルシウムは有利である。 有利にこの試薬は更に尿素0.5〜３重量％含有
する。1.4〜1.6重量％が特に有利である。 前記組成における本発明による試薬は調整済溶
液の形で希釈システムを表わすが、この反応時間
は公知の未希釈システムでの試験に対し僅かに長
くなるにすぎない。この測定は通常の血漿におい
ては約30秒であり、経口抗凝固剤を用いる血栓生
成予防を行なつている人の血漿においては約60〜
120秒である。前記欠点を有する公知の未希釈ク
イツク試験において通常の血漿での相応する時間
は約15秒、前記のような病理学的血漿では約30〜
60秒である。これに対して公知の、希釈に関して
本発明による試薬と比較可能なテストは約５倍の
反応時間を必要とする。 本発明による試薬は与えられた波長で一定の吸
収が達成されるまでの時間を測定するというよう
に利用するのが有利である。しかしながら動力学
的に評価することも可能であり、この際、評価の
較正曲線を基礎とするのが有利である。合成基質
を基礎とする公知光学的クイツク試験に対し著し
く短かくなつた測定時間は生理学的な範囲以外に
存在するイオン強度及びPH−値及びKMより下に
ある基質濃度の共同の作用に起因する。 次に実施例につき本発明をより詳細に説明す
る： 例 １ Ａ 蛋白質融解性を有さないトロンボプラスチン
の製造： 新らしく得られた家兎の脳からR.Biggs
“Human Blood Coagulation、Haemostatis
and Thrombosis”Blackwell Scientific
Publications、オツクスフオード、1976年、第
663頁の方法によりアセトン処理を行ない乾燥
粉末を製造し、恒量まで乾燥させた。 前記粉末2.5ｇを0.1モル／酢酸ナトリウム
緩衝剤、PH７、50ml中に懸濁させ、30分間37℃
で撹拌する。その後、15分間2500ｇで遠心分離
し、沈殿を0.05％デスオキシコール酸ナトリウ
ムを含有し、蟻酸カルシウム0.0125モル／で
ある、0.7％NaCl溶液50ml中で沈殿を新たに30
分間７℃で撹拌する。次いで2500ｇで15分間遠
心分離する。 この上澄液は蛋白質融解活性を有さないトロ
ンボプラスチンを含有する。 トロンボプラスチン懸濁液の活性はクイツク
試験を用いて、DIN58910により実施して測定
する。DIN58910により製造した正規の標準血
漿は12±２秒の凝固時間を示した。 Ｂ 光学的クイツク試験を実施するための試薬混
合物の製造： 溶液１：0.1モルトリス／HCl、PH8.1、２％
グリシン含有 溶液２：Tos−Gly−Pro−Arg−pNA−ア
セテートの水溶液497mg／dl 溶液３：Ａにより製造したトロンボプラスチ
ン懸濁液。 溶液１ 10容量部を溶液３ ４容量部及び溶
液２ １容量部と混合し、３ml分割量で凍結乾
燥させる。 例 ２ 光学的クイツク試験の実施： 試験の実施のために例1Bによる凍結乾燥物３
mlを付加的に尿素1.5％及びCaCl26ミリモル／
を含有するトリス／HCl−緩衝剤、PH8.1、30ml
中に溶かす。反応混合物を37℃とする。測光器評
価：測定温度37℃、波長405nm。 それぞれ試料50μ（クエン酸血漿もしくは生
理NaCl溶液中のクエン酸血漿の希釈物）を装入
し、この反応を反応混合物750μを用いて開始
する。同時に記録計（10cm／分）を作動させる。 順次、未希釈の、もしくは１：２、１：４及び
１：10で前希釈した血漿を使用する時、添付図面
の第１図に示した曲線が得られる。 例 ３ 例２により得られた曲線から、開始吸光に対し
約30mE高い吸光を達成するまでの時間を読みと
る。この時間を逆の血漿希釈に対して記載する。
直線が得られる。前記の30mEの吸光は広い範
囲、例えば10〜150mEで変えることができる。
常に直線が得られる。 例 ４ 例２と同様にして、経口血液凝固治療下にある
患者の血漿60個の未希釈で試験し、出発値に対し
約30mEまでが達せられるまでの時間を記録す
る。この同じ血漿を従来のクイツク試験を用いて
てシユニツトカー及びグロス（Schnitker、
Gross）による凝固メーターの使用下に試験し、
凝固時間を記録する。両方のシステムで得られた
データを直線回帰分析を行なう。相関係数ｒ＝
0.96が得られた。 例 ５ 例1Aにより製造した蛋白質非融解性トロンボ
プラスチン並びに市販のトロンボプラスチン（ト
ロンボプラスチンa.ベーリンガ−マンハイム）を
使用して例1Bと相応して反応混合物を製造する。
この反応混合物をトリス／HCl−緩衝剤、PH8.1
で例２と同様に希釈し完成反応混合とし、これを
室温（約20℃）で貯蔵する。一定の時間後、反応
混合物の自己吸光を405nmで測定する。この結果
を第２表に示す。市販のトロンボプラスチンにお
いて、添加した色原体ペプチド基質の分解に起因
する迅速な吸光上昇がみられる。 【表】
本発明による試料を用いて、種々の希釈の血漿
の光学的クイツクテストを行ない、吸光度と時間
の関係を示した図である。
の光学的クイツクテストを行ない、吸光度と時間
の関係を示した図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ トロンボプラスチン、合成トロンビン基質及
び緩衝剤を含有する血液凝固反応の光学測定（ク
イツク試験）用試薬において、哺乳動物の脳から
のアセトン乾燥粉末を製造し、このアセトン乾燥
粉末の中性水溶液を25〜40℃で恒温保持し、不溶
性フラクシヨンを取り出し、希塩溶液中のこのフ
ラクシヨンの懸濁液を界面活性剤を用いて蟻酸塩
の存在下に処理し、分離した溶解性フラクシヨン
を乾燥させることにより得られる蛋白質非融解性
トロンボプラスチンを３〜20容量％の濃度で含有
し、合成トロンビン基質２×10-5〜20×10-5モ
ル／、緩衝剤、PH7.2〜8.5、0.05〜0.25モル／
及び可溶性Ca塩２〜10ミリモル／を含有す
ることを特徴とする血液凝固反応の光学測定用試
薬。 ２ トリス緩衝剤を含有する特許請求の範囲第１
項記載の試薬。 ３ トロンボプラスチン、合成トロンビン基質及
び緩衝剤を含有する血液凝固反応の光学測定（ク
イツク試験）用試薬において、哺乳動物の脳から
のアセトン乾燥粉末を製造し、このアセトン乾燥
粉末の中性水溶液を25〜40℃で恒温保持し、不溶
性フラクシヨンを取り出し、希塩溶液中のこのフ
ラクシヨンの懸濁液を界面活性剤を用いて蟻酸塩
の存在下に処理し、分離した溶解性フラクシヨン
を乾燥させることにより得られる蛋白質非融解性
トロンボプラスチンを３〜20容量％の濃度で含有
し、合成トロンビン基質２×10-5〜20×10-5モ
ル／、緩衝剤、PH7.2〜8.5、0.05〜0.25モル／
、可溶性Ca塩２〜10ミリモル／及び尿素0.5
〜３％を含有することを特徴とする血液凝固反応
の光学測定用試薬。 ４ トリス緩衝剤を含有する特許請求の範囲第３
項記載の試薬。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57178161A JPS57178161A (en) | 1982-11-02 |
| JPS6356501B2 true JPS6356501B2 (ja) | 1988-11-08 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0062310B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57178161A (ja) |
| AT (1) | ATE16944T1 (ja) |
| CA (1) | CA1198660A (ja) |
| DD (1) | DD202347A5 (ja) |
| DE (2) | DE3113350A1 (ja) |
| DK (1) | DK157939C (ja) |
| ES (1) | ES510226A0 (ja) |
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