JPS6363863B2 - - Google Patents
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- JPS6363863B2 JPS6363863B2 JP55065434A JP6543480A JPS6363863B2 JP S6363863 B2 JPS6363863 B2 JP S6363863B2 JP 55065434 A JP55065434 A JP 55065434A JP 6543480 A JP6543480 A JP 6543480A JP S6363863 B2 JPS6363863 B2 JP S6363863B2
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- Japan
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- immunoglobulin
- latex particles
- antigen
- mixture
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫検定法に関するものである。更に
詳しくは免疫グロブリンの結合の性質を応用した
免疫検定法に関するものである。
詳しくは免疫グロブリンの結合の性質を応用した
免疫検定法に関するものである。
免疫グロブリン抗体が対応する特定の抗原、あ
るいはハプテンに結合することはよく知られてお
り、多くの免疫検定法に利用されている。このよ
うな免疫検定法において起こり得る問題として、
検定する体液中に含まれる他の蛋白質による干渉
がある。特に人血清にはリウマチ因子（以下RA
因子と称す）および補体成分であるC1qが含まれ
ており、これらの物質も免疫グロブリンと結合す
る。更に人間の血清中のRA因子とC1qの量は人
それぞれに異なるので検定の前に血清中の内因性
のRA因子とC1qを不活性化するか、または除去
する処理が通常必要で、この前処理をしなければ
検定の結果は著しい誤差を生じる。
るいはハプテンに結合することはよく知られてお
り、多くの免疫検定法に利用されている。このよ
うな免疫検定法において起こり得る問題として、
検定する体液中に含まれる他の蛋白質による干渉
がある。特に人血清にはリウマチ因子（以下RA
因子と称す）および補体成分であるC1qが含まれ
ており、これらの物質も免疫グロブリンと結合す
る。更に人間の血清中のRA因子とC1qの量は人
それぞれに異なるので検定の前に血清中の内因性
のRA因子とC1qを不活性化するか、または除去
する処理が通常必要で、この前処理をしなければ
検定の結果は著しい誤差を生じる。
近年では免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片は抗原
に対して特異性を示し、RA因子または／および
C1qとは結合しない（免疫グロブリンのFc断片は
免疫グロブリンとRA因子または／およびC1qと
の結合原因となり、抗原に対しては結合しない）
という性質を利用し、RA因子または／および
C1qが存在しても、その干渉を受けずに行なえる
免疫検定法として、免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片を使う方法（特開昭54−119292号公報）があ
る。しかしながら、免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片をFc断片と分離するには、カラムクロマトグ
ラフイーによる繁雑な操作が必要となる。また通
常Ｆ（ab′）2断片とFc断片の共存下ではRA因子ま
たは／およびC1qの影響は避けることができない
と考えられており、事実Ｆ（ab′）2断片とFc断片の
共存下で抗原と抗体の両者を溶液状態で反応させ
抗原の存在量を効定する方法では、免疫グロブリ
ン全体を用いて同様に検定する周知の方法と同様
にRA因子または／およびC1qの影響を受ける。
に対して特異性を示し、RA因子または／および
C1qとは結合しない（免疫グロブリンのFc断片は
免疫グロブリンとRA因子または／およびC1qと
の結合原因となり、抗原に対しては結合しない）
という性質を利用し、RA因子または／および
C1qが存在しても、その干渉を受けずに行なえる
免疫検定法として、免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片を使う方法（特開昭54−119292号公報）があ
る。しかしながら、免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片をFc断片と分離するには、カラムクロマトグ
ラフイーによる繁雑な操作が必要となる。また通
常Ｆ（ab′）2断片とFc断片の共存下ではRA因子ま
たは／およびC1qの影響は避けることができない
と考えられており、事実Ｆ（ab′）2断片とFc断片の
共存下で抗原と抗体の両者を溶液状態で反応させ
抗原の存在量を効定する方法では、免疫グロブリ
ン全体を用いて同様に検定する周知の方法と同様
にRA因子または／およびC1qの影響を受ける。
本発明者は、鋭意研究の結果免疫グロブリンの
Ｆ（ab′）2断片とFc断片との混合物をラテツクス粒
子に感作した混合物感作ラテツクス粒子を用いれ
ば、体液中にRA因子または／およびC1qが存在
したとしても、その干渉を受けない免疫検定法が
可能であることを見い出した。すなわち本発明は
試料中にRA因子または／およびC1qが存在して
も、その干渉を受けずに行なえる免疫グロブリン
の結合性を用いた免疫検定法を提供するものであ
る。特に本発明による方法は免疫グロブリンの各
フラグメントの内、Ｆ（ab′）2断片単独ではなく、
免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片とFc断片両者の混
合物を感作したラテツクス粒子を用いることを特
徴とした免疫検定法である。
Ｆ（ab′）2断片とFc断片との混合物をラテツクス粒
子に感作した混合物感作ラテツクス粒子を用いれ
ば、体液中にRA因子または／およびC1qが存在
したとしても、その干渉を受けない免疫検定法が
可能であることを見い出した。すなわち本発明は
試料中にRA因子または／およびC1qが存在して
も、その干渉を受けずに行なえる免疫グロブリン
の結合性を用いた免疫検定法を提供するものであ
る。特に本発明による方法は免疫グロブリンの各
フラグメントの内、Ｆ（ab′）2断片単独ではなく、
免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片とFc断片両者の混
合物を感作したラテツクス粒子を用いることを特
徴とした免疫検定法である。
更に本発明は、
(a) 体液中の試料を、ある抗原（ハプテンも含
む）に対して特異性を示す免疫グロブリンＦ
（ab′）2断片と、もう一方の断片であるFc断片と
の混合物を感作したラテツクス粒子と混合し反
応混合物をつくる。
む）に対して特異性を示す免疫グロブリンＦ
（ab′）2断片と、もう一方の断片であるFc断片と
の混合物を感作したラテツクス粒子と混合し反
応混合物をつくる。
(b) 試料中に存在する抗原と反応させるように反
応混合物をインキユベートする。
応混合物をインキユベートする。
(c) 前記反応の程度を測定し、体液試料中の抗原
の存在量を検定する。
の存在量を検定する。
(a)、(b)、(c)各工程から成る体液試料中の抗原の
存在量を決定することを特徴とする免疫検定法で
ある。
存在量を決定することを特徴とする免疫検定法で
ある。
本発明に使用する免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片とFc断片の混合物は、公知の方法、例えばペ
プシンを用いた酵素分解により分解し、その分解
混合物をそのまま分解することなく使用する。以
下に分解混合物の調製例を示す。
片とFc断片の混合物は、公知の方法、例えばペ
プシンを用いた酵素分解により分解し、その分解
混合物をそのまま分解することなく使用する。以
下に分解混合物の調製例を示す。
調製例
免疫グロブリン100mgを蒸留水に溶解し10mlと
し、結晶クエン酸を添加しPH4.5に調整する。次
いでペプシン0.2mgを加えた後、37℃、96時間イ
ンキユベートし、免疫グロブリンＦ（ab′）2断片と
Fc断片の混合物を得る。
し、結晶クエン酸を添加しPH4.5に調整する。次
いでペプシン0.2mgを加えた後、37℃、96時間イ
ンキユベートし、免疫グロブリンＦ（ab′）2断片と
Fc断片の混合物を得る。
本発明は、ある抗原と免疫グロブリンとの間の
特異的な反応は起こすが、RA因子または／およ
びC1qと免疫グロブリンとの間の反応は要求され
ない免疫検定法において、免疫グロブリン全体も
しくは免疫グロブリンＦ（ab′）2断片単独の感作ラ
テツクス粒子の代りに、免疫グロブリンＦ（ab′）2
断片とFc断片の混合物感作ラテツクス粒子を広
く使うことができる。
特異的な反応は起こすが、RA因子または／およ
びC1qと免疫グロブリンとの間の反応は要求され
ない免疫検定法において、免疫グロブリン全体も
しくは免疫グロブリンＦ（ab′）2断片単独の感作ラ
テツクス粒子の代りに、免疫グロブリンＦ（ab′）2
断片とFc断片の混合物感作ラテツクス粒子を広
く使うことができる。
上記、混合物感作ラテツクス粒子と抗原との特
定の結合は、ラテツクス粒子の凝集を起こす。凝
集の程度は肉眼で観察することにより定性的判定
ができ、未凝集の粒子の自動的計数、または凝集
に光を照射し、その吸光度の測定により定量的判
定ができる。
定の結合は、ラテツクス粒子の凝集を起こす。凝
集の程度は肉眼で観察することにより定性的判定
ができ、未凝集の粒子の自動的計数、または凝集
に光を照射し、その吸光度の測定により定量的判
定ができる。
更に本発明の免疫グロブリンＦ（ab′）2断片とFc
断片の混合物感作ラテツクス粒子は、微量抗原物
質を免疫化学的に分離するための免疫化学的分離
試薬として使用することができる。すなわち、ラ
ジオイムノアツセイあるいは酵素抗体法に用いら
れる第二抗体用免疫化学的分離試薬として用いる
ものである。
断片の混合物感作ラテツクス粒子は、微量抗原物
質を免疫化学的に分離するための免疫化学的分離
試薬として使用することができる。すなわち、ラ
ジオイムノアツセイあるいは酵素抗体法に用いら
れる第二抗体用免疫化学的分離試薬として用いる
ものである。
本発明による免疫検定法による定量的検定法と
しては連続流動法によるのが好ましく、半定量的
検定法としては反応板、スライド板上で肉眼的に
判定する迅速測定法により実施することできる。
しては連続流動法によるのが好ましく、半定量的
検定法としては反応板、スライド板上で肉眼的に
判定する迅速測定法により実施することできる。
以下に実施例を記し、本発明を詳細に説明す
る。
る。
実施例 １
物理的結合によるＦ（ab′）2断片とFc断片混合物
感作ラテツクス粒子の調製 ラテツクス粒子（Dow社製、直径0.220μ）の30
％懸濁液をPH8.2の0.2Mアンモニウム／0.154M塩
化ナトリウム緩衝液で30倍に希釈し、この緩衝液
で２度遠心洗浄する。１mlあたり10mgのＦ（ab′）2
断片とFc断片混合物溶液と前記緩衝液で２％の
濃度に調製したラテツクス懸濁液とを１：20の割
合で混合し、37℃、120分間インキユベートした。
余剰のＦ（ab′）2断片とFc断片混合物は前記緩衝液
を使用し遠心洗浄した。次にウシ血清アルブミン
１％添加緩衝液で1.0％、つまり初濃度にくらべ
30倍に希釈されているラテツクス懸濁液をつく
る。
感作ラテツクス粒子の調製 ラテツクス粒子（Dow社製、直径0.220μ）の30
％懸濁液をPH8.2の0.2Mアンモニウム／0.154M塩
化ナトリウム緩衝液で30倍に希釈し、この緩衝液
で２度遠心洗浄する。１mlあたり10mgのＦ（ab′）2
断片とFc断片混合物溶液と前記緩衝液で２％の
濃度に調製したラテツクス懸濁液とを１：20の割
合で混合し、37℃、120分間インキユベートした。
余剰のＦ（ab′）2断片とFc断片混合物は前記緩衝液
を使用し遠心洗浄した。次にウシ血清アルブミン
１％添加緩衝液で1.0％、つまり初濃度にくらべ
30倍に希釈されているラテツクス懸濁液をつく
る。
抗血清の調製
CRP抗血清をフロインドコンプリートアジユ
バンドを使つてウサギに免疫し作製した。
バンドを使つてウサギに免疫し作製した。
自動的に操作される検定
患者の血清を１秒間に0.1mlの割合で定流量ポ
ンプ、多岐管、粒子計数器および記録計から成る
連続流動系に吸収する。血清をアンモニウム緩衝
液で懸濁されたラテツクス粒子0.5mlと混合し、
インキユベートコイルを20分間通過させる。次い
で、この溶液を粒子計数器に流し、ここで未凝集
粒子を計数し、血清中のCRPを測定する。血清
中のCRP濃度は1ng／ml〜100ng／mlの範囲で測
定可能であつた。
ンプ、多岐管、粒子計数器および記録計から成る
連続流動系に吸収する。血清をアンモニウム緩衝
液で懸濁されたラテツクス粒子0.5mlと混合し、
インキユベートコイルを20分間通過させる。次い
で、この溶液を粒子計数器に流し、ここで未凝集
粒子を計数し、血清中のCRPを測定する。血清
中のCRP濃度は1ng／ml〜100ng／mlの範囲で測
定可能であつた。
また患者10人の血清試料を用いて測定した結
果、５％のCV値が得られ、同様の試料を用いた
一次元免疫拡散法で得られた成積との比較の相関
係数は0.93を示した。
果、５％のCV値が得られ、同様の試料を用いた
一次元免疫拡散法で得られた成積との比較の相関
係数は0.93を示した。
実施例 ２
化学的結合によるＦ（ab′）2断片とFc断片混合物
感作ラテツクス粒子の調製法 カルボキシ化ラテツクス粒子（Dow社製、直
径0.255μ）の10％懸濁液を0.1Mトリスー塩酸／
0.154M塩化ナトリウム緩衝液（PH8.4）で10倍に
希釈する。それに１％濃度のＦ（ab′）2断片Fc断片
混合溶液を40：１の割合で混合し、共有結合させ
る。実施例１と同様に遠心洗浄後、ヒト血清アル
ブミン含有0.1Mトリスー塩酸／0.154M緩衝液
（PH8.4）で１％懸濁液に調製する。
感作ラテツクス粒子の調製法 カルボキシ化ラテツクス粒子（Dow社製、直
径0.255μ）の10％懸濁液を0.1Mトリスー塩酸／
0.154M塩化ナトリウム緩衝液（PH8.4）で10倍に
希釈する。それに１％濃度のＦ（ab′）2断片Fc断片
混合溶液を40：１の割合で混合し、共有結合させ
る。実施例１と同様に遠心洗浄後、ヒト血清アル
ブミン含有0.1Mトリスー塩酸／0.154M緩衝液
（PH8.4）で１％懸濁液に調製する。
抗血清の調製
HPL抗血清をフロインドコンプリートアジユ
バンドを使つてヤギに免疫し作製した。
バンドを使つてヤギに免疫し作製した。
手動的に操作する検定
上記で作成したＦ（ab′）2断片とFc断片混合物感
作ラテツクス試薬0.1mlと前記トリス緩衝液0.1ml
とをアクリル製樹脂のセル（層長10mm）に入れ混
合する。
作ラテツクス試薬0.1mlと前記トリス緩衝液0.1ml
とをアクリル製樹脂のセル（層長10mm）に入れ混
合する。
次いで妊娠人血清0.1mlを加え振とう混合しな
がら37℃、30分間インキユベートする。その後前
記緩衝液3.1mlを加え良く振とうした後、900nｍ
の吸光度を測定し盲検の吸光度との差を求め、標
準HPLを用いて作製した検量線より血清中の
HPL濃度を測定する。
がら37℃、30分間インキユベートする。その後前
記緩衝液3.1mlを加え良く振とうした後、900nｍ
の吸光度を測定し盲検の吸光度との差を求め、標
準HPLを用いて作製した検量線より血清中の
HPL濃度を測定する。
血清中のHPL濃度は、2nｇ／ml〜500nｇ／ml
の範囲で測定可能であつた。またラジオイムノア
ツセイ法で得られた成績との相関係数は0.95を示
した。男性RA患者血清20例での成績はいずれも
HPL濃度5nｇ／ml以下を示し、RA因子の影響を
受けないことが示された。
の範囲で測定可能であつた。またラジオイムノア
ツセイ法で得られた成績との相関係数は0.95を示
した。男性RA患者血清20例での成績はいずれも
HPL濃度5nｇ／ml以下を示し、RA因子の影響を
受けないことが示された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 免疫グロブリンＦ（ab′）2断片とFc断片との混
合物を、平均粒径が0.1μ〜1.0μのラテツクス粒子
に感作させ、得られた感作ラテツクス粒子と体液
中の抗原とを反応させることから成る免疫検定
法。 ２ 体液試料を免疫グロブリンＦ（ab′）2断片とFc
断片との混合物感作ラテツクス粒子と混合して反
応混合物とし、試料中の抗原と、抗原に対して特
異性を示す免疫グロブリンＦ（ab′）2断片との反応
により生じるラテツクス凝集の程度を肉眼で判定
するか、もしくは波長0.3μ〜1.8μの光を照射し、
その吸光度または散乱光の強度を測定することに
より、抗原の存在量を決定することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の免疫検定法。 ３ ラテツクス凝集の程度を反応混合物中に残つ
ている未凝集ラテツクス粒子あるいは凝集ラテツ
クス粒子の選択的計数により抗原の存在量を決定
することを特徴とする特許請求の範囲第１項また
は第２項記載の免疫検定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6543480A JPS56162055A (en) | 1980-05-19 | 1980-05-19 | Method for determining immunity using immunoglobulin fragment mixture sensitizing latex particles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6543480A JPS56162055A (en) | 1980-05-19 | 1980-05-19 | Method for determining immunity using immunoglobulin fragment mixture sensitizing latex particles |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56162055A JPS56162055A (en) | 1981-12-12 |
| JPS6363863B2 true JPS6363863B2 (ja) | 1988-12-08 |
Family
ID=13286994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6543480A Granted JPS56162055A (en) | 1980-05-19 | 1980-05-19 | Method for determining immunity using immunoglobulin fragment mixture sensitizing latex particles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56162055A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2604526B1 (fr) * | 1986-09-30 | 1990-12-21 | Indicia Ste Civile Etu Rech | Procede et dispositif de dosage de substances d'interet clinique reactives immunologiquement |
| CN102749445A (zh) * | 2012-06-29 | 2012-10-24 | 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 | 一种提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1087285B (it) * | 1976-11-10 | 1985-06-04 | Hoffmann La Roche | Procedimento di determinazione immunologico |
| ES471585A1 (es) * | 1977-07-15 | 1979-01-16 | Behringwerke Ag | Procedimiento para la determinacion de reactivos fc |
| GB2013211B (en) * | 1978-01-26 | 1982-06-30 | Technicon Instr | Immunoassays using f(ab')2 fragments |
| JPS54109494A (en) * | 1978-02-16 | 1979-08-28 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Method of measuring antigennantibody reaction |
-
1980
- 1980-05-19 JP JP6543480A patent/JPS56162055A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56162055A (en) | 1981-12-12 |
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