JPS6359890A - 酵素固定膜とその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医療産業、食品産業及びこれらに関連する各
種産業分野で利用される生化学物質、食品成分等の簡易
分析計、試験器等の感応部分に用いられる酵素固定膜と
その製造法に関するものである。

〔従来の技術とその問題点〕

酵素は各種生体中で生合成される水溶性の、蛋白触媒で
あり、常温常圧中性付近のｐＨ等の反応条件のもとで、
その酵素蛋白の三次元構造と親和性を有する特定の化学
物質に対して選択的な化学変化を促進する性質がある。

この反応性を利用した分析技術は酵素分析法としてすで
に体系化され、臨床化学検査、食品分析等に広く利用さ
れている。酵素は生体組織中に各種のものが複合的に存
在しあるいは生体から分泌されるが、これを分析試薬に
利用するさいには共存物質を分離除去し、単一酵素に精
製する必要がある。ところが、酵素精製工程はきわめて
複雑で高度の技術を要し、回収率も一般に低いことから
分析用酵素剤は、甚だ高価となることが実用上の問題点
である。

従来の酵素分析法では、酵素剤は使い捨てにされていた
が、酵素の経済的利用をはかるために最近開発された方
法が、酵素固定膜及び微生物膜を用いるバイオセンサ法
である（鈴木周−編＝「イオン電極」、３、酵素電極の
展開６５頁より、１９８１年１１月１日、講談社発行参
照）このバイオセンサ法は上記文献に詳記されているよ
うに、水溶性蛋白質の酵素を、水に不溶な物質上に吸着
したりあるいはその中に包括したりして、実質的に水に
不溶にしたものを、酸素電極やイオン電極と組み合せて
用いるものである。

このように酵素を固定化して用いれば、高価な酵素を使
い捨てにしないで繰り返して使用できる上、反応の結果
も電気化学センサにより迅速に検知することができる利
点があるため、上記文献の６９真〜７７頁に掲載の表３
・ｌに示されたように、多数の酵素電極が提案されてい
るがこれを組み立てる上で特に重要な材料は酵素固定膜
である。

酵素固定膜の調製には、前記文献の図３．１に図解され
ているように共有結合法、架橋化法等の化学的方法や、
包括法、吸着法等の物理的方法が種々提案されている。

共有結合法は、合成高分子あるいは天然高分子膜に共有
結合で酵素を固定化するもので、ペプチド法、アルキル
化法、ジアゾ法等があり、比較的活性が高い標品が得ら
れ、酵素の溶失がなく、安定性に優れたものを得られる
長所がある反面、固定化に用いる試薬によっては酵素の
不活性化がしばしば起こりやすく、調製法が比較的複雑
な短所も指摘されている。

架橋法はグルタルアルデヒド等の多官能性の架橋試薬を
用いて酵素を相互に架橋化して、膜状に成形する方法で
あり、調製が極めて簡便であるといわれているが、実際
にはかなり厳密なｐＨ１架橋剤濃度の調整が必要である
とか、多量の酵素と補蛋白を必要とし、化学修飾により
酵素の不活性化が起こることもある等の短所がある。

また、イオン交換樹脂、アセチルセルロース膜。

コロジオン膜、コラーゲン膜、ポリ塩化ビニール膜等に
酵素を吸着固定化する吸着法があるが、吸着率に限界が
あるため酵素の損失があり、また−旦吸着した酵素の脱
離が起こりやすい欠点がある。

以上の諸法の外に、ポリアクリルアミドゲル。

コラーゲン膜中に酵素分子を包括する方法がある。

これらの包括法は物理的方法であるので、酸素の化学修
飾が起こらず酵素の質変があまりない利点があるが、酵
素の溶出がおこりやすく、また低分子の基質にしか用い
られないというような問題点が指摘される。

この外に光重合法を用いるプレポリマー法があるが酵素
が光により失活するという問題がある。

以上のように、酵素固定膜の製法には各種各様の提案が
あるが、物理的固定化法では酵素の脱離流出が起きやす
く、長期間酵素活性を一定に保ちにくいという難点があ
る。また化学的方法は一般に製膜操作が煩雑で、酵素の
化学修飾による失活が生じやすい等の問題点があり、理
想的方法は未だなく、簡単で確実に高活性の酵素膜を得
る方法が切望されている。

〔発明の目的〕

本発明は酵素が失活しに（＜、高活性の酵素固定膜と、
それを迅速容易に製造することができる方法を提案し、
バイオセンサ式分析の普及を図ることを目的とするもの
である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は上記の目的を達成するためＧこなされたもので
、第１の発明は、酵素に対し物理化学的に親和性を有す
る　　アミノ酸共重合体を酵素の坦体（支持膜）として
用いたことを特徴とする酵素固定膜にか＼るもので、そ
のま＼又は酸素電極に張設された公知の多孔質テフロン
膜上に密着させて使うものである。

第２の発明は、前記第１の発明にか＼る酵素固定膜に気
体透過性の重合体から成る補強膜を裏打ちして、通常、
従来使用されている多孔質テフロン膜を使用せず、酸素
電極に直に装着して使用するａ４素固定膜に関するもの
である。

また第３及び第４の発明は、第１及び第２の発明にか＼
る酵素固定膜の製造法に関するもので、第３の発明は、
　　アミノ酸から成るポリマー溶液に酵素を分散させて
調製したものを回転板の中心部に滴下して遠心力により
薄膜を形成させ、それを乾燥固化させることによって酵
素固定膜を得るという製造法である。

また第４の発明は、第３の発明によって得られた酵素固
定膜に気体透過性のある補強膜を一体に形成させた耐久
力のある酵素固定膜を得るという製造法である。

更に詳しく本発明を説明すれば、本発明における酵素固
定化材としては、　　アミノ酸の共重合体溶液が用いら
れる。

アミノ酸共重合体は各種のものが用いられるが、とくに
好適なものは、ヘリックス構造を有し、気体透過性の高
い、Ｌ−ロイシン（以下ＬＬ台 と略記）と側鎖構造に親水性基を有するＮ−カルボヘン
ゾキシーＬ−リジン（以下Ｚ−Ｌｙｓと略記）から成る
α−アミノ酸共重合体である。

溶媒としてはベンゼン、ジオキサン等が、また重合開始
材にはトリエチルアミン等が用いられる。

次に上記のα−アミノ酸の共重合体溶液は酵素剤を混合
して基液を作るが、その配合割合は任意に加減できる。

酵素剤は粉末状が好ましいが、液状のものも使用できる
。

上記混合物から成る基液を第１図に示すようなスピンナ
ーの回転盤１上に吸着させたガラス板等からなる基板２
の回転中心部に滴下し、遠心力によって厚さ１μ程度の
薄膜３を形成する。なお４は酵素粒子、６は真空ポンプ
に接続された基板吸着用排気管である。

こ＼では、遠心力を利用した製膜法をスピンキャスト法
と呼略称することにする。

スピンナーの回転は最初は遅くしておき、その後−気に
速くして溶媒を飛ばすことにより酵素を効率良く固定化
できる。

薄膜３は薄いので、補強を必要とする時は、スピンキャ
スト法により同じ要領で薄膜３上に補強膜５を一体に形
成する。

補強膜材料としては気体透過性が高い重合体（４−メチ
ルペンテン−１）（以下ＰＭＰと略記）。

“　　あるいは重合体（１−（１−リメチルシリル）−
１−プロピレン〕　（以下ＰＭＳＰと略記）等が好適で
ある。

これらの補強膜用高分子材料はスピンキャスト法で製膜
でき、丈夫であり、気体透過性がきわめてすぐれている
特長を有する。

したがって、補強膜も同様な製膜法で酵素固定化材３上
に重畳して形成することができる。

これにより補強膜５で裏打ちされた酵素固定膜を得るこ
とができる。

製膜時間は３０秒〜１分程度であり、従来法の多くが数
時間を要したのに比しきわめて短時間に製膜できるので
酵素の失活も避けられる。

本発明の特長、利点を列挙すれば次の通りである。

（１）迅速容易に均一な厚みの薄膜ができる。

（２）薄膜３の化学的組成は酵素４の化学的組成に酷似
したアミノ酸共重合体であるため、酵素を変性失活させ
ることがない。

（３）　　きわめて高密度に酵素を固定化できる。した
がって感度のすぐれた酸素固定膜が得られる。

（４）補強膜５はポリフッ化エチレン以上の問い酸素透
過性を有する非多孔性膜であるため、従来のように多孔
質テフロン膜（隔膜）を使用しなくとも酸素電極に直接
装着して使用でき、多孔質テフロン膜を使用したものよ
りも応答がきわめて速いものが得られる。

〔実施例〕

ＬＬとＺ−ＬＶＳの共重合体（それぞれのアミノ酸酸無
水物のモル比を７：３として合成したもの）をベンゼン
−ジオキサンの等量混合液に溶解したちの２０ｇにグル
コース定量用酵素〔東京化成工業株式会社製グルコース
オキシダーゼ（Ｇ。

Ｄ＞１３．３車位／■の活性を有するもの〕　５０■を
加え、攪拌して充分分散させる。

この溶液３ｍｎを採り、第１図に示すようにスピンナー
の回転盤１上に吸着させたガラス板２の回転中心部に滴
下した後、直ちに５００　ｒ、ｐ、ｍの速度で２０秒間
回転させて均一な厚さの酵素固定膜を形成させ、次いで
ガラス板２と共に真空デシケータに移して数時間乾燥す
る。

次いで薄い酵素固定膜３を補強するため、再び、スピン
ナーの回転盤の回転中心上にこの酵素固定膜を付着した
ままのガラス板２を吸着させ、ＰＭＰ溶液あるいはＰＭ
ＳＰ溶液の３〜Ｉを酵素固定膜３上に滴下して、再び５
００ｒ、ｐ、ｍで２０秒間回転させる操作を数度操り返
えして第１図に示すような補強した複合酵素固定膜を作
った。

なお、製膜はすべて２０〜２５℃のエアーフィルター下
で行った。

膜の表面および断面を走査電顕写真により観察したとこ
ろ、酵素固定膜厚さ約１μ、補強膜厚さ約１５μの均一
な複合膜が形成されたことが確認された。なお酵素粒子
は、その一部が薄膜に埋没し、一部が露出した状態で固
定され、この状態で均一に分散固定されていることが分
った。

このようにして得た複合酵素固定膜を薄膜３側を試料側
に向けて公知のガルバニ電池式酸素センサの酸素電極に
装着した後、グルコース溶液中に浸漬し、 反応に伴う酸素還元電流の変化（減少）を、市販のグル
コース定量用酵素固定膜と比較した結果は第２図に示す
通りであった。図中７は市販品、８゜９は本発明による
複合酵素固定膜を使用した場合を示すものである。

なお市販品８は、酵素を固定した光硬化アクリル酸誘導
体膜を透孔の大きさが０．６５μの公知の多孔質テフロ
ン隔膜に密着させてものであり、８は補強膜材としてＰ
ＭＰを使用し、薄膜３と補強膜５の厚さを夫々１μｍと
３９μｍとしたものであり、９は補強膜材としてＰＭＳ
Ｐを使用し、薄膜３と補強膜５の厚さを夫々１μｍと１
５μｍとしたものである。

第２図かられかるように本発明の酵素固定膜を用いた場
合は市販の酵素固定膜よりも電流減少中が大きく、つま
り高感度であって応答も速いことが分った、そしてＰ　
Ｍ　Ｓ　Ｐ補強膜を施した酵素固定膜の場合（９の場合
）は特に高感度であった。

因に、これらの薄膜と補強膜の酸素透過係数Ｐ（ｃ、、
ｃ　０ｚ（Ｓ　Ｔ　Ｐ）　°ｃｍ／ｃｍ２°ｓｅｃ　°
ｃｍＨｇ〕を合葉等（Ｉｎｄ　、Ｅｎｇ　、Ｃｈｅｍ　
、Ｆｕｎｄａｍ　、Ｖｏｌ　７＋　４９７（１９６８）
］の方法で求めたところ、第１表に示す結果を得ている
。

第１表　酸素透過係数Ｐの測定値 一方、複合膜の酸素透過速度Ｒ（ｃｍ／５ｅｃ）を実測
した結果は第２表に示す通りである。

第２表　酸素固定膜の透過係数Ｐの測定値第２表中の計
算値は第１表のＰからＲ＝ＰＸＪの関係（ｆ＝膜厚ｃｍ
）より求めたものであり、実測値は２倍以上高い値とな
っている。その理由は明らかでないが、酵素（Ｇｏ、Ｄ
＞が含まれたことによる相乗効果と推定される。

第３図は本発明にか＼る酵素固定膜を使用した場合の酸
素センサにおけるグルコースの検量線であるが１．Ｉ　
Ｘ　１０−６〜Ｉ　Ｘ　１０−”ｎｏ　Ｅ　／　ｌ　（
２，ＯＸｌ、０−１〜１．８　Ｘ　１０３■／Ａ）とい
う、きわめて広い範囲で直線性を示しており、これらの
値は従来報告されたＧＯＤセンサや微生物センサ（端出
、温州、鈴木等編「化学センサー」講談社すイエンテイ
フイク（１９８４）　、Ｐ１９２、Ｐ１９８）より上限
、下限の濃度域はいずれも広く、３ケ月のくり返し使用
後も初期とは一同等の感度を維持し、きわめて安定性も
よいことが分った。

本発明にか＼る酵素固定膜は上記グルコース定量用にの
み限定されるものではなく、種々の酵素剤あるいは微生
物を固定化して各種成分、例えばアミノ酸、核酸、脂質
、ビタミン、乳酸、尿酸。

尿素、アルコール等の定量に広く用いられるものである
。

また、組み合せて用いるセンサは、酸素電極に限られる
ものではなく、Ｈ２０□センサや、各種イオンセンサ、
温度センサ等に装着して使用できる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、酵素を高密度に固定化した高活性の酵
素固定膜を容易に経済的に製造することができる。

本発明にか＼る酵素固定膜を従来品に代えてガルバニ電
池式酸素センサの酸素電極に装着したところ、従来品を
用いた場合に比し、応答速度が、１．５倍も速く、酵素
の活性が低下せず、感度が著しく向上する効果が得られ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にか＼る製膜方法の模式図、第２図は従
来品と本発明にか＼る酵素固定膜を使用した場合のセン
サの感度、応答性比較図、第３図はグルコース検量線を
示す図である。 １・・・回転盤 ２・・・ガラス板（基板） ３・・・薄膜 ４・・・酵素粒子 ５・・・補強膜 ６・・・排気管 覇　　　＄ 困　べ　督　ｇ　怪　珈 ↓　＋ｈ　　　　悲　渉　云 回　峡　ミ　デ　オ　白 第　　　２　　　　図 時向（ｓｅｅ） 第　　　３　　　　図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸共重合体で薄膜（支持膜）を形成し、そ
   の薄膜内に酵素を分散固定したことを特徴とする酵素固
   定膜。
2. （２）酵素を分散固定したアミノ酸共重合体から成る薄
   膜に気体透過性の重合体から成る補強膜を裏打ちしたこ
   とを特徴とする酵素固定膜。
3. （３）アミノ酸から成る共重合体溶液に酵素を分散させ
   て調製したものを回転する基板の中心部に滴下して遠心
   力により薄膜を形成させ、それを乾燥固化させることを
   特徴とする酵素固定膜の製造法。
4. （４）アミノ酸から成る共重合体溶液に酵素を分散させ
   て調製したものを回転する基板の中心部に滴下して遠心
   力により薄膜を形成させ、それを乾燥固化させる第１工
   程と、上記薄膜上に気体透過性を持つ補強膜を第１工程
   と同様の方法で一体に形成する第２工程とから成ること
   を特徴とする酸素固定膜の製造法。