JPH02236153A - 選択透過膜およびそれを用いる電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明一は、たとえば電気化学的に検出可能な物質の生
成、または消費を検出する方式の固定化生体触媒電極な
どに好適に用いられる選択透過膜およびそれを用いる電
極に関する． 従来の技術 近年、生化学などの研究の発達によって従来未解明であ
った生体反応が解明されて化学工業の各分野に応用され
るようになってきた． 細胞、酵素などが触媒する生化学反応の応用範囲は広い
が、特に生化学反応を物質の検出手段に応用するいわゆ
るバイオセンシングは注目を集めている．このバイオセ
ンシングによって、従来の技術では測定不可能であった
物質あるいは測定に多大の時間と労力を費やした物質を
簡便に測定することができ、環境計測、食品製造、食品
分析、医療分析などの各分野において実用化が進んでい
る． 一般に、酵素などの生体触媒には、 ■反応の特異性が高い， ■温和な条件下での測定が可能である．■高感度で微量
成分の測定が可能である．などの利点があるが、触媒と
して生体由来の物質を用いている故に、 ■酵素などの生体触媒が高価である． ■温度、ｐＨなどの反応条件に制限がある．■様々な要
因によって酵素などの生体触媒の触媒能が失われる、い
わゆる失活が生じる．という欠点を併せ持っている． このような問題点を解決するために、生体触媒を固定化
して用いることが考え出されており、多くの方法が提案
されている．そのうちで共有結合性の架橋剤を用いて生
体触媒を架橋反応によって固定化する方法は、その結合
が吸着やイオン結合などに比較して強固であるために、
実用化に適している． このような固定化生体触媒を被検出物質の測定に応用す
る場合には、生体触媒とその生化学反応によって増減す
る物質を検出できる検出機構とを組合わせて使用する．
このとき検出機構としては、電気化学検出器、蛍光検出
器、熱検出器などが応用されている．特に、固定化酵素
による生化学反応における酸素の消費または過酸化水素
の生成を酸素電極または過酸化水素電極などを用いて電
気化学的に検出する方法は、装置構成の簡単さ、検出感
度の高さ、応答速度の速さなどの利点を有しており、最
もよく用いられている． しかしながら、たとえば過酸化水素電極を用いた場合に
は、生化学反応によって生成された過酸化水素だけでな
く、測定試料に含まれるアスコルビン酸などの妨害物質
をも検出してしまい、測定の信頼性が低下してしまうこ
とが知られている．そこで固定化酵素膜と、酵素電極ま
たは過酸化水素電極との間に選択透過展を介在させる方
法が実用化されている．すなわち、酵素電極や過酸化水
素電極などの表面の近傍に緩衝液などを介して被検出物
質以外の物質の透過を制限する選択透過膜と、固定化酵
素膜とをこの順に配置するかあるいは電極表面に直接選
択透過膜と、固定化酵素膜とをこの順に形成する．これ
によって妨害物質の検出を防止するとともに、測定精度
を向上することができる． 従来では、このような選択透過膜として、たとえば特開
昭６０−５６２５４号に開示されているように、アセチ
ルセルロースなどの素材を用いた選択透過膜が使用され
ている．しかしながら、この選択透過膜を製造するため
には、取り扱いの不便な溶剤を使用しなければならない
という問題がある．また、所望の選択透過能を得るため
には、微妙に乾燥時間等を調節しなへければならず、多
大な時間と非常に面倒な操作とを要しなければ実用可能
な選択透過膜を得ることができない．また、本件発明者
等は、タンパク質と架橋剤とを用いて簡便に選択透過膜
を形成する方法を提案した（特開昭６３−１８２５５９
号）．シかしながら、選択透過膜に限らず、一般にタン
パク質と架橋剤とを用いて形成された固定化タンパク質
膜には、物理的強度が低いという問題があり、その取り
汲いが不便であり、耐久性に劣るという欠点がある． このような固定化タンパク質膜の物理的強度の問題は、
たとえば物理的強度の大きい担体上にタンパク質を固定
化しても固定化タンパク質膜自体が脆くなり、部分的に
剥離することがあり、根本的に解決することはできない
． したがって、上述したような選択透過膜に対する問題点
は、有効な解決策が提示されずに現在番こ至っている．
一般に、選択透過膜ではなく、酵素などの生体触媒であ
るタンパク質を固定化した固定化タンパク質膜の強度を
向上させる方法は、たとえば特公昭５８−４９８２１号
に示されてレ１る．この方法は、アミノおよびイミノ系
高分子とともに、生体触媒である酵素を固定化し、酵素
固定化膜の物理的強度を向上させるものである．しかし
ながら、このような方法を選択透過膜に応用する場合に
は、固定化されたタンパク質の物性が変化しやすいので
所望の選択透過能を得ること力《困難であるという問題
がある． さらに、特開昭６２−３２３５２号に示されているよう
に、タンパク質である酵素をポリエステル布に固定化し
、酵素固定化膜の物理的強度の補強を図る方法も提案さ
れている．しかしながら，このような場合には、タンパ
ク質膜の膜厚が増大してしまい、選択透過膜の形成に応
用する場合番こは、固定化酵素電極の測定感度と測定速
度が悪化してしまうという問題がある． 発明が解決しようとする課題 したがって本発明の目的は上記技術的課題を解決し、所
望の選択透過能を有し、物理的強度に浸れ、なおかつｍ
便に製造することができる選択透過膜およびそれを用い
る電極を提供することである． 課題を解決するための手段 本発明は、タンパク質と、少なくとも１種類の架橋剤と
を含み、前記タンパク質以外に架橋剤と反応する高分子
物質が少なくとも１種類添加された混合溶液を膜状に展
開し、 架橋反応により前記タンパク質を固定化して成ることを
特徴とする選択透過．ｒｍである．また本発明は、前記
タンパク質が少なくとも１種類以上の球状タンパク質を
含む成分構成であり、前記少なくとも１種類の架橋剤が
アミノ基と架橋反応する架橋剤を含み、 前記高分子物質がアミノ基、アミン基の誘導体あるいは
その両方を有する直鎖状多糖類を含むことを特徴とする
前記選択透過膜である．前記タンパク質と直鎖状多糖類
との構成重量比は１０００：１から１０００：１０の範
囲であり、タンパク質と架橋剤との構成重量比は、１０
０：５から１００：５０の範囲であることが好ましい．
また前記直鎖状多糖類はキトサンであってもよい．さら
に本発明は、上述した選択透過膜を導電性基体近傍に設
けたことを特徴とする電極である．このような電極にお
いて前記選択透過膜の導電性基体と反対側表面上に、少
なくとも１種類のオキシダーゼを固定化した固定化酵素
膜を設けてもよい 作　　用 導電性基体表面上にタンパク質を固定化し、これを選択
透過膜とし、さらに固定化酵素膜を形成する場合には、
この選択透過膜の物理強度が固定化酵素電極の寿命に大
きな影響を与える．一般に、固定化タンパク質膜の物理
的強度を向上させるためには、固定化タンパク質膜中に
おける架橋剤の濃度を高くすればよい．しかし、この固
定化タンパク質膜を選択透過膜として形成する場合には
、固定化タンパク質膜の物理的特性が架橋剤濃度によっ
て変化するので、選択透過能が悪化してしまうことがあ
り、望ましくない．また、固定化タンパク質膜中に架橋
剤と反応する補強物質を共存させて固定化タンパク質膜
の強度を向上させる方法もある．しかし、このような方
法では、補強物質が固定化タンパク質膜の物理的特性に
悪影響を与え、選択透過膜としての本来の機能、すなわ
ち選択性を失わせてしまう恐れがある． 本件発明者は、特にタンパク質と架橋剤とで構成される
選択透過膜中に架橋剤と反応する補強物質を共存させる
実験を行い、選択透過膜の物理的特性に悪影響を与えず
、なおかつ選択透過膜の物理的強度を向上させる補強物
質および、その製造条件を検討し、本発明を完成するに
至った．このような補強物質には、 ■固定化されるタンパク質の溶液またはこのタンパク質
と架橋剤との混会溶液に溶解する物質であること． ■選択透過膜の物理的特性に悪影響を与えないために少
量で選択透過膜の物理的強度を向上させることができる
物質であること． ■架橋剤に対して、固定化すべきタンパク質と同程度の
反応性を有し、架橋反応によって不溶化する物質である
こと． などの諸性質が要求される． したがって本件発明者は、タンパク質と架橋剤との混合
溶液中に共存させることが可能で、架橋剤と架橋反応を
行い、かつ、選択透過膜の選択透過能に悪影響を与えな
い化ｉ！！ｉ物を探索した．たとえば、架橋剤としてグ
ルタルアルデヒド等を用い、溶媒として蒸留水または！
ｌ！胃液などを用いて一定濃度のタンパク質と架橋剤の
混合溶液を調製し、この温き溶液に各種化合物を共存さ
せてグルタルアルデヒド等と架橋反応を行わせ、固定化
タンパク質膜を作成した．作成された固定化タンパク質
膜の物理的強度および選択透過能について実験し、選択
透過膜の物理強度を向上させ、選択透過能に悪影響を与
えない化合物を探索することができる． この結果、タンパク質を少なくとも１種顕以上の球状タ
ンパク質を含む成分構成にし、架橋剤としてアミン基と
架橋反応を行う化合物を用い、前記混き溶液に共存させ
る化合物としてアミン基、アミノ基の誘導体、あるいは
その両方を倉む直鎖状多糖類を使用すれば固定化タンパ
ク質膜の選択透過性に悪影響を与えることなく、なおか
つ固定化タンパク質膜の物理的強度を向上することがで
きることが見いだされた． 本発明によれば、容易に優れた選択透過膜を形成するこ
とが可能である．特に、導電性基体表面上に選択透過膜
を直接に設け，ることが容易に可能となり、さらに選択
透過膜上に固定化酵素膜を形成することにより、固定化
酵素電極を製造することができる． 本発明に使用される架橋剤としては、各種架橋剤を使用
することができるが、グルタルアルデヒド、ヘキサメチ
レンジイソシアネートなどの架嬌試薬は結き強度が大き
いので、好ましく用いられる．特にグルタルアルデヒド
はより好ましく用いられる． タンパク質と架橋剤との横成重量比は、得られる選択透
過膜の選択透過性の点で、好ましくは１００：５〜１０
０：５０の範囲である．また本発明に従う選択透過膜に
使用されるタンパク質は、アルプミン、グロプリン、プ
ロラミンなどの球状タンパク質を少なくとも１種類以上
含む成分構成であれば、優れた選択透過能を有する選択
透過膜を製造することができる． また、タンパク質と架碑剤との混合溶液に添加され架橋
剤と反応する高分子物質は、好ましくはアミノ基、アミ
ノ基誘導体あるいはその両方を有する直鎖状多糖類であ
り、具体的にはグルコサミン、ガラクトサミンなどのア
ミノ糖およびその誘導体を楕成単位とする多糖類を用い
ることが可能である．このようなものには、バクテリア
のべブナドグリカン、一部脱アセチル化したヒアルロン
酸や一部脱アセチル化したコンドロイナン硫酸、キトサ
ンが例示できる．容易に入手可能なキトサンは、このよ
うな高分子物質として好適に用いられる． また本発明に従う選択透過膜においては、タンパク質と
前記直鎖状多糖類との構成重量比は、１０００：１から
１０００：１０の範囲にあることが好ましい．タンパク
質に対する直鎖状多糖類の構成重量比が１０００：１０
より大きくなると、選択透過膜の選択能が悪化してくる
．この原因については定かではないが、直鎖状多糖類の
タンパク質に対する構成重量比が大きくなると、相対的
にタンパク質に対する架橋剤濃度が低下し、タンパク質
に対する架橋反応が不充分になる．したがって，固定化
タンパク質膜が脆くなり、導電性基体表面との結合性、
密着性およびタンパク質問の結合性に影響し、膜の緻密
さが保たれなくなるためだと考えられる．また、上記構
成重量比が１０００＝１よりも小さくなると膜強度の向
上が不充分となる． 本発明に従えば、選択透過膜は先ず上述したタンパク質
と架橋剤とを蒸留水または＆！街液などに溶解し、さら
に上記高分子物質を添加し、たとえば導電性基体などの
表面上に塗布する．これによって高分子物質を添加した
混合溶液では、架橋反応が進行し、固定化タンパク質膜
−が形成される．このようにして、製造された選択透過
膜は、たとえば超音波処理などの物理的衝撃に対して非
常に耐久性に優れている．また高分子物質を添加したこ
とにより、選択透過能が悪化するといった事態を招来す
ることもない． 本発明に従う選択透過膜を導電性基体上に配置し、これ
によって過酸化水素測定用４Ｘ４極を構成することがで
きる．このとき、選択透過膜を［１液などを介して導電
性基体近傍に配置することも可能であるが、導電性基体
上に直接選択透過膜を形成してもよい．さらに、この選
択透過膜の導電性基体とは反対側に少なくとも１種類の
オキシダーゼ等の酵素を固定化することによって、固定
化酵素電極を製造することができる．このような固定化
酵素電極は物理的強度が大きく、耐久性および被検出物
質の，選択性に非常に優れている．また本発明に従う選
択透過膜は、バイオリアクターにおいて反応生成物、若
しくは原材料のみを選択的に分離するためなどにも使用
することが可能である． 以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されるものではない．なお、
％は重量％を表す． 実施例 測定装置 本実施例では、第１図に示されるフロー型測定装置を使
用した．第１図に示されるフロー型測定装置は、μｌオ
ーダの試料注入が可能な高速液体クロマトグラフイ用の
インジエクタ３と、本発明に従う選択透過膜を用いた電
極Ｅ１〜Ｅ４（Ｃｌ〜Ｃ５）および参照電極としてのＡ
ｇ／ＡｇＣｌ電極８が取付けられ、対極７としてステン
レス鋼製の管路が備えられた測定用セル５とを含んで構
成される．たとえば内径０．５ｍｍ、長さ１．５ｍのテ
フロン製の希釈用管路４は、インジエクタ３と、測定用
セル５との間に接続される．測定用セル５の内容積は４
０μｌであり、電極Ｅ１〜Ｅ４（Ｃ１〜Ｃ５）とＡｇ／
ＡｇＣｌ　＠極８とが、ｙＩＷＩ液の管路を介して対向
して配置される．電極Ｅ１〜Ｅ４（Ｃｌ〜Ｃ５）には、
ポテンシオスタット９によってＡｇ／ＡｇＣｌ電極８に
対して＋〇．６０Ｖの電圧が印加される． このような構成は、恒温槽１２内に配宜され、恒温槽１
２内の温度は３７℃に保持される．緩衝液１の送液には
高速液体クロマトグラフイ用のボンプ２を用い、緩衝液
１としてｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸ナトリウムＩ！衝
液が１．．Ｏｍ１／分の流量で送液される．測定を終え
た試料を含む緩衝液は廃液瓶１１にて捕捉される．なお
測定値は記録計１０によって記録される． 実施例１ タンパク質としてウシ血清アルプミン《フラクションＶ
，シグマ社製》を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
、タンパク質以外に架橋剤と反応する物質としてキトサ
ン（東京化成工業製）を用いた． キトサンは１００ｍＭ塩酸水溶液に溶解して０．５％キ
トサン溶液とした． ワツセルマン試験管中で ５％ウシ血清アルブミン水溶液　４００μ！、２５％グ
ルタルアルデヒド水溶液　　２０μｌ、０．５％キトサ
ン溶液　　　　　　　　２０μｌ、蒸　　留　　水　　
　　　　　　　　　　　　　５６０　μ！　、を混合し
、 最終濃度　　　　２％　ウシ血清アルブミン、０．５％
　グルタルアルデヒド、 ０．０１％　キトサン の混合溶液を調製した． この混合溶液のタンパク質とキトサンの構成重量比は１
０００：５、タンパク質と架橋剤の構成重量比は１００
：２５である． 一方、一導電性基体である直径２ｍｍの白金線の側面を
熱収縮テフロンで被覆し、その断面を１６００番手のエ
メリー紙で研磨した．この研磨された表面に、マイクロ
シリンジで上記混合溶液５μｌを載せて４０℃で乾燥し
、白金電極上に直接タンパク質膜を形成した．このよう
にして、過酸化水素を検出するための電極Ｅ１を作成し
た．このタンパク質膜で被覆された白金電極から成る電
ｉｉＥ１を第１図に示すフロー型測定装置に組み込み、
１００ｍＭリン酸緩衝液１を流しながら、ｋｇ／ＡｇＣ
ｌ電極８に対してｏ．６ｖの電位を印加した．この状態
でインジェクタ３から５ｍＭ過酸化水素を注入したとこ
ろ、検出電流値は２１８ｎＡであった．次に５ｍＭアス
コルビン酸の溶液を注入したところ、検出電流値は２．
９ｎＡであった．したがって、第１表に示すようにアス
コルビン酸による検出電流値の同濃度の過酸化水素の検
出電流値に対する割合は１．３％であった．（以下余白
》 第　　１ 表 上述したように作成した電極Ｅ１を超音波処理装置で１
０分間処理した後、再び第１図に示すフロー型測定装置
に組み込んだ．５ｍＭ過酸化水素を注入したときの検出
電流値は２１８ｎＡであり、５ｍＭアスコルビン酸の溶
液を注入したときの検出電流値は２．９ｎＡであった． この結果は、超音波処理を行う前の結果とともに第２表
に示されている．第２表から、超音波処理の前後におい
て、電極Ｅ１の過酸化水素およびアスコルビン酸に対す
る感度に変化はなかったことが判る． 第２表 実施ｒ！４２ タンパク質としてウシ血清アルブミン（フラクション■
，シグマ社製）を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
，タンパク質以外に架橋剤と反応する物質としてキトサ
ン（東京化成工業製》を用いた． キトサンは１００ｍＭ酢酸水溶液に溶解して０．５％キ
トサン溶液とした． ワツセルマン試験管中で ５％ウシ血清アルブミン水溶液　４００μｌ、２５％グ
ルタルアルデヒド水溶液　．２０μｌ、０．５％キトサ
ン溶液　　　　　　　　２０μｌ、蒸　　留　　水　　
　　　　　　　　　　　　　５　６　０μｌ　、を混合
し、 最終濃度　　　　２％　ウシ血清アルブミン、０．５％
　グルタルアルデヒド、 ０．０１％　キトサン の混合溶液を調製した． この混合溶液のタンパク質とキトサンの楕成重量比は１
０００：５、タンパク質と架橋剤の楕成重量比は１００
：２５である． 一方、導電性基体である直径２ｍｍの白金線の側面を熱
収縮テフロンで被覆し、その断面を１６００番手のエメ
リー紙で研磨した．この研磨された表面に、マイクロシ
リンジで上記混合溶液５μｌを載せて４０℃で乾燥し、
白金電極上に直接タンパク質膜を形成した．このように
して、過酸化水素を検出するための電極Ｅ２を作成した
．このタンパク質膜で被覆された白金電極から成る電極
Ｅ２を図面に示すフロー型測定装置に組み込み、１００
ｍＭリン酸＆！衝液１を流しながら、Ａｇ／ＡｇＣ１電
極８に対して０．６Ｖｆ）電位を印加した．この状態で
インジェクタ３がら５ｍＭ過酸化水素を注入したところ
、検出電流値は２２０ｎＡであった．次に５ｍＭアスコ
ルビン酸の溶液を注入したところ、検出電流値は２．９
ｎＡであった．したがって、第１表に示すようにアスコ
ルビン酸による検出電流値の同濃度の過酸化水素の検出
電流値に対する割合は実施例１と同様に１．３％であっ
た．また、電極Ｅ２に超音波処理を行っても、過酸化水
素およびアスコルビン酸に対する感度に変化はなかった
．したがって、キトサンを溶解するための水溶液は、酸
性溶液であれば、塩酸であっても酢酸であってもよいこ
とが判った．実施例３ タンパク質としてウシ血清アルブミン（フラクション■
．シグマ社製）を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
、タンパク質以外に架橋剤と反応する物質としてキトサ
ン《東京化成工業製》を用いた． キトサンは１００ｍＭ塩酸水溶液に溶解して０．５％キ
トサン溶液とした． ワツセルマン試験管中で ５％ウシ血清アルブミン水溶液　４００μ！２５％グル
タルアルデヒド水溶液　　２０μｌ、０．５％キトサン
溶液　　　　　　　２００μｌ蒸　　留　　水　　　　
　　　　　　　　　　　３　８　０μ！　、を混合し、 最終濃度　　　　２％　ウシ血清アルブミン、０．５％
　グルタルアルデヒド、 ０．０５％　キトサン の混合溶液を調製した． この混合溶液のタンパク質とキトサンの構成重量比は１
０００：２５、タンパク質と架橋剤の構成重量比はＺｏ
ｏ：２５である． 一方、導電性基体である直径２ｍｍの白金線の側面を熱
収縮テフロンで被覆し、その断面を１６００番手のエメ
リー紙で研麿した．この研磨された表面に、マイクロシ
リンジで上記混合溶液５μｌを載せて４０℃で乾燥し、
白金電極上に直接タンパク質膜を形成した．このように
して、過酸化水素を検出するための電極Ｅ３を作成した
。

このタンパク質膜で被覆された白金電極から成る電極Ｅ
３を第１図に示すフロー型測定装置に組み込み、１００
ｍＭリン酸ｗｉ衝液１を流しながら、Ａ　ｇ　／　Ａ　
ｇ　Ｃ　ｌ電極８に対して０．６Ｖの電位を印加した．
この状態でインジエクタ３から５ｍＭ過酸化水素を注入
したところ、検出電流値は２１９ｎＡであった．次に５
ｍＭアスコルビン酸の溶液を注入したところ、検出電流
値は６．８ｎＡであった．したがって、第１表に示すよ
うにアスコルビン酸による検出電流値の同濃度の過酸化
水素の検出電流値に対する割合は３．１％であった．実
施例１．２に比較してわずかに選択透過能に劣るが、充
分使用に耐える値である．また電極Ｅ３に超音波処理を
行っても、過酸化水素およびアスコルビン酸に対する感
度に変化はなかった．比較例１ 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その断面を１６００番手のエメリー紙で研磨し、白金電
極Ｃ１とした． この白金電極Ｃ１を図面に示すフロー型測定装置に組み
込み、１００ｍＭリン酸緩衝液１を流しながら、Ａｇ／
ＡｇＣ１電極８に対して０．６Ｖの電位を印加し、５ｍ
Ｍ過酸化水素を注入したところ、検出電流値は５３０ｎ
Ａであり、次に５ｍＭアスコルビン酸の溶液を注入した
ところ、検出電流値は３３３ｎＡであった．したがって
、第１表に示すようにアスコルビン酸による検出電流値
の同濃度の過酸化水素の検出電流値に対する割合は６２
．９％であった．これによって選択透過膜を設けていな
い白金電極Ｃ１では、アスコルビン酸を含む試料を測定
するこはできないことが判った． 比較例２ タンパク質としてウシ血清アルブミン（フラクション■
，シグマ社製）を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
、タンパク質以外に架橋剤と反応する物質として１．４
−ジアミノブタンを用いた．ワツセルマン試験管中で ５％ウシ血清アルブミン水溶液　４００μ！２５％グル
タルアルデヒド水溶液　　２０μＩＯ．５％１．４−ジ
アミノブタン溶液　２０μｌ、蒸　　留　　水　　　　
　　　　　　　　　　　５　６　０μ！　、を混合し、 最終濃度　　　　２％　ウシ血清アルブミン、０．５％
　グルタルアルデヒド、 ０．０１％　１．４−ジアミノブタン の混合溶液を調製した。

一方、導電性基体である直径２ｍｍの白金線の側面を熱
収縮テフロンで被覆し、その断面を１６００番手のエメ
リー紙で研磨した．この研磨された表面に、マイクロシ
リンジで上記混合溶液５μｌを載せて４０℃で乾燥し、
白金電極上に直接タンパク質膜を形成した．このように
して、過酸化水素を検出するための電極Ｃ２を作成した
．このタンパク質膜で被覆された白金電極から成る電極
Ｃ２を第１図に示すフロー型測定装置に組み込み、１０
０ｍＭリン酸緩衝液１を流しながら、Ａ　ｇ　／　Ａ　
ｇ　Ｃ　１電極８に対して０．６Ｖの電位を印加した．
この状態でインジエクタ３から５ｍＭ過酸化水素を注入
したところ、検出電流値は２９６ｎＡであった．次に５
ｍＭアスコルビン酸の溶液を注入したところ、検出電流
値は１４４ｎＡであった．したがって、第１表に示すよ
うにアスコルビン酸による検出電流値の同濃度の過酸化
水素の検出電流値に対する割きは４８．５％であった．
１，４−ジアミノブタンを添加して得られた選択透過膜
は選択透過能に劣り、電極Ｃ２では、妨害物質としてア
スコルビン酸を含む試料の測定を行うことができないこ
とが判った，また、超音波処理を行うとさらに選択性が
低下することから物理的強度にも劣ることが判った． 比較例３ タンパク質としてウシ血清アルプミン（フラクション■
．シグマ社製）を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
、タンパク質以外に架橋剤と反応する物質としてトリエ
チレンテトラアミンを用いた． ワツセルマン試験管中で ５％ウシ血清アルブミン水溶液　４００μ！、２５％グ
ルタルアルデヒド水溶液　　２０μ！、０．５％トリエ
チレンテトラアミン溶液２０μ！、蒸　　留　　水　　
　　　　　　　　　　　　　５６０　μ！　、を混合し
、 最終濃度　　　２％　ウシ血清アルブミン、０．５％　
グルタルアルデヒド、 ０．０１％　トリエチレンテトラアミン、の混合溶液を
調製した． 一方、導電性基体である直径２ｍｍの白金線の側面を熱
収縮テフロンで被覆し、その断面を１６００番手のエメ
リー紙で研磨した．この研磨された表面に、マイクロシ
リンジで上記混合溶液５μｌを載せて４０℃で乾燥し、
白金電極上に直接タンパク質膜を形成した，このように
して、過酸化水素を検出するための電極Ｃ３を作成した
．このタンパク質膜で被覆された白金電極から成る電極
Ｃ３を図面に示すフロー型測定装置に組み込み、１００
ｍＭリン酸ｌ！衝液１を流しながら、Ａｇ／ＡｇＣ１　
ｔｌｉ８に対して０．６Ｖの電位を印加した．この状態
でインジエクタ３から５ｍＭ過酸化水素を注入したとこ
ろ、検出電流値は４２６ｎＡであった．次に５ｍＭアス
コルビン酸の溶液を注入したところ、検出電流値は１０
４ｎＡであった．したがって、第１表に示すようにアス
コルビン酸による検出電流値の同濃度の過酸化水素の検
出電流値に対する割合は２４．４％であった。

トリエチレンテトラアミンを添加して得られた選択透過
膜は選択透過能に劣り、電極Ｃ３では妨害物質としてア
スコルピン酸を含む試料の測定を行うことができないこ
とが判った．また超音波処理を行うと、さらに選択性が
低下することから物理的強度にも劣ることが判った． 比較例４ タンパク質としてウシ血清アルブミン《フラクションＶ
．シグマ社製》を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
用いた． ワツセルマン試験管中で ５％ウシ血清アルブミン水溶液　４００μ！、２５％グ
ルタルアルデヒド水溶液　　２０μ！蒸　　留　　水　
　　　　　　　　　　　　　　５　８　０μ！　、を混
合し、 最終濃度　　　　２％　ウシ血清アルブミン、０．５％
　グルタルアルデヒド、 の混合溶液を調製した． 一方、導電性基体である直径２ｍｍの白金線の側面を熱
収縮テフロンで被覆し、その断面を１６００番手のエメ
リー紙で研磨した．この研磨された表面に、マイクロシ
リンジで上記混合溶液５μｌを載せて４０℃で乾燥し、
白金電掻上に直接タンパク質膜を形成した．このように
して、過酸化水素を検出するための電極Ｃ４を作成した
．このタンパク質膜で被覆された白金電極から成る電極
Ｃ４を図面に示すフロー型測定装置に組み込み、１００
ｍＭリン酸緩衝液１を流しながら、Ａｇ／ＡｇＣＺ電極
８に対してｏ．６Ｖの電位を印加した．この状態でイン
ジエクタ３から５ｍＭ過酸化水素を注入したところ、検
出電流値は２１９ｎＡであった．次に５ｍＭアスコルビ
ン酸の溶液を注入したところ、検出電流値は２．６ｎＡ
であった．したがって、第１表に示すようにアスコルビ
ン酸による検出電流値の同濃度の過酸化水素の検出電流
値に対する割合は１．２％であった．このように、タン
パク質と架橋剤とからのみ成る選択透過膜は、その選択
透過能に優れている．しかし、この電極Ｃ４を超音波処
理装置で１０分間処理した後、再び第１図に示すフロー
型測定装置に組み込んだ，５ｍＭ過酸化水素を注入した
ときの検出電流値は２６２ｎＡであり、５ｍＭアスコル
ビン酸の溶液を注入したときの検出電流値は６．６ｒｔ
Ａであった． この結果は、超音波処理を行う前の結果とともに第２表
に示されている．第２表から、超音波処理の後において
は、電ｆｉｃ４の過酸化水素およびアスコルビン酸に対
する感度が上昇し、また選択透過性が悪くなっている．
したがって、このような電極Ｃ４では、物理的強度が不
充分であり、その耐久性に劣ることが判った． 実施例４ 直Ｐｉ２　ｍ　ｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被
覆し、その断面を１６００番手のエメリー紙で研磨した
表面に実施例１と同様な材料および手順で選択透過膜を
形成する．この上に牛血清アルブミンをｌｍｇ／ｍｊ！
、グルコースオキシダーゼ（タイプ■、シグマ社製）を
１ｍｇ／ｍｌ、グルタルアルデヒドを０，２％になるよ
う１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に
溶解した液をマイクロシリンジで３μｌ滴下し゛、４０
℃で１５分間加熱し、固定化酵素層を形成し、電極Ｅ４
とした． この電極Ｅ４を図面に示すフロー型測定装置に組み込み
、１００ｍＭリン酸緩衝液１を流しながら、Ａｇ／Ａｇ
Ｃｌｉｌ極８に対して０．６Ｖの電圧を印加した．イン
ジエクタ３から３０ｍＭのグルコース水溶液５μｌを注
入したところ、検出電流値は３９３ｎＡであった．次に
、３０ｍＭのアスコルビン酸水溶液を同量注入したとこ
ろ、検出電流値は１１．２ｎＡであった．つまり、同濃
度のグルコースに対するアスコルビン酸の検出値は２．
８％であり、実用上全く無視できるものである． さらに、この電極Ｅ４をフロー型測定装置から一旦取外
し、超音波処理装置で１０分間処理した後、再度フロー
型測定装置に取付けた．そして超音波処理前と同様に、
３０ｍＭのグルコースおよびアスコルビン酸水溶液を、
各々５μ！注入した．グルコースに対する検出電流値は
３９５ｎＡで、アスコルビン酸に対する検出電流値は１
１．１ｒ＋Ａであった．この結果は第３表に示されてい
る．このように、本電極Ｅ４は超音波処理による性能劣
化がないことが判った． また、超音波処理した本電極を室温、Ｍ衝液中で保存し
たところ、３カ月後も感度低下や選択性の低下が認めら
れず優れた耐久性を示した．第３表 比較例５ 選択透過腹作成時にキトサンを含まながった以外、実施
例４と同様に固定化酵素電極Ｃ５を作成した． この電極Ｃ５を第１図に示すフロー型測定装置に組み込
み１００ｍＭリン酸緩衝液１を流しながら、Ａｇ／Ａｇ
Ｃｆ電極に対して０．６ｖの電圧を印加した，３０ｍＭ
のグルコース水溶液５μｌを注入したところ検出電流値
は３８５ｎＡであった．次に、３０ｍＭのアスコルビン
酸水溶液を同量注入したところ検出電流値は１０、３ｎ
Ａであった． さらに、この電極Ｃ５をフロー型測定装置がら一旦取外
し、超音波処理装置で１０分間処理した．目視的には膜
に異常は認められなかったが、再度フロー型測定装置に
電極を取付け、超音波処理前と同様に、３０ｍＭのグル
コースおよびアスコルビン酸水溶液を、各々５μｌ注入
したところ、グルコースに対する検出電流値は４０２ｎ
Ａで、アスコルビン酸に対する検出電流値は１６．２ｎ
Ａであった．この結果は、実・施例４の結果とともに第
３表に示されている．このように、電極Ｃ５においては
、超音波処理によって膜透過性が変動し選択性の低下が
起きたことが判る． また、超音波処理した本電極を室温・Ｈｉｌｔ液中で保
存したところ、２カ月後に目視的に膜の剥離が認められ
、超音波処理によって引き起こされた膜の部分的破損が
最終的に膜の剥離にまで進展したものと考えられる． 発明の効果 以上説明したように本発明によれば、タンパク質を用い
て選択透過能を有する機能性膜を構築する場合に、固定
化タンパク質膜の特性に悪影響を与えず、なおかっ、物
理的強度に優れた選択透過膜を容易に作成することがで
きる．

【図面の簡単な説明】

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）タンパク質と、少なくとも１種類の架橋剤とを含
   み、前記タンパク質以外に架橋剤と反応する高分子物質
   が少なくとも１種類添加された混合溶液を膜状に展開し
   、 架橋反応により前記タンパク質を固定化して成ることを
   特徴とする選択透過膜。
2. （２）前記タンパク質が少なくとも１種類以上の球状タ
   ンパク質を含む成分構成であり、 前記少なくとも１種類の架橋剤がアミノ基と架橋反応す
   る架橋剤を含み、 前記高分子物質がアミノ基、アミノ基の誘導体あるいは
   その両方を有する直鎖状多糖類を含むことを特徴とする
   請求項第１項記載の選択透過膜。
3. （３）前記高分子物質がキトサンであることを特徴とす
   る請求項第２項記載の選択透過膜。
4. （４）前記タンパク質と直鎖状多糖類との構成重量比が
   １０００：１から１０００：１０の範囲であることを特
   徴とする請求項第２項記載の選択透過膜。
5. （５）前記タンパク質と架橋剤との構成重量比が１００
   ：５から１００：５０の範囲であることを特徴とする請
   求項第２項または第４項記載の選択透過膜。
6. （６）請求項第１項〜第５項に記載される選択透過膜を
   、導電性基体近傍に設けたことを特徴とする電極。
7. （７）前記選択透過膜の導電性基体とは反対側表面上に
   、少なくとも１種類のオキシダーゼを固定化した固定化
   酵素膜を設けたことを特徴とする請求項第６項記載の電
   極。