JPS636462A - パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は特定成分の測定方法に関し、特にパーオキシダ
ーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法に関する。

【従来技術】

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開発
されて米でいるが、それらの方法の中量も精度の高い方
法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合しう
る物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と抗
体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビノン、プ
ロティンＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプター、酵素と基
質等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られている
。 −般的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合物
質（以後標識体と称する）を用い特定成分に応じて変化
した該標識のシグナルを検出することにより特定成分の
測定が行われる。 特に支持体に直接的にまたは間接的に担持させた特定成
分を標識体と゛反応させ、両者の複合体として標識体を
固定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナル
を検出する方法が適宜用いられる。 例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をデル
からニトロセルローズ膜上に転写担持し、標識体たとえ
ば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、ＴＬ
Ｃプレート上に７１１］１１した脂質等の特定成分に標
識体を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤＮＡ
と該ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応させ
シグナルを検出する方法或は免疫ｆｆｉ鳳化学染色法な
どである。 これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでなく、特定成分もしくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報をう
ろことができる０例えば電気泳動後膜上に展開、担持さ
れた蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開した脂質成分
等の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体とを結
合させた複合体上にシグナルを検出する方法に於ては特
定成分のシグナルの位置、移動度から該特定成分の分子
量、等電点或は極性等の情報かえられる。 また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とする
特定成分の存在場所、状態等の情報かえられる。

【発明が解決しようとする問題点】

前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた複
合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検
出する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量で
あるため標識が高感度に検出されること、また特定成分
に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が高い
分解能をもったものであることが必須である。 特異結合物質の標識としては、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、酵素等が用いられている。 放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は膜管
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材料の
感光、現像など長い時間と煩雑な操作を要する欠点があ
る。 蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必要で
ある。 一方、Ｗ！を素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成
色素はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、
標識酵素としてパーオキシダーゼ、７ルカリ７オス７ア
ターゼ、β−がラクトシグーゼ等が用いられてきた。支
持体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反応により色
素を生成、沈着させる方法において、標識酵素としてパ
ーオキシダーゼが主として用いられ、その際、基質とし
て、従来ノアミ／ベンツノン、０−ノアニジノン、４−
クロロ−１−す７トール等が使用されてきた。 ノアミノベンツノンや０−ノアニジノンは毒性が強くバ
ックグランドが出やすい欠点がある。４−クロロ−１−
す７トールは他に比べやや感度が高いが、より微量の特
定成分を測定するため、もしくは、特定成分に対するよ
り多くの情報を明確に得るには、感度は充分とは言えな
い。 従って本発明の目的は、簡易に且つ高感度、高分解能で
ありしかも迅速な特定成分の測定方法を提供することで
ある。

【問題点を解決するための手段】

前記目的に沿って種々検討した結果、測定対象の特定成
分とパーオキシダーゼを標識として有する標識体とから
なる複合結合体を支持体上に担持せしめ、該複合結合体
上にパーオキシダーゼの酵素反応によって色素を形成、
沈着せしめる特定成分の測定方法に於て、該酵素反応の
基質として過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及び
フェノール化合物の三者を用いる測定方法によって問題
点が解消され、前記本発明の目的が達成される。 次に本発明の詳細な説明する。 本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸着、化学的結
合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の特異
結合物質を介して間接的に担持されてもよい。又、特定
成分を支持体上に直接もくくは間接的に担持せしめた後
、前記Ｈａ体を反応させ前記複合結合体を形成させても
よいし、或は複合結合体を形成せしめた後に該複合結合
体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめてもよ
い。更にＰＸ：ｆ＆体は該特定成分と複合結合体を形成
し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結
合してもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介して結
合してもよい。 また本発明に於て標識体はパーオキシダーゼと抗パーオ
キシグーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識したも
のであってもよい。 複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反応のパーオキ
シダーゼの基質としては、過酸化水素、芳香族第一級ア
ミン化合物及び７工ノール化合物を用いる。パーオキシ
ダーゼと過酸化水素の作用により芳香族第一級アミン化
合物は酸化され、次いでフェノール化合物とカップリン
グして鮮かな青色色素が生成、沈着する。 従来の過酸化水素及び４−りａａ−１−六７トールを基
質として用いるアナリティ力ルバイオヶミ　ス　ト　リ
　−　（＾ｎａｌｙＬｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）　里、　１４２−１４７（１９８２）に記載の
方法と比べ本発明の方法は発色時間が短縮され、スポッ
トは鮮明で感度は１０倍以上上昇した。また、その結果
、パーオキシグ−ゼ標識体の量を低減する事ができコス
ト的にも有利である。 本発明において、対象とする特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質又は物
質群である。 たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げら
れる。 また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。たとえば、蛋白
質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖類
、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロティン
Ａ１アビジン、ビオチン、レセプター、補＃素、酵素の
基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられる。 本発明に使用し得る支持体としては、セルロースアセテ
ート、ニトロセルロース等の膜、ポリアクリルアミド等
のデル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカゾル担体、
プレート状、ビーズ状のプラスチック、ガラス、金属、
ＪａＪｌｌ等が挙げられる６また組繊化学染色において
は、ｍｍそのものも支持体として使用できる。 本発明において使用し得る芳香族第一級アミン化合物と
しては、〇−又はｐ−７ミノフ工ノール系化合物及び〇
−又はｐ−フェニレンジアミン系化合物及びそれらの塩
が挙げられる。 好ましくはｐ−フェニレンジアミン系化合物であり下記
−般式（１）で示されるものである。 −般式〔（〕 式中、Ａ及びＢは水素原子またはアルキル基を表し、Ａ
とＢは窒素原子と共に複素環を形成してもよく、Ｄ　、
Ｅ　、Ｇ及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、アミ７基、アルコキシ基、アシルアミド基、アリー
ルスルホンアミド基、フルキルスルホンアミド基または
アルキル基を表わす。 Ａ及びＢで表されるアルキル基としては、炭素原子数１
乃至６のものが好主しく、特に１乃至４のものが好まし
い０例えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙げること
ができる。これらのアルキル基は置換基を有していても
よく置換基としては、例えばウレイド基、テトラヒドロ
７リル基、カルボキシル基、メタンスルホンアミド基、
スルホ基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシエトキシ
基、／トキシエトキシエトキシ基、メトキシテトラエト
キシ基が亭げられる。 Ｄ、Ｇ及びＪとしては水素原子、アルコキシ基及びフル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基が好
ましく、さらに好ましくは水素原子である。Ｅとしては
水素原子、アルキル基、アシルアミド基が好ましく、よ
り好ましくは炭素原子数１〜３のアルキル基特にメチル
基である。また、−般式（１）で示される化合物の塩と
してはｐ−トルエンスルホン酸、スルホン酸、スルフィ
ン酸、硫酸エステル、スルファミン酸、チオ硫酸Ｓ−エ
ステル、カルボン酸、リン酸エステル、アミドリン酸、
リン酸、亜リン酸エステル、有機ホウ素化合物、塩酸及
び硫酸等の有機酸又は無機酸の塩を挙げることができ、
特にｐ−）ルエンスルホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好
ましい。 以下に本発明に係る芳香族第１級アミン化合物の代表的
具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 例示化合物 （１−１）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−フミノ
アニリン （１−２）Ｎ、Ｎ−ジエチル−４−フミノフニリン（１
−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−７ミノ
アニリン （１−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフ
ルフリル−３−メチル−４−７ミノアニリン（１−５）
Ｎ−エチル−Ｎ−カルボキシメチル−３−メチル−４−
７ミノアニリン （１−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メ
チル−４−７ミノアニリン （１−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフル７リルー
３−メチル−４−７ミノフエノール（１−８）３−７セ
チルアミノー４−アミツノメチルアニリン （１−９）Ｎ−エチル−Ｎ−βメタンスルホンアミドエ
チル−４−７ミノアニリン （１−１０）Ｎ−エチル−Ｎ−β−７タンスルホンアミ
ドエチルー３−メチル−４−アミノアニリン（１−１１
）Ｎ−メチル−Ｎ−βスルホエチル−ｐ−フェニレンジ
アミン （１−１２）Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキンエチル−３−
メチル−４−アミノアニリン （１−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（２−メトキシエ
トキシ）エチル〕−３−メチルー４−アミ７アニリン （１−１４）Ｎ−エチル−Ｎ−１２−Ｃ２−＜２−メト
キシエトキシ）エトキシ〕エチル）−３−メチル−４−
７ミノアニリン （１−１５）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−１２−Ｃ２−Ｃ２
−（２−ノドキシエトキシエトキシ）エトキシ〕エトキ
シ〕エトキシ）エチル〕−３−メチルー４−アミ／アニ
リン （１−１６）Ｎ、Ｎ−ノエチル−３、メタンスルホンア
ミドエチル−４−７ミノアニリン。 −般式（１１で示される化合物の塩は、−般的に水溶性
であり、水もしくは緩衝液中に容易に溶解する事ができ
る。 本発明において使用し得る７１／−ル化合物は、芳香族
第一級アミン化合物の酸化体とカップリングして色素を
生成する化合物であり、該生成色素の水に対する溶解性
を滅するため、ベンゼン環上に適当な置換基を置換した
フェノール化合物である。 該フェノール化合物の中でも好ましいのは、ヒドロキシ
ル基の４位が置換されていない又は芳香族第一級アミン
化合物の酸化体とカップリング反応する際に離脱しうる
基（以下、離脱基と称する）もしくは原子（以下離脱原
子と称する）で置換されているフェノール化合物である
。 本発明において有利に用いられる７エ／−ル化合物は次
の一般式［［［］で示される。 一般式（ＩＩ） Ｏ１＋ 式中Ｒ３は一価の有機基又は原子を表し、２は水素原子
、離脱基又は離脱原子を表し、ｋは１乃至４の整数を表
す。 Ｚで表される離脱原子としては、ハロゲン原子例えば、
塩素原子、臭素原子が挙げられる。 Ｚで表される離脱基としては、例えば−０Ｒ２゜−０Ｃ
ＯＲ２，−０ＳＯ□Ｒ２、−ＳＲ２、−０ＣＯＮ）ＩＲ
、、−０ＳＯ□ＮｌｌＲ２゜れる、ここにＲ２及びＲ１
は水素原子、脂肪族炭化水素残基、脂環式化合物残基、
アリール基又はヘテロ環残基を表す６ Ｒ，で表される原子としてはハロゲン原子例えば塩素原
子、臭素原子が挙げられる。 Ｒ，で表される一価の有機基としては、例えば脂肪挨炭
化水素残基、脂環式化合物残基、ヘテロ環残基、アリー
ル基、　−５ＣＮ、　−ＯＲ，、−０ＣＯＲ，、−０Ｓ
Ｏ□Ｒ，、−ＳＲ，。 Ｒ１ びＲ５は水素原子、脂肪族炭化水素残基、脂環式化合物
残基、アリール基又はヘテロ環残基を表す。 Ｒ，、Ｒ，、Ｒ）、Ｒ４及びＲ５で表される脂肪族炭化
水素残基としては飽和のもの不飽和のもののいずれでも
よく、また直鎖のもの、分岐のもののいずれでもよい。 そして好ましくはアルキル基（例えばメチル基、エチル
基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、し−ブチ
ル基、イソブチル基、ドデシル基、オクタデシル基の各
基）、アルケニル基（例えばアリル基、オクテニル基等
の各基）である。 ＲｚＲｚ、ＲｉｔＲ−及びＲ１で表される脂環式化合物
残基としては５乃至６貝のもの、例えばシクロペンチル
基、シクロヘキシル基が挙げられる。 Ｒ＋、Ｒ２，Ｒ＊＋Ｒ＋及びＲ５で表されるヘテロ環残
基としてはビリノニル基、ビラノニル基、ビリグツニル
基、キ７リル基、ピロリノル基、７ラリル基、チエニル
基、ピペリジル基、ピロリル基　ピロリニル基、テトラ
ゾリル基、チアゾニル基、イミダゾリル基、モルホリル
基、フリル基、オキサシリル基、チアゾリル基、ベンツ
イミダゾリル基、ベンツオキサシリル基、ベンツチアゾ
リル基等の各基が代表的である。 Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ４及びＲ９で表されるアリール基
としてはフェニル基、ナフチル基が代表的である。 前述の２つのＲ３が結合して形成するベンゼン環に融合
する非芳香族環としては５乃至６貝のもの例えばシクロ
ペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環が挙
げられる。 前述の２つのＲ１、特に５位と６位のＲ２が結合して形
成するベンゼン環と融合する芳香族環としては、５乃至
６員のものたとえば、フェニル基、ビリノニル基、ピラ
ジニル基、ビリグツニル基、ピロリジル基、７ラリル基
、チエニル基、ピペリノル基、ピロリル基、ピロリニル
基、チアジニル基、イミダゾリル基、フリル基、オキサ
シリル基、チアゾリル基等、が挙げられる。 以上のＲ，、Ｒ２，Ｒ，、Ｒ，及びＲ１で表される脂肪
族炭化水素残基、脂環式化合物残基、アリール基、ヘテ
ロ環残基、並びに前述の２つのＲ１が結合して形成する
非芳香族環、芳香族環は置換基を有していてもよい。 かかる置換基としては、例えばハロゲン原子（例えば塩
素原子、フッ素原子）、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキ
シ基、ケト基、カルボキシル基、スルホ基、アミ７基（
例えば、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミ／、
アニソ／、Ｎ−フルキルアニソ／）、アルキル基（例え
ば、メチル、プロピル、イソプロピル、し−ブチル、オ
クタデシル、シアノアルキル、ハロアルキル、アルアル
キル）、アルケニル基、アリール基（例えば、フェニル
、トリル、アセチルアミノ７ヱニル、４−ラウロイルア
ミノフェニル、エトキシフェニル）へテロ環残基、アル
コキシ基（例えば、エトキシ、７エ／キシ、メトキシ、
テトラデシルオキシ）、アリールオキシ基（例えば、フ
ェノキシ、２．４−ノーｔ−７ミル７エ／キシ、ｐ−ｔ
−ブチルフェノキン、４−ｎ−ドデシルオキシ７ヱノキ
シ、４−ヒドロキン−３−ｔ−ブチルフェノキシ、４−
ヒドロキシ−３−ｎ−ブチルフェノキシ）、アリールチ
オ基、アミド基（例えば、アセトアミド、メタンスルホ
ンアミド、ｐ−ドデシルベンゼンスルホンアミド）、カ
ルバモイル基（例えば、Ｎ−ｐ−カルボキシナトキシフ
ェニルカルバモイル、Ｎ、Ｎ−）へキンル力ルパモイル
、Ｎ−ベンジルカルバモイル、Ｎ−エチルカルバモイル
、Ｎ−７トキシエチルカルバモイル）、スル７７モイル
基（例えば、Ｎ、Ｎ−ノエチルスル７アモイル）、フル
キルスルホニル基、７リールスルホニルｉ（例えば、ベ
ンゼンスルホニル、クークロロベンゼンスルホニル）、
アシル基（例えば、アセチル、ｐ−クロロベンゾイル、
ベンゾイル）、アシルオキシ基（例えば、アセチルオキ
シ、ｍ−タロロペンゾイルオキシ）、アシルオキシカル
ボニル基及びアルコキシカルボニル基（例えば、Ｎ−メ
トキンエチルカルバモイルメトキシカルボニル、エトキ
シカルボニル、メトキシカルボニル、トリエトキシカル
ボニル）、アリールオキシカルボニル基（例えばフェノ
キシカルボニル、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル）、
了り一ルチオカルボニル基（例えば、フェニルチオカル
ボニル）、イミド基（例えば、サクシンイミド、オクタ
デシルサクシンイミド）が挙げられる。 以下に本発明の７１／−ル化合物の代表的具体例を示す
が、本発明に泪いられる化合物はこれに限定されるもの
ではない。 例示化合物 （２−１）　　２−ベンツルー４−クロロフェノール（
２−２）　　Ｎ−ベンゾイル−４，６−フクロロー５−
メチル−２−フミノフエノール （２−３）　　２−ベンゾイルアミノ−５−７セトアミ
ノー４−クロロ７エ７−ル （２−４）　　　４−クロロ−１−す７トール（２−５
）　　　４−メトキシ−１−す７トール（２−６）　　
２．４−ジクロロ−１−す７トール（２−７）　　１−
ヒドロキシ−４−プロモーＮ−エチル−２−す７トアミ
ド （２−８）　　１−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｎ−プ
ロピル−２−す７トアミ　ド （２−９）　　２．６−ノプロモー１，５−ノヒドロキ
ンーナ７タレン （２−１０）　　１−ヒドロキシ−５−フェニルスルホ
ンアミドナフトール （２−１１）　　１−ヒドロキシ−２，４−ジクロロ−
５−二トローナフトール 支持体に担持された特定成分とパーオキシグーゼ標識体
との複合結合体上に色素を生成沈着せしめるには１発色
用基質試液中に支持体を浸漬させれば良い６発色用基質
試験液は、適当なｐＨの緩衝液中に過酸化水素、芳香族
第一級アミン化合物及び７エ／−ル化合物を溶解し、調
製される。フェノール化合物は、少量の親水性の有機溶
剤たとえばメタ／−ル、エタノール、ＤＭＦ等に溶解し
て加えても良い。 芳香族第一級アミン化合物と７二ノ一ル化合物とのモル
比は１対１００から１００対１が適当であり、１討１０
からの１ＯＮ１が好ましい。 酵素反応により支持体上に色素が充分生成沈着した後、
未反応物質を洗い流し、反応を停止する。 生成色素についての情報は、目視にて、もしくは技術的
に公知な方法たとえば分光度計を用いて読み取る事がで
きる。

【実施例】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。 実施例に ニトロセルロース膜上での抗原の測定：純水にて洗浄後
、風乾したニトロセルロース膜（バイオラッド社製；厚
み０．４５μ屑）に、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと称す
）にて段階希釈したヤギＩｇＧの１μｌをス叡７トした
。 風乾後１％牛血清アルブミン（ＢＡＳ）−ＰＢＳ溶液に
より４℃にて一晩ブロッキングを行い、次いでバーオキ
シグーゼ楳識つサぞ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社製：
１％ＯＳ八−ＰへｌＳ溶液により１５００倍希釈したも
の）と４°Ｃ２時間反応させた。０．０５％Ｔｕ＋ｅｅ
ｎ　２０（ポリオキシエチレンソルビタンモ／ラウレー
）　；和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し発色
用基質試液中に浸漬した。　発色用基質試液は次の３種
を用い、比較した。。 （１）　　：　３ｍｇの１−４−クロロ−１−す７トー
ルを１ｚｌのメタノールに溶解し、５ｚｌの０．０５Ｍ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４，２００ｘＨＮａＣ１
含有；以下ＴＢＳと称す）を加えるさらに３％過酸化水
素２０μｌを加える。 （２）＝（１）の試液にＮ−エチル−Ｎ−β−メタンス
ルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミ／アニリン
３／２硫酸１水塩１１ｇを加えた。 （３）：（１）の試液にＮ、Ｎ−ジエチル−３−メチル
−４−７ミノアニリン塩酸塩１簾２を加えた。 １５分間反応後、充分水洗し、風乾した。発色用基質試
液（１）を用いた場合、スポットは灰紫色であり１、　
Ｏｚ　ｇのヤギＩｇＧ　Ｌか検出できなかったが発色用
基質試液（２）及び（３）を用いた場合スポットは鮮や
かな青色で１ａｇのヤギＩｇＧが検出可能であった。　
　　′実施例（２） ：　ＴＬＣプレート上での糖脂質抗原の測定：ＴＬＣプ
レート（ポリグラム、マチエリ−・ナーデル社製）上に
牛脳より分離精製したＧＭ、が〃ングリオシドな量を変
化させクロロホルム、メタノール混合液に溶解しスポッ
トした後、クロロホルム対メタノール対０．５％塩化カ
ルシウム水溶液（５５対４５対１０　Ｖ／Ｖ）の展開液
にて展開した。風乾後１％ポリビニルピロリドン、１％
オパルプミンーＰＢＳ溶液にて４℃、−晩ブロッキング
し、ウサギにて作製した。抗ＧＭいガングリオシド抗血
清（１％ポリビニルピロリドン、１％オパルプミンーＰ
ＢＳ溶液にて５００倍希釈）と３７°Ｃ２時間反応させ
た。 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳ溶液にて３面洗浄
後パーオキシグーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン
抗体（カッベル社！：３％ポリビニルピロリドン−ＰＢ
Ｓ溶液にて１５００倍希釈）と３７℃、２時間反応させ
た。 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ　−２０−ＰＢＳＳ液にて３回洗
浄後発色用基質試液中に浸漬した０発色用基質試液は次
の３種を用い、比較した。 （１）：実施例１の（１）と同様 （２）　：　（１）にＮ−エチル−Ｎ−ヒドロキシルエ
チル−３−メチル−４−７ミノアニリン硫ｆｉｌ水塩ｆ
ｇを加えた。 （３）　：　（２）の試液中、４−クロロ−１−ナフト
ールの代わりに４−メトキシ−１−す７トールを用いた
。 １５分間反応後充分水洗し、風乾した。 （１）の発色用基質試液を用いた場合、スポットは灰紫
色であり、４ＨのＣＭ、ｙングリオシドしが検出できな
かったが、（２）及び（３）の試液を用いた場合、スポ
−／　）は鮮かな青色で０，２ｘｇまで検出可能であっ
た。 実施例３ ：抗体及びハイプリドーマのスクリーニング：αビアフ
チトリプシン５０μ 全アジュバントと共にＢａｊｊｂ／Ｃマウス（雌、６週
齢）の腹腔内に注射した。３週間後、さらにαピアンチ
トリプシン５０μｇを７０インドの不完全７ジユバンド
と共に腹腔内に注射し、さらに２週間後α１ーアンチト
リブＦン３０μｇをＰＢＳに溶解し、静脈注射した。 最゛終免疫の３日後＃臓細胞を取り出し、常法に従い、
マツスミエローマ細胞Ｘ　６３．６．５．３と融合した
。９６穴プレ一ト５枚に分配しＨＡＴ選択培地にて培養
した。 融合の３週間後ハイプリドーマのコロニーが生成したウ
ェルについて、抗体の測定を以下の方法にて行った。 ニトロセルロースを４λｌ角の正方形に切断し、おのお
のにαビアフチトリプシン５００μｙ／ｚＩＰＢＳ溶液
１μｉをスポットした．９６穴マイクロタイタープレー
）１六当ｒ）１枚ずつ加え、１％ＩＩＩＡｓ−Ｐ［ｌＳ
溶液にで４℃、１晩ブロツキングした。ＰＢＳにて洗浄
後、ハイプリドーマの培養上ｆｆ１４０μｌを加え、室
温にで２時間反応させた．０．０５％Ｔｗｅｅｎー２０
ーＰ［ｌＳ溶液にで３回洗浄した後、バーオキシグーゼ
標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カフベル社製
；１％ＢＡＳ−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したちの
）を４０μ！加え、室温にて２時間反応させた，　０．
０５％Ｔ＊ｅｅＩＩー２０ーＰＢＳ溶液にて３回洗浄後
、発色用基質試液を加え、ニトロセルロース上に色素が
生成したものを抗体活性陽性としｒ二０発色泪基質試液
として （１）：実施例１の（１）と同様 （２）　：　（１）にＮ，Ｎ〜ノエチル−４−アミノア
ニリン硫酸塩１りを加えた、の２種票を用い比較した。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼを標識
   として有している標識体とから成る複合結合体を支持体
   上に担持せしめ、該複合結合体上にパーオキシダーゼの
   酵素反応によって色素を形成、沈着せしめる特定成分の
   測定方法において、該酵素反応の基質として過酸化水素
   、芳香族第一級アミン化合物及びフエノール化合物の三
   者を用いることを特徴とする特定成分の測定方法。
2. （２）前記特定成分を支持体上に直接もしくは間接的に
   担持せしめた後、前記標識体を反応させ、複合結合体を
   形成せしめることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の特定成分の測定方法。
3. （３）前記複合結合体を形成せしめた後に、該複合結合
   体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の特定成分の測
   定方法。