JPS5990054A

JPS5990054A - ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬

Info

Publication number: JPS5990054A
Application number: JP20089782A
Authority: JP
Inventors: Koichi Kondo; 孝一近藤
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-11-15
Filing date: 1982-11-15
Publication date: 1984-05-24
Also published as: DE3376508D1; EP0109078A1; JPH038512B2; EP0109078B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明＆Ｊ：ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、［ｈｃ
ＧＪと略称することもある。）の酵素免疫測定法（以下
、「Ｅ工Ａ」と略称することもある。）に関するもので
ある。

従来、ｈ　ＣＧのｌ′ｉ：　Ｉ　Ａについては次の２法
が提案されている。

（１）競合法：酵素で標識した一定量のｈＣＧを含有す
る物質と、未知量のｈｃＧを含有する物質とを抗ｈＣＧ
抗体に対して競合的に結合させ、抗体と結合した酵素の
酵素活性もしくは抗体と結合しなかった酵素の酵素活性
を測定し、その測定結果を、予め既知１七のす、　ＣＧ
において同様にして得られた結果とり１比することによ
り定量を行う方法。

（２）ザンドイツチ法：未知旦のｈＣＧを含有する物質
を、抗ｈＣＧ前、体を用いて固定し、これに酵素で標識
した抗体を結合させて、その酵；に活性をｎ１１）定し
定１号する方法。

本発明者は、上記（１）の競合法においては特定のβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識体と特定の抗体とを用いると
高感度で高特異性の微量定風が可能であることを見出し
た（特開昭５６−１３８２４８号公報参１！α）。寸だ
上記（２）のサンドイツチ法においては、担イ・ト上に
保持された抗体、抗原および標ｎｊ’、ｌｉ剤を結合さ
亡だ抗体を用いるＥＩＡにおいて、担体上に保持される
抗体と標識剤を結合する抗体とが互いに抗原決定部位を
重複しない２種の抗体であり、該抗体のうち一方がＩＣ
Ｇに特異的に反応する抗体であることを特徴とするｈＣ
ＧのＥＩＡが高感度、高精度、高特異性であることを見
出した（特開昭５７−６７８５８号公報参照）。

しかしながらこれらの方法においてもなお、約０．１．
−２ｍＩＵ　以下の微量ｈＣＧを粘度よく測定すること
はｔ）！ｉ　Ｌ　＜　、悪性腫瘍のより確かな診断と経
過観察あるいは正常人におけるその生理学的意義を決定
する上では、更に感度の高い測定法が必要とされた。

本発明者は上記の事情に鑑み、更に検討を重ねたところ
、上記特異抗体を用いるサンドイツチ法によるＥＩＡに
おいて、抗ｈＣＧ抗体を用いてペルオキシダーゼと結合
させることにょシ得られる抗体−酵素標識体が高感度、
高精度の微量定量を可能にすることを見出しだ。これに
基づいてさらに研究をした結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定法にお
いて、担体上に保持される抗体と標識剤を結合させる抗
体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体であ
り、担体上に保持される抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンに特異的に反応する抗体であり、標識剤としてペルオ
キシダーゼを用いこれと抗体とを一般式〔式中、ｎはＯないし５の！ｌｌ数を、Ｒは化学結合ま
たは２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で
表わされる化合物ＣＩ）で結合させたものを用いること
を特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測
定法および（２）■ペルオキシダーゼと抗体とを一般式〔式中、ｎはＯないし５の整数を、Ｒは化学結合まだは
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物ＣＩ）で結合させたもの、および■ペルオ
キシダーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重
複せずかつヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応す
る抗体を担体上に保持したものを含有するヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンの免疫化学的測定用試薬である。

本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ゲμ粒子（例、アガロ−
スゲμ〔例、セファロース４Ｂ。

セファロース６Ｂ（ファ／ｌ／マシア・ファインケミカ
ル社（スエーデン）Ｆり、デキストヲンゲμ〔例、セフ
ァデックスＧ−７５，セファデックスＧ−ｉｏｏ、セフ
ァデックスＧ　−２００（ファルマシア・ファインケミ
カル社製）　〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオ
ゲルＰ−３０，バイオゲ）ＶＰ６０．パイオゲ／ｌ／Ｐ
−１００（バイオラッド・ヲポフトリーズ社（米国））
）、−ｔ＝ニルローフ子〔例、アビセ／Ｉ／（脂化成製
）、イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエグー
ルセルロース、カルボキシメチルセ／Ｉ／ロース）’１
．物理的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス珪、ガラスロ
ッド。

アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ボリヌチレン球
、ポリスチレン粒子）〕、イオン交換樹脂（例、弱酸性
陽イオン交換樹脂〔例、アンバーフ、イト丁ＲＣ−５０
（ローノ・・ハースン１（米１月）重り）、ゼオカーフ
゛２２６（パームチットト１４（＋！’ｉド、イツ）製
）〕、＠塩基ｔ′１″陰イオン交換樹脂〔例、アンバー
ライトＩ　Ｒ−４Ｂ　、ダウエックス３（ダウケミ力）
（ｙ社（米国））ｉ・陽）］）などが挙げられる。

木泉明における相体上に保持された抗体における１月＋
Ｑ［、イ゛Ｗ熾ｊ１１１を結合させた１１０体における
抗体とｎ：いに抗原法定部位を重複しない２種の抗体で
あり、ｈ　（、’：　Ｇに〕ｒ、〒異的にＪτ応する４
−０体でｆ）ｊｌばよい。

％ｉ　ｈ　ＣＧ　Ｋ特２１′Ａ的に反応する抗体ト１．
’１．１１、たとえば■エンドクリノロジー（Ｅｒｏｌ
ｏｃｒｉ　ｎｏｌｏｇｙ　）。

偽１０４巻（１，９７９年）、第３９６頁に記載されて
いるような抗体が皐げられる。即ち、Ｉ］ＣＧ−β鎖の
Ｃ末端側のｈｃＧＫ特異的なペプチドと牛アルブミンや
牛チログロブリンなとキャリアー用タンパクとを１−エ
チ／ｌ／−３−（３−ジメチルアミノプロピ／Ｉ／）カ
ルボジイミドなど水溶１°１モカルポジイミドを用いて
得だ縮合物をフロイントの完全アジュバントもしくは不
完全アジュバントと共に人以外の温血動物たとえばウサ
ギに頻回接種して抗体を形成せしめ、これを採取するこ
とによりｈＣＧに特異的に反応する抗面清を得ることが
できる。

（わ特開昭５６　１３８２４８に記載されだｈＣＧに特
異的に反応する抗ｂ　ＣＧ抗体、すなわち担体」−に不
溶化した一般式〔■〕ＩＩ−Ｒ，−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−１１ｅ−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ　−ＯＨ（■：）
１されるペプチドの１４位のＧｌｙを含む１〜１４個の部
分ペプチド４４を表わす。〕で表わされるベフ。

チドに抗ｈ　Ｃ，（？　：１元体を含有する体液を接触
させ、ついで特異的に１（促ＩＫされた抗ｈＣＧ抗体を
溶出することにより得られだ抗ｈＣＧ抗体が挙げられる
。

該ｈｃＧ［特異的に反応する抗体と１〜では、さらに、
■前記一般式〔■〕で表わされるペプチドとキャリア用
タンパクとをグルグルアルデヒド（［ＧＬＡＪと略称す
ることもある。）の存在下に縮合せしめた４ｉ？ｉ合生
成物を人以外の温血動物に接ｌｊｊ、　ｌ、て抗体を形
成せしめ、これを採Ｊ（Ｙすることにより得られた抗体
が挙げられる。

ここにおいてキャリア用タンパクとは、単独では抗体産
生を誘導することができないベプタイドなどハプテン（
低分子量物質）に対する抗体を産生させるためにハプテ
ンと結合させて用いられるものをいい、その例としては
たとえば牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、牛チ
ログロブリン、破イ（Ｓ風トキソイド、ヘモシアニンお
よびポリアミノ酸などが挙げられる。

一般式〔■〕で表わされるペプチドとキャリア用タンパ
クとをＧ　ＬＡの存在下に結合さぜるには、公知の方法
〔例、ホルモン・アンド・メタポリツク・リサーチ（ｆ
（ｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｒｅ　
−５ｅａｒｃｈ　）　、第８巻（１９７６年）　＋　Ｋ
Ｓ　２４　ｉ頁〕によって実施し得る。一般式〔■〕で
表わされるペプチドとキャリア用タンパクの使用量比＆
、１１対工ないし２ネ１１が適当であり、反応ｐｆＴは
７．３前後が良好な結果を与える場合が多い。また反応
に要する時間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３
時間が適当である。この様にして鋼重した縮合生成物は
常套手段で４℃前後で水に対して透析し、凍結乾燥して
保存することができる。

以上の様にして！Ｆ！！造した縮合生成物は人ｊジ外の
温血動物に接種される。−ト紀ｈＣＧに特異的に反応す
る抗体の製４に用いられる人以外の温血動物としては、
たとえば咄乳湛血動’Ｖｎ＋　（例、ウサギ、ヒツジ、
ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）　１
．Ｐｋ８！　（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ
、ウズラ）などが挙げられる。該縮合生成物を人以外の
＃ｉＡ　ｒｆｉｔ動物に接種するノＴ法としては、動物
に１１ｆ　ｒ４１−Ｊ−る手１１１合生成物ケよ抗体産
生ずるに有効なＲ）でよく、だとえｖ１ニウサギに１回
２ｒｑを等容量（１ｓｔ）の生ｌｉｐ食１！水およびフ
ロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならびに
後肢掌皮下ＶＣ４週問おきに５回接４・口すると４１″
１、体を産生さぜ（４Ｊる１→合が多い。

このようにして、温血動物中に形成され／こ抗体を拝＋
（ｙする方法としては、たとえばウサギでｔし、通常最
終１ヂξ種後７日から１２［１の間に耳静脈から採血し
、ｊ’ｉｔ心分１心任１て血清として得られる。

１＋　ＣＧの’ｌ’？異４’ｊ’ｉ’、　ｆ＋の製造に
用いられる担体−ににＣ＋！、持された抗原に干？りる
担体としては、前記し７だ担体と同様のものが挙げらｉ
］る。

４１１体にｔｔｒ、原もし７〈は抗体を保持さぜるにｔ
、１：、公知の常套手段を応用し１１）るが、たとえば
゛代ｉｔ’ｌｌ　”、ヅ１′５８巻（Ｉｌ、　９７　］
イト）、第６９６頁にＨ己市ｙされ。

ているプロＪ・シアンｌ、’ｅ　、　Ｇ　ｉＩ、　Ａ法
などが挙げられる。まだ１．Ｌす１（ｊ“１易か方法と
１−で物Ｊｌｌ的に４１ｊ住表面に吸着さＷてもよい。

前記一般式（ｖｑ　）で表わされるペプチドの「信イ・
例としてＯ」、だとえＩ（１：　ｈ　ＣＧ−βのＣ＊端
ペプチド（ＩＸ　）　（］　２３−１４５　）　ＣＨ−
Ａｌａ、−Ｐｒｏ−Ｐｒｃ−Ｐｒｏ−８ｐｒ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｉ、ｐｕ　
−Ｐｒｏ−Ｇ］、ｙ−Ｐｒｏ　−Ｓ　ｅｔ−Ａｓｐ−’
Ｉ’ｈｒ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ　
−０１１）が挙げられ、これはたとえば特開昭５６−１
３８２４８号公報に記載の方法により製造することがで
きる。

木明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に門し略号で表示する場合、それらＶよＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏｍｍｊ、５ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂ
ｉｏ　−１ｏｇｉｃａｉ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ、ｕｒｅ
　　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を次に挙げる。また、アミノ酸
などに関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しな
ければ工４体を示すものとする。

Ａｌａ　　：　　アラニンＰｒｏ　　：　　プロリンＳｅｒ　　：　　セリンＴ、、ｅｕ　　：　　ロイシンＡｒｇ　　：　　アルギニンＧｕｙ　　：　　グリシンＡｑｐ　　：　　アスパラギン酸Ｔｈｒ　　：　　スレオニン１１ｅ　　：　　イソロイシンＧｌｎ　　：　　グルタミン本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチド合成の
公知の常套手段で製造しうる。固イ’ｌ１合成法、Ｍ、
ｉ目合成法のいずれによってもよいが、液相合成法が有
利な場合が多い。そのようなペプチド合成の手段と（７
ては、たとえば”　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、；４
１Ｔ　１巻（１９６６）、５ｃｂｒ’６ｄｅｒ　ａｎｄ
　Ｌｕｂｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｌｃ　ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ−あるいは″ペプチ
ド合成“、泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）に記
載された方法、たとえばアジド法、クロライド法、酸無
水物法、混合無水物法、ＤｃＣ法、活性エステル法、ウ
ッドワード試？１８Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾ
ール法、酸化ｉ７元法、Ｄ　ＣＣ／　７デイテイプ（例
、ｌ０ＩＪ１３　、　ＩＴＯＢｔ、　。

ＨＯＳ　ｕ　）法などがあげられる。

このようにして得られたｈＣＧに特異的に反応する抗体
を担体上に保持するには、公知の常套手段を応用し得る
が、たとえば前記したパ代謝°′。

＠８巻（１９７１年）、椿６９６頁に記載されているゾ
ロムシアン法、ＧＬＡ法などが挙げられる。

また、より簡易な方法として物理的に担体表面に吸〃ｔ
させてもよい。

本発明の測定法でいう抗原としてｔよ、測定対象となる
ｈＣＧをいう。

本発明で用いられる標識剤を結合させた抗体における抗
体は、ｈｃＧに非特異的に反応するものであって、前記
担体上に保持された抗体と互いに抗原決定部位を重複し
ないものが用いられる。

該ｈＣＧに非特異的に反応する抗体の例としては、たと
えば、人尿より公知の方法で精製したｈＣＧを、人以外
の温血動物に接種してｈＣＧに列する抗体を形成すしめ
、さらに塩析により得たγ−グロブリン画分を１．１　
ＣＧ−βのＣ末端ペプチドを結合させた同相を充てんし
たカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに
４かけて素通り画分を得、さらに１１ＣＧを結合させた
固相を充てんしだカラムを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーでれ１１製して得られたり、　Ｌ　Ｈなど
類似の（イ９造を有する蛋白ホルモンとも交差反応を示
す抗体などが挙げられる。

標識剤であるベットオキシダーゼとしては、種々の起源
のものを用いるととができるが、その例としてはたとえ
ば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、旧ｊｌ！ｔ　
＋ソラマメおよびトウモロコシなどから得られるペルオ
キシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出された
ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｌｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）がＫｌましい。

ベルメキシダーゼと抗体とを結合させる化合物として、
一般式〔式中、ｎおよびＲ＆よ前記と同意義を有する。〕で）
！（わされる化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わさ
れる２価の６員環状炭化水素残基としてη）１、飽和の
もの、不ｆｊｌ、和のもののいずれでもよい。ｆｉ；］
和の２価の６１［ｙＲ状１・ニジ化水素の例としでは、
たとえば１．２−．１．３−．１．４−シクロヘキシレ
ンが挙げられ、不ｈ’、ｊ和の２価の６　、ｆｉ　＋３
ｉ状炭化水；ζ残ＪＩＳＯ例として日１、たとえば１．
２−．１．３−．１．４−フェニレンなどが挙げられる
。

該化合物ＣＩ）において、ｎとしては１７１＋：いし５
の整数が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価
の６銭環状炭化水素残基が好ましく、特に１，４−シク
ロヘキシレンが好ましい。

本発明の方法において用いられる化合物〔■〕ハ、りと
えばザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈ
ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　）第７９巻２３３頁（１９７６年）、Ｈ−ロピアン・
ジャーナル・メブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏ−ｐ
ｎａｎ　、Ｔｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｌｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭
５２−８５１６３号公報、特開昭５２−８５１６４号公
報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造す
ることができる。たとえば、一般式〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。

ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマ
レイミド化合物ＣＩ）と一般式〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。

〕で表わされるサクシンイミド化合物〔■〕とを脱水剤
あるいは脱酸剤の存在下で反応させることによシ製？復
することができる。上記一般式において、ハロゲン原子
としては塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子
としてはたとえばナトリウム、カリウムなどが挙げられ
る。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫
酸。

シンクロへキシルカルボジイミドなどが、脱酸剤として
はたとえばピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられ
る。

前記化合物ＣＴ［’）は、たとえば特開昭５２−８５１
６４号公報に記載の方法あるいはこれに阜じて製造する
ことができる。たとえば一般式％式％〔式中、１１およびＲは前記と同意義を有する。〕で表
わされる化合物（ＩＶ　）を脱水閉環せしめることによ
り得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無
水ｒｉｌｉ酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）
を用い、温和に加熱することにより反応させることがで
きる。

サラに別法として、ヘルベティカ・キミヵ・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　）　第
５８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法あ
るいｔよこれに準じて製造することができる。たとえば
、一般式〔式中、Ｚはアルキ／Ｉ／基を示す〕で表わされるＮ−
アルコキシカルボニルマレイミド（Ｖ〕と、一般式％式％［）〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミ２７酸〔■〕とを反応させて、一般式〔式中、ｎに−よびＲは前記と同意斡を有する。〕で表
わされるマレイミド化合物〔■１〕を得る。７次に一般
式〔■〕で表わされるサクシンイミド化合物［：■〕を
加え先に述ベプこと同様の脱水側もしくは脱酸剤の存在
下で反応させることによりルシ造することができる。

上記一般式〔ｖ〕で表わされる化合物において２で表わ
されるアルさルとしては、たとえＩＩ：ｌ’メチノド′
、エチルがりｊｔげられる、。

ペルオキシダーゼに化合物〔１〕を反応さぜるＩｐｌ　
ｌ：ｔ、、両者をｐＨ約６ないし８のＰ両液中で約１０
ないし５０１〕の湿度で約１０分ないし２４時間反応さ
ぜることによって行なわれる。該緩衝液としては、たと
えばｐＨ７，０の帆ＩＭリン酸緩ｔ１’ｊｔイ疋、　、
ｐｌＴ　（ｉ、　３のｏ、ｒ＋ｓｉΔリン酸緩衝液など
が挙げられる１、このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ
のＮ’ｌ’！　ｆｌｔＷは、たとえばゲルクロマトグラ
フィーなどにより行なうことができる。該ゲルクロマト
グラフィーを行なう１際に用いられる担併とし−ｃ　ｒ
ｔｔ、　？ｃ　トＪ−ｉｔセファデックスＧ−２５（フ
ァルマシア・ファインケミカル社（スエーデン＞製〕。

バイオゲルＰ−２（１：バイオ・ラッド・ラボラトリー
ズ社（米国）製〕などが挙げられる。

マレイミド化ペルオキシダーゼを抗ｈＣＧ抗体と反応さ
せる場合、抗ｈＣＧ抗体Ｉ４Ｇあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ａビ）２両分を、メルカプトエチルアミ
ン）：ｊｌの存在下でＪ′供元し、ゲルクロマトグラフ
ィーによって精製された抗ｈＣＧ抗体Ｉ　ｇ　Ｇ　モｌ
−，＜＆：ｔ、Ｆａｂ’とマレイミド化ペルオキシダー
ゼとを反応させる。

該反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０しの湿度
で、約１ないし４８時間反応させることにより行なうこ
とができる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ６，（ｌ
の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０
．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。

このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどによシ精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲ／１／ＡＣＡ　４４Ｃ
Ｌ　Ｋ　Ｂ社（スエーデｙ）ｔＭ）、セファクリルＳ−
２００（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製〕などが埜けられる。

本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。

まず、■二担体に保持された抗体に、４１ｊ１定すべき
ｈＣＧ含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った
後これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗ｈＣＧ抗
体■ｇＧもしくはＦ’ａｂ’との結合物を加えて反応さ
せる。

本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるｈＣＧ
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、旬液あるい
Ｖ、１：各抽臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、　
、＋ｎｔ清および血漿が繁用される。

■：　■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基
質を加え、生じた物質の吸光度もしくは螢光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。。

■二　上記■−■の操作を既知量のｈＣＧの標準簿液に
列し予め行ない、ｈＣＧと吸光度もしくは螢光強度との
関係を標準曲線として作成しておく。

■：　未知ｆｉｔのｈＣＧを含む分析対象物について得
られた吸光度もしくは螢光強度を標準曲線にあてはめ、
分析対象物中のｈＣＧ含量をｆｉ％ｌ定する。

本発明のサンドインチ法によるｈｃＧの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとしては、主として、（１）担体上に保持された抗体。

（２）本発明方法によ勺得られたペルオキシダーゼで標
識化された抗体フラグメン）　（Ｆａｂ’）。

（３）標準ｈＣＧ。

（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛崩潰アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシンａ＋　ｐａｒ　液が
挙げられる。）。

（５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その−
例どして螢光法の場合、酵素基質としてｐ−・ハイドロ
キシフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩ｉ町面）および酵素反応
停止液が挙げられる。

上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。

標準ｂ　ＣＧもしくは被検液約１０ないし２００Ｉ１７
１に紙糸１≦（４）を加えて希釈し、一定職の試薬（１
）を加えて約０ないし４０℃で約１ないし４８時間反応
させる。担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし７３
００μｋを加えたのち、約Ｏないし４０　ｔＥで反応さ
せる。約１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上
に結合しているペルオキシダーゼ活性を測定する。即ち
ペルオキシダーゼの糸質Ｍ約１０〜１０００１を加えて
約２０〜４０℃で約（）、２〜２４時間反応させたのち
、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは螢光
強度を測定する。

本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でｈＣＧの痛感度測定が可
能となる。

本発明の試→１ｊ≦を用いると、他の類似したホルモン
（たとえばｈ　Ｌ　１１　二黄体形成ホルモン）からの
妨害を受けることなく瞳めて高感度かつ正確にｈＣＧを
測定できるので、絨毛性ＩＷ￥瘍やその他のｈＣＧ産生
腫瘍などの診断、予後管理などにも極めて有用な手段を
提供するものである。

以下に、参考例νよび実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。

参考例／抗体の製造人尿よシ公知の方法で糖製した約１４１，０ＯＯＩＵ７
膚ｇのｈ　ＣＧ　１πｇを牛］Ｊ１１食塩水ｌＮｔに溶
ｆＩｎシ、これにフロイントの完全アジュバント（Ｆ’
ｒｅｕｎイ８ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａ、ｄｊｕｖａ、ｎｔ
、、　”免疫の生化学“′、橘ら著、共立出版株式会社
（１９６７年）　’ｌ］　ｉ　ｍｔを加えてよく混和し
乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内および背部
皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週毎に５回行な
い最終免疫後１週間で採血しパイロットアッセイを実施
しだ。その結果、ｈＣＧ−βのＣ末☆１ｉｉｌペプチド
〔ＩＸ〕にも親和性をもつ抗血清Ｎ３０５Ｂを得た。

参考例λ 特異抗ｈＣＧ抗体のＵ；ジ造ｈＣＧ−ρのＣ末端ペプチド（ＩＸ　）　５　Ｍｅを０
．５Ｍ　ＮａＣ１を含む帆ＩＭ　ＮａＨＣＯ３８ｗｔに
溶解し、予めＮ／ｉ、０ＯＯＨＣＩで洗浄したブロムシ
アン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファイン
・ケミカルズ社ｑｉｊｊ　）　ｌ　ｑに加え、５℃で一
夜１５討゛Ｖした。反応終了後同じ０．５ＭＮａＣ１を
含む０．ＩＭＮａ、ｆｌＣＯ３で十分に洗浄し、次いで
）ＩＣＩでｐＨ８にｆ１１１’ｌｌ生′斗した０、５Ｍ
　エクノーノ１／アミン１０＋／をン后加して室温で１
時間反応させた後、（１）　ｉ　ＭＮＡ、Ｃ１を含む０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）　、　（２）Ｉ　ＭＮ
ａＣｌを含む（，１，１−Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ３，０
）および（３）０゜１．５ＭＮ几０１を含む０．０２Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐｌＴ　８．０）　　で順次洗浄しカラ
ムに充）１（シだ。

参考例／で得られた抗血清Ｎ　３０５　Ｂ　８　ｖｌｌ
を１゜５ｇの無水硫酸ナトリウムを用いて塩析洗眼させ
、得られだｒ−グロブリン画分を上記のペプチド〔ＩＸ
）結合セファロース４Ｂカラム（０，９ｘ４ｃｍ）にイ
ー１しだ。

０、１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（
ｐ）（８，０）　　でカラムを洗浄し、ｈＬＨ（黄体形
成ホルモン）、ｈＦ’ｓＨ（卵胞刺激ホルモン）および
ｈ　Ｔ　Ｓ　Ｈ（甲状腺刺激ホルモン）と交差反応する
抗ｂＣＧ抗体を除去した。次いで０．１７Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で溶出することによってｈＣ
Ｇ−βのＣ末端ペプチド（ＴＸ）と強い親和性をもつ特
異抗体Ｎ３０５ＢＳを得だ（蛋白量１．２ｆｆｙ）。

参考例３抗ｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（ＴＸ’）抗体の製１ｉｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（ＩＸ　：）　２５　Ｍｆ
および牛チログロブリン（ＢＴＧと略称する）５（１＆
を０．２Ｍリン酸緩術両液ｐＨ７，３）４肩ｔに溶解し
、５％ＧＬＡ水溶液４１１を加えて室温で３時間１１テ
？ｌ’後、４℃で透析（水２　ｐ　Ｘ　４　）　ＬＳＩ
Ｉ結乾燥して免疫原を得た。このｈｃＧ−βのＣ末端ペ
プチド〔■〕−ＢＴＧ縮合物１．５ツを半押食塩水０゜
７５　ｔｅｌに溶解し、これにフロイントの完全アジュ
バント（Ｆｒｅ＋、＋ｎ＃　３　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａ
ｄｊｕｖａｎｔ、　）　０．７５ａｔを加えて」：〈混
和し、乳剤を作り、これをウーリーギの向火１（，１部
筋肉内および背部皮下数ケ所に注ル１しだ。Ｉ；Ｊ、ｊ
二の操作を４Ｊ周おきＶＣ４回行ない最終免役後ｌｉｔ
・：３間で１゛１−而１２、遠心分１：リトして抗ｍ１
清を採取し抗ｈＣＧ−βｔｙ）ｃ末＋に１Ａｉ　ヘ−ｆ
チ）−（ＴＸ　）　ニ対する；Ｉ７Ｉ：ＪｒｌｌＪ＋ｌ
ｆ　Ｎ　３１３　Ｂを得た。

次いでＩ’ｒ、　＋ｆｉｔ　ｉｉ’すＮ３１３１３を常
法により硫酸アンモニウムで塩析させて得たγ−グロブ
リン画分を２〃゛９のｈＣＧを結合させたセファロース
４Ｂカラム（１ｒ（径０．９（・ｍ、長さ４ｃｍ）に付
した。

０、１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩向液（
ｐｎｓ、ｏ）でカラムをｌ；シ浄し、次いで０．１７Ｍ
グリシン−１１，ｘ酸μ両液（ｐｒ＋２．３）で溶出す
ることによって、ｈ　（／　ＧにＹ［（、和性の高い特
異抗体Ｎ３１３ＢＳを調ＳＩＩすした。

参考例り非１１．．ｉ醪へ抗ｈ　ＣＧ抗体の製造宍考例／で得ら
れた抗血清Ｎ　３　Ｑ　５　Ｂについて硫酸アンモニウ
ム塩析し、５ｍｙのｈ　ＣＧ−βのＣ末ｒ＜７１ｉペプ
チド〔■Ｘ〕を結合させたセファロース４Ｂカヲム（直
↑予０．９Ｃｍｌ廼さ４ｃｍ）のアフイニディークロマ
トグヲフイーで素通りする抗体画分を調製した。次いで
この抗体画分を２■のｈＣＧヲ結合させたセファロース
４Ｂカラム（ｉＮ　径０．９（・ｍ、長さ４ｃｍ）に付
した。、０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ８，０）でカラムを洗浄し、次いで５　Ｍ　
Ｍｇｃ：ｔ２　で溶出することによってｈＣＧに親和性
の高い非特異抗体Ｎ３０５ＢＧを調製した。

実施例／（１）マレイミド基の導入６１”ｆの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガー
マンハイム社（西ドイツ）１す！〕をＩＭｔの０．１Ｍ
リン酸ｓ　＊ｒ　を夜（ｐＨ７，０）にｒ’ｃ＋　Ｍし
、５０１’（１のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとか
した結合試目１；　Ｍ　Ｍ　Ｃ（一般式〔■〕において
、ｎ−１，Ｒ＝シク■」へ・Ｘシレンである化合物）４
．８ｆｆｙを加えて３（ｌで６０分間ｖｄ拌しながら反
応させた。

生成した沈ｌ殴を遠心分離して除去し、上清をセファデ
ックスＧ−２５０カラム（１，０×４５ｒ圃）にｊＱ　
Ｌ、０．１．Ｍ！］ン酸緩術７ｔｅで溶出さ止だ。タン
パクを含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて２ＪＩ
＆宿した。このようにしてｉｉ＋、＋１１製した７１ノ
イミｌ゛化ペルオキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ
１分子を）たり導入されたマレイミド基の数は１．０〜
１．２個であった（ペルオキシダーゼの分子紙を４０．
０００．蛸霜ｏｒ１ｍ　＝　２２．７５として計算）。

（２）マレイミド化ペルオキシダーゼと抗ｂ　ＣＧ　抗
体（Ｆ’ａｂ’　　フラグメント）との複合体の’Ｊ’
！　’ｌＮｔ２ｇ考例クチ得られり抗体Ｎ　３０５　■
３　Ｇ　５　ｒｌｆに０゜１りのペプシンを加え３０′
Ｃで一夜反応後、セファデックスＧ−１５０カラム（直
ｆ＋、２　、５ｃｍ　、　μさ５５ｃ＋ｎ）で粘イ（（
支）した。得られたト九体Ｆ’（ａ、ｂ’）２画分を２
−メルカプトエチノνアミンで還元１．、セファデック
スＧ−２５０カラムによるゲルクロマトグラフィーで粘
イ（・すしてウザギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’フラグメン
ト）を得た。

上＾１屓１）でｒｔ！−Ｊ　製したマレイミド化ペルオ
キシダーゼ１．５八′ｑを０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐａ
ｒ　６．　（１）０．１５＊ｌに溶解し、先に得た抗ｈ
ｃＧ抗体（ｒａｂ’フヲグメント）１．８ｆｆｆをとか
した５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　０．１５＊ｌを
加えて４ｔＥで２０時間反応させた。反応後、ウルトロ
ゲｌ　Ａ　ｃ　Ａ４４を充てんしたカラム（１，５ｘ４
５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（６，５）で溶出させた。溶出
液の２８０の吸光度ならびに酵素活性を測定した。ペル
オキシダーゼとウザギ抗ｈＣＧ抗体（ｐａｂ’フラグメ
ント）との用合体が生成していることを、以下の方法で
確認した。

まず、Ｉ′ｉ１′素活性の測定はギルバルトらの方法〔
アナリテイカル・り゛ミスドリー（Ａｎａ］ｙｔｉｃａ
ｌＣｈｃ＋ｍ１ｓｔｒｙ　）　、第４０巻（１９ｆｉ８
年）、　１．２５６頁〕で行なった。即ち、溶出ｒｔｔ
の各フラクションを０．１％ウシ血清アルブミンを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で１８００倍に希
釈した。この１０　ｐ、ｅ　に０．１％ウシ血清アルブ
ミンを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ［（５
，０）’Ａ’−ＩＦ−１’ｉγしたＱ、５！’、５ｐ−
ハイドロキシフェニル酸ｌ’！’、：　０　、２５ｍｌ
を加えて混合し３０１〕で５分間インキュベートした。

次に帆０１％過酸化水素０．０５ｎ／を加えで３０Ｃで
２０分反応させた。０．１Ｍグリシン緩（町液（ｐＨＩ
Ｏ，３）２．５がｔを加えて酵素Ｊ女一応を停止トさＶ
、　１．　／ＩＱ／ｎｉのキニンの螢光強度を１００と
し励Ａ’４　）Ｙ、３２０ｎｍにおける４　０５　ｎｍ
の螢光ｌ１ｊＧ度を測定しメζ。結果を第１図に示す。

第１図において、−〇−は２８０ｎｍにおける吸光度ｆ
、１−Ｑ］、ペルオキシダーゼ活性（螢光強パ〔として
）をそれぞれ示す。フラクション３８イ」近においてペ
ルオキシダーゼと（九ｈ　Ｃ（？　抗体（Ｆ’ＦＬｔ／
フラグメント）との複合体の生成が極めて良好であると
とが分かつプこ。

（３）抗体結合同和の調製ポリスチレン珪（直径４　、８　ｍｍ　、　Ｐｒｅｃｉ
ｓｉｏｎＰＩＦＵｓｔｉｃｓ　　Ｂｑ、１１　　Ｃｏ、
　、　　Ｃｈｉｃａｇｏ　、　　Ｕ、　　Ｓ、　　Ａ、
　　）　　１　５　０　０個に、参考［？ｌＩ　、２あ
るいは３．に記載の特異抗ｈ　ＣＧ抗体Ｎ　３０５　Ｂ
　ＳあるいはＮ３１３ＢＳの１５ＩＩｇ／ＴＷ！　　０
．ＯＩＭＮａＣｌ−０，ＯＩＭリン酸緩衝ｒｌＺ（ｐＨ
８，０）　　１００ｍｌを加え５１Ｓで−イタインキュ
ベートし７た。０．１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸
緩衝（（５＜　ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで
冷所保存した。

（４）ＥＩＡＥＩＡ用の試す（５とし７て以下のものを用いた。

（ｉ）実）血例／（２）で得られたペルオキシダーゼと
つ田ギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆ’ａｂ’　　フラグメント）と
の１．１１合体（め　実施例／（３）で得られた抗ｈＣＧ抗体片）り作
ボリスヂレン球（３１１＋’Ｗ　準ｈ　　ＣＧ　　、　）梵’ｊ　ンイ
７ｃ）Ｉ　　Ｌ　Ｈ（４）緩衝液Ｂｉ　１．０％正常ヒ
ツジ血ｉ’ｉＪｆ　＋　１％ウシ血ｉ？ｆｆアルブミン
、０．１　’ｉ’ｌ；　ＮａＮ　３　．０−１５　ＭＮ
Ａ、Ｃ］を含むｐ［Ｔ　７．３の帆Ｑ２Ｍリン酸緩衝液
■　ペルオキシダーゼ活性測定に・２］４要な試薬０゜
０２％過酸化水素と帆１５％０−フエニレンジアミンヲ
含むｐＨ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウ
ム緩衝液および反応停止液（ＩＮ−塩酸）１則　　定緩？＋６ｒどｉＷＲ２００ｐＨ中でｈＣＧもしくはｈＬ
Ｉ−１とウサギＪ７’Ｆ、　ｂ　ｃ　ｔ；　１％作ポリ
スチレン球とを室ン晶で１０間反応させた。ポリスチレ
ンはを洗浄後、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ＭＵＧ抗体
（Ｆａｂ’　　フラグメント）複合体３００　ｐ１８　
を加えて４℃で１目間反応させたのら、ポリスチレン球
を洗ｌ￥１し、これに０．０２％ｉ１％酸化水素と０．
１５％０−フェニレンジアミンを含む０．】λ４クエン
酸−リン酸二ナトリウｌ−緩怠１フイタ（ｐＨ，４，＞
＜　）　５００１’ｌを加えて９２品で４０分間放ｔ１
イし、ＩＮ塩酸２ｔｔｔｆを添加して反応を１′：ｒ止
さぜ、４９２　ｎｍにおける吸光度を１１・、’：’）
ｊＹ、　１．／イー１１ン）１（曲線７針了Ｌ＋た。そ
れぞれの（゛貰ンｑ〜曲糸′処を４合２図に示し／ζ。

第２図中、＋　はＮ　３０５　Ｂ　Ｓ記ｉ合ボリヌチレ
ン球でのｈ　ＣＧの標準曲線を、−〇−＆Ｊ、Ｎ５Ｑ５
ＢＳ結合ボリスチｌ／ン球での）１Ｌ　”ｒｌ　（ＤＪ
ｌ１５？”Ｑ’、曲線を、＋ｐｐＨ：３１．３　Ｂ　Ｓ
　結ａホリヌチレン球でのｈＣＧの、÷　はＮ　３１３
　＋’ＩＳ結合ポリスチレン球でのｈ　Ｔ、　Ｈの４：
酊（Ｌ！−曲線をそれぞれ示す。

このように、本発明の測定方法はｈＣＧに特異的かつ高
感度であり、ｈＬｆ（とけ交差反応を示さなかった。

実施例λ　　短時間法標準ｈＣＧ、実施例Ｘ（２）で得られたペルオキシダー
ゼ−抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’　　フラグメント）複合体
、および実施例／（３）で得られだ抗ｈＣＧ抗体Ｎ３０
５ＢＳ結合ポリスチレン球１個を２５％正常ヒツジ血清
、１％ウシ血清アルグミン、０．００２％メルチオレー
）　、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０゜（）２Ｍリン
酸緩蓮１液（ｐＨ７，０）　３００１１１３　　中で同
１１．’？に混合して４℃１日間反応させたのち、ポリ
スヂレンボー／Ｉ／を洗浄し、実施例／（４）に示した
方法でペルオキシダーゼ活性を測定した。第３図に示し
たように、良好なｈｃａの標準曲線を与えた。

実施例３ｍ−マレイミドベンシイ）Ｖ−Ｎ−ハイドロキシサクシ
ンイミド（Ｍ　Ｂ　Ｓ　）による結合法西洋わさびべｙ
ｖＡキシダーゼ〔ベーリンガーマンハイム社（西ドイツ
）製：］　６　”’（／を０．１Ｍリン酸緩衝１１グ（
ｐＨ７，０）に溶解し、５０ｐＡのＮ。

「−ジメチルホルムアミドにとかした結合ｇ　４％　Ｍ
ｎ５（一般式ＣＩ）においてｎ＝０　＋　Ｒ＝フェニレ
ンである化合物）４．８ＦＩＩｙを加えて２５℃で３０
分間トノ１押しながら反応させた。次に反応生成物をセ
ファデックスＧ−２５０カラム（１，０×４５ｃｍ）に
通し、０．０５Ｍ酢酸緩衝ｒ＋１　（ｐＨ！５．０　）
で溶出した。タンパクを含む両分を分取し、コロジオン
Ｓを用いて７１■宿した。このようにして得だマレイミ
ド化ペルオキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子
あたり導入されたマレイミド基の数＆、ｔ（１，６８〜
０．７８であった。

春考例りでイ）られたｔｆｃ体Ｎ　３０５　Ｂ　Ｇ　５
ｆｆｆＫＯ。

１１・′グのペプシンを加え３０℃で一夜反応後、セフ
ァデックスＧ−１５０カラム（直径２．５Ｃｍｌ長さ５
５ｃｍ）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’）２ｉｉ
［ｑ分ヲ２−メルカプトエチルアミンで還元し、セファ
デックスＧ−２５０カラムによるゲルクロマトグラフィ
ーで精製してウサギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆ　ａｂ’　　フラ
グメント）を絹製した。抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’　　フ
ラグメント）１．７Ｍ１７をとかした５ｍＭニゲ−レン
ジアミン四Ｃ（トド俊ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）　０．１５ｆ！Ｉを、先に調製
し７だマレイミド化ペルオキシダーゼ１６５岬の０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　０．１５＃Ｉｔに加え
て４℃で２０時間反応させた。反応後、ウルトロゲ／Ｌ
／ＡＱＡ４４を充てんしたカラム（１，，５Ｘ４５ｃｍ
）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、Ｑ、１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＦ１６．５）で溶出させ、ペルオキシダ
ーゼ−ウサギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’フラグメント）複
合体を得た。

本複合体を実／ｉｍ例／（２）　、　（４１に示した方
法に従って検定したところ、同相への非特墨的吸着が極
めて小さく、高感度を与えることが分った。

Ｅ工Ａにおける試薬としては、以下のものを用いた。

■　実施例Ｚ（３）で得られた抗ｈＣＧ抗体ｔＪ　３０
５ＢＳ結合ポリスチレン球 ■　実施例３で得られたペルオキシダーゼとウサギ抗ｈ
ＣＧ抗体（ｒａ、ｂ’　　フラグメント）との複合体 ■　　イ・ツ１ンｉ７’（ｈ　　ＣＧ ■　緩衝面Ｂ（実１（Ｉｉ例バ４）参照〕■　ベルオＡ
シダーゼ活性測定に必要な試薬０．５％ｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸を含むｐＨ５，０の酢酸緩両液、０．０
１％過酸化水素水および反応停止液（ｐ）１１０．３の
０．１Ｍグリシン緩雨液）実施例’Ｉ、　　　ｈＣＧの特異免疫化学的測定用キッ
トおよびｈＣＧの測定下記のｈ　に　Ｇ免疫化学的測定用キットを用い、前記
の操作法に従って正常人、卵巣摘出患者、排卵期婦人、
妊婦および絨毛癌摘出患者の血漿中のに＋　ＣＧ　ｉ１
度を測定した。

ｈＣＧの免投化学的測定キット（１）実施例／（３）で得られる１個あたり約１１１ｅ
のｈｃａｑ・、ν異抗体で感作した直径４．８ｎｎｎの
ポリスチレン球（２）実施例バ２）で得られるペルオキシダーゼ４ｔ％
　ｎｒｆｔｌ抗１ｃＧ抗体複合体（３）　　０〜１０　Ｑ　ｍ　ＩＵの標準ｈｃａ（４）
上記（１）　、　（３）の試薬および被検試料の希釈に
用いる緩衝液ＢＣ実施例／（４）参照〕（５）０−フェニレンジアミン（６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ；　Ｏ
−１％ウシ血清アルブミン、０．００２％メルチオレー
トを含むｐＨ７，５のＯ，ＩＭ！Ｊン酸緩衝液（７）上
記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ　；　０．０２％過酸
化水素帆００２％メルチオレートを含むｐＨ４゜８の０
．１Ｍクエン酸緩術両液８）停止液；ＩＮ塩酸（９）コントロール血清（正常ヒツジ血清）操作法被検試料５０ｐｌに試薬（４）　２５０　Ｉｌｌおよび
試薬（１）１個を添加し、室温で１日間反応させた。ポ
リスチレン球を水洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２
）３００１１１Ｃ複合体として約３ｏｎｇ）を添加し、
４して１日間反応させた。ポリスチレン球を水洗し、試
薬（７）で溶解した０、１５％（Ｄ試薬（５）　５００
　Ｉｌｌを加えて室温で４０分間反応させたのち、ＩＮ
塩酸１．５＊ｉ！ＩＣ添加して反応を停止させ、４９２
　ｒｉｍの吸光度を測定した。別に標準ｈＣＧ溶液につ
いては、試薬（４）２００　Ｉｌｌ　　、コントロー／
Ｌ／血清５０１１Ｊおよび試薬（１）１個を加えて−ｌ
二記と同一操作を行ない標準曲線を作成した。

上記方法により、正常人、卵巣摘出患者、排卵より１婦
人、好ＩＪｉ４および絨毛癌摘出患者の血清中のｌ〕Ｃ
Ｇ濃度を測定した。結果は第１表に示される。

正常人直情　１　　　　　　　　０．２０２　　　　　
　　０、２５３　　　　　　　０．３５４　　　　　　　０．１８５　　　　　　　０．２７３　　　　　　　０．５４４　　　　　　　０．２８！−，０，７７被検試料　　　　　ｈ　ｃ　ａ　濃度（ｍ　Ｉ　Ｕ／ｉ
ｌｌ　）２　　　　　　　　　　　０．１９３　　　　　　　　　　　０、２５妊婦面清　　］、　　　　　　１．０００２　　　　　
　３４．０００３　　　　　　１８　、０００２９．８３５．３第１表の結果から明らかなように、正常者を含め極微量
の血清ｈＣＧがｈＬＨなどの４１１似したホルモンの交
差反応を受けることなく測定できる。

まだ、絨毛癌摘出者の予後管理においても、治癒の判定
に極めて有効である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例／で得られたペルオキシダーゼとウサギ
抗ｈＣＧ抗体（Ｆ’ａｂ’　　フラグメント）との反応
生成物のゲルクロマトグラフィーにおける溶出パターン
を、第２図は実施例１においてペルオキシダーゼ標Ｒｔ
’ｆｋ抗ｈＣＧ抗体（ｒａｂ’　　フラグメント）とｈ
ＣＧ特異的抗体結合ポリスチレン球とを用いるＥＩＡの
ｈＬＨの標準曲線を、第３図は実〃亀例！で得られた同
時アラ七イ法におけるｈＣＧの標準曲線をそれぞれ表わ
す。；１！′ｌ　　ｌノ１フラクション集、竿　？　艮′１ｈＣＧ　　ｆｍｌＵ／ｍｆ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）担体上に保持された抗体、抗原および標識剤を結
合させた抗体を用いる免疫化学的測定法において、相体
上に保持される抗体と標識剤を結合さぜる抗体とが互い
に抗原決定部位を重複しない２種の抗体であり、担体上
に保持される抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的
に反応する抗体であり、標識剤としてベルオギシダーゼ
を用いとれと抗体とを一般式〔式中、ｎ　ｉｊ：　０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す１
．〕で表わされる化合物で結合させたものを用いること
を特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測
定法。
（２）■ベルオキシダーゼと抗体とを一般式〔式中、ｎ
はＯないし５の整数を、Ｒは化学結合または２価の６員
環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化合
物で結合させたもの、および■べ／Ｉ／メキシダーゼに
結合さ忙る抗体と互いに抗原決定部位を重複せずかつヒ
ト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応する抗体を担体
上に保持し７だものを含有するヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンの免疫化学的測定用試桑。